Génétique

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115 032 – 115 033

Français – p 1 Kit transformation génétique

protéines fluorescentes
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Avant de commencer l’expérience

1. Lire toutes les instructions avant de commencer l’expérience.
2. Ecrire l’hypothèse de départ et le résultat escompté.

1 Objectif de l’expérience

L’objectif de cette expérience est de développer une compréhension du

processus biologique de transformation bactérienne par l'ADN de plasmide
pFluorogreen™. Cette expérience permet aux élèves d'observer le caractère
phénotypique de la protéine fluorescente verte ou bleue acquis après la
transformation des cellules bactériennes.

2 Brève description de l’expérience

Dans cette expérience, vous pourrez transformer une souche E. coli, qui n'a
pas de résistance aux antibiotiques, avec l'ADN plasmidique super-enroulé qui
possède un gène de résistance aux antibiotiques. En plus du gène de
résistance aux antibiotiques, le plasmide contient le gène de la pFG dénommé
pFluorogreen™ qui produit la protéine fluorescente verte.*

Les cellules bactériennes contenant l’insert du plasmide seront sélectionnées

par étalement sur un milieu gélosé contenant de l'ampicilline. Seules les
cellules bactériennes transformées par le plasmide survivront à la sélection
sur les boîtes d’agar - ampicilline et produiront des colonies fluorescentes
vertes qui seront visibles sous lumière UV. L'efficacité de transformation
pourra alors être estimée.

**************************************************************************************
Référence : 115 032 : utilise le plasmide pFluogreenTM qui synthétise une
protéine verte fluorescente.

Référence : 115 033 : utilise 2 plasmides pFluogreenTM et pFluoroblueTM qui

synthétise chacun une protéine fluorescente soit verte soit bleue.

FRANÇAIS 1
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Préparation des colonies

Incubation 16 à 18 h

Transférez 2 à 4 des grandes colonies dans chaque tube et

remettez en suspension

ADN plasmidique

Incubez dans la glace

pendant 15 minutes

Incubez à 42°C
pendant 90 secondes

Incubez dans la glace

pendant 2 minutes
Ajouter 250 µl
Bouillon de
récupération

37°C pendant
30 minutes

Témoin Expérience

Incubez une
Incubez une
nuit à 37°C
nuit à 37°C

La lumière UV à grandes
longueurs d’ondes est
nécessaire pour visualiser
les colonies fluorescentes

FRANÇAIS 2
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3 Important ! Prévention des allergies

Les expériences de transformation contiennent des antibiotiques qui sont

utilisés à la sélection des bactéries transformées. Les élèves qui ont des
allergies à la pénicilline, l’ampicilline, la kanamycine ou la tétracycline ne
doivent pas participer aux manipulations.

1. Mettez des gants et des lunettes pour réaliser tous vos travaux dans le
laboratoire.

2. Exercez avec une grande prudence quand vous travaillez

simultanément avec des équipements de chauffage et des mélanges
de réactifs.

3. Ne pas porter les pipettes de réactifs à la bouche – Utiliser des

pipeteurs type propipettes ou micropipettes.

4. La bactérie E-coli utilisée dans l’expérience n’est pas considérée

comme pathogène. Bien qu’E.coli soit rarement associée à des
infections, il est important de suivre les consignes de sécurité en
manipulant et en disposant du matériel contaminé de la bactérie.

5. Disposez correctement le matériel après avoir réalisé l’expérience :

A. Lavez le plan de travail avec 10 % d’une solution d’eau de javel ou
un désinfectant de laboratoire.
B. Tout le matériel, boîtes de Pétri, pipettes, tubes inclus, devront
être nécessairement désinfectés avant d’être mis à la poubelle.
Après avoir utilisé le matériel, le désinfectez suivant l’une des
deux possibilités :
- Autoclavage à 121°C pendant 20 minutes.
Rassemblez les boîtes de Pétri et fermez-les avant de les
disposer. Placez tout le matériel contaminé dans le panier que
vous disposez dans l’autoclave. Fermez le couvercle en
prenant toutes les précautions pour que le milieu du liquide ou
l’agar se répande pas dans la chambre de stérilisation.

