FBCB-UNL Bioquímica Básica de Macromoléculas Guía de coloquios 2020

Enzimas, generalidades

1. ¿Qué es un catalizador? ¿Por qué aumenta la velocidad de reacción? ¿Es posible

aumentar la constante de equilibrio de una reacción utilizando un catalizador?
Ejemplifique cómo puede actuar un catalizador químico.

2. ¿Qué son las enzimas? ¿Qué son los cofactores y los grupos prostéticos de enzimas?
¿Qué tipos de compuestos actúan como cofactores? ¿Qué entiende por apo- y holo-
enzima?

3. Describa las características más relevantes de las enzimas como catalizadores. ¿Cómo
es la interacción enzima sustrato? ¿Qué efectos catalíticos se producen en el sitio
activo?

4. ¿Qué significan los números que identifican a una enzima de acuerdo a la

nomenclatura de la “Comisión de Enzimas” (Enzyme Commission) “Comité de
Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular”
[Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular
Biology (NC-IUBMB)]. ¿Qué reacción catalizan las enzimas cuyas tres primeros
números de código son EC 2.7.7....?

5. Trace un perfil de energía en función de las coordenadas de reacción para una

reacción catalizada, y explique su significado. Compare con una reacción no catalizada.

Purificación de proteínas

1. La obtención de una proteína en forma pura, ya sea desde una fuente natural o
expresada en una célula huésped transformada con un vector adecuado que la codifica,
¿requiere tareas previas a las específicas de purificación? ¿Cuáles son las mismas?

2. Describa la propiedad más importante por la que se puede separar a las

macromoléculas con cada método separativo.

3. ¿Qué determinaciones experimentales debe realizar para efectuar el seguimiento del

proceso de purificación y recuperación de la proteína en cada paso y cómo construye con
esos datos una tabla de purificación?

4. ¿Qué tipo de métodos conoce para realizar medidas de actividad enzimática?

5. Enumere todos los recaudos que debe tomar para realizar una medida de actividad
enzimática en forma adecuada.

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6. ¿Qué procedimientos conoce para realizar la extracción de la proteína a purificar
desde el tejido o la célula?

7. Si tiene un cultivo celular del que desea purificar una proteína intracelular. a) Explique
qué procedimientos realizaría para obtener un extracto crudo en el que se encuentre
soluble la proteína. b) ¿Qué procesos de fraccionamiento (no cromatográficos) aplicaría
en las primeras etapas para purificar parcialmente la proteína? c) Suponga que la
estrategia de purificación del extracto crudo obtenido en el punto anterior consiste en un
fraccionamiento salino con sulfato de amonio (al 70% de saturación), seguido de una
cromatografía de intercambio iónico. Si luego de realizado el fraccionamiento salino
obtiene la proteína de interés en el precipitado, ¿qué pasos previos y por qué debería
efectuar antes de sembrar la muestra en la columna de cromatografía de intercambio
iónico?

8. ¿Hasta cuándo sigue realizando pasos de purificación de una proteína? ¿Cómo puede
estimar el grado de pureza alcanzado por un dado protocolo de purificación?

Problemas
[Salvo que se indique expresamente algo diferente, una unidad de actividad enzimática
(U) es la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato, o la
aparición de 1 µmol de producto por minuto, en las condiciones especificadas en cada
caso]

1. Se desea determinar la actividad enzimática de una acetilsalicilato deacetilasa (EC

3.1.1.55) de hígado de camello (Camelus dromedarius) presente en 1,5 ml de una
muestra a pH 7,3 y conteniendo 12,5 mg/ml de proteína. La enzima cataliza
preferentemente la reacción:

acetilsalicilato + H2O  salicilato + acetato

La actividad de la enzima puede ensayarse con el sustrato alternativo para-nitro-fenil-

acetato (pNPA):

Así, la actividad puede ensayarse por un método continuo, ya que el pNP absorbe a 405
nm, con un Ɛ405 nm = 18,0 mM-1.cm-1

Al ensayar la actividad enzimática con 10 µl de una dilución 1:50 de la muestra, en un

medio 50 mM Tris-HCl pH 8,1 conteniendo 5 mM MgCl2 y 2 mM pNPA en un

2
volumen final de 0,5 ml, se obtuvo un ∆Abs405nm de 0,36 (utilizando una cubeta de 1 cm
de camino óptico) luego de 2 min de reacción.

a) Calcular la actividad específica y las unidades por ml de la enzima en la muestra.

b) ¿Cuántas U de acetilsalicilato deacetilasa hay en la muestra?
c) ¿Podría haber realizado el ensayo utilizando las mismas condiciones pero sin diluir la
muestra? Justifique su respuesta.
d) ¿Qué valor de ∆Abs405nm se obtendría al cabo de 10 min de reacción si se ensayara la
actividad con 25 µl de una dilución 1:100 de la muestra?

