Germinação Cultivo Vitro

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA

CURSO DE BIOTECNOLOGIA
Germinação e cultivo in vitro de três espécies do gênero Capsicum
Mariane Rabelo Coelho Fernandes
Monografia apresentada à Coordenação

do Curso de Biotecnologia, da
Universidade Federal de Uberlândia,
para obtenção do grau de Bacharel em
Biotecnologia.
Uberlândia – MG
Dezembro – 2017
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Ana Paula Oliveira Nogueira
Monografia apresentada à Coordenação

do Curso de Biotecnologia, da
Universidade Federal de Uberlândia,
para obtenção do grau de Bacharel em
Biotecnologia.
Uberlândia – MG
Dezembro - 2017
Orientadora: Prof. Dr. Ana Paula Oliveira Nogueira

Instituto de Genética e Bioquímica
Homologado pela Coordenação do Curso de Biotecnologia em __/__/__.
Edgar Silveira
Coordenador
Uberlândia – MG
Dezembro - 2017
Aprovado pela banca examinadora em: 15/12/2017 Nota:100
Ana Paula Oliveira Nogueira

Presidente da Banca
Uberlândia, 15 de dezembro de 2017.

AGRADECIMENTOS
A Universidade Federal de Uberlândia e ao seu corpo docente que me proporcionou
enorme fonte de conhecimento durante a graduação.
Ao Programa Ciência sem Fronteiras, pelo qual pude realizar um dos maiores desejos
de minha vida, além de me promover enorme crescimento profissional e pessoal.
A minha orientadora, Prof. Dr. Ana Paula Oliveira, pelos seus ensinamentos, correções
e suporte no pouco tempo que lhe coube.
Aos membros da banca, por compartilharem comigo suas experiências acadêmicas e
conhecimento.
Ao colega de laboratório, Bruno, pelo apoio ao longo do último ano.
A sétima turma de biotecnologia, que além de companheiros de turma, se tornaram
amigos inseparáveis, que espero ter pela vida toda.
Aos meus pais, minhas irmãs, familiares e amigos, pela paciência e por me motivarem
ao longo desses 5 anos.
Ao meu afilhado, Enzo, por ser a luz da minha vida e me proporcionar infinitos
momentos de alegria.
Ao meu namorado, Gabriel, pelo carinho, apoio e confiança depositados em mim no
momento em que mais precisei.
Aos meus sogros e cunhados, pelo carinho demonstrado em tão pouco tempo.
E a todos que direta ou indiretamente fizeram parte da minha formação, o meu muito
obrigada.
RESUMO
As pimentas cumari-do-pará, malagueta e dedo-de-moça são representantes do gênero
Capsicum, tendo como característica marcante a ardência. Neste trabalho objetivou-se avaliar
as condições ideais de cultivo in vitro, visando a micropropagação destas espécies de
pimentas. Para geração de fonte de explantes, avaliou-se a germinação in vitro de sementes,
provenientes de frutos frescos e secos e a morfologia das plântulas geradas em diferentes
concentrações de sais e sacarose do meio MS. A indução de calos (IC) e a área coberta por
células de calos (ACCC) em explantes foliares e caulinares obtidos de plântulas de cumari-
do-pará foi induzida mediante utilização de 2,4-D e BAP. Observou-se que a germinação de
sementes e vigor de plântulas de cumari-do-pará é mais satisfatória em meio MS50% e 15 g
L-1 de sacarose. Para as pimentas malagueta e dedo-de-moça, sugere-se que estudos para
aumento da taxa de germinação sejam realizados, para que estas sejam utilizadas como fonte
de explantes. Já a IC% e a ACCC% em explantes caulinares e foliares foram maiores quando
se utiliza 2,0 mg L-1 e 1,0 mg L-1 de 2,4-D, respectivamente, sendo a presença de BAP
desnecessária. Conclui-se que, para cumari-do-pará, os objetivos foram atingidos.
Palavras-chave: Capsicum chinense Jacquin.; Capsicum frutescens L.; Capsicum baccatum.

SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 1
1.1. Pimentas do gênero Capsicum ....................................................................................... 1
1.1.1. Principais espécies de Capsicum no Brasil ................................................................ 2
1.1.2. Valor econômico e nutricional das pimentas .............................................................. 3
1.1.3. Capsaicinoides ............................................................................................................ 5
1.2. Cultura de tecidos in vitro ............................................................................................. 7
1.2.1. Germinação de sementes in vitro .............................................................................. 10
1.2.2. Calogênese ................................................................................................................ 11
2. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 12
2.1. Geral .............................................................................................................................. 12
2.2. Específicos ..................................................................................................................... 12
3. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 13

3.1. Local .............................................................................................................................. 13
3.2. Germinação de sementes de pimentas e análise da morfologia das plântulas ........ 13
3.2.1. Fonte de sementes e assepsia .................................................................................... 13
3.2.2. Germinação de sementes de pimentas e análise da morfologia das plântulas.......... 14
3.3. Indução de calogênese em explantes foliares e caulinares utilizando combinações de
BAP e 2,4-D ............................................................................................................................ 16
3.4. Análises estatísticas ...................................................................................................... 16
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 17

4.1. Germinação in vitro e medidas morfológicas de plântulas de Capsicum spp. ......... 17
4.2. Indução de calos (IC) e área coberta por células de calos (ACCC) em explantes
caulinares e foliares de pimenta Cumari-do-pará ............................................................. 29
5. CONCLUSÕES ................................................................................................................. 35
REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 36
APÊNDICES .......................................................................................................................... 44
APÊNDICE A - Germinação de sementes de Capsicum spp. provenientes de frutos frescos
ao longo de 30 dias .................................................................................................................. 44
APÊNDICE B - Resumo da análise de variância em esquema fatorial para germinação de
sementes de Capsicum spp. provenientes de frutos frescos em diferentes concentrações de
meio MS .................................................................................................................................. 44
APÊNDICE C - Germinação de sementes de Capsicum spp. provenientes de frutos secos ao
longo de 30 dias ...................................................................................................................... 44
APÊNDICE D - Resumo da análise de variância em esquema fatorial para germinação de
sementes de Capsicum spp. provenientes de frutos secos em diferentes concentrações de meio
MS ........................................................................................................................................... 44
APÊNDICE E - Resumo da análise de variância em esquema fatorial para médias de
características morfológicas de plântulas de Capsicum spp. obtidas de germinação in vitro de
sementes de frutos frescos ....................................................................................................... 45
APÊNDICE F - Resumo da análise de variância em esquema fatorial para médias de
sementes de frutos secos ......................................................................................................... 46
APÊNDICE G - Porcentagem de indução de calos (IC) e área do explante coberta por
células calos (ACCC) em explantes caulinares de cumari-do-pará em diferentes combinações
de BAP e 2,4-D, após 30 dias de cultivo ................................................................................ 47
APÊNDICE H - Resumo da análise de variância em esquema fatorial para médias de
indução de calos em explantes caulinares de Capsicum chinense Jacquin (cumari-do-pará) sob
diferentes concentrações de BAP e 2,4-D no meio de cultivo, após 30 dias de cultivo ......... 47
APÊNDICE I - Resumo da análise de variância em esquema fatorial para médias de
indução de calos em explantes foliares de Capsicum chinense Jacquin (cumari-do-pará) sob
diferentes concentrações de BAP e 2,4-D no meio de cultivo, após 30 dias de cultivo ......... 47
APÊNDICE J Porcentagem de indução de calos (IC) e área do explante coberta por células
calos (ACCC) em explantes foliares de cumari-do-pará em diferentes combinações de BAP e
2,4-D........................................................................................................................................ 48
APÊNDICE K – Plântulas de cumari-do-pará proveniente de sementes frescas germinadas
in vitro em meio MS ............................................................................................................... 48
APÊNDICE L – Calos em explantes caulinares de cumari-do-pará, em que a) 1,0 mg L-1 de
2,4-D e 0,0 mg L-1 de BAP, b) 2,0 mg L-1 de 2,4-D e 0,0 mg L-1 de BAP e c) 2,0 mg L-1 de
2,4-D e 1,0 mg L-1 de BAP...................................................................................................... 49
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Porcentagem de germinação de sementes de malagueta e cumari-do-pará

(Capsicum spp.) provenientes de frutos frescos em diferentes concentrações de meio MS, 30
dias após inoculação................................................................................................................. 18
Tabela 2 – Porcentagem de germinação de sementes de malagueta, cumari-do-pará e dedo-

de-moça (Capsicum spp.) provenientes de frutos secos em diferentes concentrações de meio
MS, 30 dias após inoculação ................................................................................................... 20
Tabela 3 – Características morfológicas de plântulas de malagueta e cumari-do-pará

(Capsicum spp.) obtidas de germinação in vitro de sementes de frutos frescos, 30 dias após a
inoculação de sementes ........................................................................................................... 24
Tabela 4 – Características morfológicas de plântulas de cumari-do-pará, malagueta e dedo-

de-moça (Capsicum spp.) obtidas de germinação in vitro de sementes de frutos secos, 30 dias
após a inoculação de sementes .............................................................................................. 26
Tabela 5 - Porcentagem de indução de calos em explantes caulinares de cumari-do-pará (C.

chinense) sob diferentes concentrações de BAP e 2,4-D no meio de cultivo, após 30 dias de
cultivo ...................................................................................................................................... 30
Tabela 6 - Porcentagem de indução de calos em explantes foliares de cumari-do-pará (C.

chinense) sob diferentes concentrações de BAP e 2,4-D no meio de cultivo, após 30 dias de
cultivo ...................................................................................................................................... 31
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Frutos de pimentas do gênero Capsicum................................................................. 2
Figura 2 – Estrutura química da capsaicina ............................................................................. 6
Figura 3 - Esquema representativo das diversas técnicas de cultivo in vitro ........................... 9
Figura 4 - Sementes extraídas de frutos frescos de Capsicum spp. ....................................... 14
Figura 5 – Medições de características morfológicas das plântulas obtidas in vitro ............ 15
Figura 6 – Germinação in vitro de sementes de cumari-do-pará, malagueta e dedo-de-moça

(Capsicum spp.) provenientes de frutos frescos em diferentes concentrações de meio MS ao
longo de 30 dias ...................................................................................................................... 17

(Capsicum spp.) provenientes de frutos secos em diferentes concentrações de meio MS ao
longo de 30 dias ...................................................................................................................... 19
Figura 8 – Porcentagem de indução de calos (IC) e área do explante coberta por células de
calos (ACCC) em explantes caulinares de cumari-do-pará em diferentes combinações de BAP
e 2,4-D, 30 dias após a inoculação .......................................................................................... 29
2,4-D, 30 dias após a inoculação ............................................................................................. 32
LISTA DE ABREVIAÇÕES
2,4-D Ácido 2,4 Diclorofenoxiacético

