Evaluación Del Bombeo de Protones en Levaduras

EVALUACIÓN DEL BOMBEO DE PROTONES EN LEVADURAS
1. OBJETIVOS
1.1. Evidenciar por medio de la acidificación del medio, la verificación del proceso respiratorio
en levaduras, utilizando glucosa como fuente de carbono.
1.2. Determinar el efecto de un agente desacoplante de los procesos de transporte electrónico y
fosforilación oxidativa, mediante el monitoreo de la acidificación del medio por parte de la
levadura.
1.3. Evaluar el efecto de un inhibidor de la cadena respiratoria, mediante la distorsión de la
acidificación del medio por parte de la levadura
2. FUNDAMENTO TEÓRICO.
La levadura utilizada en la fabricación del pan, el vino y la cerveza, Saccharomyces cerevisiae, es

un hongo unicelular, el cual, al igual que todos los organismos vivos, consume combustibles
carbonados para suplir sus necesidades energéticas. Una de las estrategias que más le brinda
energía a este organismo vivo, es el proceso respiratorio, compuesto de varias etapas enzimáticas
de transformación de los combustibles carbonados, que le permiten oxidar completamente la
fuente carbonada en dióxido de carbono y agua y los electrones rescatados en la etapas
oxidativas, son transportados a través de una cadena de proteínas acopladas a la membrana
mitocondrial interna, proteínas que simultáneamente se encargan de transportar protones desde la
matriz mitocondrial hacia el espacio existente entre las dos membranas que posee la mitocondria,
generando así, un gradiente de concentración de protones, que produce una disminución del pH
en ese espacio. El gradiente formado, se convierte en una fuerza protomotriz que permite
accionar el trabajo de la enzima compleja: ATP sintasa, que se encarga de producir el ATP,
considerada como la “moneda energética universal de los seres vivos, en un proceso denominado
fosforilación oxidativa (Figura 1).
Figura 1. Transporte de electrones a través de la cadena respiratoria

y síntesis de ATP en la fosforilación oxidativa.
En condiciones normales, los procesos de transporte de electrones y fosforilación oxidativa se
encuentran acoplados, de tal manera que, si los electrones pueden fluir libremente por la cadena
de trasportadores, el gradiente de protones formado simultáneamente, conduce a la eventual
formación de ATP. Experimentalmente, es posible detener el transporte de electrones por medio
de inhibidores de las proteínas trasportadoras, con lo cual se detienen los procesos de transporte
de electrones, bombeo de protones y la síntesis de ATP y también se puede desacoplar los dos
procesos mediante la acción de agentes desacoplantes, los cuales, aunque no impiden el
transporte de electrones y el traslado de los protones, estos no quedan disponibles para que la
ATP sintasa pueda utilizar el gradiente. En los dos casos, el proceso de síntesis de ATP se ve
detenido o fuertemente deteriorado, situación que es energéticamente insostenible a largo plazo
para el organismo vivo.
La levadura, también dispone en su membrana plasmática de una proteína de membrana que

actúa como bomba de protones, y se encarga de llevar al medio extracelular, el exceso de
protones como parte de sus sistemas de equilibrio ácido/base, y así, la existencia de esta proteína,
permite evidenciar, por medio de la caída del pH extracelular, si el proceso respiratorio se está
desarrollando de manera normal (Figura 2).
Figura 2. Producción energética en la levadura a partir de glucosa y

destino de los protones generados en la cadena respiratoria.
3. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS.
Para la realización de la presente práctica de laboratorio, será necesario disponer de los equipos,
materiales y reactivos indicados, de acuerdo con las especificaciones consignadas en la tabla 1.
Tabla 1. Cantidades y especificación de los materiales y reactivos requeridos para la práctica

Equipos y materiales Cantidad/grupo Reactivos Cantidad/grupo
Beaker de 100 ml 3 Suspensión de levadura activa 200 mg/ml 15 ml
(preparada por constante agitación con
agua a temperatura ambiente)
Beaker de 250 ml 1 Solución de glucosa al 10% 15 ml
Agitador de vidrio 1 Dinitrofenol 40 mM 0.2 ml
Pipeta de 10 ml 1 Azida de sodio 400 mM 0.5 ml
Pipeta de 1 ml 1
Frasco lavador 1
Agua destilada o desionizada 120 ml
Reactivos y equipos generales

Balanza de precisión 1
4. PROCEDIMIENTO.
4.1. Experimento control.
4.1.1. Diluya 5 ml de suspensión de levadura con 40 ml de agua destilada, asegurándose de

tomar una suspensión uniforme por agitación previa.
4.1.2. Determine con la ayuda de un potenciómetro calibrado, el pH de la solución y repita
la medición tres veces más con intervalos de 3 minutos para obtener la línea basal o
pH inicial tras la activación de la levadura sin adición de combustible energético
exógeno.
4.1.3. Adicione 5 ml de glucosa al 10%, agite y mida el pH lo más pronto posible y anote el
resultado.
4.1.4. De la misma manera, determine y registre el pH de la solución cada 5 minutos, por
cuatro veces adicionales y luego cada diez minutos en dos ocasiones adicionales,
agitando previamente la solución antes de cada determinación.
4.1.5. Registre los resultados obtenidos en la tabla 2.
4.2. Acción del dinitrofenol.
4.2.1. Diluya 5 ml de solución de levadura con 40 ml de agua destilada