2. La fructosa-bisfosfato aldolasa (EC 4.1.2.13) es una enzima ubicua, que se encuentra

en organismos procariotas y eucariotas, tanto autotróficos como heterotróficos y cataliza
la ruptura de la fructosa-1,6-bisP (Fru1,6P2) con producción de gliceraldehído-3P
(Ga3P) y dihidroxiacetona-P (DHAP) según la reacción:

Fru1,6P2  Ga3P + DHAP

Una de las funciones biológicas principales de la enzima es la de estar involucrada en el

metabolismo glucolítico. La medida de actividad de la aldolasa puede realizarse por un
método continuo acoplado a las sucesivas reacciones de la triosa-P isomerasa (TPIasa):

DHAP  Ga3P

y de la Ga3P deshidrogenasa (Ga3PDHasa) fosforilante (que se desacopla por el

agregado de arseniato en lugar de fosfato):

Ga3P + NAD+ + arseniato  3P-glicerato + NADH + H+

Utilizando este método, se ensaya a 30 ºC la actividad enzimática de una muestra de

aldolasa de hepatocito de oso pardo. El medio de ensayo tiene un volumen final de 3 ml
(en una cubeta de espectrofotómetro de 1 cm de camino óptico) y contiene 50 mM
Mops-NaOH pH 7,5, 5 mM Fru1,6P2, 5 mM MnCl2, 2 mM NAD+, 5 U de TPIasa, 2 U
de Ga3PDHasa y 10 mM arseniato. Se realiza la medida con 20 µl de una dilución
1:200 de la muestra y se obtiene un ∆Abs340nm de 0,311 luego de 3 min de reacción. [El
Ɛ340 nm del NADH es de 6.220 M-1.cm-1]

a) ¿Cuál es la actividad de la aldolasa por mililitro de la muestra?

b) Si la actividad específica de la aldolasa en la muestra fuera de 125 U/mg, ¿cuál sería
la concentración de proteína en la misma?
c) Si se realizara el ensayo en idénticas condiciones (incluso de pH 7,5) pero el medio
careciera de buffer, ¿cuál sería el pH final luego de los 5 min de reacción?
d) Si el ensayo se realizara en idénticas condiciones, pero se utilizara la muestra de
aldolasa sin diluir, ¿qué ∆Abs340nm esperaría determinar luego de los 30 s de reacción?

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3. La enzima cistationina β-liasa (desaminante) (EC 4.4.1.8) está involucrada en el
metabolismo de la L-metionina en diferentes organismos, catalizando la reacción
prácticamente irreversible de ruptura hidrolítica de la L-cistationina con producción de
amonio:

L-cistationina + H2O  L-homocisteína + piruvato + NH4+

L-cistationina piruvato L-homocisteína

[A pH 6,5: I. La cistationina tiene no tiene carga neta, ya que el pKa de los grupos
carboxilo es de ~3,0 y el de los grupos amino de ~10,0. II. Lo mismo ocurre con la L-
homocisteína, ya el pKa de los grupos carboxilo y amino son similares y el del grupo –
SH es de ~8,5. III. El piruvato tiene carga negativa, dado que el pK del grupo carboxilo
es de ~4,0]

Ud. es empleado de un laboratorio farmacéutico y tiene que resolver sobre la compra de

