Génotoxicité : mutagenèse et

cancérogenèse

Pr Abdessamad AMINE
[email protected]

Programme ToxNuc-E
 Plan

• Processus de mutagenèse

• Réparation de l’ADN

• Analyse de la mutagenèse

• Mesure de la cancérogenèse
 Plan

• Processus de mutagenèse

• Réparation de l’ADN

• Analyse de la mutagenèse

• Mesure de la cancérogenèse
 La Mutagenèse

Introduction de modifications irréversibles dans la séquence d'un génome ou dans le

génome de la descendance d'un organisme vivant suite à une erreur de la machinerie

cellulaire ou à une exposition à un agent chimique ou physique, à un virus intégratif ou

à un élément transposable.

Les mutations spontanées sont rares et aléatoires et constituent la principale source de

diversité génétique, moteur de l'évolution. Cependant, le taux de mutation peut être

considérablement augmenté par des facteurs physiques ou chimiques, appelés agents

mutagènes.
Processus de mutagenèse

Mécanismes

Agents mutagènes
 Processus de mutagenèse

Il existe deux classements des processus mutagènes :

Selon l’action sur la structure chimique de l’ADN (vision “biochimique“)

Mutations affectant un ou quelques nucléotides : “small scale“
Mutation affectant une région chromosomique : “large scale“

Selon l’action sur une ou plusieurs fonctions biologiques (vision “génétique“)

Perte de fonction
Gain de fonction
Létale
 Action sur la structure chimique de l’ADN
Mutations affectant un ou quelques nucléotides : I

Substitutions (mutation ponctuelle)

Transition : purine à purine (A ::: G) ou pyrimidine à pyrimidine (C ::: T)

Transition

Transversion : purine à pyrimidine ou pyrimidine à purine

Transversion

Les substitutions provoquent :

Mutation silencieuse : code pour le même aminoacide
Mutation miscodante : code pour un aminoacide différent
Mutation non codante : code pour un “stop“
 Action sur la structure chimique de l’ADN
Mutations affectant un ou quelques nucléotides : II

Insertions
Mutation générée par un “glissement“ de l’ADN polymérase

Insertion

Réplication fautive

Délétions
Mutation générée par un “glissement“ de l’ADN polymérase

Réplication fautive

Délétion

Ce type de lésion peut provoquer un décalage du cadre de lecture ou “Frameshift“ en

cas d’insertion ou de délétion de 1, 2 ou plus de nucléotides (sauf 3 et multiples).
 Action sur la structure chimique de l’ADN
Mutations affectant un ou quelques nucléotides : III

Dégradations (exemples)
Tautomérisation : incorporation d’un analogue de base toxique ou d’une base incorecte

Déamination : transformation d’une Cytosine en Uracil ; d’une Guanine en Xanthine ou

d’une Adenine en Hypoxanthine

Alkylation : transfert d'un groupement alkyle sur une base de l’ADN. Il existe des agents
alkylants spécifique d’un sillon de l’ADN

Oxydation : attaque radicalaire (OH•) d’une base, en particulier d’une guanine

Perte de base (site abasique)

Dépurination : élimination d’une base purique

Dépyrimidination : élimination d’une base pyrimidique

Site AP
 Action sur la structure chimique de l’ADN
Mutations affectant un ou quelques nucléotides : IV

Pontage intra et inter brin

Pontage intra brin Pontages inter brin

Adduits ADN-protéines

Pontage ADN-protéine
 Action sur la structure chimique de l’ADN
Mutations affectant une région chromosomique

Amplification x

Délétion
x

C
B D
A E E D C B A

Inversion x

Dicentrique x

Translocation x
Action sur la structure chimique de l’ADN
Mutations affectant une région chromosomique

Perte d’Hétérozygotie (LOH) entre hétéro-allèle

Action sur la structure chimique de l’ADN
Mutations affectant une région chromosomique

Perte d’Hétérozygotie avec un pseudo-gène

 Action sur la structure chimique de l’ADN
Altération du squelette sucre-phosphate

Cassures simple-brin CSB

Cassures double-brin
 Action sur une ou plusieurs fonctions biologiques
Mutations provoquant une perte de fonction

Mutation amorphe
Mutation qui abolit complètement la fonction du produit du gène.
Celui-ci est totalement inactif ou absent.

Mutation hypomorphe
Mutation qui diminue la quantité ou l’activité d’un produit de gène.

Les mutations “perte-de-fonction“ sont généralement silencieuses car la seconde copie

du gène est sauvage, hormis pour les mutations conduisant à une haplo-insufisance.

