Bioseparación y Purificación de Ureasa de Soya

Bioseparación y purificación de ureasa de soya
Fecha:
Resumen
Palabras clave: Se recogió el filtrado y se almacenó 2 mL del mismo a
4°C, al filtrado restante se le agrego 50 ml de acetona fría.
Posteriormente se centrifugó a 3000 RMP durante 30

Introducción y objetivos
minutos, el líquido sobrenadante fue decantado y el
Materiales y métodos
precipitado obtenido se disolvió en 10 mL de buffer de
Preparación de soluciones
fosfatos, pH 7.2.
Se realizó la preparación de las soluciones
requeridas para la bioseparación de ureasa proveniente de
frijol de soya. Las concentraciones y cantidades de cada Cuantificación de proteínas
preparación se muestran a continuación (Tabla 1): Se elaboró una curva estándar de albúmina sérica
bovina a las concentraciones mostradas de la siguiente

Tabla 1. Preparación de soluciones. Cantidades y
concentraciones de soluciones requeridas en la bioseparación de
ureasa de soya. manera (por triplicado).
Cantidad (mL) Solución Tabla 2. Cantidades de reactivos para la cuantificación de

proteínas.
30 Alcohol etílico al 30%
50 Urea 0.25 M Tubo Concentración BSA 1 Buffer
50 Buffer de fosfatos 100 (ug/mL) mg/mL fosfatos
mM, pH 7.2 (uL) 100 mM,
5 AgNO3 1.0 mM pH 7.2
100 HCl 0.1 M (mL)
1 0 0 500
2 10 5 495
Bioseparación de ureasa del frijol de soya 3 20 10 490
4 30 15 485
Se pesaron 10 g de frijol de soya y se procedió a 5 40 20 480
6 50 25 475
moler en molino de cuchillas con malla #20. 7 60 30 470
8 70 35 465
Posteriormente se añadió 30 mL de alcohol etílico al 30% 9 80 40 460
10 90 45 455
y se agitó en baño de hielo durante 1 hora. 11 100 50 450
Transcurrido el tiempo de extracción con etanol, Actividad enzimática de la ureasa
se filtró la mezcla al vacío utilizando filtro whatman #41. Se prepararon los tubos de reacción de la
siguiente manera.
Finalmente se adicionó el contenido de cada
Tabla 3. Cantidades de reactivos y tiempos necesarios para
medir la actividad de la ureasa (EE=extracto etanolico, mezcla de reacción en una celda de metacrilato y se tomó
EA=extracto con acetona, B=blanco)
lectura en espectrofotómetro (Spectronic 20) a 595 nm.
Reactivo EE EA B
Urea 0.25 M (mL) 7.5 7.5 7.5 Resultados
Buffer fosfatos 100 mM, pH 7.2
4.5 4.5 4.5
(mL)
Incubar 5 minutos, todos los tubos, a 50 C 0
Muestra (mL) 1.5 1.5 1.5

Curva estándar BSA y = 0.0048x + 0.1055
Incubar 30 minutos, todos los tubos, a 50 C 0
0.8
Absorbancia 595 nm
Hg (NO ) 1.0 mM (gotas)
2 3 2 4 4 4
0.6
0.4
Una vez terminada la reacción en cada tubo, se 0.2
0
transfirió el contenido a un matraz Erlenmeyer de 25 mL y 0 50 100 150
se agregó 5 gotas de indicador azul de metileno y rojo de Concentración μg/mL
metilo.
Grafica 1. Se muestra la curva BSA para la cuantificación de
Finalmente se valoró cada uno de los extractos proteína total.
con una disolución de HCl 0.1 M.
Para la lectura espectrofotométrica por el método
de Bradford se utilizó 500 μL de cada tubo de la curva
estándar y la muestra, con la adición de 500 μL de reactivo
de Bradford. Se agitó por inversión cada uno de los tubos
de manera suave y se incubo durante 5 minutos a
temperatura ambiente y en oscuridad.
Tabla 5. Purificación de Ureasa. Una unidad de actividad ureasa fue definida como los mmol)/mL/minuto de urea hidrolizada y, la
actividad específica como los mmoles generados/min/mg de proteína extraída.
Actividad Factor de
Muestra Actividad Proteína (ug) Rendimiento
específica Purificación
EE 0.31 11.35 100 0.027 1.0

EC 0.38 144.68 122.58 0.002626 0.0972
tambien provoca una disminución notable en la actividad
Discusión de la enzima. No es necesaria la ruptura de cadenas
polipeptídicas. UAM (2017) por su parte también otorga

