UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

SIMONE SAKAGUTE TAVARES

Avaliação da toxicidade da Atrazina livre e Atrazina

nanoencapsulada no desenvolvimento e metabolismo
mitocondrial em Drosophila melanogaster.

Ribeirão Preto
2019
 SIMONE SAKAGUTE TAVARES

Avaliação da toxicidade da Atrazina livre e Atrazina

nanoencapsulada no desenvolvimento e metabolismo
mitocondrial em Drosophila melanogaster.
Versão Corrigida

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Bioquímica da Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo, para obtenção do título de Mestre
em Ciências, ênfase em Bioquímica.

Orientadora: Profa. Dra. Luciane Carla

Alberici

Ribeirão Preto
2019
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio
convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a
fonte.

Tavares, Simone Sakagute

Avaliação da toxicidade da Atrazina livre e Atrazina
nanoencapsulada no desenvolvimento e metabolismo
mitocondrial em Drosophila melanogaster. Ribeirão Preto,
2019.
57 p. : il. + 2 CDs

Dissertação de Mestrado, apresentada à Faculdade de

Medicina de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração:
Bioquímica.
Orientadora: Carla Alberici, Luciane.

1. Toxicidade. 2. Mitocondria. 3.Drosophila melanogaster. 4

Atrazina. 5 Nanocapsula.
 FOLHA DE APROVAÇÃO

Nome: Simone Sakagute Tavares

Título: Avaliação da toxicidade da Atrazina livre e Atrazina nanoencapsulada no
desenvolvimento e metabolismo mitocondrial em Drosophila melanogaster.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Bioquímica - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, para obtenção do título de Mestre
em Ciências, ênfase em Bioquímica.

Aprovado em _________ de ______________________ de 20___________

BANCA EXAMINADORA

Prof.(a) Dr.(a)__________________________________________________________

Instituição:_____________________________________________________________

Julgamento:____________________________________________________________

Prof.(a) Dr.(a)__________________________________________________________

Instituição:_____________________________________________________________

Julgamento:____________________________________________________________

Prof.(a) Dr.(a)__________________________________________________________

Instituição:_____________________________________________________________

Julgamento:____________________________________________________________
Dedico aos meus pais que sempre acreditaram na minha capacidade e
investiram em minha formação.
 AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha orientadora, Luciane Carla Alberici, por ter, primeiro, me dado essa
oportunidade, segundo, por ter sido sempre compreensiva, gentil e amiga. O aprendizado no
mestrado foi além da parte científica e isso, pra mim, com certeza tem um significado
imensurável. Muito obrigada, professora.

Agradeço a FAPESP, CNPq e CAPES por todo suporte financeiro.

Para que meu mestrado fosse possível é inevitável não agradecer à todos os
mediadores, principalmente professores, que fizeram diferença na minha jornada até aqui.
Eles me instigaram, ensinaram, estimularam raciocínio, auxiliaram em meu desenvolvimento.
Sem eles o aproveitamento e aprendizado do mestrado não teriam a riqueza que tiveram.
Dentre tantos, gostaria de destacar minha orientadora de iniciação científica, Nadia Monesi.
Ela me proporcionou uma bagagem importante e essencial para o mestrado.

Agradeço à todos do laboratório que contribuíram durante o mestrado. Destaco alguns:

Julia Fernanda com todo seu comprometimento com as nossas moscas, Carlos Dechandt que
perdia seus finais de semana para me ajudar nas intermináveis respirações, Carlos Couto que
me auxiliou muito em diversos experimentos, e Gustavo Ferrari que além de toda ajuda de
bancada e escrita também foi apoio psicológico nas horas do café.

À todos os amigos que me auxiliaram tanto nas minhas lamentações quanto nas
construções positivas durante esse processo. Eles foram apoio psicológico. Citar nomes é um
tanto perigoso para uma pessoa com pouca memória como a minha. Cada um deles tem um
espaço especial.

Não menos importante, tenho muito a agradecer às pessoas que foram importantes no
meu desenvolvimento moral e ético. Características óbvias para qualquer área de escolha.
Meus pais, Lucia Hitomi Sakagute e Alfredo Luis Ferreira Tavares, que me ensinaram muito
sobre valores. Eles me deram a oportunidade de escolher os meus próprios e me apresentaram
muitos dos quais acabei escolhendo. Além disso, sempre foram muito preocupados com a
minha educação. Quando lembro da minha infância, lembro da minha mãe dizendo que a
educação sempre vem em primeiro lugar. E eles trabalharam muito para isso (estudar nesse
país não é nada barato). Sempre me incentivaram. Muito obrigada mãe. Muito obrigada pai.
Meus avós, José Ribeiro Tavares e Aurea Ferreira Tavares, que sempre me acolheram com
muito amor (educação é amor!). Obrigada vô, obrigada vó. Meus irmãos, Rafael Sakagute
Tavares e Natália Sakagute Tavares, meus cúmplices. Cumplicidade é tão importante nesse
processo. Amo vocês, meus irmãos. Ao meu marido, Carlos Roberto P. Andrade Filho, que
foi e é meu companheiro há muito tempo. Com toda simplicidade possível, conseguiu segurar
na minha mão e aguentar comigo mais essa etapa. Muito obrigada, meu amor. E, por último,
mas não menos importante, agradeço aos meus “filhos”, uma filha de coração, minha sobrinha
Letícia Sakagute Tavares Miranda, e outro filho biológico, João Vitor Sakagute Tavares de
Andrade. Eles são meu alicerce. Sem eles, já teria desistido há tempos. Muito obrigada, meus
amores.
RESUMO