cistationina β-liasa comercial, teniendo dos cotizaciones de sendas compañías
biotecnológicas. Ambos productos ofrecidos contienen la cistationina β-liasa del mismo
origen biológico a un 90% de pureza.
La compañía P cotiza a $8.300 por 2.000 U de actividad enzimática (ensayados a 25 ºC
y a pH 6,5). La compañía Z cotiza a $9.200 por 2 ml de un producto conteniendo 10
mg/ml de proteína, pero no informa cuál es la actividad enzimática. Para encontrar esto
último, Ud. realiza la medida de actividad catalítica por un método discontinuo. El
método está basado en utilizar [14C]cistationina (uniformemente marcada, con
radioactividad específica de 9.331 dpm/µmol) para, trabajando a pH 6,5, capturar
diferencialmente el piruvato producido adsorbiéndolo a discos de papel de filtro cargado
positivamente con grupos DEAE. Luego de lavar exhaustivamente los discos de papel
para eliminar la adsorción inespecífica, se los seca en estufa y se cuenta la
radioactividad incorporada a los mismos en un contador de centelleos.
Realiza la medida de actividad de cistationina β-liasa a 25 ºC (y demás condiciones
idénticas a las informadas para el producto P) en un volumen final de 1 ml utilizando 10
µl de una dilución 1:250 del producto Z y deja llevar a cabo la reacción por 5 min (son
condiciones de velocidad inicial). Detiene la reacción por calentamiento en baño maría
hirviente durante 30 s. Luego de enfriar toma la mitad de volumen (0,5 ml) y lo adsorbe
sobre un disco de papel-DEAE. Termina de procesar el disco de papel y determina en el
mismo un valor de radioactividad incorporada de 799,9 dpm.
En base a todos los datos que ahora dispone, ¿cuál producto compra, el P o el Z?

4
4. Durante la purificación de una enzima de 50 kDa el paso 5 fue una cromatografía de
exclusión molecular en Superdex 200 y los diferentes valores de las columnas de la
tabla de purificación resultaron ser como se muestra:

Volumen [Proteína] Proteína Actividad Actividad Actividad Rendimiento Purificación

(ml) (mg/ml) (mg) (U/ml) (U) (U/mg) (%) (veces)
10 50 2.000 45 800

a) Complete la tabla en los casilleros faltantes de datos.

b) ¿Qué datos podría completar de la tabla para los casilleros correspondientes al
extracto crudo (primer paso de purificación)?
c) ¿Qué valores correspondería poner en cada casillero si la muestra obtenida de la
columna de Superdex 200 fuera concentrada 5 veces por ultrafiltración con límite de
corte 5K?
d) ¿Qué valores correspondería poner en cada casillero si la muestra obtenida de la
columna de Superdex 200 fuera diluida por el agregado de 40 ml de buffer (el mismo en
el que se encuentra la enzima)?

5. Se purificó una fructosa-bisfosfato aldolasa (EC 4.1.2.13) [ver problema 2 de más

arriba] del alga fotosintética Chlorella fusca.
Se obtuvieron por sonicación de células enteras 120 ml de un extracto crudo
conteniendo 25 mg/ml de proteína y 20 U/ml de actividad enzimática. Posteriormente se
realizó un fraccionamiento salino, recuperándose la actividad enzimática en la fracción
40-70% de saturación con sulfato de amonio. Esta fracción se redisolvió en 40 ml dando
una concentración de proteína de 20 mg/ml y 2.800 U de actividad enzimática.
Luego se realizó una cromatografía de interacción hidrofóbica en columna de Phenyl
Superose, recuperándose 5 ml conteniendo 1.200 U de actividad enzimática y 2 mg de
proteína. Esta fracción se concentró 10 veces por ultrafiltración por Centricon con
membrana de tamaña de exclusión 3K.
Finalmente se realizó una cromatografía de exclusión molecular en Sephacryl S300
donde se recuperaron 6 ml y 0,1 mg/ml de proteína. La actividad de la enzima fue
medida por el método y en las condiciones detalladas en el problema 2. El agregado de
1 µl de esta última fracción produjo un aumento de absorbancia a 340 nm de 0,622 al
cabo de 60 s.

a) Construya la tabla de purificación.

b) Indique cuál es el rendimiento y la purificación total alcanzados.
c) Indique cuál es la etapa de mayor purificación y cuál la de mayor rendimiento.
d) Indique si todos los pasos se justifican fundamentando su respuesta.

6. Continuando con el problema anterior. Un individuo purificó la misma enzima de la

misma alga fotosintética, pero producida en forma recombinante por expresión
heteróloga del gen respectivo en células de Escherichia coli. En el último (tercero) paso

5
de purificación que empleó según el protocolo que desarrolló obtuvo los siguientes
datos:

Volumen [Proteína] Proteína Actividad Actividad Actividad Rendimiento Purificación

(ml) (mg/ml) (mg) (U/ml) (U) (U/mg) (%) (veces)
5 15 4.574 65 90

Además, la muestra de la enzima recombinante fue estudiada por ultracentrifugación

analítica encontrándose la presencia de una única banda proteica.