Haplo-insufisance : la quantité de produit de la copie sauvage du gène n'est pas suffisante pour assurer la
fonction physiologique normale (cas des protéines requises en quantité stœchiométrique ).
 Action sur une ou plusieurs fonctions biologiques
Mutations provoquant un gain de fonction

Mutation hypermorphe
Mutation qui augmente la quantité de produit d’un gène dans la cellule.

Mutation néomorphe
Mutation provoquant l’expression d’une protéine fonctionnellement différente de la
protéine sauvage ou bien équivalente mais délivré au mauvais moment au cours du
développement ou au mauvais endroit.

Mutation antimorphe ou dominante négative

Mutation responsable d’une activité biologique antagoniste à celle du produit du
gène sauvage.

Les mutations “gain-de-fonction“ sont dominantes.

 Action sur une ou plusieurs fonctions biologiques
Mutations létales

Mutation létale
Mutation provoquant la mort cellulaire immédiate ou à cours terme.

Mutation létale conditionnelle

Mutation létale uniquement dans des conditions environnementales spécifiques.

Mutations synthétiques létales

Il s’agit de deux mutations viables sur deux gènes différents qui provoquent la mort
cellulaire lorsqu’elles sont combinées.

Les mutations létales sont dominantes

 La mutagenèse : processus biologique “naturel“
Erreurs générées par la réplication
Taux d’erreur moyen (x 10-5)
Famille Protéine (humaine) Activités associées Fonction
Substitution Délétion / Addition
Réplication chromosome
Pol  (alpha) Primase 16 D : 3,9 & A : 0,3
Réparation CDC
Réplication chromosome
Pol (delta) 3’ -> 5’ exo NER, BER, MMR 1 D:2
Réparation CDC
B Réplication chromosome
Pol  (epsilon) 3’ -> 5’ exo NER, BER, MMR < 0,67 D<1
Réparation CDC
TLS, ICL & SHM
Pol  (zeta) 10 ?
Réparation CDC
BER & TLS
Pol (beta) dRP & AP lyase 67 D : 90 & A : 0,2
Réparation CSC
BER
Pol (lambda) dRP lyase ? ?
X Réparation CDC

D’après C. Cazaux, communication personnelle

Pol (mu) TdT Réparation CDC 400 ?
Pol (sigma) Cohésion Chromatide soeur

Pol (eta) TLS (BPDE) & SHM 2 200 D : 240 & A : 130
Pol (iota) dRP lyase TLS, BER & SHM 10 - 10 000 ?
Y Pol (kappa) TLS (BPDE) 580 D : 180 & A : 60
Rev 1 TdT TLS

Réplication mitochondrie
Pol (gamma) 3’ -> 5’ exo
A BER mitochondrie

Pol (theta) ICL (Cis-P)

 La mutagenèse : processus biologique “naturel“
Autres processus

Tautomérisation

Dégradation spontanée des bases

Attaques radicalaires

Alkylation

Décalage du cadre de lecture dans les séquences répétées

 La mutagenèse : processus biologique “naturel“
Fréquence des lésions spontanées de l’ADN

Lésions spontanées par jour et par cellule chez les mammifères

Types de lésions Spontanée + 1 Gy Ratio

Cassures simple brin 20 000 à 40 000 1 000 1/30

Cassures double brin 1 << 40 +++

Lésions de bases 20 000 2 000 1/10

Autres lésions (pontages) 5 000 200 1/25

Total 50 000 3 500 1/20

 La mutagenèse : processus biologique “naturel“
Mécanisme indispensable pour les mammifères

Hypermutagenèse somatique des gènes d’immunoglobulines (SHM)

Les gènes codants pour les anticorps sont initialement assemblés par recombinaison V(D)J

Un second cycle de diversification permet d’obtenir une meilleur spécificité par hypermutation
somatique
• Introduction de substitutions de base (activation-induced déaminase) dans une zone de 1 kb
autour de la séquence de l’Anticorps
• Réparation de la lésion avec un processus peu fidèle
• Etape de réplication de la matrice lésée avec une polymérase peu fidèle

Mécanisme ultra-spécifique
des lymphocyte B au cours de la production d’anticorps
Agents mutagènes

Agents physiques

Agents chimiques
 Agents génotoxiques physiques
Les ondes électromagnétiques

Rayonnement ionisant

Rayonnement mutagène

Lumière visible
Liaison
longue Ondes radio Micro-ondes Infrarouge Ultraviolet Rayons X Rayons 
distance

Fréquence
eV keV MeV - GeV
Hz kHz MHz GHz THz
Energie des photons

Longueur d’onde

>1000 km km m cm - mm µm nm A pm fm
 Agents génotoxiques physiques
Classification des rayonnements
Mutagène
Proton (p)

Neutron (n)
Particules
Ion - alpha ()
Rayonnements Electron ()
ionisants

Ondes Photon gamma ()