ACCC Área do explante coberta por células de calos
AIB Ácido indol butírico
ANA Ácido Alfa- Naftalenoacético
BAP 6-Benzilaminopurina
cm Centímetro
g Grama
g L-1 Grama por Litro
ha Hectare
IC Indução de calos
Kg Quilograma
KIN Cinetina
m Metro
mg L–1 Miligrama por Litro
mL Mililitro
MS Murashige e Skoog
MS0% Meio de cultura composto por água e ágar
MS100% Meio de cultura MS com concentração total de sais e 30 g L-1 de
sacarose
MS50% Meio de cultura MS com metade da concentração de sais e 15 g L-1 de
sacarose
pH Potencial de Hidrogênio
T Tonelada
t/ha Tonelada por hectare
v/v Volume por volume (fração volumétrica)
und Unidade
1. INTRODUÇÃO
1.1. Pimentas do gênero Capsicum
As pimentas do gênero Capsicum são bastante apreciadas na culinária brasileira
devido a sua característica mais marcante, a ardência (também chamada pungência). As
diversas variedades de pimentas são consumidas in natura, desidratadas, moídas e também na
forma de geleias e molhos (CARVALHO et al., 2006).
O gênero Capsicum, pertencente à família Solanaceae, é composto por plantas bem
adaptadas ao clima tropical e tem como centro de origem as Américas (PINHEIRO;
AMARO; PEREIRA, 2012). O Brasil, por sua vez, é um grande centro de diversidade
genética do gênero, sendo as regiões sudeste e centro-oeste as principais áreas de cultivo no
país (FURTADO; DUTRA; DELIZA, 2006). De acordo com a Food and Agriculture
Organization (FAO), no ano de 2014, foi produzido cerca de 32.300.000 t de Capsicum
mundialmente, colhidas em uma área equivalente a 1.937.370 ha, com rendimento de 16,68
t/ha (FAO, 2014).
O gênero Capsicum apresenta 33 espécies, entretanto, apenas cinco espécies são
domesticadas e cultivadas: Capsicum annuum L., Capsicum baccatum L., Capsicum chinense
Jacq., Capsicum frutescens L. e Capsicum pubescens L, sendo que a última não é cultivada no
Brasil (COSTA et al., 2015; MENICHINI et al., 2009; DUTRA et al., 2010). As plantas
deste gênero possuem grande variabilidade quanto às suas características morfológicas, tais
como tamanho, cor e formato de folhas, frutos e flores, entre outros. São, em sua maioria,
anuais, diploides (2n=24) e autógamas, ou seja, a autofecundação ocorre em uma taxa igual
ou superior a 95%, entretanto é possível que ocorra polinização por intermédio de abelhas e
outros insetos, permitindo que a fecundação cruzada atinja até 40% entre plantas da mesma
espécie e, em alguns casos, do mesmo gênero. São consideradas, em sua maior parte, plantas
arbustivas, com caule semilenhoso que pode exceder 1,0 m de altura. O sistema radicular é
pivotante, podendo atingir até 1,2m de profundidade (FILGUEIRA, 2008; PICKERSGRILL,
2007; CARVALHO; BIANCHETTI, 2004; MARTIN; SANTIAGO; COOK, 1979).
1.1.1. Principais espécies de Capsicum no Brasil
As pimenteiras da espécie C. chinense Jacquin são bem adaptadas ao clima tropical e
apresentam maior resistência a doenças deste clima do que as outras espécies. No Brasil, a
espécie é representada pelas pimentas biquinho, cumari-do-pará (Figura 1A), pimenta de
cheiro (Figura 1B), entre outras. Os frutos podem apresentar cor verde (imaturos) até amarelo
e vermelho escuro (maduros), possuindo alta pungência e intenso aroma. A pimenta cumari-
do-pará, especificamente, possui frutos de formato ovalado a triangular, com cerca de 3 cm de
comprimento, sendo amarelos quando maduros e muito picantes (CARVALHO et al., 2006).
Figura 1 – Frutos de pimentas do gênero Capsicum. A) Pimentas Cumari-do-pará e

malagueta em conserva; B) Pimenta de cheiro in natura; C) Pimentões in natura.
A espécie Capsicum baccatum L., representada pelas pimentas dedo-de-moça e
cambuci, possui frutos de tamanho médio, polpa firme e com pungência variável de suave a
2
média. A pimenta dedo-de-moça possui pungência mediana, frutos alongados, com cerca de
7,5 cm de comprimento que são vermelhos quando maduros (CARVALHO et al., 2006).
As pimentas tabasco e malagueta são exemplares da espécie Capsicum frutescens L.,
que é um dos grupos de pimenta mais conhecidos, sendo consumidas in natura, em conservas
e na forma de molhos. Seus frutos são do tipo baga, de forma cônica, alongada e cor verde ou
vermelha, com 8 a 12 cm de comprimento e 1 a 2 cm de diâmetro (CARVALHO;
BIANCHETTI, 2004). A pimenta malagueta (Figura 1A) possui alta pungência e seus frutos
medem de 1 cm a 3 cm de comprimento e são vermelhos quando maduros (CARVALHO et
al., 2006).
Por fim, os pimentões (Figura 1C), páprica e jalapeño, fazem parte do grupo de
pimentas da espécie Capsicum annuum L. var. annuum, que ocupa a maior área cultivada de
pimentas no mundo. Esta espécie apresenta frutos que diferem quanto ao formato, tamanho,
posição na planta, cor e à pungência (CARVALHO et al., 2006).
1.1.2. Valor econômico e nutricional das pimentas
No Brasil, o cultivo de pimentas ganhou popularidade nos últimos anos em todo
território, com destaque para os estados de Minas Gerais, Goiás, São Paulo, Ceará e Rio
Grande do Sul (RIBEIRO; REIFSCHNEIDER, 2008). O cultivo é realizado por pequenos,
médios e grandes produtores de maneira individual ou de forma integrada a agroindústria
(FURTADO; DUTRA; DELIZA, 2006; RIBEIRO et al., 2008).
A informação disponível sobre valores de produção e comercialização de pimentas no
Brasil não expressa a realidade econômica para esta hortaliça. Grande parcela da produção e
comercialização ocorre em mercados regionais e locais, não datados, não contribuindo com
valores estatísticos reais (DOMENICO; LILLI; MELO, 2010).
3
Atualmente, estima-se que a produtividade nacional média de pimentas esteja entre 10
a 45 t/ha ao ano. A pimenta malagueta, a mais cultivada no Brasil, tem uma produtividade de
10 t/ha. Outros exemplos de produtividade são das pimentas biquinho e de bode, que se
encontra em torno de 20 t/ha (GENUNCIO; ZONTA; NASCIMENTO, 2015).
Segundo Rufino e Penteado (2006), a importância socioeconômica da pimenta deve-se
ao alto valor agregado ao produto e ao emprego de mão-de-obra. No Brasil, segundo o Censo
Agropecuário (IBGE, 2006), a produção de pimenta foi de aproximadamente 18700 t na safra
de 2006, gerando um valor de produção de R$29,77 milhões, sendo as regiões Nordeste
(34,35% da produção) e Sudeste (30,13%) as maiores produtoras. De acordo com um
levantamento feito pela Central de Abastecimento de Minas Gerais (CEASA-MG), na
unidade de Uberlândia, no ano de 2016 o preço médio de pimentas foi de R$8,64/kg e o total
de pimentas ofertadas foi de aproximadamente 232 mil kg, sendo as pimentas de bode e
biquinho as mais ofertadas.
O fruto é utilizado na medicina popular no combate às inflamações na garganta e
diarreia, como dilatador capilar e expectorante (PIRES, 2004). Outras aplicações na medicina
popular são para o tratamento de artrites, reumatismo, erupções cutâneas, feridas e picadas de
animais (MEGHVANSI et al., 2010; VAN WYK; WINK, 2004).
Atualmente, existem diversos produtos desenvolvidos à base de capsaicina disponíveis
no mercado. Estes produtos incluem pomadas anti-inflamatórias, pomadas para artrite,
xampus, cremes hidratantes, entre outros. A capsaicina é comercializada principalmente na
forma de pomadas, géis e cremes, que são bastante utilizadas no tratamento de artrites e
artroses. O emplastro Sabiá é aplicado para o alívio de dores musculares (CARVALHO et al.,
2006). Um adesivo tópico (Qutenza) à base de capsaicina de alta potência (8%) é utilizado no
tratamento da dor associada à neuralgia pós-herpética, mediante supervisão médica (JONES;
MOORE; PETERSON, 2011).
4
Além disso, do ponto de vista nutricional, os frutos de pimenta são fonte de vitaminas,
proteínas, lipídeos, minerais e fibras. As vitaminas C, E e os carotenoides presentes nas
pimentas agem como antioxidantes, que podem atuar na prevenção de doenças
cardiovasculares, cataratas, câncer, entre outras (REIFSCHNEIDER, 2000).
1.1.3. Capsaicinoides
A principal característica das pimentas do gênero Capsicum é a pungência. Esta
característica pode ser atribuída a alcaloides denominados capsaicinoides, que estão
acumulados na placenta (tecido interno do fruto onde estão armazenadas as sementes) e são
liberados quando o fruto sofre dano físico (CARVALHO et al., 2006) sendo que o grau de
pungência varia entre espécies e variedades, tendo duas escalas de classificação mais comuns:
a escala de Unidade de Calor de Scoville (SHU) e a escala de temperatura.
A escala de Unidade de Calor de Scoville (SHU) é uma forma de avaliar a pungência
de pimentas, as quais podem ser elencadas em baixa (0 a 30 mil SHU), média (30 a 75 mil
SHU), alta pungência (75 a 120 mil SHU) e, acima de 120 mil SHU, muito alta pungência
(REIFSCHNEIDER, 2000). Segundo Bontempo (2007), a capsaicina pura equivale a
15.000.000 de unidades Scoville. Quando o valor de SHU ultrapassa 120 mil, as pimentas são
utilizadas em conservas, na indústria farmacêutica e na indústria bélica, para fabricação de gás
de pimenta (REIFSCHNEIDER, 2000). Já na Escala de Temperatura, criada por Julie Cohn, a
pungência da pimenta é classificada em uma escala de 1 a 10, sendo espécies muito picantes
classificadas de 8 a 10, espécies com média ardência de 4 a 6 e espécies com pouco ardor de 1
a 3 (LINGUANOTTO NETO, 2004).
São conhecidos aproximadamente 14 capsaicinóides, destes os que ocorrem em maior
quantidade são a capsaicina (Figura 2), a diidrocapsaicina e a nordiidrocapsaicina, que variam
5
conforme a maturação do fruto e são responsáveis por mais de 90% da pungência (SIMÕES
et al., 2010).
Figura 2 – Estrutura química da capsaicina.
A capsaicina vem sendo considerada uma substância medicinal, visto que apresenta
propriedades antioxidante, anti-inflamatória, quimiopreventiva, bactericida, anticancerígena e
anti-hemorrágica. Além de atuar como estimulante do apetite, a capsaicina controla o
colesterol, induz termogênese, influencia a liberação de endorfinas e funciona como
analgésico natural (PINTO; PINTO; DONZELES, 2013; BONTEMPO, 2007).
De acordo com Bhutani et al. (2007) e Dou et al. (2011), a capsaicina também possui
capacidade de bloquear vias de ativação relacionadas com a formação de tumores e, portanto,
apresenta potencial para a prevenção e tratamento de mielomas múltiplos e outros tipos de
câncer. Mori et al. (2006) relata que a capsaicina foi capaz de promover apoptose in vitro em
linhagens celulares de câncer de próstata e reduziu significativamente o crescimento de massa
tumoral in vivo.
Diversos estudos relatam o potencial medicinal das pimentas do gênero Capsicum,
bem como potencial para uso no agronegócio, no controle de pragas. Segundo Neves et al.
(2009), o extrato de pimenta malagueta apresentou atividade nematicida contra juvenis de
Meloidogyne javanica. De acordo com Costa et al. (2009), as pimentas cumari, cambuci e
malagueta podem ser usadas como conservantes naturais em alimentos, devido a presença de
antioxidantes.
6
Guimarães et al. (2014) constata que extratos aquosos de sementes de pimenta dedo-
de-moça apresentam atividade repelente sobre o gorgulho do milho e frutos de pimenta dedo-
de-moça possuem atividade inseticida tanto na forma de extratos alcoólicos quanto de extratos
aquosos. O uso de compostos bioativos de plantas no controle de pragas e vetores, por ser um
método natural, torna-se mais seguro e barato do que a utilização de agroquímicos. Além
disso, evita-se a bioacumulação de defensivos agrícolas no ambiente e em animais que não
são alvos da desinfestação (MADHUMATHY; AIVAZI; VIJAYAN, 2007).
1.2. Cultura de tecidos in vitro
A cultura de tecidos vegetais pode ser utilizada tanto na agricultura, por meio da
multiplicação rápida e eficiente de plantas, da engenharia genética, da poliploidização, da
conservação de germoplasma, quanto na indústria, pela produção de metabólitos secundários,
tendo em vista sua alta em condições in vitro (ARIKAT et al., 2004; RAMACHANDRA
RAO; RAVISHANKAR, 2002; BOTTA et al., 2001). O cultivo in vitro, por ser independente
de clima ou estações do ano, permite uma produção contínua de plântulas ou calos (massa
celular indiferenciada).
Portanto, os setores agronômico e industrial são beneficiados pelo melhoramento nas
técnicas de cultivo in vitro de pimentas. Uma possibilidade seria a análise da capacidade
medicinal, agronômica e industrial da capsaicina, produzindo-se esse composto por sistemas
de suspensão celular, obtidos por intermédio de calos friáveis (calos que se fragmentam
facilmente). Ademais, a transformação genética e obtenção de poliploides do gênero
Capsicum são favorecidas pelo levantamento de dados sobre o cultivo in vitro.
Segundo Quisen e Angelo (2008), a cultura de tecidos vegetais é um conjunto de
técnicas em que células e tecidos vegetais são cultivados in vitro em meio nutritivo sintético,
7
de composição definida, sob condições adequadas de assepsia, nutrição, luz e temperatura,
com o objetivo de gerar uma planta. A técnica de cultura de tecidos in vitro é baseada na
Teoria da Totipotência que, segundo Termignoni (2005), determina que todas as células
vegetais nucleadas vivas são totipotentes e qualquer fragmento vegetal (folha, caule, gema
axilar) pode gerar uma planta completa desde que as condições nutricionais, hormonais e o
meio de cultura sejam adequados.
Nas técnicas de cultura in vitro, pequenos fragmentos de tecido vivo, chamados de
explantes, são retirados de um organismo vegetal, passam por uma desinfestação e são
cultivados assepticamente, por períodos indefinidos em um meio de cultura apropriado
(TORRES et al., 1998). O meio de cultura deve fornecer todas as substâncias essenciais, tais
como os macronutrientes e micronutrientes, para o crescimento dos tecidos, sendo o padrão
de crescimento e desenvolvimento controlado por meio dos reguladores de crescimento, como
as auxinas e as citocininas (CALDAS et al., 1998)
Os principais reguladores de crescimento utilizados são as auxinas, tais como ácido
naftalenoacético (ANA), ácido indol-3-acético (AIA) e ácido indol-3-butírico (AIB), que têm
a capacidade de produzir crescimento celular e promover a divisão celular (KRIKORIAN,
1991), também pode-se citar o ácido diclorofenóxiacético (2,4-D), uma auxina sintética
amplamente utilizada na indução de calos (NOGUEIRA et al., 2007). Outra classe de
reguladores de crescimento são as citocininas, principalmente 6-Benzilaminopurina (BAP) e
cinetina (CIN), que promovem divisão, alongamento e diferenciação celular (TAIZ; ZEIGER,
1991). O balanço de auxinas/citocininas adicionados ao meio de cultura, permite a
regeneração da planta inteira, pois influencia a via metabólica que o explante deve seguir,
sendo esta via destinada à emissão de raízes, brotos ou calos (SKOOG; MILLER, 1957).
8
Na técnica de cultura de tecidos mais empregada, a micropropagação, existem duas
rotas de multiplicação (Figura 3), uma por meio da organogênese direta, na qual o explante se
desenvolve em um indivíduo completo sem passar pela fase de formação de calos, e outra por
meio da organôgenese indireta, passando pela fase de calo (massa celular indiferenciada)
(GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). O cultivo de calos pode ser utilizado para se
estudar o desenvolvimento celular, obtenção de compostos provenientes do metabolismo
primário e secundário, obter suspensão celular e propagação por meio de geração de gemas ou
embriões somáticos (LANDA et al., 2000; SANTOS et al., 2005).
Figura 3 – Esquema representativo das diversas técnicas de cultivo in vitro (Adaptado de

