Introducción

En la primera mitad del siglo XX los métodos de purificación proteica eran en extremo
crudos comparados con los estándares de la actualidad. La purificación de las proteínas
era una tarea ardua que tenía tanto de arte como de ciencia. En general, el desarrollo de
un procedimiento satisfactorio de purificación para una proteína determinada era cuestión
de años de trabajo con cantidades enormes de material de partida. No obstante, para 1940
se habían obtenido en forma pura unas 20 enzimas. Desde entonces se purificaron y
detallaron en distinto grado decenas de moles de proteínas. Las técnicas modernas de
separación tienen tal grado de discriminación que uno puede obtener en cantidad una serie
de proteínas con propiedades tan similares que hace unos pocos años su mezcla se
consideró una sustancia pura. No obstante, el desarrollo de un procedimiento eficiente de
purificación de una proteína dada puede ser todavía un desafío intelectual y demandar
mucho tiempo (G.Voet, 2004)
Las proteínas se purifican por procedimiento de fraccionamiento. En una serie de pasos
independientes, las propiedades fisicoquímicas de la proteína de interés se aprovechan
para separarla de manera progresiva de otras sustancias. La idea no es necesariamente
minimizar la perdida de la proteína, sino eliminar en forma selectiva los otros componentes
de la mezcla, de manera que solo quede la sustancia requerida (MacFaddin, 2003)
En 1926 Sumner cristalizo ureasa en forma pura, y demostró que las proteínas pueden
tener actividad catalítica de enzimas (Bruce Alberts, 2013).
La ureasa, enzima número 3.4.1.5 en la Unión Internacional de Bioquímica, cuyo nombre
sistemático es amidohidrolasa de urea, tiene un peso molecular de 483000 Dalton. La
ureasa consta de seis subunidades estructurales iguales. Es una enzima muy específica,
que existe en varios tipos de tejidos vegetales; por ejemplo, en el frijol de soya (H.Herrera,
2003).Esta enzima Cataliza la hidrólisis de la urea produciendo gas carbónico, hidróxido de
amonio (Granados, 2001) según la reacción
(1)

Por ello se utiliza mucho como agente catalítico para la medición cuantitativa de urea. El
hidróxido de amonio que se forma en una base puede titularse con ácido clorhídrico y puede
relacionarse, estequiométricamente, con la cantidad de urea presente en una muestra y así
cuantificarla (H.Herrera, 2003).La reacción de neutralización es:
(2) NH4OH + HCl → NH4Cl + H2O
En el presente trabajo esta parte experimental se utilizó para determinar la actividad
enzimática, definida como cantidad de producto formado o cantidad de sustrato degradado
por unidad de tiempo.
Para obtener la concentración de urea presente en los extractos se utilizó el método de
Bradford donde se emplea un colorante hidrofóbico cuyas disoluciones acuosas en
presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo y que, al encontrarse en el entorno
hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul intenso desplazando el máximo
de absorbancia de 465nm a 595nm.Este ensayo requiere un solo reactivo y unos 5 minutos,
comparado con el ensayo de Lowry que requiere 3 reactivos y 40 minutos. Los detergentes
y los pH alcalinos interfieren con el ensayo (Morales, 2001).
Un gran número de métodos bioquímicos requieren del uso de marcos de referencia para
calcular las concentraciones de las muestras problema. Estos marcos de referencia tendrán
una concentración conocida y mediante una extrapolación de la curva estándar se podrá
determinar la concentración del compuesto que contiene la muestra problema. En el caso
de proteínas se realiza la curva patrón de suero albumina de bovino (UNAM, 2005)
Para determinar el éxito de un protocolo de purificación de proteínas, se puede controlar en
cada paso el procedimiento midiendo los siguientes parámetros:
Proteína total. La cantidad de proteína presente en una fracción se obtiene determinando
la concentración de proteína en una alícuota de cada fracción y multiplicándola por el
volumen total de la fracción.
Actividad total. La actividad enzimática de la fracción se obtiene midiendo la actividad
enzimática en una alícuota de cada fracción multiplicándola por el volumen total de la
fracción.
Actividad específica. Este parámetro se obtiene dividiendo a actividad total por la proteína
total.
Rendimiento. Este parámetro es una medida de la actividad existente después de cada
paso de purificación expresada como porcentaje de la actividad del extracto crudo. La
actividad del extracto inicial se toma como el 100%.
Grado de purificación. Este parámetro mide el incremento en pureza y se obtiene dividiendo
la actividad específica, calculada después de cada paso de purificación, por la actividad
específica del extracto inicial (Berg., 2007)

Objetivo general
Determinar el grado de purificación de la enzima ureasa a partir de frijol de soya mediante
la evaluación de la actividad catalítica y la concentración.

