Purificación Enzimática

Juan Pablo Raposo, Joaquìn Gómez

Laboratorio de Química Biológica (Cs. Biológicas) - 1er cuat. 2023 - Jueves 8 - 13 hs. Departamento de
Química Biológica, FCEyN, UBA

Introducción
Los métodos de purificación consisten en el enriquecimiento de una muestra en el
producto contenido en esta que se busca estudiar. La naturaleza del método purificación en el
caso de enzimas va a variar según sus características, la fuente biológica de la cual proviene
la muestra que se busca purificar y la concentración de la enzima en esa fuente.

La actividad de una enzima varía dentro de los diversos tejidos de un mismo organismo
por lo que se encuentra en distintas concentraciones en distintos tejidos. En general el tejido
del que se extraiga la enzima se busca que sea el más rico en esta. Además, la mayoría de las
enzimas se deterioran rápidamente por lo que las muestras de tejido con las que se trabajen
deben ser frescas. Las enzimas en tejido se encuentran a menudo formando complejos con
otros componentes celulares e incluso pueden variar ampliamente en su localización
intracelular. Una de las técnicas más comunes para poder separar los distintos componentes
intracelulares es la centrifugación diferencial. Al centrifugar a velocidades cada vez mayores
por aplicación de fuerza centrífuga, se puede separar de un homogenato de tejido distintas
fracciones que corresponden a distintas organelas, compuestos o restos celulares. Sabiendo la
localización de la enzima de estudio dentro de la célula se puede seguir este procedimiento
para obtener una fracción más pura. A la hora de extraer a la enzima de su entorno es
importante trabajar en frío, esto se debe a que por un lado si se busca estudiar la actividad de
una enzima, se formaría un sesgo en las mediciones producto de la reacción endógena del
tejido y el frío detiene la acción de proteasas sobre la enzima de interés

Una vez realizada la homogeneización del tejido de estudio y realizado el

fraccionamiento celular, se debe elegir un esquema de purificación que permita separar la
enzima deseada de las otras. Los métodos de purificación varían ampliamente en su
resolución y la cantidad de muestra que requiere llevarlos a cabo pero uno de los más
comunes es el de purificación por solubilidad diferencial. Dadas sus propiedades
fisicoquímicas se puede hacer precipitar ciertas proteínas de una solución al modular factores
como la temperatura y la fuerza iónica. La precipitación por calor se da debido a que las
proteínas difieren en su sensibilidad al calor. La precipitación por fuerza iónica ocurre porque
la introducción de iones a una muestra proteica cambia la fuerza de la interacción entre la
proteína y el solvente. A bajas concentraciones de sal, la solubilidad aumenta, por un proceso
llamado salting in mientras que a concentraciones más altas, las interacciones entre soluto y
disolvente se vuelven más débiles que las del soluto consigo mismo, salting out. El límite de
concentración en el cual se alcanza el efecto de salting out es propio de cada proteína.

La presencia de una enzima se detecta de forma específica midiendo su actividad. Para

poder comparar entre distintas fracciones del proceso de purificación se trabaja en
condiciones saturantes de sustrato de forma tal que se compara el Vmax. La actividad de una
enzima se mide en unidades enzimáticas (UE), unidad que se refiere a la cantidad de producto
formado o sustrato consumido en una unidad de tiempo.

El método de purificación se puede caracterizar según los parámetros actividad

específica (AE), rendimiento (R) y purificación (P). El primero refiere a las unidades
enzimáticas totales respecto a la masa total de proteína. El rendimiento es el porcentaje de UE
de una fracción respecto las UE totales. Por último el grado de purificación se calcula como
la AE de la fracción sobre la AE de la fracción original.

En este trabajo se llevó a cabo un protocolo de purificación de la enzima ALA-D a

partir de un homogenato de hígado de cerdo. A las distintas fracciones obtenidas por el
procedimiento se les midió la presencia de proteínas utilizando reactivo de Bradford y se
evaluó la actividad enzimática de las distintas reacciones y se realizó un cuadro de
purificación para poder comparar las cualidades de cada fracción y comparar los datos
obtenidos de cada fracción.

Desarrollo experimental

Purificación

Durante el proceso de la purificación deben mantenerse todas las muestras conteniendo

nuestra enzima de interés en hielo, incluidas las fracciones de purificación ya que por un lado
se evaluará la actividad enzimática y de esa forma prevenimos el sesgo que puede producir la
actividad endógena del tejido elegido como fuente y porque este tejido puede contener
proteasas que degraden la enzima. Al mantener en frío las muestras, se frenan ambas
reacciones.