En base a esta información y la correspondiente al problema anterior:

a) Esquematice qué resultado obtendría al realizar un PAGE nativo y un SDS-PAGE
con la muestra del último paso de purificación de la proteína purificada de fuente
biológica (problema anterior).
b) Esquematice también el PAGE nativo que se obtendría de analizar la muestra
obtenida luego del paso de interacción hidrofóbica en la purificación a partir de fuente
biológica.
c) ¿Encuentra ventajas y/o desventajas del protocolo de purificación por procedimiento
recombinante respecto a partir de fuente biológica? Detalle cuáles serían unas y/u otras.

6. En el proceso de purificación de una proteína se tienen 100 ml de un extracto crudo y

sobre el mismo se realiza un fraccionamiento salino con sulfato de amonio al 55% de
saturación. El precipitado, que posee la proteína de interés, se logra redisolver en un
volumen de 4 ml. En esa solución se determina la concentración de sulfato de amonio,
estimándose en 0,75 M, mientras que la concentración de proteínas es de 5 mg/ml.

a) Indique qué cantidad de sulfato de amonio debe agregar para hacer el

fraccionamiento. Usar el sitio web:
http://kuchem.kyoto-u.ac.jp/seika/shiraishi/protocols/as_precipitation.html
b) Si el proceso continuara con una cromatografía de intercambio iónico y debe primero
eliminar la sal por cromatografía de filtración por gel, disponiendo de una columna de
Sephadex G25 (rango de fraccionamiento 1.000-5.000) cuyo volumen es de 10 ml.
¿Podría sembrar toda la muestra en esa columna y separar las proteínas de las sales
adecuadamente en ese único procedimiento? Explique qué convendría hacer.
c) Si una vez desalada, usted tiene ahora las proteínas en un volumen de 10 ml a una
concentración de 2 mg/ml, ¿podría sembrarlas en una columna de intercambio iónico de
5 ml, cuya capacidad de retención se estima en 20 mg/ml? Explique si son adecuados o
excesivos la cantidad de proteínas, el volumen de muestra o el volumen de la columna.
d) Si en vez de la cromatografía de intercambio iónico, usted decide efectuar una
cromatografía de interacción hidrofóbica, ¿podrá sembrar directamente los 4 ml del
precipitado redisuelto en la columna? ¿Qué capacidad de retención tendría que tener la
columna?

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7. Ud. es contratado por una empresa de biotecnología para que decida y haga el
escalamiento respecto a la producción de una aldehído deshidrogenasa (ALDHasa), que
se necesita en un estado de alta pureza. En el laboratorio de la empresa se han
desarrollado tres protocolos para la obtención de la enzima:

Protocolo I. Obtención de la fuente natural, la bacteria Streptococcus mutans. La

purificación de esta fuente parte de 250 g de peso húmedo de células, obteniéndose por
sonicación 2.000 ml de un extracto crudo conteniendo 18,0 mg/ml de proteínas y 3,60
U/ml de actividad de ALDHasa. Luego de 5 pasos de purificación, se obtienen 10 ml de
una muestra conteniendo 0,40 mg/ml de proteína. Con esta muestra se ensaya actividad
por un método continuo, usando como sustrato gliceraldehído-3P (Ga3P) y midiendo la
producción de NADPH a 340 nm, según la reacción:

Ga3P + NADP+ + H2O  3P-glicerato + NADPH + 2 H+

El ε del NADPH a 340 nm es de 6.000 M-1 cm-1. El ensayo realizado con 5 µl de una
dilución 1:100 de la muestra purificada, en un volumen de reacción de 0,5 ml, dio un
cambio de absorbancia a 340 nm (medido en cubeta de 1 cm de camino óptico) de 0,06
luego de 30 s de reacción.

Protocolo II. Obtención en forma recombinante. El gen que codifica para la ALDHasa
fue clonado y expresado en Escherichia coli, con un sistema que expresa la proteína
recombinante sin ningún tipo de modificación. Partiendo de 250 g de peso húmedo de
células de E. coli transformadas e inducidas para la expresión, se obtuvieron por
sonicación 2.000 ml de un extracto crudo conteniendo 18,0 mg/ml de proteínas y 36.000
U de actividad enzimática. Luego de 3 pasos de purificación se recuperan 10 ml
conteniendo 80 mg de proteína con una actividad ALDHasa de 2.000 U/ml.