Andrade, 2002).
A proporção entre auxina e citocinina é determinante na resposta organogênica, em
que altas razões auxina/citocinina geralmente induzem à formação de raiz, enquanto baixas
proporções promovem a formação de brotos. Já a formação de calos, geralmente, ocorre em
razões intermediárias da combinação entre ambos reguladores (TAKAHASHI, 2002).
9
1.2.1. Germinação de sementes in vitro
O primeiro passo para o sucesso do estabelecimento in vitro de uma espécie é a
escolha de uma boa fonte de explantes. Parte das contaminações que ocorrem frequentemente
em culturas de tecidos vegetais podem ser consequência da presença de microrganismos
endofíticos (AZEVEDO, 1998). Desta forma a utilização de plantas germinadas in vitro para
os experimentos de cultura de tecidos vegetais promove uma maior facilidade na obtenção de
explantes assépticos, pois as sementes podem ser submetidas a protocolos de desinfecção
mais intensos, devido a maior proteção do embrião (GRIGOLETTO, 1997). Do ponto de vista
fisiológico, a capacidade das plântulas germinadas in vitro gerarem respostas, como a
calogênese, aos reguladores de crescimento é favorecida por se encontrarem em um melhor
estágio juvenil (GRIGOLETTO, 1997; GRATAPAGGLIA; MACHADO, 1998).
A germinação é um evento fisiológico que depende da qualidade da semente e das
condições de germinação, que são variáveis entre as espécies vegetais (SALOMÃO; SOUSA-
SILVA, 2003). Dessa forma, é importante otimizar o processo de germinação por meio de
estudos de meio de cultura, favorecendo a obtenção de plantas sadias e vigorosas que possam
ser utilizadas como fonte de explantes (ALMEIDA et al., 2013).
O meio de cultura MS, desenvolvido por Murashige e Skoog (1962) é considerado o
meio básico de cultura, composto de sais subdivididos em: macronutrientes, micronutrientes,
fonte de carbono (sacarose), vitaminas e hexitol (mio-inositol). Entretanto, em alguns casos a
utilização de composições menos concentradas em macronutrientes são mais satisfatórias
(GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). Segundo Souza (2003), ao adicionar-se sacarose ao
meio de cultura, pode-se manter a plântula in vitro por um maior período de tempo,
entretanto, para algumas espécies, não há necessidade de suplementação do meio de cultura
com sacarose.
10
De acordo com Freitas e colaboradores (2008), os frutos da pimenteira são
considerados carnosos e, portanto, suas sementes apresentam alto teor de água após a colheita
e extração. A submissão das sementes a um processo de secagem é importante para que o teor
de água seja diminuído até níveis adequados, levando a conservação de características como
germinação e vigor durante o armazenamento e até o momento da semeadura.
O resultado das alterações morfológicas, físicas e fisiológicas, como variações no
vigor e no acúmulo de matéria seca é definido como a maturação da semente, sendo este um
processo que se inicia com a fertilização e se estende até a maturidade fisiológica - momento
em a transferência de matéria seca da planta à semente é interrompida (MARCOS FILHO,
2005). A maturação fisiológica é um pré-requisito para o sucesso da germinação, visto que a
maturação da semente é uma condição fundamental na determinação da qualidade da semente
(DIAS et al., 2006). Além disso, segundo Nascimento e Freitas (2006), para sementes de
frutos carnosos, como as pimentas, os maiores índices de vigor, reserva de matéria seca e
germinação são encontrados no período de maturidade fisiológica destas.
1.2.2. Calogênese
Na calogênese, ou seja, na formação de massa de células indiferenciadas, utiliza-se
explantes provenientes de tecidos jovens e não lignificados, pois estes apresentam maior
potencial de resposta in vitro. A partir de calos friáveis, que se desintegram facilmente, pode-
se obter uma suspensão celular, utilizada como uma fonte de extração de metabólitos
secundários, a partir do cultivo de células em larga escala (VANISREE et al., 2004). O
crescimento de calos também pode ser empregado na indução de variação somaclonal, bem
como para possíveis estudos fisiológicos (DIXON; PAIVA, 1995; RODRIGUES;
ALMEIDA, 2010).
11
São necessários reguladores de crescimento no meio de cultura para que ocorra a
calogênese nos explantes inoculados, visto que os reguladores modificam o metabolismo das
células, causando assim a desdiferenciação. O processo é influenciado pelo estado físico de
incubação, como luminosidade e calor, pela constituição do meio nutritivo e pelo tipo de
explante (GEORGE; HALL; KLERK, 2008).
De acordo com Vietez e San-José (1996), para que haja a formação de calos,
recorrentemente é preciso que ocorra a adição de reguladores de crescimento exógenos ao
meio de cultura. Sendo essa exigência devida à concentração e equilíbrio de auxinas e
citocininas, ao conteúdo endógeno de hormônios no explante, ao genótipo da planta matriz e
ao tipo de explante utilizado. Desta forma, estudos sobre as condições de cultivo in vitro de
espécies produtoras de compostos bioativos com potencial valor medicinal, agronômico e
econômico são de extrema importância para que se permita futura produção em larga escala
deste composto.
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Avaliar as condições de cultivo in vitro visando a micropropagação das pimentas
cumari-do-pará, malagueta e dedo-de-moça (Capsicum spp.).
2.2 . Específicos
 Avaliar a germinação in vitro de sementes provenientes de frutos secos e frescos de cumari-
12
do-pará, malagueta e dedo-de-moça (Capsicum spp.) em diferentes concentrações de sais do
meio MS.
 Avaliar as características morfológicas de plântulas de cumari-do-pará, malagueta e
dedo-de-moça (Capsicum spp.) germinadas in vitro em diferentes concentrações de sais do
meio MS, visando fontes potenciais de explantes;
 Avaliar as concentrações de BAP e 2,4-D necessárias para indução de calos em
explantes caulinares e foliares de pimenta cumari-do-pará (C. chinense).
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Local
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais
(4C-222b), do Instituto de Genética e Bioquímica - INGEB, da Universidade Federal de
Uberlândia – UFU.
3.2. Germinação in vitro e análise da morfologia de plântulas geradas in
vitro
3.2.1. Fonte de sementes e assepsia
Nesta pesquisa, foram realizados dois experimentos, sendo o primeiro com uso de
sementes extraídas de frutos frescos e o segundo com sementes extraídas de frutos secos
(submetidos a secagem natural/armazenamento por aproximadamente 20 dias). Os frutos das
13
espécies cumari-do-pará (Capsicum chinense Jacquin), malagueta (C. frutescens L.) e dedo-
de-moça (C. baccatuum L.) foram adquiridos em comércio local no município de Uberlândia-
MG.
Para assepsia das sementes de ambos experimentos, os frutos foram previamente
lavados com detergente neutro e, em câmara de fluxo laminar, desinfestados com solução de
hipoclorito de sódio 2,5% por dez minutos. Após este procedimento, foram lavados três vezes
com água destilada autoclavada, em seguida foram cortados com auxílio de um bisturi. As
sementes foram extraídas (Figura 4), imersas em álcool etílico 70% (v/v) por um minuto e
lavadas com água destilada autoclavada. Adicionou-se solução de hipoclorito de sódio 2,5%
por cinco minutos e por fim as sementes foram lavadas três vezes com água destilada
autoclavada.
Figura 4 - Sementes extraídas de frutos frescos de Capsicum spp. A) Pimenta malagueta