Energie

électromagnétiques Rayon X

Rayonnements

Ultraviolet (UV)
Ondes Visible
électromagnétiques
Infrarouge (IR)
Rayonnements
non ionisants
Vibrations Ultra-sons
mécaniques Son
 Agents génotoxiques physiques
Effets biologiques des radiations UV

Les UV sont classés en trois catégories :

UV-C (180-290 nm) :

Dimères de pyrimidine (12 photoproduits différents)
Stress oxydatif
Cassures simple-brin

UV-B (290-320 nm) :

Dimères de pyrimidine (12 photoproduits différents)
Stress oxydatif

UV-A (320 nm-visible) :

Dimères cyclobutane de thymines uniquement
Stress oxydatif
Agents génotoxiques physiques
Effets mutagène des radiations ionisantes

Irradiation  :
Stress oxydatif
Cassures double-brin
Cassures simple-brin
Pontages
LMDS

Irradiation  :
Stress oxydatif
Cassures simple-brin
Cassures double-brin

Irradiation  :
LMDS
Cassures double-brin
Cassures simple-brin
 Agents mutagènes chimiques
Introduction

1942 : mise en évidence de l’effet mutagène de l’Ypérite (gaz moutarde) sur

la drosophile par Charlotte Auerbach (1899 - 1994) à Edimbourg.

2006 : près de 170 000 publications scientifiques font état de travaux qui

utilisent ou analysent la mutagenèse.

Plus de 1 000 substances chimiques sont considérées

comme mutagènes en 2006
 Agents mutagènes chimiques
Classement I

Analogues de base

5-Bromo 2-desoxyuridine (BrdU)

Aminopurine
Ganciclovir (anti-retroviral utilisé dans le traitement de l’Herpes & du HIV)

Composés altérants les propriétés structurales et d’appariement des bases

Acides
Acide nitreux : issu de la digestion des nitrites (conservateurs des aliments)
Acide méthanoïque (acide formique)

Agents alkylants
Methylants : methyl-methane-sulfonate (MMS)
Ethylants : ethyl methane sulfonate (EMS)

Agent provoquant des adduits de l’ADN

N-acetoxy-N-2-acetylaminofluorine (NAAAF)
Benzo(a)pyrene diol epoxide (BPDE)
 Agents mutagènes chimiques
Classement II

Agents intercalants
Acridine orange
Proflavine
Bromure d’ethidium

Agents altérant la structure de l’ADN

Radiomimétiques : Bléomycine, Zéocine
Cross-linkers : Cis-Platine, Psoralènes, moutardes azotées ou souffrées (Ypérite)
Peroxides

Agents altérant les processus métaboliques cellulaires ou la réparation de l’ADN

Inhibiteurs de la réparation de l’ADN : cadmium (métaux lourds )
Inhibiteurs de la détoxification des espèces radicalaires : L-Buthionine Sulfoximine (BSO)
 Agents mutagènes chimiques
Conclusions

Chaque agent mutagène à son spectre de mutagenèse :

Cadmium :
Mésappariements
Deletions
Cassures simple-brin
Cassures double-brin

Cis-Platine :
Pontages inter brin
Réarrangements chromosomiques (RH)

Benzo(a)pyrene diol epoxide (BPDE) :

Adduits
Réarrangements chromosomiques (RH)
Insertion de bases
Décalage de la trame de lecture
 Plan

• Processus de mutagenèse

• Réparation de l’ADN

• Analyse de la mutagenèse

• Mesure de la cancérogenèse
 Réparation de l’ADN
Réparation par excision de bases : BER
 Réparation de l’ADN
Réparation par excision de nucléotide : NER
 Réparation de l’ADN
Réparation des mésapariements : MMR
 Réparation de l’ADN
Synthèse trans-lésionnelle : TLS

Mécanisme utilisé au cours de la réplication : “tolérance“ des dommages

 Réparation de l’ADN
Réparation des cassures double brin : RH ou NHEJ
 Réparation de l’ADN
Conclusions

Nombreux acteurs dans chaque processus de réparation

Redondance des mécanismes de réparation

Un mécanisme de réparation ne restaure pas systémiquement à l’identique

Effet du cycle, de l’apoptose et de la signalisation sur la réparation

 Plan

• Processus de mutagenèse

• Réparation de l’ADN

• Analyse de la mutagenèse

• Mesure de la cancérogenèse
 Analyse de la mutagenèse
Test d’Ames

But :
Analyser rapidement et à moindre coût le pouvoir mutagène (ou anti-mutagène) d’une substance