Objetivos específicos
 Extraer la ureasa del frijol de soya mediante los solventes orgánicos etanol y
acetona.
 Determinar la actividad enzimatica de la ureasa de los extractos etanólicos y
acetónicos mediante la titulación con ácido clorhidrico
 Cuantificar la ureasa contenida en el extracto etanólico y acetónico mediante el
método de Bradford
Metodología

Preparación de soluciones

 30 mL de alcohol etílico al 30%: Se agregaron 9 ml de alcohol absoluto en un matraz

aforado de 50 ml y se agregó 21 ml de agua destilada.

 50 mL de urea 0.25 M: Se agregaron 20 ml de agua destilada en un matraz aforado

de 50 ml y se agregó 750.75 mg de urea y se homogenizó. Luego se aforó a 50 ml
con agua destilada.

 50 mL de buffer de fosfatos 100 mM, pH 7.2.Se realizaron dos soluciones (A y B).

Solución A(NaH2PO4 0.2M):Se disolvieron 27.6 g de NaH2PO4.H2O en agua
destilada, completando un litro.
Solución B(Na2HPO4: Se disolvió 53.65 g de Na2HPO4.7H2O en agua destilada,
llevando el volumen final a 1 litro.
Se mezclaron 140 ml de solución A y 360 ml de solución Luego se aforó a 1 litro con
agua destilada.Se tomaron 50 ml de la solución final en un matraz aforado de 50ml.

 5 mL de Hg (NO ) 1.0 mM. Al carecer de este reactivo se sustituyo por nitrato de

2 3 2

plata, el cual se preparó mezclando 169.87 mg de nitrato de plata en 1 litro de agua

destilada. Luego se tomó 5 ml de esa solución y se almacenó en un matraz aforado
de 10 ml.

 100 mL de HCl 0.1 M. Se tomaron 0.306 ml de HCl y se aforó a 100ml con agua
destilada.

Bioseparación de ureasa de frijol de soya

Se pesaron 10g de frijol de soya y se molió en un molino de cuchillas con malla #20.
Después se agregó 30 ml de alcohol etílico al 30% y se agitó en baño de hielo la mezcla
durante una hora. Luego se filtró(Whatman #41) la mezcla resultante al vacio.Se recogió el
filtrado y de éste se almacenaron 2 ml a 4°C,al resto se le agregó 50 ml de acetona.
Seguidamente se centrifugó a 3000RPM por 30 minutos. Se decantó el líquido
sobrenadante y se disolvió el precipitado con 10ml de buffer fosfatos 100mM,pH 7.2.

Actividad enzimática de la ureasa

Se prepararon tubos de acuerdo a la siguiente tabla
 Tabla 1:Cantidades de reactivos y pasos necesarios para medir
la actividad de la ureasa

Reactivo EE EA C+ B
Urea 0.25 M (mL) 7.5 7.5 7.5 7.5
Buffer fosfatos 100 mM, pH 7.2 (mL) 4.5 4.5 4.5 4.5

Incubar 5 minutos, todos los tubos, a 50 C 0

Muestra (mL) 1.5 1.5 1.5 1.5

Incubar 30 minutos, todos los tubos, a 50 C 0

Hg (NO ) 1.0 mM (gotas)

2 3 2 4 4 4 4

EE(2)= Extracto Etanólico(diluído 1:10 y 1:100), EA = Extracto con Acetona(crudo y diluído 1:10), C+
= Control positivo (ureasa comercial)
y B = Blanco (agua destilada).

Se transfirió el contenido de cada tubo a un matraz Erlenmeyer de 25ml y se agregó 5 gotas

de indicador (azul de metileno y rojo de metilo). Después de valoró con una disolución de
HCl 0.1M, agitándose constantemente el matraz para apreciar mejor los cambios del
indicador que señaló el punto final (cambio de verde limón a fuscia). Luego se anotó el
volumen de HCl utilizado en la muestra para cada matraz y se restó el volumen de cada
blanco al resultado anterior. Finalmente se representó la cantidad de sustancia de urea
hidrolizada (mmol)/mL/minuto en función del volumen (mL) de extracto de harina de soya
empleados.