(Capsicum frutescens L.). B) Pimenta cumari-do-pará (Capsicum chinense Jacquin). C)
Pimenta dedo-de-moça (Capsicum baccatuum L.)
3.2.2. Germinação de sementes de pimentas e análise da morfologia das plântulas
Com intuito de avaliar a germinação de sementes e morfologia das plântulas de
pimenta cultivada in vitro, os experimentos foram realizados em esquema fatorial, sendo o
14
primeiro fator, constituído pelas espécies (malagueta, dedo-de-moça e cumari-do-pará) e o
segundo fator, pelo meio de cultura MS (0, 50 e 100% das concentrações de sais
suplementados com 0, 15 e 30 g L-1 de sacarose). Adotou-se o delineamento experimental
inteiramente ao acaso com seis repetições, sendo cada unidade experimental constituída por
um frasco contendo 30 mL de meio de cultivo, onde foram inoculadas 10 sementes. Antes da
inoculação das sementes, o pH do meio de cultura foi corrigido para 5,8 e os meios foram
solidificados com 8 g L-1 de ágar. Por fim, os meios de cultura foram autoclavados a 120 ºC e
1,1 atm, durante 20 minutos. O número de sementes germinadas foi avaliado a cada 2 dias por
um período de 30 dias.
Ao final dos 30 dias, mediu-se: o comprimento da parte aérea e da raiz principal (cm),
cuja soma resultou no tamanho da plântula e o comprimento e largura das folhas primordiais
(cm), conforme figura 5. Avaliou-se também o número de folhas, de raízes secundário e a
matéria fresca das plântulas (g). Os processos metrológicos foram realizados com o uso de
régua milimétrica e balança de precisão, medindo, quando disponíveis, 5 plântulas de cada
repetição.
Figura 5 – Medições de características morfológicas das plântulas obtidas in vitro. A)

Medida do comprimento da folha primordial (cm). B) Medida da largura da folha primordial
(cm). C) Medida da parte aérea e da raiz principal (cm), resultando no tamanho da plântula
(cm).
15
3.3. Indução de calogênese em explantes foliares e caulinares utilizando
combinações de BAP e 2,4-D
Inocularam-se segmentos de folhas ou caules, obtidos de plântulas de pimenta cumari-
do-pará, em meios de cultura MS suplementados com diferentes concentrações de 2,4-D (0,0;
1,0; 2,0; e 4,0 mg L-1) combinado com BAP (0,0; 1,0; 2,0; e 4,0 mg L-1). O pH foi corrigido
para 5,8 e os meios foram solidificados com 8 g L-1 de ágar e suplementados com 30 g L-1 de
sacarose. Por fim, os meios de cultura foram autoclavados a 120ºC e 1,1 atm, durante 20
minutos. O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado, em que
cada tratamento foi constituído por 12 repetições, sendo cada repetição um tubo contendo 10
ml de meio de cultivo, onde foram inoculadas um explante caulinar ou foliar. Os tratamentos
foram mantidos sob fotoperíodo de 16h. A cada 7 dias, durante um mês, foram feitas
observações acerca da indução de caule (IC) e área do explante coberta por células de calos
(ACCC). A ACCC foi contabilizada por meio de uma adaptação do método descrito por
Mendonça et al. (2013), em que a ACCC foi dada pelas porcentagens 0, 10, 25, 50, 75, 90 ou
100% de área do explante coberta por células de calos.
3.4 . Análises estatísticas
Os dados de germinação, caracteres morfológicos das plântulas e indução de calos
foram submetidos à análise de variância em esquema fatorial. Anteriormente à análise,
procedeu-se a transformação dos dados para atender às pressuposições da ANOVA, conforme
descrito abaixo, de acordo com Ferreira (2011):
Transformação para germinação: arcsen√ , em que 100% = 100 - ¼N e 0% = ¼N
Transformação para características morfológicas e indução de calos: √
16
As médias foram comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de significância,
utilizando-se o Programa Genes (CRUZ, 2016).
Os dados de área coberta por células de calo foram submetidos somente à análise
descritiva, pelo programa EXCEL.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Germinação in vitro e medidas morfológicas de plântulas de Capsicum
spp.
A taxa de germinação in vitro de sementes provenientes de frutos frescos de três
espécies de pimenta ao longo de 30 dias após a inoculação está apresentada na Figura 6. Os
tratamentos correspondentes ao meio MS0% foram perdidos, devido a não gelificação do
ágar.
Figura 6– Germinação in vitro de sementes de cumari-do-pará, malagueta e dedo-de-moça

(Capsicum spp.) provenientes de frutos frescos em diferentes concentrações de meio MS ao
longo de 30 dias.
17
Notou-se que a germinação de sementes cumari-do-pará (C. chinense) iniciou-se ao
sétimo dia após a inoculação em ambos os meios de cultura (MS50% e MS100%). Ademais,
observou-se que, ao final dos 30 dias, a pimenta cumari-do-pará apresentou alta taxa de
germinação em ambos os meios de cultura testados, sendo 93,3% no meio MS100% e 83,3%
no MS50%. A germinação da espécie malagueta (C. frutescens) iniciou-se no dia 7 após a
inoculação das sementes em meio MS50% e no dia 12 após a inoculação em meio MS100%.
A taxa de germinação foi visivelmente menor nestas pimentas em relação às sementes de
cumari-do-pará, visto que apenas 18,3% sementes germinaram em ambos os meios de cultivo.
Por outro lado, as sementes de pimenta dedo-de-moça (C. baccatum) não germinaram em
nenhum dos meios de cultura testados.
Considerando-se que não houve germinação para as sementes de dedos-de-moça,
analisaram-se estatisticamente apenas os dados de malagueta e cumari-do-pará.
Desta forma, pela análise de variância constatou-se que não houve efeito significativo
para a interação entre espécie e meio de cultura, havendo significância apenas para a espécie.
Pela Tabela 1, observou-se a superioridade de germinação in vitro das sementes de pimenta
cumari-do-pará.
Tabela 1 – Porcentagem de germinação de sementes de malagueta e cumari-do-pará
(Capsicum spp.) provenientes de frutos frescos em diferentes concentrações de meio MS, 30
dias após inoculação.
Meio de Cultura
Tipo de pimenta MS50%¹ MS100%² Média
Malagueta 16,30 17,35 16,82 bb
Cumari-do-pará 88,76 93,20 90,98 aa
Média 52,53 AA 55,27 AA
Coeficiente de Variação (%) 18,39
Médias seguidas pelas mesmas letras maiúsculas na horizontal e minúsculas na vertical não diferem
estatisticamente entre si, pelo teste de Tukey a nível de 5% de significância.
¹ Meio MS com metade das concentrações de sais e 15 g L-1 de sacarose.
² Meio MS com concentração total de sais e 30 g L-1 de sacarose.
18
Na germinação in vitro de sementes provenientes de frutos secos, constatou-se que as
sementes de cumari-do-pará, embora tenha ocorrido um decréscimo em relação às
provenientes de frutos frescos, ainda possuem a melhor taxa de germinação entre as três
pimentas, nos três meios testados, sendo a melhor taxa, ao longo de 30 dias, no meio
MS100% (80% de sementes germinadas), seguido pelo meio MS0% (68% de sementes
germinadas) e pelo meio MS50% (64% de sementes germinadas), sendo o início da
germinação no quinto dia após inoculação (Figura 7).