Protocolo III. Obtención en forma recombinante, similar al anterior, pero con un

sistema que expresa la proteína recombinante con una etiqueta de 6 histidinas en el
extremo N-terminal. Partiendo de 250 g de peso húmedo de células de E. coli
transformadas e inducidas para la expresión, se obtuvieron por sonicación 2.000 ml de
un extracto crudo conteniendo 36 g de proteínas y 72.000 U de actividad ALDHasa. La
purificación por una columna de cromatografía de metal inmovilizado, produjo una
muestra de 20 ml conteniendo 3,6 mg/ml de proteína y una actividad ALDHasa de
1.800 U/ml.

¿Cuál de los protocolos recomendaría utilizar para la obtención de la ALDHasa?

Justifique su respuesta.

8. La asparaginasa cataliza la reacción:

asparagina + H2O  aspartato + NH3

7
Esta enzima es usada con fines terapeúticos en caso de leucemia. Las células tumorales
en rápida división necesitan cantidades mayores de asparagina que las normales. La
administración de asparaginasa reduce los niveles de asparagina disponible en los
individuos enfermos, lo que reprime la viabilidad del tumor.
Un laboratorio farmacéutico que desea comercializar asparaginasa le encarga que
realice la purificación de la enzima del hongo Aspergillus niger. A tal fin, parte de 200
ml de un extracto crudo libre de células conteniendo 20 mg/ml de proteína. Para medir
actividad enzimática incuba una alícuota de 10 l del extracto con el sustrato a 37 C en
0,2 ml de medio de reacción, finalizándose esta a los 5 min directamente por el
agregado de 1 ml de reactivo de color para NH3. La lectura de absorbancia a 540 nm
(descontando el blanco) en una cubeta de 1 cm de camino óptico fue de 0,44 (el 540nm
para el producto formado es de 2.200 M-l.cm-l). Luego realiza un fraccionamiento
salino, recuperando la asparaginasa en la fracción 10-90% de sulfato de amonio. Al
redisolver esta fracción en 20 ml del buffer de purificación Ud. recupera el 95% de
actividad enzimática y 3.800 mg de proteína.
Luego de dializar exhaustivamente la muestra realiza una cromatografía en columna de
DEAE-celulosa y recupera 80 ml que contenían 600 U de asparaginasa purificada 20
veces respecto al extracto crudo. Como último paso realiza una cromatografía en
columna de hidroxilapatita de la que recupera 20 ml conteniendo 0,12 mg/ml de
proteína y 17 U/ml de actividad enzimática.

a- Construya la tabla de purificación y analícela, indicando la purificación y el

rendimiento total alcanzados. Señale la etapa de mayor purificación y la de mayor
rendimiento.
b- ¿Aconsejaría iniciar la preparación de la asparaginasa en gran escala usando los
mismos pasos de purificación o sugeriría alguna modificación? Justifique su respuesta.

9. Se desea estudiar la enzima ADP-glucosa pirofosforilasa (ADPGlcPPasa; EC

2.7.7.27) de Marchantia polymorpha (una especie de musgo). Esta enzima es un
heterotetrámero del tipo 22, con una masa molecular de 220 kDa y un pI de 6,4. Esta
enzima cataliza la reacción reversible:

ATP + glucosa-1P  ADP-glucosa + PPi

La actividad de la misma puede evaluarse mediante un método radioactivo que utiliza

glucosa-1P uniformemente marcada con 14C (es decir, todos los carbonos de la molécula
son 14C). Luego de detener la reacción, la ADP-glucosa generada se separa del sustrato
marcado y se cuantifica por medida de la radioactividad.
Luego de un extenso proceso de purificación a partir de la fuente natural, se obtuvieron
2 mL de la enzima de interés con alto grado de pureza (una única banda por PAGE
nativo). La actividad de esta muestra se midió con una alícuota de 10 µL (dil 1/10) en
un medio de ensayo de 0,2 mL y durante 10 min, obteniéndose como resultado una
radioactividad de 500 dpm, mientras que el testigo de [14C]glucosa-1P mostró una