- Laissez tremper dans 10 % d’eau de Javel.

Ouvrez les boîtes de Pétri, les tubes et matériels contaminés
et immergez-les dans une cuve contenant 10 % d’eau de
Javel.
Laissez tremper toute une nuit puis retirer. Portez les gants et
les lunettes quand vous travaillez avec l’eau de Javel.

6. A la fin de l’expérience, lavez vos mains avec du savon et de l’eau.

FRANÇAIS 3
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4 Mise en place de l’expérimentation de

transformation et du témoin
1. Etiquetez un microtube « ADN + ». Ce sera le tube de transformation
avec le plasmide pFG.
2. Etiquetez un second microtube « ADN - » . Ce sera le tube témoin
sans plasmide pFG.
Référence : 115 032 : utilise le 3. Utilisez une pipette stérile 1mL, ajoutez 250 µl (0,25 mL) d’une
plasmide pFluogreenTM qui solution CaCI2 glacée dans chaque tube.
synthétise une protéine verte 4. Comme dans un laboratoire de recherches, prélever les colonies
fluorescente. depuis la boîte « souches» E. coli . Utilisez la méthode suivante pour
chaque tube étiqueté « ADN + » et « ADN - » :
Référence : 115 033 : utilise 2 - Utilisez un cure-dent stérile pour transférer chaque colonie (2-
plasmides pFluogreenTM et 4 colonies, approximativement 2-4 mm de grosseur).
pFluoroblueTM qui synthétise - Entre vos doigts, tournez le cure-dent vigoureusement de haut
chacun une protéine en bas dans la solution en déplaçant les cellules.
fluorescente soit verte soit 5. Dans les tubes, remettez les cellules en suspension en tapant ou au
bleue. Vortex.
6. Dans le tube étiqueté « ADN + », ajoutez le mélange : 10 µl of
pFluorGreen (provenant du tube « pFG »)*

« - » tube sans plasmide « + » tube avec plasmide

Une technique Boîte Souches

expérimentale correcte est E. coli
primordiale : le plasmid
ADN (pFluoroGreen) doit
être ajouté directement
dans le tube où les Transférer 2 à 4
grandes
bactéries sont remises en colonies dans
suspension chaque tube de
CaCI2 glacée

Evitez d’arracher l’agar lors du transfert des cellules de la boîte vers les
tubes avec la solution de chlorure de calcium.

FRANÇAIS 4
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7. Incubez deux tubes dans de la glace pendant 15 minutes.

8. Placez les deux tubes à 42°C pendant 90 secondes.

L’étape du choc thermique facilite l’entrée de l’ADN à l’intérieur des
cellules bactériennes.

9. Replacez les deux tubes immédiatement dans la glace pendant 2

minutes.

10. Utilisez une pipette stérile, additionnez 250 µl de milieu de

récupération LB (Luria Broth) dans chaque tube et mélangez.

11. Incubez les cellules pendant 30 minutes à 37°C au bain-marie pour la

période de récupération.

12. Pendant l’incubation, étiquetez 4 boîtes gélosées comme indiqué ci-

dessous. Ecrivez sur le fond ou le côté des boîtes de Pétri.
• Identifier une boîte sans rayure : LB-
• Identifier une boîte sans rayure : LB + (plasmide pFG)
• Identifier une boîte avec rayures : LB / Amp-
• Identifier une boîte avec rayures : LB / Amp + (plasmide pFG)
• Inscrire vos initiales ou votre numéro de groupe

13. Après la période de récupération, enlevez les tubes du bain-marie et

placez-les sur la paillasse. Passez à l'étalement des cellules pour
l'incubation.