(Capsicum spp.) provenientes de frutos secos em diferentes concentrações de meio MS ao
longo de 30 dias.
Para a pimenta malagueta, o início da germinação de sementes no meio MS50% se
deu ao sétimo dia após a inoculação, já a germinação nos meios MS100% e MS0%, se
iniciaram no dia 10 após a inoculação (Figura 7). As taxas de germinação para essas
pimentas, ao longo de 30 dias, foram ligeiramente menores em comparação com as taxas de
germinação de frutos frescos, sendo que MS50% apresentou 16,7% sementes germinadas,
19
seguida pelo meio água e ágar, com 13,3% de sementes germinadas e pelo meio MS100%,
com 11,6% sementes germinadas.
Entretanto, para a pimenta dedo-de-moça, a secagem agiu positivamente sobre a
germinação nos meios MS0% e MS50%, sendo as taxas de germinação 36,7% e 13,3% de
sementes germinadas, respectivamente. O início da germinação para as sementes desta
espécie ocorreu no dia 14 após a inoculação no meio MS0%, no dia 18 após a inoculação no
meio MS100% e no dia 26 após a inoculação no meio MS50% (Figura 7).
De acordo com a análise de variância, constatou-se que houve efeito significativo da
interação entre espécie e meio de cultura. Pela Tabela 2, observou-se novamente a
superioridade de germinação in vitro das sementes de pimenta cumari-do-pará, não havendo
diferença significativa dos meios de cultura. A pimenta dedo-de-moça apresentou maiores
taxas de germinação em meio MS0% e MS50%, não havendo diferença significativa entre
estes. Para as pimentas malaguetas, não se observou diferença significativa entre os meios de
cultura, entretanto esta pimenta apresentou inferioridade nas taxas de germinação em relação
à dedo-de-moça no meio MS0%.
Tabela 2 – Porcentagem de germinação de sementes de malagueta, cumari-do-pará e
dedo-de-moça (Capsicum spp.) provenientes de frutos secos em diferentes concentrações de
meio MS, 30 dias após inoculação.
Meio de Cultura
Tipo de Pimenta MS0%¹ MS50%² MS100%³
Malagueta 14,34 Ac 15,03 Ab 10,75 Ab
Cumari-do-pará 69,81 Aa 64,56 Aa 80,96 Aa
Dedo-de-moça 34,79 Ab 11,98 ABb 5,66 Bb
¹ Meio composto por água e ágar.
³ Meio MS com metade das concentrações de sais e 15 g L-1 de sacarose.
20
Com base nos resultados de ambos os experimentos de germinação, constatou-se que
para a pimenta cumari-do-pará a taxa de germinação é maior quando estas são provenientes
de frutos frescos. Em um estudo com mangabeira, Ledo et al. (2007) relata que não foi
observada diferença significativa dos tratamentos para a porcentagem de germinação aos vinte
dias, que variou de 95 a 100%.
Entretanto, nota-se no presente estudo que o meio de cultura MS100% foi o que
apresentou a maior taxa de germinação de pimenta cumari-do-pará, o que é mais evidente no
experimento com sementes de frutos secos. Zanotti et al. (2012), estudando a germinação de
sementes de copaíba, observaram que houve mais sementes germinadas em meio com
concentração total de sais do que em meio com concentração de sais reduzida pela metade. Já
Naves (2001), na propagação in vitro de bromélia imperial, avaliou a germinação de sementes
utilizando meio MS em diferentes concentrações e observou uma maior percentagem de
germinação das sementes presentes nos meios com concentrações superiores a 75% do MS.
A secagem dos frutos de pimenta cumari-do-pará atuou negativamente sobre a
germinação dessas pimentas, possivelmente reduzindo o teor de água das sementes até um
nível crítico, o que afeta a qualidade destas, tornando-as menos viáveis para germinação.
Baseado na baixa taxa e no início de germinação dessas variedades, considerou-se
uma das prováveis causas, a possibilidade de dormência das sementes de pimentas malagueta
e dedo-de-moça. Segundo Carneiro et al. (2010), a espécie Capsicum baccatum var. pendulum
apresenta dormência em suas sementes, o que dificulta a propagação. Segundo Rivas,
Sundstrom e Edwards (1984), a porcentagem de germinação de sementes de pimenta
malagueta é menor do que em outras pimentas.
Baskin e Baskin (2004) definem a dormência como a incapacidade de uma semente
viável germinar sob quaisquer condições ambientais que favoreçam sua germinação.
Entretanto, alguns autores, como Fenner e Thompsom (2005), sugerem que a dormência não
21
deve ser condicionada somente à ausência de germinação, mas que diferentes condições
ambientais modificam a dormência de uma semente, de forma que uma semente não dormente
é aquela que não requer condições específicas para germinar.
Sendo assim, é necessário que as sementes destas variedades sejam submetidas a
tratamentos para superação de dormência. Randle e Honma (1981) recomendam que após a
secagem das sementes, estas sejam armazenadas por um período mínimo de seis semanas,
para que a dormência seja completamente superada.
Com base nos resultados apresentados, inferiu-se que a secagem das sementes
contribuiu para a germinação de pimentas dedo-de-moça, provavelmente permitindo a
maturação fisiológica das mesmas.
A secagem, por ter sido realizada de forma natural, pode ter agido como repouso para
os frutos e sementes de pimentas. Segundo Dias et al. (2006) e Vidigal et al. (2006), algumas
sementes dão prosseguimento ao processo de maturação quando são mantidas, por algum
tempo, nos frutos após a colheita, o que permite com que as sementes alcancem o máximo de
germinação e vigor. Desta forma, o armazenamento dos frutos após a colheita, sem que haja
extração das sementes, pode apresentar alguns benefícios, pois além de permitir a maturação
das sementes, possibilita a colheita de frutos imaturos, evitando que estes sejam injuriados por
condições desfavoráveis no campo (BARBEDO et al., 1994; MARTINS et al., 2006).
De acordo com Ricci et al. (2013), sementes que não atingiram a maturidade
fisiológica e que são submetidas à germinação logo após a colheita apresentam menor
porcentagens de germinação quando comparadas com sementes que foram colocadas para
germinar após um período de armazenamento. Castro, Godoy e Cardoso (2008) relatam que
esta situação também é observada quando se faz armazenamento (repouso) de outros frutos
carnosos como pimentão, abóbora, melancia e tomate.
22
Além disso, constatou-se que a presença de sacarose e de sais podem ter dificultado a
germinação nessas espécies, pois as soluções de açúcares e sais que compõem o meio de
cultivo, além de exercerem o papel nutritivo, também atuam no crescimento celular e na
morfogênese, visto que modificam as propriedades osmóticas do meio de cultura. Segundo
George e colaboradores (1993), o aumento da concentração de sacarose diminui a
porcentagem de germinação, pois a concentração de sacarose afeta a regulação osmótica do
meio de cultura. Concentrações elevadas de sacarose fazem com que o meio de cultura
dificulte a absorção de água pelas sementes, impossibilitando o início do processo de
germinação. Almeida et al. (2013), ao estudar a germinação de jenipapo, constatou que na
ausência de sais e da sacarose houve mais de 90% de germinação, não diferindo
estatisticamente do meio composto por ½ MS e 30 g L-1 de sacarose (78%).
De acordo a análise de variância para as características morfológicas das plântulas de
pimentas obtidas in vitro a partir de sementes de frutos frescos, observou-se que houve efeito
significativo, ao nível de 5% de probabilidade pelo teste F, da interação entre espécie e meio
de cultura somente para as características largura da folha (cm) e comprimento da folha (cm).
Para as características tamanho da plântula (cm), comprimento da raiz principal (cm) e
comprimento da parte aérea (cm) ocorreu significância para o meio de cultivo. Já para os
caracteres número de raízes secundárias (und), número de folhas (und) e matéria fresca (g)
observou-se houve efeito significativo para a espécie (Tabela 3).
Observou-se que para as características cuja interação entre espécie e meio de cultura
exerceu efeito significativo, a pimenta malagueta apresentou menores médias para a
característica largura de folha quando cultivada em meio MS100% em relação a cumari-do-
pará. Já para a característica comprimento da folha, não houve diferença significativa do meio
de cultura no cultivo das pimentas malagueta, enquanto que a pimenta cumari-do-pará
apresentou superioridade quando cultivada em meio MS50% (Tabela 3).
23
Tabela 3 - Características morfológicas de plântulas de malagueta e cumari-do-pará
(Capsicum spp.) obtidas de germinação in vitro de sementes de frutos frescos, 30 dias após a
inoculação de sementes.
Meio de cultura
Característica Tipo de pimenta MS 50 MS 100 Média
Malagueta 10,12 8,25 9,18 aa
Tamanho da Plântula Cumari-do-pará 9,56 8,49 9,03 aa
Média 9,84 AA 8,37 AB
MS 50 MS 100 Média
Malagueta 4,68 3,94 4,31 aa
Comprimento da Parte aérea
Média 4,45 AA 3,74 BB
MS 50 MS 100 Média
Malagueta 11,80 11,54 11,67 aa
Número de Raízes Secundárias
Cumari-do-pará 1,47 1,85 1,66 bb
Média 6,64 AA 6,69 AA
MS 50 MS 100 Média
Malagueta 5,44 4,29 4,86 aa
Comprimento da Raiz Principal
Média 5,39 AA 4,61 BB
MS 50 MS 100 Média
Malagueta 3,11 2,60 2,86 bb
Número de Folhas
Média 3,49 AA 3,16 AA
MS 50 MS 100
Largura da Folha Malagueta 0,51 Aa 0,39 Ab
Cumari-do-pará 0,39 Ba 0,61 Aa
MS 50 MS 100
Comprimento da folha Malagueta 1,37 Aa 1,20 Ab
Cumari-do-pará 1,11 Ba 1,60 Aa
MS 50 MS 100 Média
Malagueta 0,0907 0,0759 0,0833 aa
Peso
Cumari-do-pará 0,0615 0,0488 0,0551 bb
Média 0,0761 AA 0,0624 AA
¹ Meio MS com metade das concentrações de sais e 15 g L-1 de sacarose.
Para a característica tamanho da plântula não se observou diferença significativa do
meio de cultura para a pimenta cumari-do-pará, enquanto que houve superioridade do meio
24
MS50% para a pimenta malagueta. Em relação as características comprimento da raiz
principal e comprimento da parte aérea, houve maiores médias das pimentas malagueta e
cumari-do-pará quando estas foram cultivadas em meio de cultura MS50% (Tabela 3).
Verificando-se as médias para número de raízes secundárias e matéria fresca (Tabela
3), notou-se superioridade da pimenta malagueta em relação à pimenta cumari-do-pará em
ambos os meios de cultura, já o número médio de folhas foi maior nas pimentas cumari-do-
pará.
Observou-se que, no geral, as plantas provenientes de sementes cultivadas em meio
MS50% aparentam ter um vigor mais alto do que as cultivadas em meio MS100%, tanto para
as pimentas cumari-do-pará quanto para as malaguetas, que apresentam médias semelhantes
na maioria dos caracteres morfológicos.
Para as características morfológicas de plântulas de pimentas obtidas a partir de frutos
secos, constatou-se que houve interação significativa entre os fatores espécie e meio de
cultura, ao nível de 5% de probabilidade do teste F, exceto para o número de raízes
secundárias, para o qual não houve significância de nenhum dos fatores (Tabela 4).
Para as características tamanho da plântula, comprimento da raiz principal e
comprimento da parte aérea, notou-se que para as pimentas cumari-do-pará e malagueta não
houve diferença significativa dos meios de culturas testados. Para dedo-de-moça o meio
MS50% forneceu as maiores médias para comprimento da raiz principal e comprimento da
parte aérea. No meio MS0%, nenhuma das espécies apresentou superioridade, não havendo
diferença significativa entre elas. Enquanto no meio MS50%, observa-se as maiores médias
para tamanho da plântula e comprimento da parte aérea nas pimentas dedo-de-moça. Para o
meio MS100% geraram as maiores médias para tamanho da plântula, comprimento da
parte aérea e comprimento da raiz principal foram obtidas no cultivo de cumari-do-pará e
malagueta (Tabela 4).
25
Tabela 4 - Características morfológicas de plântulas de cumari-do-pará, malagueta e
dedo-de-moça (Capsicum spp.) obtidas de germinação in vitro de sementes de frutos secos, 30
dias após a inoculação de sementes.
Meio de Cultivo
Característica Tipo de pimenta MS 0% MS 50% MS 100%
Cumari-do-pará 3,91 Aa 4,28 Ab 4,11 Aa
Tamanho da Plântula Malagueta 6,07 Aa 6,08 Aab 6,08 Aa
Dedo-de-moça 4,49 Aa 8,43 Aa 1,09 Bb
MS 0% MS 50% MS 100%
Comprimento da Parte aérea
Malagueta 3,00 Aa 3,46 Aab 3,16 Aa
Dedo-de-moça 2,49 Ba 4,97 Aa 0,66 Ca
MS 0% MS 50% MS 100% Média
Cumari-do-pará 0,00 0,00 0,00 0,00 a
Número de Raiz Secundária
Malagueta 0,39 0,00 0,34 0,25 a
Dedo-de-moça 0,17 0,00 0,48 0,22 a
Média 0,19 A 0,00 A 0,28 A
MS 0% MS 50% MS 100%
Comprimento da Raiz Principal
Malagueta 3,04 Aa 2,59 Aa 2,92 Aa
Dedo-de-moça 2,02 Aa 3,43 Aa 0,62 Bb
MS 0% MS 50% MS 100%
Número de Folhas
Malagueta 2,81 Aa 2,16 Aa 2,68 Aa
Dedo-de-moça 0,34 Bb 1,40 Aa 0,28 Bb
MS 0% MS 50% MS 100%
Cumari-do-pará 0,29 Aa 0,35 Aab 0,34 Aa
Largura da Folha
Malagueta 0,30 Aa 0,28 Ab 0,38 Aa
Dedo-de-moça 0,15 Ba 0,73 Aa 0,17 Ba
MS 0% MS 50% MS 100%
Cumari-do-pará 0,85 Ab 0,94 Aa 0,92 Ab
Comprimento da Folha
Malagueta 1,06 Aa 1,03 Ba 1,25 Aa
Dedo-de-moça 0,03 Ac 0,15 Ab 0,06 Ac
MS 0% MS 50% MS 100%
Peso
Malagueta 0,0300 Aa 0,0300 Ab 0,0329 Aa
Dedo-de-moça 0,0155 Ba 0,0506 Aa 0,0155 Ba
¹ Meio composto por água e ágar.
³ Meio MS com metade das concentrações de sais e 15 g L-1 de sacarose
26
Observou-se que para as características largura da folha não houve diferença
significativa do meio de cultura para as espécies malagueta e cumari-do-pará, sendo que para
dedo-de-moça o meio MS50% apresentou as melhores médias, sendo a espécie significativa
neste meio de cultura. Para o comprimento da folha, não houve diferença significativa do
meio de cultura para as espécies dedo-de-moça e cumari-do-pará, á para a pimenta malagueta,
as menores médias nesta característica foram obtidas no meio MS50%. Para esta
característica houve diferença significativa da espécie em todos os meios de cultura testados,
sendo que a pimenta malagueta apresentou superioridade em relação às demais espécies
(Tabela 4).
Já para o número de folhas e a matéria fresca (Tabela 4), o meio de cultura não
apresentou efeito significativo para as pimentas cumari-do-pará e malagueta. A pimenta dedo-
de-moça, por sua vez, apresentou as melhores médias quando cultivadas em meio MS50%. O
fator espécie só foi significativo nas plântulas cultivadas em meio MS50%, em que a pimenta
dedo-de-moça apresentou superioridade em relação as demais.
Para a característica número de raízes secundárias nenhum dos fatores, nem sua