8
radioactividad específica de 100 dpm/nmol. La concentración de proteínas de la muestra
era de 0,1 mg/mL.
Por otra parte, se clonaron los genes que codifican para las subunidades (masa
molecular 50 kDa y pI 6,0) y (masa molecular 60 kDa y pI 7,2) y la enzima
recombinante se expresó fusionada a una etiqueta de His6 en células de Pichia pastoris.
La misma se purificó por IMAC en un solo paso, obteniéndose 10 mL de una muestra
que mostró una única banda por PAGE nativo. Para evaluar la actividad de esta muestra
se utilizó el método radioactivo descripto más arriba. En este caso se utilizaron las
mismas condiciones que antes, sólo que la muestra fue diluida 1/100 y la radioactividad
medida resultó ser de 1.000 dpm. La concentración de proteínas de esta muestra era de
10 mg/mL.

a) Calcule la actividad en U/mL, U/mg y U totales de las muestras obtenidas a partir de

su fuente natural y de forma recombinante.
b) ¿Qué diferencias y/o similitudes encuentra para las muestras obtenidas con los
diferentes protocolos? ¿Cuál de ellos brinda mayor cantidad de enzima pura?
c) Esquematice qué obtendría para la enzima recombinante luego de realizar las
siguientes experiencias: i) PAGE nativo, ii) SDS-PAGE, iii) IEF nativo seguido de
SDS-PAGE y iv) IEF desnaturalizante con urea seguido de SDS-PAGE. Cuando lo
considere adecuado, grafique en el gel los marcadores de masa molecular: A, 20 kDa;
B, 50 kDa; C, 80 kDa; D, 120 kDa y E, 250 kDa.

9
Caracterización estructural de proteínas

1. ¿Qué clasificación mayor sobre los principios de métodos para caracterizar niveles
estructurales de proteínas puede establecer?

2. ¿Cuál es el pre-requisito fundamental para estudiar niveles estructurales en una

proteína?

3. ¿Cómo se puede calcular la masa molecular de una proteína si conoce a) el número

de pares de bases del gen que la codifica y b) su secuencia aminoacídica? Efectúe las
suposiciones necesarias.

3. ¿Cómo puede determinar la estructura primaria de una proteína? ¿Qué metodología

aplicaría? ¿Qué estrategia se utiliza para poder secuenciar una proteína pese a ser un
polímero extenso?

4. Describa al menos tres métodos útiles para determinar la estructura secundaria y

terciaria de una proteína. ¿Se pueden predecir las estructuras secundaria y terciaria de
péptidos y proteínas?

5. ¿Qué métodos espectroscópicos le permiten evaluar aspectos conformacionales

(cambios de estructura terciaria/cuaternaria, accesibilidad de residuos al solvente) en
una proteína?

6. ¿Qué métodos permiten determinar la estructura 3D de una proteína? Indique

ventajas y desventajas.

7. Cómo procedería para determinar la estructura cuaternaria de una proteína funcional.

Problemas
[Para la resolución de algunos problemas de esta guía le será de utilidad la información
que se encuentra en la siguiente tabla]

Agente de corte Corta si

Tripsina aa1 es Arg o Lys
Quimotripsina aa1 es Phe, Tyr, Trp (o sea, aromático)
Pepsina aa2 es Phe, Tyr, Trp, Leu, Asp o Glu
Papaína aa1 es Asp, Glu, Gly o His
Bromuro de cianógeno aa1 es Met

Dada una secuencia proteica del tipo H3NX-X-aa1-aa2-Y-YCOOH

10
1. Retomemos el problema 3 que ya habíamos analizado en la guía de coloquios 4 sobre
niveles estructurales de proteínas. Sobre la base de los resultados que se habían obtenido
sobre la ADP-GlcPPasa de fuente bacteriana o vegetal, considere que lo anteriormente
mostrado para el comportamiento de la enzima de ambas fuentes en SDS-PAGE
correspondía a la proteína conservada en un medio conteniendo el compuesto reductor
DTT (de puentes disulfuro) y que este último también estaba presente en el medio y las
condiciones de corrida de la electroforesis.
Si el DTT se elimina del medio de conservación de la proteína y también durante la
realización de la electroforesis, no hay cambios significativos en el comportamiento de
la enzima bacteriana, pero en el SDS-PAGE de la enzima de origen vegetal se
identifican dos bandas proteicas: una de 52 kDa (con pI de 6,06) y otra de 100 kDa.
A su vez, cuando se analiza el comportamiento cinético de las respectivas enzimas se
encuentra que la ADP-GlcPPasa bacteriana exhibe similares propiedades en ausencia o
presencia de DTT, pero la enzima de plantas tiene mayor actividad (~2 veces mayor la
Vmax) en presencia comparada con la ausencia del reductor.