Aide-mémoire:
L'ADN et les cellules compétentes sont combinés dans une suspension.
Après que les cellules ont incubé avec l'ADN, un milieu de croissance
(bouillon de récupération) est ajouté. Les cellules antibactériennes continuent
de croître grâce au processus de récupération, au cours de laquelle la paroi
cellulaire est réparée. Les cellules récupérées commencent à exprimer le
gène de résistance aux antibiotiques.

FRANÇAIS 5
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5 Repiquage des cellules bactériennes

Rappel
Suivre les procédures
adéquates pour Repiquage de la cellule avec le tube étiqueté « ADN -» (tube Témoin)
l'élimination des matériaux
contaminés. 14. Utilisez une pipette stérile 1 mL pour transférer les cellules récupérées du
tube étiqueté «- » au centre des boîtes suivantes :

0,25 mL dans la boîte étiquetée LB-

0,25 mL dans la boîte étiquetée LB/ AMP-

15. Répartissez l’ensemble des cellules à la surface de la boîte à l’aide d’un

ensemenceur stérile (voir figure « a »)
16. Refermez les deux boîtes pour permettre au liquide d'être absorbé.

Pour éviter la contamination lors du repiquage, ne laissez pas le couvercle sur

la paillasse de laboratoire. Soulevez suffisamment le couvercle de la boîte
Figure « a » pour permettre l'étalement. Veillez à ne pas creuser la gélose avec l’anse.

Repiquage des cellules bactériennes avec le tube étiqueté « ADN + »

17. Utilisez une pipette stérile 1 mL pour transférer les cellules récupérées du
tube étiqueté «+ » au centre des boîtes suivantes :
0,25 mL dans la boîte appelée LB + (pFG plasmide)
0,25 mL dans la boîte appelée LB/ Amp + (pFG plasmide)

18. Etalez les cellules à l’aide d’un ensemenceur stérile de la même manière
que l’étape n°15.

19. Refermez les deux boîtes pour permettre au liquide d'être absorbé.
(environ 15-20 minutes)

6 La préparation des boîtes pour

l'incubation

20. Empilez votre ensemble de boîtes les unes sur les autres et regroupez la
pile à l’aide d’un ruban adhésif. Mettez vos initiales ou votre numéro de
groupe sur le ruban adhésif.
Les boîtes doivent être laissées à plat pour permettre à la suspension de
cellules d'être absorbée par l’agar.
21. Placez l'ensemble des boîtes dans un endroit sûr désigné par votre
professeur.
22. Une fois la suspension cellulaire absorbée par la gélose, placez les boîtes
retournées (gélose vers le haut) dans un incubateur à 37 ° C pendant une
nuit (15-20 heures).

Les boîtes sont retournées pour éviter la condensation sur le couvercle qui
pourrait couler sur la culture et interférer sur les résultats expérimentaux.

FRANÇAIS 6
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7 Lecture des boîtes après incubation

Rappel 23. Assombrir la pièce et utiliser une lampe UV à grandes longueurs

Suivre les procédures d’onde pour visualiser les cellules transformées qui apparaitront en vert
adéquates pour ou bleu en raison de l'expression de la protéine fluorescente verte ou
l'élimination des matériaux bleue.
contaminés.
Pour visualiser les colonies fluorescentes, la lumière UV à grandes
longueurs d’onde peut être tenue sous les boîtes dans une pièce
sombre. (ex mini lampe UV réf 701 434)

24. Procéder à l'analyse de vos résultats.

8 Résultats et analyse de l’expérimentation

Prise de notes et enregistrements

Ecrire les recommandations suivantes dans votre cahier de laboratoire ou sur
une feuille.

Avant de commencer l'expérience

Ecrire une hypothèse qui reflète l'expérience.
Prédire les résultats expérimentaux.

Au cours de l'expérience
Noter vos observations, dessiner vos schémas ou photographier les résultats.

Après l'expérience
Formuler une explication à partir des résultats.
Déterminer ce qui pourrait être modifié dans l'expérience si l'expérience était à
refaire.
Ecrire une hypothèse de ce que reflèterait ce changement.