Durante este trabajo se utilizó un homogenato fabricado previamente. El tejido de

hígado de cerdo que se utilizó como fuente enzimática fue troceado y homogeneizado en una
licuadora con buffer de extracción (compuesto por buffer fosfato de sodio 20 mM pH 6,8,
NaCl 0.15 M y β-Me 10 mM) en relación 1:5. A continuación fue centrifugado a 800 xg
durante 5 minutos, el sobrenadante resultante es el homogenato al cual se llamará Fracción H.
Durante el trabajo, de cada una de las fracciones obtenidas se reservaron alícuotas de 1 ml y
0,5 ml para medir su actividad enzimática y utilizar en un trabajo futuro de electroforesis
respectivamente.

La Fracción H restante fue centrifugada durante 15 minutos a 15000 xg. De esta

centrifugación se obtendrá una Fracción S del sobrenadante mientras se descartara el
precipitado. Una vez tomadas las alícuotas, la Fracción S será divida en dos partes a las
cuales se someterá a dos tratamientos térmicos distintos para poder compararlos. Una mitad
se calentará hasta los 62°C en un baño de agua con agitación constante y se mantendrá la
temperatura durante 2 minutos, por otro lado, se repetirá el procedimiento para la otra mitad
pero a una temperatura de 45°C. Una vez concluidos los dos minutos se volverá a sumergir
en un baño de hielo, ambas partes se centrifugar durante 15 minutos a 15000 xg, descartando
el precipitado y guardando los sobrenadantes a los cuales se denominará Fracción C1 y C2
respectivamente a las cuales se agregará β-Me hasta una concentración final de 10 mM
(durante el tratamiento térmico el β-Me del buffer de extracción evapora). El β-Me disponible
en el laboratorio es de concentración 200 mM.

A la Fracción C1 se le adiciona sulfato de amonio correspondiente hasta una

concentración de 55% m/v. Durante el proceso se vigilará que el pH permanezca entre 6,8 y
7,0 mediante tiras reactivas. Una vez se alcanza la concentración deseada se deja 20 minutos
en frío y se centrifuga durante 15 minutos a 15000 xg. El precipitado se resuspende en 5 ml
de buffer de resuspensión (buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6,8 y β-Me 10 mM)

Actividad enzimática

Sobre las alícuotas de 1 ml de cada fracción se midió la actividad enzimática y se

cuantificaron las proteínas totales. Para la medición de la actividad enzimática se utilizó un
sistema de incubación compuesto por buffer fosfato de sodio 50 mM pH 6.8 hasta volumen
final 1 ml, 0.1 ml de β-Me 200 mM, 0.1 ml de ALA (8.35 mg/ml) y 0.04 a 0.2 ml de una
alícuota de cada fracción. La incubación se realizó a 37°C en aerobiosis durante 30 minutos,
una vez transcurridos se detuvo la reacción agregando 0.1 ml de solución saturada de CuS04
y agitando vigorosamente. A continuación se centrifugó durante 15 minutos a 3000 rpm para
estudiar la presencia de PBG en el sobrenadante. De la fracción H, S y C2 se incubó con
alícuotas de 100 μl, de la C1 se incubó una alícuota de 200 μl y de P 40 μl. De cada fracción
se hizo un blanco donde no se agregó fracción.

La determinación de PBG se realizó agregando 1 ml de Reactivo de Ehrlich y leyendo

su absorbancia a 555 nm entre los 8 y 15 minutos después del agregado. Se asume linealidad
para las posibles concentraciones de PBG obtenibles de este procedimiento y se determinará
la concentración a partir de la ley de Beer. A partir de estos datos se determinarán las UE
para cada procedimiento.
Proteínas totales

En cuanto a la determinación de proteínas totales, se utilizó el método de Bradford. El

método indica que a 0,1 ml de solución se lo hacen reaccionar con 2 ml de reactivo de
Bradford, se lo debe agitar y dejar reposar 2 minutos antes de medir absorbancia a 595 nm.
La cantidad de proteína total en cada fracción se calculó a partir de la curva de calibración
realizada en el TP1. En este trabajo asumimos que los valores de absorbancia caen dentro del
rango lineal. Para las fracciones H, S y P se realizaron diluciones 1:100 y para las C1 y C2,
1:50.

De cada fracción se hizo un blanco donde no se le agregó proteína. El método utilizado

asume que la curva de calibración que realizamos para el TP1 es válida para este. Tanto para
determinar la cantidad de proteínas totales como la actividad enzimática, se duplicó el
resultado final para C1 y C2 ya que en un protocolo de purificación no dividiríamos nuestra
muestra en 2 para hacer ambos pasos sino que nos abocaremos hacia uno u otro.