interação, foram significativos. Ao avaliar o efeito da sacarose na germinação de Capsicum
annuum, Nascimento et al. (2015) constataram que não houve variação significativa sobre o
número de raízes das plântulas entre os meios de cultura MS acrescidos com 0, 15, 30, 45 e
60 g L-1 de sacarose. Em um ensaio sobre a germinação de sementes de Euphorbia
heterophylla, Prudente et al. (2015) não observaram diferença significativa no número médio
de raízes em sementes cultivadas em meio MS 100% e MS 50%. Estes resultados corroboram
com os obtidos para plântulas provenientes de sementes de frutos secos.
De forma geral, o meio de cultura MS50% apresentou as melhores médias para as
espécies avaliadas. Resultados semelhantes foram relatados por Ledo et al. (2014) , que
observou que plântulas de cambuizeiro (Myrciaria tenella O. Berg) apresentavam maior
27
desenvolvimento da parte aérea quando cultivadas em meio MS com 50% da concentração
total de sais e 15 g L-1 de sacarose. O desenvolvimento da parte aérea do acesso OIT de
Jenipapeiro também é favorecido na presença de sacarose (30 g L-1) e meio de cultivo MS
com metade da concentração de sais (ALMEIDA et al., 2013).
De acordo com Maldaner e colaboradores (2006), as concentrações de nutrientes no
meio de cultura influencia diversos processos metabólicos, o que resulta em crescimento e
diferenciação de tecidos. Segundo Reis et al. (2008), a presença de maior concentração de
nutriente no meio produz plântulas mais vigorosas e maiores, embora possa reduzir a
germinação.
Em relação a concentração de sacarose, Reis et al. (2008), em um estudo com Melissa
officinalis L., constatou que a presença de 15 g L-1 de sacarose proporcionou os melhores
resultados para comprimento da parte aérea das plântulas. Segundo estes mesmos autores,
esses resultados devem-se ao fato das sementes possuírem reservas nutritivas em seu interior,
permitindo com que a emissão da radícula e crescimento da parte aérea seja possível sem que
haja grandes concentrações de sacarose no meio de cultura. Ademais, em meios de cultura
que contenham altas taxas de fonte de carbono, as pressões osmóticas destes são alteradas o
que pode favorecer a perda de água da semente para o meio, dificultando tanto sua
germinação como o crescimento.
Comparando-se os resultados dos experimentos de germinação in vitro e morfologia
das plântulas geradas in vitro a partir de sementes de frutos secos e frescos, inferiu-se que por
apresentarem alta taxa de germinação e plântulas vigorosas, as plântulas de pimentas cumari-
do-pará provenientes de frutos frescos, são excelentes fontes de explantes quando cultivadas
em meio MS50%, visto que este meio, por ser diluído, é mais econômico que o meio de
cultura MS100%.
28
4.2. Indução de calos (IC) e área coberta por células de calos (ACCC) em
explantes caulinares e foliares de pimenta Cumari-do-pará
Aos 14 dias após a inoculação de explantes, foram observados os primeiros calos nos
tratamentos contendo 1mg L-1 de 2,4-D + 0 mg L-1 de BAP e 2 mg L-1 de 2,4-D + 0 mg L-1 de
BAP, tanto para explantes caulinares quanto para explantes foliares.
Ao final de 30 dias, para o experimento contendo explantes caulinares, observou-se
formação de calos nos tratamentos suplementados 1 mg L-1 de 2,4-D e suas combinações com
BAP, 2 mg L-1 de 2,4-D e suas combinações com BAP (com exceção do tratamento
suplementado com 4 mg L-1 de BAP) e também no tratamento suplementado com 4 mg L-1 de
2,4-D e 4 mg L-1 de BAP (Figura 8).
calos (ACCC) em explantes caulinares de cumari-do-pará em diferentes combinações de BAP
e 2,4-D, 30 dias após a inoculação.
Mediante análise de variância, constatou-se que para os explantes caulinares ocorreu
efeito significativo da interação entre os dois reguladores de crescimento (2,4-D e BAP) na
29
indução de calos, sendo que a maior indução de calos (99,9% de IC) ocorre na presença de 2
mg L-1 de 2,4-D e na ausência de BAP, seguido pela combinação de 1,0 mg L-1 + 0,0 mg L-1
de BAP, que apresentou 43,3% de calogênese (Tabela 5).
Tabela 5 - Porcentagem de indução de calos em explantes caulinares de cumari-do-
pará (C. chinense) sob diferentes concentrações de BAP e 2,4-D no meio de cultivo, após 30
dias de cultivo.
2,4-D²
-1 -1
BAP¹ 0 mg L 1 mg L 2 mg L-1 4 mg L-1
0 mg L-1 0,00 Ca 43,30 Ba 99,99 Aa 0,00 Ca
1 mg L-1 0,00 Ba 27,39 Aa 27,39 Ab 0,00 Ba
2 mg L-1 0,00 Ba 19,97 ABab 27,39 Ab 0,00 Ba
4 mg L-1 0,00 Aa 0,00 Ab 0,00 Ac 6,28 Aa
¹ 6-Benzilaminopurina
² Àcido diclorofenóxiacético
Em relação à área do explante coberta por células de calos (ACCC), as maiores médias
para explantes caulinares foram observadas nos tratamentos 2,0 mg L-1 de 2,4-D + 0 mg L-1
de BAP (66,6%), seguido por 2,0 mg L-1 de 2,4-D + 2 mg L-1 de BAP e 1,0 mg L-1 de 2,4-D +
1 mg L-1 de BAP, ambos com 62,5% de ACCC, todavia o primeiro apresentou maior número
de explantes induzidos em comparação com os últimos (Figura 8).
Já para os explantes foliares, constatou-se que, com base na análise de variância, 2,4-D
e sua interação com BAP promovem efeito significativo na calogênese, verificando-se a maior
porcentagem de indução (35,16%) quando os explantes foram inoculados em meio
suplementado com 1,0 mg L-1 de 2,4-D + 0,0 mg L-1 de BAP. Os meios de cultura
suplementados com 2 mg L-1 de 2,4-D e com 0,0 mg L-1 ou 1,0 mg L-1 de BAP, geraram
30
27,37% de indução de calos, sendo considerados os segundos melhores meios para indução
(Tabela 6).
Tabela 6 - Porcentagem de indução de calos em explantes foliares de cumari-do-pará
(C. chinense) sob diferentes concentrações de BAP e 2,4-D no meio de cultivo, após 30 dias
de cultivo.
2,4-D²
BAP¹ 0 mg L-1 1 mg L-1 2 mg L-1 4 mg L-1
0 mg L-1 0,00 Ba 35,16 Aa 27,37 Aa 0,00 Ba
1 mg L-1 0,00 Ba 0,00 Bb 27,37 Aa 0,00 Ba
2 mg L-1 0,00 Aa 6,28 Ab 6,28 Aab 0,00 Aa
4 mg L-1 0,00 Aa 12,95 Aab 0,00 Ab 6,28 Aa
¹ 6-Benzilaminopurina
² Àcido diclorofenóxiacético
Conforme figura 9, observou-se que todos os meios de cultura suplementados com 1,0
mg L-1 de 2,4-D, com exceção da combinação de 1 mg L-1 de 2,4-D e 1 mg L-1 de BAP, ou
2,0 mg L-1 de 2,4-D foram capazes de induzir a formação de calos em explantes foliares de
cumari-do-pará. Meios de cultura sem suplementação com 2,4-D ou com 4,0 mg L-1 de 2,4-D,
com exceção do tratamento suplementado com 4,0 mg L-1 e 0,0 mg L-1, não induziram a
calogênese nestes explantes (Figura 9).
Os tratamentos que geraram maiores porcentagem de ACCC em explantes foliares de
cumari-do-pará foram as combinações de 1 mg L-1 de 2,4-D + 4 mg L-1 de BAP e 1 mg L-1 de
2,4-D + 0 mg L-1 de BAP, ambos com 50% de ACCC. Entretanto, o último tratamento
apresentou médias maiores de indução de calos (Figura 9).
É importante ressaltar que ocorre diferença entre os valores de indução de calos (IC)
das Tabelas 5 e 6 e Figuras 8 e 9, respectivamente, devido à transformação empregada nos
dados das tabelas para submissão destes à análise de variância.
31
2,4-D, 30 dias após a inoculação.
Sendo assim, neste trabalho, ao se observar as variáveis IC e ACCC, constatou-se que
para explantes caulinares de pimenta cumari-do-pará, o tratamento composto por 2 mg L-1 de
2,4-D na ausência de BAP foi satisfatório para a indução de calos, resultando em 100% de
indução e uma média de 66,6% de área coberta por calos. Além disso, notou-se que 1 mg L-1
de 2,4-D, sem presença de BAP, gera a maior indução de calos (41,67%) e grande área
coberta por células de calos (45%) em explantes foliares de C. chinense Jacquin. Desta
forma, observou-se a maior superioridade na indução de calos bem como na área coberta por
células de calos de explantes caulinares em relação à explantes foliares.
Verificou-se também que, para os dois tipos de explantes, os tratamentos contendo
altas concentrações de reguladores de crescimento (4 mg L-1), isoladamente ou combinados
entre si, apresentaram baixa ou nenhuma formação de calos (Figura 8 e 9). Além disso, notou-
se que a presença do regulador de crescimento 2,4-D, isoladamente, na concentração de 1 mg
32
L-1 ou 2 mg L-1 é suficiente para a calogênese, enquanto o uso de BAP não é necessário para a
formação de calos.
Smozinski e Santos (2015), ao estudarem a indução de calos em explantes de
Capsicum chinense cv. Guaraci cumari-do-pará, relataram as combinações de 1,0 mg L-1 2,4-
D + 2,5 mg L-1 BAP e 2,0 mg L-1 2,4-D, como sendo as mais satisfatórias para formação de
calos em explantes foliares e em segmentos nodais e entrenodais, respectivamente. Em um
experimento com C. annuum, Farias Filho (2006) relata a calogênese com o uso de uma
concentração de 2,0 mg L-1 de 2,4-D, bem como formação de calos em C. chinense com 1,5
mg L-1 de 2,4-D. Kittipongpatana et al. (2007), observaram a calogênese em explantes foliares
de C. annuum em meio MS suplementado com 1,0 mg L-1 de 2,4-D e 0,1 mg L-1 de BAP. O
uso de 1,0 mg L-1 de 2,4-D e 1,0 mg L–1 de BAP é recomendado para a indução de calos em
explantes foliares de Capsicum annuum (SOUZA, 2016).
De acordo com Paz (2016), a maior porcentagem de indução e proliferação de calos
friáveis em Capsicum frutescens cv. Stromboli ocorreu em meio suplementado com 1,5 mg L–
1
de 2,4-D. Gomes et al. (sem data) relata que, em nim indiano (Azadirachata indica A. Juss),
a presença de 1,0 e 2,0 mg L-1 de 2,4-D no meio de cultura induziu maior formação de calos,
100 e 80%, respectivamente, nos explantes, na ausência de BAP. Santos et al. (2003) também
não observou calogênese em explantes foliares de Coffea arabica L. cv. Rubi inoculados em
meio suplementados com BAP, na ausência de 2,4-D. Esses resultados corroboram com os
obtidos neste experimento, visto que baixas concentrações de auxina (1,0 e 2,0 mg L-1) foram
consideradas as mais satisfatórias para indução de calos.
Além disso, de acordo com Pinhal et al. (2011), o balanço hormonal entre auxinas e
citocininas deve ser equilibrado para promover a formação de calos. Desta forma, pode-se
inferir que para pimenta cumari-do-pará, as concentrações 1 mg L-1 e 2 mg L-1 de 2,4-D, na
33
ausência de BAP, promoveram calogênese devido ao balanço com o conteúdo endógeno de
citocininas presente no explantes foliares e caulinares.
Já em relação à baixa indução de calogênese em altas concentrações de 2,4-D e BAP
(4 mg L-1), Smozinski e Santos (2015) relatam resultados semelhantes em C. cv. Guaraci
cumari-do-pará, visto que o meio de cultura suplementado com a maior concentração de 2,4-
D (4,0 mg L-1) causou necrose em 96% dos explantes. Palú, Silva e Pasqual (2004) relatam
que a partir da concentração de 2,0 mg L-1 de 2,4-D ocorreu diminuição na formação de calos
em Coffea arabica L., provavelmente devido a um efeito fitotóxico causado por
concentrações maiores que 2,0 mg L-1.
Nogueira et al. (2007), em um estudo de indução de calos em explantes foliares de
murici-pequeno, relata que as áreas cobertas por calos foram significativamente maiores
quando os explantes foram inoculados na presença de 2,4-D, evidenciando que a presença
desta auxina é essencial no processo de calogênese. Santos et al. (2014), obtiveram maiores
porcentagens da área foliar coberta por calo (AFCC) nos tratamentos suplementados com 1,0
mg L-1 ou 4,0 mg L-1 de BAP em explantes de Cissus verticillata (L.) Nicolson & Jarvis.,
onde todos os explantes apresentaram entre 75 e 100% da AFCC.
Já Cerqueira et al. (2002), trabalhando com a indução de calos em segmentos foliares
de erva-de-touro (Tridax procumbens Linn) verificaram efeito significativo da combinação de
auxina e citocinina, obtendo 100% de área coberta com calos em explantes foliares em meio
acrescido com 2,0 mg L-1 de ANA + 2,0 mg L-1 de BAP. Estes mesmos autores obtiveram
75% de área coberta por calo em explantes caulinares, quando utilizou-se 1,0 mg L-1 de ANA
+ 2,0 mg L-1 de BAP. Sendo assim, pode-se inferir que a proliferação de calos é dependente
da espécie bem como da resposta do explante a reguladores de crescimento. Segundo Karp
(1995), as diferenças observadas ocorrem devido à variação na sensibilidade do explante aos
fitoreguladores e/ou devido a diferenças no teor endógeno de hormônios.
34
5. CONCLUSÕES
Concluiu-se que plântulas de cumari-do-pará, provenientes de sementes de frutos
frescos, germinadas em meio de cultura MS50% são excelentes fontes de explantes devido ao
grande número e alto vigor de plântulas geradas in vitro. Em relação a indução de calos nessa
espécie, a maior formação de calos e grande área coberta por calos foram obtidas em
segmentos caulinares, quando cultivados em meio de cultura suplementado com a
combinação de 2 mg L-1 de 2,4-D + 0 mg L-1 de BAP. Além disso, o meio MS com metade da
concentração de sais e suplementado com 15 g L-1 (MS50%) de sacarose forneceu, no geral,
os valores mais altos para as características morfológicas para as três espécies estudadas.
Embora a secagem dos frutos tenha favorecido a germinação de sementes e maior
vigor de plântulas das pimentas dedo-de-moça, as taxas de germinação dessas, assim como de
pimenta malagueta, ainda foram consideradas baixas e, portanto, recomenda-se que novos
estudos acerca da germinação dessas pimentas sejam feitos, especialmente, estudos
relacionados à superação de dormência e maturação de sementes.
Testes de aclimatação das plântulas obtidas in vitro e estudos de suspensões celulares
são de extrema importância para complementação de informações que contribuam para a
exploração comercial destas espécies, bem como de seus compostos bioativos, como a
capsaicina.
35
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43
APÊNDICES
APÊNDICE A - Germinação de sementes de Capsicum spp. provenientes de frutos frescos ao
longo de 30 dias.
Dias
Pimenta
0 7 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
MS100% 0,00 0,00 0,00 1,7 6,7 6,7 06,7 10,0 11,7 13,3 16,7 16,7 18,3
Malagueta
MS50% 0,00 3,3 6,7 6,7 10,0 10,0 11,7 15,0 15,0 18,3 18,3 18,3 18,3
Cumari-do- MS100% 0,00 6,7 18,3 40,0 48,3 56,7 70,0 78,3 85,0 90,0 90,0 93,3 93,3
pará MS50% 0,00 15,0 43,3 56,7 66,7 70,0 81,7 85,0 86,7 88,3 88,3 88,3 88,3
Dedo-de- MS100% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 000 1,7 1,7
moça MS50% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
APÊNDICE B - Resumo da análise de variância em esquema fatorial para germinação de