Cuantificación de proteínas

 Curva estándar de proteína

Se realizó una curva estándar de albúmina sérica bovina hasta una concentración máxima
de 100ug/mL en intervalos de 10ug, de acuerdo a la tabla siguiente y por triplicado.

Tabla 2.- Cantidades de reactivos para la cuantificación de proteínas.

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Concentración
ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL

BSA 1 mg/mL
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
(uL)

Buffer fosfatos
100 mM, pH 500 495 490 485 480 475 470 465 460 455 450
7.2 (mL)

* cada columna es un tubo, se preparó tres tubos por columna para hacerlo por triplicado
  Reacción de Bradford (Curva estándar y muestras):

Se preparó cada tubo de la curva estándar y de las muestras de acuerdo a la

siguiente tabla:

Tabla 3. Preparación de tubos para la reacción de Bradford.

Tubo Volumen adicionar

Curva estándar ó Muestra * 500 uL

Reactivo
500 uL
Bradford

* Las muestras son EE, EA, C+ y B

Se agitó invirtiendo los tubos suavemente, procurando no hacer espuma. Luego se

incubó al menos 5 minutos(no más de 1 hora) en oscuridad a temperatura ambiente.
Se adicionó la mezcla de cada tubo a una celda cuadrada desechable de metacrilato
y se realizó la lectura en espectrofotómetro a 595nm

Resultados

Ilustración 1: Muestras tituladas con HCl

2 tablas (el típico de biosep y los datos de la titulación)y dos graficas(actividad
especifica y curva estándar)
Tabla típica de biosep

Actividad Proteína Actividad Factor de

Muestra Rendimiento
(nkat) (mg) específica Purificación

EC A 1 P1 100 A1/P1 1.0

EE A 2 P2 100(A2/ A1) A2/P2 [A2/ P2]:[A1/ P1]

Para Actividad(nkat):
(VR)(13.5ml) U= umol/min 1kat=60x106 U 1x10-9kat=1nkat

Muestra ml HCL ml HCl Volúmen ml ureasa VR

consumidos corregidos total(ml)
EE 13.5
EA
blanco

Tabla de datos de biosep: muestras,ml HCL consumidos,ml HCL corregido(restando

blanco),volumen total(13.5ml),ml ureasa se obtiene asi conc ureasa(de curva estándar)*L de
extracto(1.5x10-3) / densidad ureasa(1340 g/L) osea ([ureasa]*1.5x10-3)/1340g/L. se
obtendrán los litros de ureasa, convertirlo a ml.
Gráfico de actividad espécifica:
´´Representar la cantidad de sustancia de urea hidrolizada (mmol)/mL/minuto en función
del volumen (mL) de extracto de harina de soya empleados´´
Yo creo que se grafica VR por ml ureasa.

Fórmula para el cálculo de velocidad de reacción:

VR= (ml HCl consumidos * molaridad del HCl)/(2* ml totales del tubo *30 min)
VR=(( ml HCL consumidos * 0.1M) / (2*13.5ml*30 min)
(--molaridad de HCl= 0.1M ---es 2 por la estequiometria de la reacción ---Ml totales del tubo=
7.5+4.5+1.5 =13.5ml ---tiempo de reacción:30 minutos)
Solo falta los ml HCL consumidos y se obtiene así:
mL consumidos=ml gastados menos los ml gastados en el blanco

La VR va en el eje Y.

En el eje X creo que va la cantidad de ureasa, se obtiene multiplicando la

concentración de ureasa(obtenida del grafico de albumina) por el volumen
agregado(1.5ml).o bien se pone la concentración de ureasa en el eje X, la
neta nose.
(se que dice que grafiquemos en función del volumen (mL) de extracto de harina de
soya empleados(eje x),pero usamos siempre 1.5 ml de extracto y eso nos daría el grafico
una línea vertical (hacia arriba) y eso no sirve de nada)

Discusión

Parte de la titulación
La ureasa posee 3 o 4 grupos sulfhidrilos activos, siendo un representante de un gran
número de enzimas cuya actividad depende de la existencia de grupos -SH intactos
formando parte de la cadena peptídica de la enzima como cisteína. (Tangarife, 2008)
La oxidación de estos grupos puede ocasionar una inactivación reversible de la enzima. Por
ejemplo:

(3)

Estas formas E—S—S—E inactivas muy probablemente pueden ser reactivadas mediante
el efecto de compuestos ricos en -SH, como el glutatión o la cisteína pero una alteración
más estable, en particular en el caso de la ureasa, es la reacción de los grupos -SH con
ciertos iones de metales pesados como Hg++, Ag+ o Cu++, formando una mercáptida:
(4)
Los principales inhibidores de su actividad enzimática son los iones metálicos pesados tales
como la plata (Ag+1) el mercurio (Hg+2) e igualmente el ácido hidroxámico y la tiourea.
En los dos experimentos realizados se tituló con HCl y de acuerdo al volumen utilizado de
este se pudo calcular los moles de urea hidrolizados. Esto fundamentado en lo que presenta
“Mora”. Dado que la molaridad es igual a mol/L, o mmol/ml, para obtener el número de
milimoles de HCl que neutralizan el NH4OH, se multiplican los ml de HCl que se consumen
por la molaridad del HCl utilizado (0.1M).
Según la estequiometría de la reacción de neutralización, un milimol de HCl neutraliza un
milimol de NH4OH, lo que implica que el número de milimoles del ácido es igual al de
milimoles de hidróxido. De acuerdo con la estequiometría de la reacción de hidrolisis, a
partir de un milimol de urea se producen dos milimoles de NH4OH; entonces, la cantidad de
milimoles de HCl que neutralice el NH4OH producido representa el doble de milimoles de
urea hidrolizada (Mora, 2007).
Este mismo autor también indica que el HCl utilizado en el blanco reacciona con el buffer
de fosfatos, y el volumen utilizado se resta a cada una de las muestras del experimento
para que solo aparezca en los cálculos la cantidad de HCl utilizado para reaccionar con el
cloruro de amonio.
La solución indicadora que se emplea en la titulación consiste en una mezcla de rojo metilo
y azul de metileno. El rojo de metilo es propiamente el indicador, que vira cuando el
hidróxido de amonio es neutralizado por el ácido clorhídrico; en su punto de viraje, a un pH
de 5.5, pasa de un color amarillo a rojo. El azul de metileno se utiliza como medio de
contraste, de tal forma que la solución vita de un color verde limón a fucsia, y se observa
mejor el cambio de color. (Véase ilustración 1)

Parte del gráfico de la titulación

En la gráfica 2 se muestra el comportamiento que donde la velocidad de la reacción en
función de (la concentración de la enzima o ml de enzima) tiene un carácter lineal, o sea,
que esas dos magnitudes son directamente proporcionales. La obtención de una línea recta
que pasa por el origen de coordenadas indica que existe una proporción directa entre la
velocidad de la reacción y la concentración de la enzima. Esta relación constituye todo el
fundamento de los estudios cinéticos (Cardellá, 2007).Pero esto solo es válido en presencia
de un exceso de sustrato (A.Fersht, 1986), (José Bermejo, 2004)
Falta discutir parte de la cuantificación, los rendimientos y factores de purificacion
obtenidos(relación con la extracción realizada,etc..)

Conclusión
Bibliografía
A.Fersht. (1986). Serie de biología fundamental: estructura y mecanismo de los enzimas. Editorial
reverté S.A.

Berg., J. (2007). Bioquímica. Editorial Reverté.

Bruce Alberts, D. B. (2013). Introducción a la biología celular. Editorial Médica Panamericana.

Cardellá, H. (2007). Bioquímica humana. Ciencias médicas.

Carlos H.Herrera R., N. B. (2003). Química de alimentos. Editorial de la Universidad de Costa Rica.

G.Voet, J. (2004). Bioquímica. Editorial Médica Panamericana.

Granados, J. (2001). Cinética enzimática de la ureasa. UNAD.

José Bermejo, S. G. (2004). Manual del técnico superior de laboratorio de análisis clínicos. MAD.

MacFaddin, J. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia

clínica. Editorial Médica Panamericana.

Mora, S. Q. (2007). Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica. EUNED.

Morales, J. C. (2001). Técnicas de diagnóstico en virología. Diaz de Santos.

Tangarife, R. D. (2008). Guía para prácticas de laboratorio de bioquímica. UNAD.

UNAM. (2005). Prácticas de bioquímica. Facultad de Odontología.