Entre los tipos de metodología de extracción se obtuvo una
un argumento que explica nuestros resultados. Se describe
mayor concentración proteica en el extracto cetónico (un
que las proteínas se desnaturalizan con mayor facilidad en
78% más) en relación al extracto etanolico. Esto puede
soluciones acuosas que contienen solventes orgánicos de
deberse a que el etanol es un agente utilizado para la
constante dieléctrica baja, en esto caso acetona (Constante
desintegración química. Su papel en el método es atacar la
Dielectrica=24). Las moléculas del solvente no acuoso
pared celular para la extracción de la ureasa en un extracto
forman hidratos compitiendo por el agua con las moléculas
crudo, mientras que la acetona homogeniza por
proteicas produciéndose la precipitación por
deshidratación (Calvo, 2016) y causa precipitación lo cual
deshidratación de proteínas.
hace sencillo recuperar una más alta concentración de
proteínas después de un proceso de centrifugación. Esto es
especialmente observable en el rendimiento del extracto
cetonico. Desafortunadamente, esto también provoca el
acarreamiento de proteínas indeseables (Rivas, 2016) lo
que explica la baja actividad específica del extracto
cetónico. Asimismo una explicación de porqué aunque
obtuvimos una mayor cantidad de proteína en el extracto
cetónico también una disminución de la actividad
específica puede deberse a que los disolventes orgánicos
interaccionan con el interior hidrófobo de las proteínas lo
cual conlleva una disminución del grado de hidratación de
los grupos iónicos superficiales de la molécula proteica.
Cuando esto ocurre, como reportado por Lopez (2013), se
desorganiza la estructura terciaria que si bien es deseable
para favorecer la precipitación y por ende la recuperación,

Conclusiones
Fue posible extraer enzima ureasa y comprobar su
actividad enzimática por medio de titulación volumétrica.
En este ensayo obtuvimos con un primer extracto etanolico
una concentración proteica de 11.35 ug y 144.68 ug para el
extracto cetónico. Se obtuvo un rendimiento mayor de
proteína para el extracto cetónico en 22%, sin embargo
también presentó una disminución del 9.76% en actividad
específica asociada al uso de solventes con constante
dieléctrica baja y la desnaturalización que estos provocan.
Referencias bibliográficas
1. Calvo J.C. (2016). Criterios para la extracción de
enzimas. (Online)
http://www.calvo.qb.fcen.uba.ar
2. Rivas, Catalina (2016) Investigacion en plantas
de importancia clínica. Universidad Autonoma de
Nuevo Leon, Mexico.
3. Teijon, José (2006) Bioquimica Estructural. 1ra
Edicion.Editorial Mares. España.
4. Lopez, L. (2013). Proteínas. Estructura de las
proteínas. Estabilidad conformacional y
adaptabilidad. Facultad de Farmacia y
Bioquímica. UBA
5. UAM (2017) sgpwe.izt.uam.mx Consultado
20/10/2017
6.

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Bioseparación y purificación de ureasa de soya

Palabras clave: Se recogió el filtrado y se almacenó 2 mL del mismo a

4°C, al filtrado restante se le agrego 50 ml de acetona fría.

Posteriormente se centrifugó a 3000 RMP durante 30

requeridas para la bioseparación de ureasa proveniente de

frijol de soya. Las concentraciones y cantidades de cada Cuantificación de proteínas

bovina a las concentraciones mostradas de la siguiente

Cantidad (mL) Solución Tabla 2. Cantidades de reactivos para la cuantificación de

Transcurrido el tiempo de extracción con etanol, Actividad enzimática de la ureasa

Muestra (mL) 1.5 1.5 1.5

se agregó 5 gotas de indicador azul de metileno y rojo de Concentración μg/mL

con una disolución de HCl 0.1 M.

Para la lectura espectrofotométrica por el método

de Bradford se utilizó 500 μL de cada tubo de la curva

estándar y la muestra, con la adición de 500 μL de reactivo

de Bradford. Se agitó por inversión cada uno de los tubos

de manera suave y se incubo durante 5 minutos a

temperatura ambiente y en oscuridad.

EE 0.31 11.35 100 0.027 1.0

tambien provoca una disminución notable en la actividad

Discusión de la enzima. No es necesaria la ruptura de cadenas

polipeptídicas. UAM (2017) por su parte también otorga

proteínas después de un proceso de centrifugación. Esto es

especialmente observable en el rendimiento del extracto

cetonico. Desafortunadamente, esto también provoca el

acarreamiento de proteínas indeseables (Rivas, 2016) lo

que explica la baja actividad específica del extracto

cetónico. Asimismo una explicación de porqué aunque

obtuvimos una mayor cantidad de proteína en el extracto

cetónico también una disminución de la actividad

específica puede deberse a que los disolventes orgánicos

interaccionan con el interior hidrófobo de las proteínas lo

cual conlleva una disminución del grado de hidratación de

los grupos iónicos superficiales de la molécula proteica.

Cuando esto ocurre, como reportado por Lopez (2013), se

desorganiza la estructura terciaria que si bien es deseable

para favorecer la precipitación y por ende la recuperación,

Fue posible extraer enzima ureasa y comprobar su

actividad enzimática por medio de titulación volumétrica.

En este ensayo obtuvimos con un primer extracto etanolico

una concentración proteica de 11.35 ug y 144.68 ug para el

extracto cetónico. Se obtuvo un rendimiento mayor de

proteína para el extracto cetónico en 22%, sin embargo

también presentó una disminución del 9.76% en actividad

específica asociada al uso de solventes con constante

dieléctrica baja y la desnaturalización que estos provocan.

1. Calvo J.C. (2016). Criterios para la extracción de

2. Rivas, Catalina (2016) Investigacion en plantas

de importancia clínica. Universidad Autonoma de

Nuevo Leon, Mexico.

3. Teijon, José (2006) Bioquimica Estructural. 1ra

Edicion.Editorial Mares. España.

4. Lopez, L. (2013). Proteínas. Estructura de las

proteínas. Estabilidad conformacional y

adaptabilidad. Facultad de Farmacia y

5. UAM (2017) sgpwe.izt.uam.mx Consultado

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