En base a lo anterior: a) ¿Qué relaciones de estructura a función podría establecer para

la ADP-GlcPPasa? b) Compare sus conclusiones con lo demostrado para la enzima en la
publicación disponible en el sitio web: http://www.plantcell.org/content/14/9/2191.long

2. La angiotensina II es un péptido biológicamente activo que en animales tiene un

efecto hipertensivo estimulando la liberación de aldosterona de glándulas adrenales. Un
estudio realizado con angiotensina II de cebra brindó los siguientes resultados:

I. El tratamiento de la angiotensina II purificada con tripsina rindió un dipéptido

(conteniendo Arg y Asp) y un hexapéptido.
II. El hexapéptido del paso anterior se purificó y se trató con quimotripsina,
obteniéndose un dipéptido (conteniendo Tyr y Val) y un tetrapéptido.
III. Luego de purificar este tetrapéptido se trató con papaína, obteniéndose dos péptidos
diferentes, uno conteniendo His e Ile y el otro Phe y Pro.
IV. En todos los casos los productos guardaban una relación molar 1:1.

En base a estos datos escriba con el código de tres letras y también en fórmulas la
estructura primaria de la angiotensina II de cebra.

3. Una proteína aislada de hojas de espinaca y purificada a homogeneidad fue analizada.

Se determinó que contiene Cu2+ y al tratarla con bromuro de cianógeno se produjeron
tres polipéptidos de 250, 116 y 50 kDa y cuyos grupos amino terminales fueron Phe,
Tyr y Leu, respectivamente.

Indique la masa molecular de la proteína y el número de residuos de Met por mol de la

misma. Si dicha proteína se encuentra fosforilada en el grupo amino terminal, indique
cuál es dicho aminoácido.

11
4. Un antibiótico polipeptídico de Streptomyces coelicolor forma complejos con iones
metálicos y aparentemente inhibe el transporte iónico a través de las membranas
matando a ciertas especies bacterianas. En el análisis de la estructura se encuentra que:

I. La hidrólisis ácida completa del péptido seguida del análisis de aminoácidos dio
cantidades equimoleculares de Leu, Pro, Orn*, Val y Phe.
*La ornitina (Orn) es un aminoácido no proteico producido enzimáticamente
II. La medida del peso molecular arrojó un valor de ~1.200.
III. No se hidrolizó con carboxipeptidasa.
IV. Cuando se realizó la degradación de Edman sobre el péptido no se generó ningún
derivado PTH-aminoácido en N-α.
V. La hidrólisis parcial del péptido, con distintos agentes de corte, seguida de
separación cromatográfica y secuenciación generó los siguientes péptidos:

Leu-Phe
Phe-Pro
Val-Orn-Leu
Orn-Leu
Phe-Pro-Val
Val-Orn
Pro-Val-Orn

Deduzca la secuencia del péptido.

5. La albúmina sérica caprina contiene 0,58% en peso de Trp, cuyo peso molecular es
204.

a) Calcule el peso molecular mínimo de la albúmina.

b) Considerando que el peso molecular de la albúmina es 70.000, calcule cuántos
residuos de Trp tiene por molécula.

6. Las proteínas denominadas histonas juegan un papel clave en el empaquetamiento del

DNA, ya que el poli-anión se enrolla alrededor de las histonas para formar los
nucleosomas, partículas engarzadas como las cuentas de un collar. Una mezcla de tres
proteínas globulares, entre ellas la histona H4, presenta la siguiente composición de
aminoácidos:

Número de Residuos
Proteína Asp y Glu Arg, Lys e His Otros AA
A 90 5 105
B 50 10 60
C 6 27 69

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Mediante un isoelectroenfoque se determinaron los puntos isoeléctricos de las tres
proteínas obteniéndose los siguientes valores: 3,0; 5,5 y 9,5 (no respectivamente). Las
masas moleculares obtenidas por cromatografía de exclusión molecular fueron de 15
kDa, 11,3 kDa y 21,5 kDa.

a) lndique el punto isoeléctrico, la masa molecular y el orden de elusión de una columna

cromatográfica de exclusión molecular de las tres proteínas.
b) En base a sus conocimientos, ¿podría decir cuál de las tres proteínas sería H4?
Fundamente su respuesta.

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