Répondre aux questions suivantes avant d'analyser vos résultats

Sur quelle(s) boîte (s) vous attendez-vous à trouver la plupart des bactéries
E-coli non transformées comme l'original ? Expliquez.

Sur quelle(s) boîte (s) pensez-vous trouver les cellules bactériennes

génétiquement transformées ? Expliquez.

Quel est l’intérêt de réaliser des boîtes témoins ? Expliquer la différence entre
chacune et pourquoi il est nécessaire de le faire à chaque fois.

Pourquoi compare-t-on les boîtes LB/amp- et LB/amp+ ?

FRANÇAIS 7
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Collecte des informations

Observez les résultats obtenus sur la boîte de la transformation et sur la boîte
de témoin.

Boîtes transformées : ADN +

• LB +
• LB/ Amp +

Contrôles des boîtes : ADN –

• LB -
• LB/ Amp -

Schématisez et décrivez ce que vous observez. Pour chaque boîte, notez les
informations suivantes :

• Combien de bactéries observez-vous ? Réaliser un comptage.

• Quelles sont les couleurs des bactéries ?
• Pourquoi les résultats sont différents pour chaque groupe de la
classe ? Ont-ils obtenu des valeurs de rendement différentes lors de
la transformation ?
• Si vous n'avez pas obtenu de résultats, quelle peut en être la cause?

9 Détermination de l’efficacité de
transformation

L’efficacité de transformation est une détermination quantitative du nombre de

cellules transformées pour 1 µg d’ADN plasmidique. C’est un indicateur du
rendement de la transformation réalisée.

Vous calculerez l’efficacité de transformation à l’aide des données que vous

aurez collectées pendant l’expérience :

1. Comptez le nombre de colonies sur la boîte avec l’ampicilline

identifiée « LB/ Amp + »
Une méthode pratique pour garder une trace de colonies comptées est :
de marquer les colonies avec un marqueur à l'extérieur de la boîte.

FRANÇAIS 8
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2. Déterminez l’efficacité de la transformation en utilisant cette formule

Nombre de Vol.final de Nombre de

transformants Récupération (ml) = transformants
X
µg d’ADN Vol. étalé (ml) par µg

Exemple pour 40 colonies observées:

40 1600
transformants 0,5 ml = (1,6 x 103)
X
0,05 µg 0,25ml Transformant par µg

Aide-mémoire

50 ng (0,05mg) d’Adn sont utilisés

Le volume final de récupération est de 0,50 ml
Le volume étalé est de 0,25ml

10 Notes pour le professeur

Important à lire

Les expériences de transformation contiennent des antibiotiques qui

sont utilisés pour la sélection des bactéries transformées. Les élèves qui
présentent des allergies identifiées à la pénicilline, l’ampicilline, la
kanamycine ou la tétracycline ne doivent pas participer à cette
expérience.

Organisation et mise en œuvre de l’expérience

Le nombre d’élèves, la durée des séances, et la disponibilité de l’équipement
sont des facteurs à considérer dans le planning et la mise en œuvre de
l’expérience avec les élèves.

Les indications présentées dans ce manuel sont basées sur 10 groupes

d’élèves constitués de 2 à 4 élèves. Voici des directives de mise en œuvre, qui
sont à adapter aux conditions spécifiques de votre laboratoire.

FRANÇAIS 9
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Jour n°1 : (Avant l’expérience)

- Préparer les boîtes d’agar

- Préparer les cellules E. coli
- Distribuer l’ADN et le milieu témoin

Jour n°2 : (Jour de l’expérience)

- Régler les bains marie entre 37°C et 42°C, l’incubateur a 37°C
- Les élèves y déposeront la transformation des cellules et des
boîtes pour une nuit entière

Jour n°3 : (Jour après l’expérience)

- Les élèves observent et contrôlent les transformations
- Les élèves calculent l’efficacité de la transformation
- Suivre les procédures de nettoyage et d'élimination

11 Contenu et compétences standards

Pour réussir cette expérience, les élèves devront développer les compétences
nécessaires pour cette étude scientifique, apprendre de nouvelles techniques
en utilisant plusieurs types d’équipements biotechnologiques, et apprendront
des procédures standards utilisées pour la transformation. L’analyse des
expériences fournira aux élèves des moyens de transformation d’un concept
abstrait avec une explication concrète.