Principe :
Hypothèse d’un parallélisme entre mutagenèse et cancérogenèse (nouveau en 1970 !)
Induction de mutations spécifiques dans différentes souches de Salmonella typhimurium porteuses
d'une mutation dans la synthèse de l’histidine
Un événement de mutagenèse peut “réverser“ le phénotype His- et His+. La souche poussera alors
sur un milieu sans histidine

Avantages :
Test rapide (48h00) et sensible
Réponse quantitative
Souple et adaptable à des échantillons très variés
Pouvoir prédictif (mutagènes qui sont cancérigènes) est de 70 à 90%
Banque de donnée de résultats très importante
Test légal de toxicologie génétique dans de nombreux pays

Inconvénients :
Test bactérien ne permettant qu’une évaluation approximative de l’effet sur l’homme
La présence d’histidine dans l’échantillon rend le test inutilisable
Les échantillons bactéricides (antibiotiques, désinfectants) ne peuvent pas être testés
La sensibilité (cancérigènes qui sont mutagènes) est de 40 à 50%
Souches bactériennes utilisées génétiquement instables (réversion naturelle)
 Analyse de la mutagenèse
Tests utilisés chez les mammifères I

Principe général :
Sélection de quelques cellules mutantes dans une population sauvage
(fréquences de 10-7 à 10-3)

Stratégie :
Utiliser des loci non létales pour la cellule et sélectionnables facilement

Limites :
Test difficiles ou impossibles à mettre en œuvre dans certaines cellules
 Analyse de la mutagenèse
Tests utilisés chez les mammifères II

Cibles moléculaires principalement utilisées :

ATPase de la pompe Na+/K+

Résistance à la ouabaïne
Mesure uniquement les substitutions de base

Hypoxanthine phosphoribosyl-transférase (hprt)

Résistance à la 6-thioguanine
Mesure principalement les délétions, insertions

Adenine phosphoribosyl-transférase (aprt)

Résistance à la 8-azaadénine
Mesure tous les évènements
Analyse du spectre de mutagenèse par PCR et séquençage
 Analyse de la mutagenèse
Tests utilisés chez les mammifères III

Etalement des cellules Traitement Récupération des cellules

Incubation 2 cycles

Comptage cellules

Clonogénicité Mutagénicité

Sélection

Comptage des mutants

Analyse
 Analyse de la mutagenèse
Stratégie d’analyse d’un composé en recherche fondamentale

Détermination de la durée du traitement (en unité de cycle cellulaire)

Mesure de la survie cellulaire par clonogénicité : détermination des LD10, LD 50 et LD 90

Analyse du cycle cellulaire aux LD10, LD50 et LD90

Analyse de la mutagenèse sur deux loci minimum

Si la cellule proliférante accompli un cycle cellulaire complet en 24h00 (temps de doublement) :

Traitement initial de : 1 cycle (24h00)
3/4 cycle (18h00)
1/2 cycle (12h00)
1/4 cycle (6h00)
 Analyse de la mutagenèse spontanée
Analyse de fluctuation

Etalement de 102 à 103 cellules Etalement de 106 cellules

Prolifération puis comptage

A B C D E F A’ B’ C’ D’ E’ F’
Cultures indépendantes

Sélection

Fluctuation du nombre de mutant

A’ B’ C’ D’ E’ F’

Analyse statistique de la fluctuation par le test

de Luria et Delbrück (1943) ou de Lea et Coulson (1948)
Taux de mutagenèse par cellule (ou locus) et par génération
Conditions expérimentales spécifiques
 Plan

• Processus de mutagenèse

• Réparation de l’ADN

• Analyse de la mutagenèse

• Mesure de la cancérogenèse
 Cancérogénèse
Les premiers pas…

1775 : Percivall Pott décrit une forte incidence des cancers du scrotum chez les ramoneurs.
Mise en évidence de l’effet mutagène des hydrocarbones de la suie plus de 150 ans après

1890 : Description d’une forte incidence des cancers de la peau de la nuque chez les
travailleurs des vignobles du bordelais
Mise en évidence de l’effet mutagènes des UV près de 80 ans après

1910 : Pierre Marie, Jean Clunet et Gaston Raulot-Lapointe publient la première

mise en évidence expérimentale de l’action tumorale des rayonnement ionisants
 Cancérogénèse
Classification

A ce jour le CIRC classifie les cancérigènes en 3 groupes :

Groupe 1 : Cancérigène pour l’homme (95 produits + leurs dérivés)

Groupe 2A : Cancérigène probable pour l’homme (66 produits + leurs dérivés)

Groupe 2B : Cancérigène possible pour l’homme (241 produits + leurs dérivés)

Un produit mutagène est presque systématiquement cancérigène.

L’inverse n’est pas forcément vrai…
D’aprés L. Loeb, Cancer Res, 2001
“Tornade“, X Men 2 “Mystique“, X Men 2