sementes de Capsicum spp. provenientes de frutos frescos em diferentes concentrações de
meio MS.
Fonte de Variação Graus de Somas de Quadrados Fcal Probabilidade (%)
Liberdade Quadrado Médios
Espécies 1 4,28702 4,28702 177,25949 0,0**
Meios 1 0,01268 0,01268 0,52426 100,0 ns
Espécies x Meios 1 0,00615 0,00615 0,25412 100,0 ns
Resíduo 20 0,4837 0,02419
** - Significativo a nível de 1% de significância do Teste F. ns - Não significativo no Teste F.
APÊNDICE C - Dados utilizados na geração da Figura 7 – Germinação de sementes de

Capsicum spp. provenientes de frutos secos ao longo de 30 dias.
Dias
Pimenta
0 5 7 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
MS100% 0,00 0,00 0,00 3,3 5,0 8,3 10,0 10,0 10,0 11,7 11,7 11,7 11,7 11,7
Malagueta MS50% 0,00 0,00 1,7 6,7 6,7 10,0 11,7 13,3 16,7 16,7 16,7 16,7 16,7 16,7
MS0% 0,00 0,00 0,00 8,3 8,3 10,0 10,0 11,7 11,7 11,7 13,3 13,3 13,3 13,3
MS100% 0,00 8,3 33,3 61,7 61,7 68,3 73,3 75,0 75,0 78,3 80,0 80,0 80,0 80,0
Cumari-
MS50% 0,00 16,0 34,0 50,0 50,0 52,0 56,0 58,0 58,0 58,0 58,0 60,0 62,0 64,0
do-pará
MS0% 0,00 14,0 40,0 56,0 56,0 62,0 62,0 64,0 68,0 68,0 68,0 68,0 68,0 68,0
MS100% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3 3,3
Dedo-de-
MS50% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2,0 6,0 13,3
moça
MS0% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 1,7 3,3 5,0 8,3 8,3 11,7 25,0 31,7 36,7
APÊNDICE D - Resumo da análise de variância em esquema fatorial para germinação de

sementes de Capsicum spp. provenientes de frutos secos em diferentes concentrações de meio
MS.
Espécies 2 4,66782 2,33391 58,26041 0,0**
Meios 2 0,13604 0,06802 1,69789 19,45837 ns
Espécies x Meios 4 0,47241 0,1181 2,94817 3,01576 *
Resíduo 45 1,8027 0,04006
** - Significativo a nível de 1% de significância do Teste F. * - Significativo a nível de 5% de significância do
Teste F. ns - Não significativo no Teste F
44
APÊNDICE E - Resumo da análise de variância em esquema fatorial para médias de
sementes de frutos frescos.
Variável FV¹ GL² SQ³ QM4 Fcal Probabilidade (%)

Espécies 1 0,00325 0,00325 0,07884 100,0 ns
Meios 1 0,33794 0,33794 8,2083 0,95704**
Tamanho da Planta Espécies x
1 0,02484 0,02484 0,60341 100,0 ns
Meios
Resíduo 20 0,82341 0,04117
Espécies 1 0,06232 0,06232 2,29428 14,54948 ns
Meios 1 0,16313 0,16313 6,00541 2,35859 *
Comprimento da
Espécies x
parte aérea 1 0,00005 0,00005 0,00196 100,0 ns
Meios
Resíduo 20 0,54327 0,02716
Espécies 1 24,4945 24,49452 151,3035 0,0 **
Meios 1 0,01225 0,01225 0,07569 100,0 ns
Número de raízes
Espécies x
secundárias 1 0,04091 0,04091 0,25267 100,0 ns
Meios
Resíduo 20 3,2378 0,16189
Espécies 1 0,02243 0,02243 0,80573 100,0 ns
Meios 1 0,16631 0,16631 5,97328 2,39164 *
Comprimento da
raiz principal Espécies x
1 0,03917 0,03917 1,40698 24,94577 ns
Meios
Resíduo 20 0,55685 0,02784
Espécies 1 0,34782 0,34782 11,73815 0,26736 **
Meios 1 0,04441 0,04441 1,49885 23,50739 ns
Número de Folhas Espécies x
1 0,01777 0,01777 0,59983 100,0 ns
Meios
Resíduo 20 0,59263 0,02963
Espécies 1 0,00368 0,00368 0,60536 100,0 ns
Meios 1 0,00345 0,00345 0,56798 100,0 ns
Largura da folha Espécies x
1 0,04776 0,04776 7,85466 1,09916 *
Meios
Resíduo 20 0,12162 0,00608
Espécies 1 0,00303 0,00303 0,19756 100,0 ns
Meios 1 0,01954 0,01954 1,27513 27,21678 ns
Comprimento da
Espécies x
folha 1 0,08936 0,08936 5,83012 2,54537 *
Meios
Resíduo 20 0,30655 0,01533
Espécies 1 0,0021 0,0021 13,1465 0,16825 **
Meios 1 0,0005 0,0005 3,15863 9,07372 ns
Matéria fresca Espécies x
1 0,0 0,0 0,01449 100,0 ns
Meios
Resíduo 20 0,00319 0,00016
¹ Fontes de variação. ² Grau de Liberdade. ³ Soma de Quadrados. 4 Quadrado Médio.
** - Significativo a nível de 1% de significância do Teste F. * - Significativo a nível de 5% de psignificância do
45
APÊNDICE F - Resumo da análise de variância em esquema fatorial para médias de
sementes de frutos secos.
Variável FV¹ GL² SQ³ QM4 Fcal Probabilidade (%)