Temps nécessaire approximatif :

1. Préparation des boîtes E. coli : Coulage pour obtenir des colonies
individuelles et incuber à 37°C de 16 à 24 heures avant
l’expérimentation (une nuit d’incubation)
2. Préparation des boîtes d’Agar : les boîtes doivent être préparées
plusieurs jours à l’avance et stockées retournées (l’agar vers le haut)
au réfrigérateur. (1 heure de préparation environ)
3. Distribution de l’ADN et le tampon témoin : cela peut être fait un jour
avant l’expérience et mis au réfrigérateur. (30 minutes de préparation
environ).
4. Réglages de l’équipement : les réglages des températures des bains
marie entre 37° C et 42° C et de l’incubateur à 37°C peuvent
s’effectuer le jour de l’expérience.
5. Transformation et étalement : chaque groupe pourra réaliser
l’expérience de transformation et un ensemble de 4 boîtes de cellules
bactériennes. Cette procédure demande environ 50 minutes de
préparation.
6. Une nuit d’incubation : incuber les boîtes environ 15-20 heures à
37°C. Des colonies supplémentaires apparaîtront entre 24-48 heures
à la température de la pièce.

FRANÇAIS 10
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12 Préparation des boîtes d’Agar (à réaliser

avant l’expérience)

Pour des résultats optimums, préparez les boîtes deux jours avant leur
utilisation et disposez-les retournées à température ambiante de la pièce.

Au-delà de 2 jours de stockage, vous pouvez placer les boîtes retournées au

réfrigérateur. Sortir les boîtes du réfrigérateur 2 jours avant de les utiliser et
placez-les retournées à température ambiante.

Réchauffer le milieu prêt à couler (ReadyPour™)

1. Réglez la température du bain marie à 60 °C.

2. Desserrez, mais ne pas retirez, le bouchon de la bouteille pour

assurer la ventilation durant toute l’opération.
Attention : Si le bouchon n’est pas desserré avant le réchauffage du
milieu (bain marie ou micro onde), il y a risque de casse ou
d’explosion de la bouteille.

3. Pressez et secouez vigoureusement la bouteille en plastique pour

briser la gélose solide dans le fond.

4. Faites réchauffer la bouteille en plastique par une des méthodes

décrites (bain marie ou micro onde). La solution deviendra couleur
ambrée et fera apparaître des petites particules.
A. Méthode micro-ondes :
Chauffez la bouteille deux fois à 30 secondes d’intervalle.
Utilisez des gants anti-chaleur, secouez et chauffez pendant 25
secondes, ou jusqu’à ce que tout soit dissous.
A nouveau, utilisez les gants anti-chaleur, secouez
occasionnellement pour accélérer la fonte.
B. Plaque chauffante ou bec (bunsen, électrique)
Placez la bouteille dans un bécher partiellement rempli d’eau.
Chauffez le bécher jusqu’à ébullition sur la plaque chauffante ou
sur le bec.
Utilisez des gants anti-chaleur, secouez occasionnellement pour
accélérer la fonte.

5. Laissez le mélange refroidir. Placez la bouteille à 60 °C dans le bain

marie pour refroidir l’agar, tout en empêchant une solidification
prématurée.
A 60 °C, la bouteille sera chaude mais pas brûlante.