4.2.2. Añada por decantación (suavemente por la pared del vaso, cerca de la superficie
líquida) 0.2 ml de una solución de dinitrofenol y agite suavemente
4.2.3. Determine el pH de la solución y repita la medición tres veces más con intervalos de 3
minutos para obtener la línea basal
4.2.4. Espere durante 5 minutos
4.2.5. Repita los pasos descritos en los apartados 4.1.3 y 4.1.4 del experimento control
4.3. Acción de la azida.
4.3.1. Diluya 5 ml de la solución de lavadura con 40 ml de agua destilada

4.3.2. Añada por decantación (lentamente por la pared del vaso, cerca de la superficie
líquida) 0.5 ml de una solución de azida de sodio y agite suavemente.
4.3.3. Determine el pH de la solución y repita la medición tres veces más con intervalos de 3
minutos para obtener la línea basal
4.3.4. Espere durante 5 minutos
4.3.5. Repita los pasos descritos en los apartados 4.1.3 y 4.1.4 del experimento control.
Tabla 2. Resultados de pH de la solución de levaduras en ausencia y presencia de dinitrofenol

y azida de sodio.
Tiempo en Experimento control Dinitrofenol Azida de sodio
minutos
0
(línea basal)
5
10
15
20
30
40
5. RESULTADOS.
Para la presentación del informe correspondiente la presente práctica, con los resultados
obtenidos, diseñe tanto tablas como figuras y con base en ellas realice una descripción lo más
clara posible del comportamiento observado. Adicionalmente, haga un análisis de los resultados,
de tal manera que explique las razones por las cuales se presenta el comportamiento observado,
lo más minuciosamente posible. También este análisis debe incluir una discusión de los
resultados consistente en la comparación de lo observado experimentalmente, con lo que se
espera observar de acuerdo con lo descrito en la literatura científica disponible.
6. CUESTIONARIO
De respuesta a las siguientes preguntas y sustente debidamente sus respuestas
6.1. ¿Cuáles son las fuentes de carbono que utiliza normalmente la levadura para obtener la
energía que precisan sus funciones vitales?
6.2. ¿De cuáles vías metabólicas dispone la levadura para realizar el catabolismo de
carbohidratos?
6.3. ¿Cuáles son los productos finales del catabolismo de los carbohidratos en las levaduras?
6.4. Mencione compuestos que funcionen como inhibidores de la cadena respiratoria de los
sitios I, II y III. Describa su efecto sobre el consumo de oxígeno y la síntesis del ATP.
6.5. ¿Cuál es el mecanismo por medio del cual los protonóforos desacoplan el transporte de
electrones de la fosforilación oxidativa? Describa su efecto sobre el consumo de oxígeno
y la síntesis del ATP.
7. BIBLIOGRAFÍA
 Wedaman KP, Reinke A, Anderson S, Yates J. 3rd., McCaffery JM, Powers T. Tor
kinases are in distinct membrane-associated protein complexes in Saccharomyces
cerevisiae. Mol Biol Cell, 2003, 14(3):1204-20.
 Serrano R. In vivo glucose activation of the yeast plasma membrane ATPase. FEBS Lett,
1983, 30;156(1):11-4.
 Peña A. Studies on the mechanism of K+ transport in yeast. Arch Biochem Biophys,
1975, 167(2):397-409.
 Berg JM, Tymoczko JL, Gatto GJ Jr., Stryer L. Biochemintry. Eight edition. WH.
Freeman & Company: New York. 2015.
 Plummer DT. Introduction To Practical Biochemistry, 3rd edition. McGraw-Hill
Publishing Co. 1987.

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La levadura utilizada en la fabricación del pan, el vino y la cerveza, Saccharomyces cerevisiae, es

Figura 1. Transporte de electrones a través de la cadena respiratoria

La levadura, también dispone en su membrana plasmática de una proteína de membrana que

Figura 2. Producción energética en la levadura a partir de glucosa y

Tabla 1. Cantidades y especificación de los materiales y reactivos requeridos para la práctica

Reactivos y equipos generales

4.1. Experimento control.

4.1.1. Diluya 5 ml de suspensión de levadura con 40 ml de agua destilada, asegurándose de

4.2. Acción del dinitrofenol.

4.2.1. Diluya 5 ml de solución de levadura con 40 ml de agua destilada

4.3. Acción de la azida.

4.3.1. Diluya 5 ml de la solución de lavadura con 40 ml de agua destilada

Tabla 2. Resultados de pH de la solución de levaduras en ausencia y presencia de dinitrofenol

De respuesta a las siguientes preguntas y sustente debidamente sus respuestas

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