Espécies 2 1,70777 0,85389 3,28502 4,89267 *
Tamanho da Meios 2 2,60681 1,30341 5,01439 1,19897 *
planta Espécies x Meios 4 4,91701 1,22925 4,72911 0,35958 **
Resíduo 36 9,3576 0,25993
Espécies 2 0,72069 0,36035 2,63 8,58825 ns
Comprimento Meios 2 1,55428 0,77714 5,67198 0,72194 **
da parte aérea Espécies x Meios 4 2,45679 0,6142 4,48273 0,48333 **
Resíduo 36 4,9325 0,13701
Espécies 2 0,19454 0,09727 0,73431 100,0 ns
Número de Meios 2 0,20956 0,10478 0,79103 100,0 ns
raízes Espécies x Meios 3 0,15793 0,05264 0,39742 100,0 ns
secundárias
Resíduo 16 2,1194 0,13246
Espécies 2 0,75299 0,3765 3,6057 3,73801 *
Comprimento Meios 2 0,63532 0,31766 3,04226 6,01483 ns
da raiz Espécies x Meios 4 1,57081 0,3927 3,76092 1,17508 *
principal
Resíduo 36 3,759 0,10442
Espécies 2 4,00472 2,00236 39,79521 0,0 **
Número de Meios 2 0,1084 0,0542 1,07722 35,12613 ns
folhas Espécies x Meios 4 0,76261 0,19065 3,78905 1,13441 *
Resíduo 36 1,8114 0,05032
Espécies 2 0,00016 0,00008 0,00546 100,0 ns
Largura da Meios 2 0,0912 0,0456 3,02558 6,10128 ns
folha Espécies x Meios 4 0,21024 0,05256 3,48714 1,65971 *
Resíduo 36 0,5426 0,01507
Espécies 2 2,25735 1,12868 415,46339 0,0 **
Comprimento Meios 2 0,01427 0,00714 2,62658 8,61389 ns
da folha Espécies x Meios 4 0,02862 0,00716 2,63395 4,997 *
Resíduo 36 0,0978 0,00272
Espécies 2 0,00059 0,0003 4,43333 1,89998 *
Meios 2 0,00059 0,0003 4,43333 1,89998 *
Matéria fresca Espécies x Meios 4 0,00134 0,00034 5,03333 0,25088 **
Resíduo 36 0,0024 0,00007
¹ Fontes de variação. ² Grau de Liberdade. ³ Soma de Quadrados. 4 Quadrado Médio.
** - Significativo a nível de 1% de significância do Teste F. * - Significativo a nível de 5% de significância do
46
APÊNDICE G - Dados utilizados na geração do Figura 8 – Porcentagem de indução de calos
(IC) e área do explante coberta por células calos (ACCC) em explantes caulinares de cumari-
do-pará em diferentes combinações de BAP e 2,4-D, após 30 dias de cultivo.
Tratamento IC(%) ACCC(%)

0mg/L 2,4-D + 0mg/L BAP 0,00 0
0mg/L 2,4-D + 1mg/L BAP 0,00 0
0mg/L 2,4-D + 2mg/L BAP 0,00 0
0mg/L 2,4-D + 4mg/L BAP 0,00 0
1mg/L 2,4-D + 0mg/L BAP 66,67 36,67
1mg/L 2,4-D + 1mg/L BAP 33,33 62,5
1mg/L 2,4-D + 2mg/L BAP 25,00 75
1mg/L 2,4-D + 4mg/L BAP 8,33 10
2mg/L 2,4-D + 0mg/L BAP 100,00 66,67
2mg/L 2,4-D + 1mg/L BAP 33,33 30
2mg/L 2,4-D + 2mg/L BAP 41,67 62,5
2mg/L 2,4-D + 4mg/L BAP 0,00 0
4mg/L 2,4-D + 0mg/L BAP 0,00 0
4mg/L 2,4-D + 1mg/L BAP 0,00 0
4mg/L 2,4-D + 2mg/L BAP 0,00 0
4mg/L 2,4-D + 4mg/L BAP 8,33 25
APÊNDICE H - Resumo da análise de variância em esquema fatorial para médias de indução

de calos em explantes caulinares de Capsicum chinense Jacquin (cumari-do-pará) sob
diferentes concentrações de BAP e 2,4-D no meio de cultivo, após 30 dias de cultivo.
Fonte de Graus de Somas de Quadrados Fcal Probabilidade (%)

Variação Liberdade Quadrado Médios
BAP 3 0,83176 0,27725 7,01176 0,02556 **
2,4 D 3 1,56862 0,52287 13,22353 0,0 **
BAP x 2,4-D 6 1,30067 0,21678 5,48235 0,01248 **
RESÍDUO 96 3,79595 0,03954
** - Significativo a nível de 1% de significância do Teste F
APÊNDICE I - Resumo da análise de variância em esquema fatorial para médias de indução

de calos em explantes foliares de Capsicum chinense Jacquin (cumari-do-pará) sob diferentes
concentrações de BAP e 2,4-D no meio de cultivo, após 30 dias de cultivo.

BAP 3 0,16186 0,05395 1,60491 19,29461 ns
2,4-D 3 0,36279 0,12093 3,59724 1,61532 *
BAP x 2,4-D 6 0,45209 0,07535 2,24131 4,51939 *
RESÍDUO 101 3,3954 0,03362
* - Significativo ao nível de 5% de significância do Teste F. ns - Não significativo no Teste F
47
APÊNDICE J - Dados utilizados na geração do Figura 9 – Porcentagem de indução de calos
(IC) e área do explante coberta por células calos (ACCC) em explantes foliares de cumari-do-
pará em diferentes combinações de BAP e 2,4-D
Tratamento IC(%) ACCC (%)

0mg/L 2,4-D + 0mg/L BAP 0,00 0
0mg/L 2,4-D + 1mg/L BAP 0,00 0
0mg/L 2,4-D + 2mg/L BAP 0,00 0
0mg/L 2,4-D + 4mg/L BAP 0,00 0
1mg/L 2,4-D + 0mg/L BAP 41,67 50
1mg/L 2,4-D + 1mg/L BAP 0,00 0
1mg/L 2,4-D + 2mg/L BAP 8,33 25
1mg/L 2,4-D + 4mg/L BAP 16,67 50
2mg/L 2,4-D + 0mg/L BAP 33,33 41,67
2mg/L 2,4-D + 1mg/L BAP 33,33 25
2mg/L 2,4-D + 2mg/L BAP 8,33 10
2mg/L 2,4-D + 4mg/L BAP 0,00 0
4mg/L 2,4-D + 0mg/L BAP 0,00 0
4mg/L 2,4-D + 1mg/L BAP 0,00 0
4mg/L 2,4-D + 2mg/L BAP 0,00 0
4mg/L 2,4-D + 4mg/L BAP 8,33 10
APÊNDICE K – Plântulas de cumari-do-pará proveniente de sementes frescas germinadas in

vitro em meio MS.
48
APÊNDICE L – Calos em explantes caulinares de cumari-do-pará, em que a) 1,0 mg L-1 de
2,4-D e 0,0 mg L-1 de BAP, b) 2,0 mg L-1 de 2,4-D e 0,0 mg L-1 de BAP e c) 2,0 mg L-1 de
2,4-D e 1,0 mg L-1 de BAP.
49

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

INSTITUTO DE GENÉTICA E BIOQUÍMICA

Germinação e cultivo in vitro de três espécies do gênero Capsicum

Mariane Rabelo Coelho Fernandes

Monografia apresentada à Coordenação

Germinação e cultivo in vitro de três espécies do gênero Capsicum

Mariane Rabelo Coelho Fernandes

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Ana Paula Oliveira Nogueira

Monografia apresentada à Coordenação

Germinação e cultivo in vitro de três espécies do gênero Capsicum

Mariane Rabelo Coelho Fernandes

Orientadora: Prof. Dr. Ana Paula Oliveira Nogueira

Homologado pela Coordenação do Curso de Biotecnologia em __/__/__.

Germinação e cultivo in vitro de três espécies do gênero Capsicum

Mariane Rabelo Coelho Fernandes

Aprovado pela banca examinadora em: 15/12/2017 Nota:100

Ana Paula Oliveira Nogueira

Uberlândia, 15 de dezembro de 2017.

A Universidade Federal de Uberlândia e ao seu corpo docente que me proporcionou

enorme fonte de conhecimento durante a graduação.

de minha vida, além de me promover enorme crescimento profissional e pessoal.

e suporte no pouco tempo que lhe coube.

Aos membros da banca, por compartilharem comigo suas experiências acadêmicas e

Ao colega de laboratório, Bruno, pelo apoio ao longo do último ano.

A sétima turma de biotecnologia, que além de companheiros de turma, se tornaram

amigos inseparáveis, que espero ter pela vida toda.

ao longo desses 5 anos.

Ao meu namorado, Gabriel, pelo carinho, apoio e confiança depositados em mim no

momento em que mais precisei.

As pimentas cumari-do-pará, malagueta e dedo-de-moça são representantes do gênero

as condições ideais de cultivo in vitro, visando a micropropagação destas espécies de

pimentas. Para geração de fonte de explantes, avaliou-se a germinação in vitro de sementes,

provenientes de frutos frescos e secos e a morfologia das plântulas geradas em diferentes

células de calos (ACCC) em explantes foliares e caulinares obtidos de plântulas de cumari-

sementes e vigor de plântulas de cumari-do-pará é mais satisfatória em meio MS50% e 15 g

de explantes. Já a IC% e a ACCC% em explantes caulinares e foliares foram maiores quando

desnecessária. Conclui-se que, para cumari-do-pará, os objetivos foram atingidos.

Palavras-chave: Capsicum chinense Jacquin.; Capsicum frutescens L.; Capsicum baccatum.

3. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 13

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 17

Tabela 1 – Porcentagem de germinação de sementes de malagueta e cumari-do-pará

Tabela 2 – Porcentagem de germinação de sementes de malagueta, cumari-do-pará e dedo-

Tabela 3 – Características morfológicas de plântulas de malagueta e cumari-do-pará

Tabela 4 – Características morfológicas de plântulas de cumari-do-pará, malagueta e dedo-

Tabela 5 - Porcentagem de indução de calos em explantes caulinares de cumari-do-pará (C.

Tabela 6 - Porcentagem de indução de calos em explantes foliares de cumari-do-pará (C.

Figura 1 – Frutos de pimentas do gênero Capsicum................................................................. 2

Figura 2 – Estrutura química da capsaicina ............................................................................. 6

Figura 3 - Esquema representativo das diversas técnicas de cultivo in vitro ........................... 9

Figura 4 - Sementes extraídas de frutos frescos de Capsicum spp. ....................................... 14

Figura 5 – Medições de características morfológicas das plântulas obtidas in vitro ............ 15

Figura 6 – Germinação in vitro de sementes de cumari-do-pará, malagueta e dedo-de-moça

Figura 7 – Germinação in vitro de sementes de cumari-do-pará, malagueta e dedo-de-moça

2,4-D Ácido 2,4 Diclorofenoxiacético

1.1. Pimentas do gênero Capsicum

As pimentas do gênero Capsicum são bastante apreciadas na culinária brasileira

devido a sua característica mais marcante, a ardência (também chamada pungência). As

diversas variedades de pimentas são consumidas in natura, desidratadas, moídas e também na

forma de geleias e molhos (CARVALHO et al., 2006).

Homologado pela Coordenação do Curso de Biotecnologia em //__.