FRANÇAIS 11
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13 Identifier les boîtes à « rayures»

6. A l’aide d’un marqueur de laboratoire, réalisez des rayures sur les

côtés de vingt boîtes de Pétri 60 x 15 mm. Cette méthode permet de
distinguer rapidement les boîtes avec l'ampicilline et les boîtes sans
ampicilline.
• Ouvrez un sachet de 20 boîtes et empilez les boîtes avec
soin.
• Commencer le marquage verticale sur le coté de la pile des 20
boîtes du bas vers haut.
• Ces boîtes seront utilisées pour le milieu avec l’ampicilline.
• Ne pas marquer le second sachet de boîtes. Elles serviront de
boîtes témoin.

14 Coulage des boîtes

Nota : Une bouteille de milieu « ReadyPour » permet de préparer les 5 boîtes

« souches», 20 boîtes témoin et 20 boîtes Amp.

7. Coulez les 5 grandes boîtes « souches » destinées à la mise en

culture d’E.coli
Utilisez une pipette de 10 mL avec pompe pour verser 10 mL de
milieu prêt à couler (ReadyPour™) sans ampicilline dans les 5 boîtes
souches.
8. Ajoutez l’IPTG dans la bouteille de milieu prêt à couler (à froid).
Refermez la bouteille et secouez afin de mélanger l’IPTG.
9. Coulez les 20 boîtes témoins (pas d’ampicilline, pas de marquage) :
Utilisez une nouvelle pipette de 10 mL (ou la même pipette utilisée à
l’étape 7) avec pipeteur pour couler les 20 boîtes témoins, 5 mL dans
chaque avec ReadyPour™ sans ampicilline.

Aide-mémoire : le coulage d’un milieu de culture type agar dans des

boîtes de Pétri
• Utilisez une pipette stérile de 10 mL munie d’un pipeteur pour
transférer le volume dans chaque boîte de Pétri. Maniez la pipette
avec précaution pour éviter la formation de bulles.
• Remuez délicatement la boîte de Pétri d'avant en arrière pour obtenir
une couverture complète.
• Si le milieu fondu contient des bulles, elles peuvent être supprimées
en passant une flamme sur la surface du milieu.
• Couvrir la boîte de Pétri et laisser le milieu se solidifier.

FRANÇAIS 12
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10. Ajoutez la totalité de l’ampicilline en poudre avec le milieu à couler

restant dans la bouteille.

11. Refermez la bouteille et secouez pour bien mélanger l’ampicilline.

12. Pour 20 boîtes de transformations :

(avec ampicilline, boîtes à rayures)
Utilisez une nouvelle pipette stérile de 10 mL pour couler le 20 boîtes ,
5 mL dans chaque.
Rappel
Suivre les procédures 13. Laissez l’Agar refroidir et se solidifier.
adéquates pour
l'élimination des matériaux Nota : si vous utilisez les boîtes dans les 2 jours suivants, stockez-les dans un
contaminés. emballage hermétique imperméable pour qu’elles restent sèches (sans
condensation interne). Retourner-les et stocker à température ambiante.

Si vous avez d’autres boîtes stériles à portée de main, utilisez le reste de

milieu de culture dans ces boîtes pour l'activité facultative décrite à la page 28

Résumé des boîtes versées

5 boîtes souches (grandes boîtes) : 10 mL dans chaque

20 boîtes témoin (petites boîtes sans rayures) : 5 mL de milieu de culture avec

de l’IPTG (pas d’ampicilline) dans chacune.

20 boîtes pour transformation (petites boîtes avec rayures) :5 mL de milieu de

culture avec de l’IPTG et ampicilline dans chacune.

FRANÇAIS 13
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15 Mise en oeuvre
15.1 Le jour précédent l’expérience

Ce TP demande 16-24 heures avant l’expérimentation la préparation de

colonies isolées d’E. coli qui recevront la transformation donc à intégrer
à votre planification.

Important : ne pas préparer les boîtes souches plus de 18 heures avant

l’expérience. Des souches trop anciennes compromettraient la réussite
de la transformation.

Préparation des cellules E. coli

1. Utilisez une pipette stérile afin d’ajouter 2 mL de milieu reconstituant

pour cellule dans le flacon de souches lyophilisées (LyphoCells).