Resultados y Discusión

Los datos de absorbancia tanto de la determinación de UE como de la cantidad de

proteínas totales se promediaron y se les restó la absorbancia medida de sus respectivos
blancos para obtener por un lado una cantidad de UE totales y por el otro la cantidad en
miligramos de proteína total. A partir de ello se calculó la actividad específica, porcentaje de
rendimiento y el grado de purificación. Todos los cálculos se encuentran en el apéndice. Los
resultados obtenidos pueden observarse en la Tabla 1.

Volumen Cantidad de proteína

F (ml) total (mg) UE tot AE (UE/mg) %R P
H 35 535.2 1892.5 3.536061286 100 1
S 32 525.3 2103.2 4.003807348 111.1334214 1.132278834
C
1 12 290.5 1665.8 5.734251291 88.02113606 1.621649295
C
2 13 162.5 656.1 4.037538462 34.66842801 1.14181801
P 2 19.2 670.5 34.921875 35.42932629 9.875924703

Tabla 1: Tabla de cantidad de proteína total, UE, AE, %R y P para las cinco fracciones.

En base a los resultados obtenidos se puede comparar a los distintos pasos del protocolo
de purificación utilizado. El cambio de rendimiento nos puede dar una medida de la
eficiencia de los pasos de purificación en cuanto se refiere a la pérdida o aumento de UE de
cada paso respecto a las del paso inicial, en este caso H. Una pérdida de rendimiento grande
implicaría una disminución de la cantidad de enzima de interés. No obstante, el análisis queda
incompleto sin evaluar el grado de purificación que se alcanza. Al evaluarse la actividad
específica en lugar de solamente las unidades enzimáticas, el grado de purificación da una
idea de la proporción de enzima de interés que forma parte de la fracción respecto a la
cantidad de proteína total. Una pérdida de rendimiento se podría justificar dado un grado de
purificación alto dependiendo del objetivo experimental del experimento.

Dado los resultados obtenidos, es posible evaluar las distintas fracciones. Por un lado,
la fracción S si bien tiene un grado bajo de purificación, el aumento de rendimiento se
justifica si bien es un aumento ligero. Por otro lado, de los dos tratamientos térmicos, es
posible observar cómo el calentamiento a 62°C significa una pérdida menor de rendimiento y
un aumento mayor de purificación respecto al calentamiento a 45°C. A partir de estos datos
sería viable plantear que la enzima de interés es termo-resistente. Por último, el paso final
tiene un aumento enorme de purificación respecto a una pérdida de rendimiento similar al de
la fracción C2.

Conclusión

A partir del protocolo de purificación realizado y el análisis de los datos obtenidos fue
posible evaluar el grado de purificación y rendimiento de cada paso y construir un cuadro de
purificación. Fue posible también evaluar y comparar los distintos pasos entre sí y ofrecer
conclusiones sobre qué tan óptimos son para purificar nuestra proteína y sobre las
características mismas de nuestra proteína de interés.

Apéndice

UE Total
AE (UE/mg)¿
Cantidad de proteínatotal

1892.5
AE (UE/mg)¿ = 3.536061286
535.2

2103.2
AE (UE/mg)¿ =4.003807348
525.3

C1

1665.8
AE (UE/mg)¿ =5.734251291
290.5

C2

656.1
AE (UE/mg)¿ =4.037538462
162.5

P
 670.5
AE (UE/mg)¿ =34.921874
19.2

Actividad específica del paso de purificación

Purificación¿
Actividad específica del Homogenato

3.536061286
Purificación¿ =1
3.536061286

4.003807348
Purificación¿ =1.132278834
3.536061286

C1

5.734251291
Purificación¿ =1.621649295
3.536061286

C2

4.037538462
Purificación¿ =1.14181801
3.536061286

34.921874
Purificación¿ =9.875924703
3.536061286

UE Total del paso de purificación

Rendimiento(%)¿
UE Total del Homogenato

1892.5
Rendimiento(%)¿ x 100 = 100
1892.5

S
 2103.2
Rendimiento(%)¿ x 100 =111.133421
1892.5

C1

1665.8
Rendimiento(%)¿ x 100 =88.02113606
1892.5

C2

656.1
Rendimiento(%)¿ x 100 =34.66842801
1892.5

670.5
Rendimiento(%)¿ x 100 =35.4293262
1892.5