2. Remettez le ruban hermétique et rebouchez. Mélangez en retournant

doucement jusqu'à ce que l’agglomérat lyophilisé soit dissous.

3. Incubez le flacon des cellules pendant 30-60 minutes à 37°C dans

l’incubateur.
La croissance doit être incontestable (le bouillon doit être légèrement
trouble ou voilé). Si la croissance n'est pas sûre, incubez sur une
période plus longue.

4. Transférez 50-75 µl de cellules dans chaque boîte souche et étalez les

cellules avec un ensemenceur stérile sur un premier quart de la boîte
puis tourner comme indiqué sur le schéma. (voir figure « b »)

Figure « b »

Figure « c »

5. Avec la même boucle (ensemenceur), étalez à la perpendiculaire les

cellules ou sur un autre endroit de la boîte (figure « c ») pour réussir à
isoler les cellules.

6. Appelez ces boîtes «E. coli », retournez et incubez les boîtes une nuit
(16-18 heures) à 37°C dans l’étuve.
Si la croissance sur des boîtes est trop importante (c’est à dire peu ou
pas de colonies apparaissent isolées), demandez aux élèves de
récupérer à l’aide de la pointe d’un cure-dent seulement une petite
quantité de cellules.

FRANÇAIS 14
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15.2 Le jour de l’expérience

1. Répartissez 1 ml de CaCI2 dans les microtubes à centrifuger pour

chacun des 10 groupes et mettez-les dans la glace.

2. Répartissez 1,5 ml du bouillon de récupération (Luria Broth médium –

« recovery broth ») dans des tubes pour chacun des 10 groupes et
conservez à température ambiante.

Autre possibilité, le flacon du bouillon de récupération (Luria broth) peut

être placé en un lieu commun pour le pipetage par les élèves.

15.3 Préparation de l’ADN

3. Etiquetez 10 tubes « pFG » ou « pFB »
4. Placez les tubes qui vont recevoir le plasmide pFluoroGreen dans de
la glace.
5. Avant de distribuer l’ADN, tapotez les tubes jusqu’à ce que
l’échantillon soit au fond du tube.
6. Utilisez une micropipette automatique, distribuez 12 µl d’ADN super-
enroulé dans chaque tube microtest appelé « pFG » ou « pFB ».
Note : les élèves utiliseront 10 µl pour chaque transformation de
l’expérience.
7. Rebouchez les tubes et placez-les dans la glace.

Chaque groupe dispose

- une des 5 boîtes E.
coli« souches » en partage
- 1 tube (1 mL) CaCl2
- 1 tube d’ADN plasmidique
- 2 boîtes rayées
- 2 boîtes non rayées
- 4 pipettes stériles 1 mL
- 2 ensemenceurs stériles
- 1 tube stérile 1,5 mL « milieu
de récupération »

Equipement pour la classe

- Bain marie
- Etuve

FRANÇAIS 15
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16 Activité optionnelle
Ne pas jeter les tubes contenant les bactéries transformées. Après avoir étalé
une partie sur des boîtes sélectives, ajoutez 50 µl d’un bouillon de
récupération aux tubes et placez-les dans un support.
Laissez-les sur la paillasse durant une nuit.

Si pour quelconque raison, la transformation ne s’effectue pas sur la sélection

des boîtes, les cellules restantes peuvent être étalées comme ci-dessous :

1. Centrifugez dans une micro centrifugeuse et récupérez le disque de

cellules bactériennes. Si la micro centrifugeuse n’est pas disponible,
laissez reposer et sédimenter les cellules bactériennes.
2. Supprimez tout sauf 50 µl du milieu. (couche supérieure)
3. Mettez en suspension les pastilles des cellules restantes.
4. Etalez tout le contenu du tube sur un milieu sélectif.
5. Incubez la boîte comme précédemment, 16-24 heures à 37°C en
incubateur.
6. Suivez ensuite les procédures nécessaires pour le nettoyage du
matériel contaminé.

17 Résultat et analyse (correction)

Répondez à ces questions avant d’analyser vos résultats

Sur quelle(s) boîte (s) vous attendez-vous à trouver la plupart des bactéries
E-coli non transformées comme l'original ? Expliquez.
Les bactéries de la boîte marquée LB- seront identiques à la souche de départ
de la boîte d’ E. coli parce qu'aucun plasmide n’a été ajouté à ces cellules,
mais ont été ré-étalées sur une boîte LB.

Sur quelle(s) boîte (s) pensez-vous trouver les cellules bactériennes

génétiquement transformées ? Expliquez.
Les bactéries se développant sur la boîte marquée LB/amp+ seront
génétiquement transformées car seules les cellules ayant acquis le plasmide
peuvent survivre car sur le plasmide le gène de résistance à l’ampicilline
s’exprime ainsi que le gène fluorescence qui permet de les visualiser.

Quel est l’intérêt de réaliser des boîtes témoins ? Expliquer la différence entre
chacune et pourquoi il est nécessaire de le faire à chaque fois.
Les boîtes de Pétri témoin aident à interpréter les résultats expérimentaux. Il y
3 boîtes témoin pendant l’expérience.
Les boîtes témoins nommées LB/ Amp- montrent que les bactéries
E-coli sans plasmide ne peuvent pas être cultivées en présence d’ampicilline.
Les boîtes de Pétri appelées LB- montrent que les cellules sans
plasmide peuvent se développer sur un milieu gélosé sans ampicilline.
Les boîtes de contrôle LB+ montre que les cellules ne sont pas
endommagées pendant la procédure de transformation et par conséquent,
sont capable de se développer sur milieu gélose sans ampicilline.

FRANÇAIS 16
Génétique
Kit transformation génétique protéines fluorescentes
Ref :
115 032 – 115 033

Pourquoi compare-t-on les boîtes LB/amp- et LB/amp+ ?

Les cellules E.coli non traitées avec l’ADN plasmidique ne seront pas
capables de croître sur un milieu avec ampicilline LB/amp- parce qu’elles
n’expriment pas le gêne de résistance à ampicilline. A contrario, les cellules
E.coli traitées avec le plasmide se développeront sur les boîtes LB/amp+
parce qu’ils n’expriment pas le gêne de résistance à ampicilline.

« LB-» boîtes ensemencées avec des bactéries E.coli témoins (pas

d’ADN plasmidique)

Résultat : pas de cellules fluorescentes visibles

Colonies blanches.
Peut ressembler à une couche de colonies « tâchée ».

Interprétation :
Les cellules bactériennes hôtes sont viables en l'absence d'ampicilline.

« LB/ Amp –» boîtes ensemencées avec des bactéries E.coli témoins

(pas d’ADN)

Résultat : pas de croissance

Interprétation :
Les bactéries E.coli sont sensibles à l’ampicilline.
Sans pFluoroGreen™, elles ne sont pas résistantes à l’ampicilline.

« LB + » boîtes avec cellules

Résultats : colonies blanches.

peut ressembler à une couche de cellules barbouillées.

Interprétation :
Les bactéries E.coli non transformées et transformées sont toutes viables en
l'absence de l'ampicilline. La majorité de la croissance sont les cellules non
transformées et donc dominent les cellules fluorescentes transformées.

« LB/ Amp + » boîtes avec des cellules

Résultats :
Les colonies individuelles deviennent fluorescentes lorsqu’elles sont exposées
à grande longueur d’ondes : les UV.

Interprétation :
Transformation de bactéries résistantes à l’ampicilline due à l'intégration du
plasmide pFluoroGreen. Les bactéries hôtes non transformées ne se
développent pas en présence d'ampicilline.

FRANÇAIS 17
Génétique
Kit transformation génétique protéines fluorescentes
Ref :
115 032 – 115 033

18 Service après vente

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