TAVARES, Simone Sakagute. Avaliação da toxicidade da Atrazina livre e

Atrazina nanoencapsulada no desenvolvimento e metabolismo mitocondrial em
Drosophila melanogaster. 2019.57 f. Dissertação (Mestrado em Ciências, com ênfase em
Bioquímica)- Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão
Preto, 2019

Nesta dissertação foi avaliada a toxicidade do herbicida atrazina na forma livre e na

forma nanoencapsulada em poli-epsilon-caprolactona. É bem sabido que atrazina livre é um
composto que se mostrou tóxico em organismos não alvo estudados. Em alguns países, esse
herbicida é proibido devido seu potencial de toxicidade em humanos. Novas estratégias, como
nanossistemas, vem sendo desenvolvidas e aplicadas no campo da agroindústria com a
finalidade de melhorar a forma de liberação dos agroquímicos e consequente aplicação nas
plantações. Porém, poucos estudos foram desenvolvidos no que diz respeito à toxicidade
desses compostos nanoencapsulados e as nanocapsulas vazias em organismos não alvo. Os
resultados para atrazina livre, 2 ppm, mostraram alterações significativas nos parâmetros de
sobrevivência, volume pupal, habilidade de escalada, capacidade fosforilativa e conteúdo
mitocondrial, sendo que a nanoencapsulação da atrazina protegeu a Drosophila apenas no
volume pupal, na habilidade de escalada e na capacidade fosforilativa. atrazina
nanoencapsulada, 2 ppm, induziu estresse oxidativo e diminuição da porcentagem de larvas
que puparam. A Nanocapsula, 2 ppm, mostrou-se tóxica no volume pupal e conteúdo
mitocondrial. Para a concentração de 20 ppm, atrazina livre alterou significativamente a
sobrevida, o volume pupal e o conteúdo mitocondrial, sendo que a sua nanoencapsulação
protegeu a Drosophila apenas em relação ao conteúdo mitocondrial. Atrazina
nanoencapsulada, nessa mesma concentração, foi capaz de alterar apenas a porcentagem de
larvas que puparam. Para a nanocapsula, 20 ppm, os parâmetros que sofreram alterações
estatísticas foram: sobrevivência, volume pupal e atividade da acetilcolinesterase. Num
panorama geral, os resultados mostram que, no modelo de Drosophila melanogaster, não há
diferença de toxicidade entre atrazina livre e atrazina nanoencapsulada.

Palavras chave: Toxicidade; mitocôndria; Drosophila melanogaster, atrazina,

nanocapsula,
ABSTRACT
TAVARES, Simone Sakagute. Assesment of free and nanocapsulated atrazine
toxicity on the development and mitochondrial metabolism of Drosophila melanogaster.
2019.57 f. Dissertação (Mestrado)- Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade
de São Paulo, Ribeirão Preto, 2019

In the present dissertation the toxicity of the herbicide atrazine was assessed in both
free and nanocapsulated in poli-epsilon-caprolactone form. It is well known that atrazine in its
free form is toxic for non-target organisms. In some countries this herbiced is forbidden due
to its toxic potencial in human. New strategies, like nanosystems, are being developed and
applied in the agriculture industry in order to improve the liberation form of chemicals and its
use on plantations. However, few strudies have being conducted in order to analyse the toxic
effect of such compounds conjugated with nanocapsules, and also the effects of the
nanocapsule vehicle in non-target organisms. The results for free atrazine, 2 ppm, showed
significant alterations on the survival parameters, pupae volume, climbing ability,
phosphorylating capacity and mitochondrial content, while the nanocapsulated atrazine
protected the Drosophila regarding the pupae volume, climbing ability and phosphorylating
capacity. Nanocapsulated atrazine, 2 ppm, induced oxidative stress and diminished the
amount of larvae that pupated. In this concentration, the nanocapsule vehicle was toxic for the
pupae volume and mitochondrial content. In the 20 ppm concentration of free atrazine,
significant changes on the survival, pupae volume and mitochondrial content was observed,
while the nanocapsulated form protected the Drosophila only in the mitochondrial content.
The nanocapsulated form of atrazine in this concentration chanced the percentage of larvae
that pupated. Regarding the nanocapsule, 20 ppm, the following parameters demonstrated
changes: survival, pupae volume and acetylcholinesterase activity.

In the broad spectrum, the results showed that, in the Drosophila melanogaster, there
is no difference in the toxic effects of atrazine in its free form when compared to
nanocapsulated atrazine.

Keywords: Toxicity; mitochondria, Drosophila melanogaster, atrazine, nanocapsule

Sumário
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 11
1.1 ATRAZINA .................................................................................................................... 11
1.2 MODELO DROSOPHILA.............................................................................................. 14
1.3 NANOCÁPSULA .......................................................................................................... 16
2 OBJETIVO GERAL .............................................................................................................. 22
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 22
3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 23
4 RESULTADOS ..................................................................................................................... 32
5 DISCUSSÃO ......................................................................................................................... 42
6 CONCLUSÃO ....................................................................................................................... 50
7 REFERÊNCIAS1 ................................................................................................................... 51
 11

1 INTRODUÇÃO

1.1 ATRAZINA

Agroquímicos se tornaram a classe de produto mais extensamente encontrada em

sistemas hidrológicos de superfície e subterrâneos, devido ao seu amplo uso na agricultura e
em áreas urbanas. Os herbicidas usados na agricultura se tornaram uma indústria global
multibilionária e representam 40% do total de pesticidas usados em todo o mundo (GRILLO
et al., 2012; MATTOS DE AGUIAR et al., 2016).

Entre muitos herbicidas tóxicos, a atrazina (ATZ) se destaca como um dos mais
utilizados mundialmente, e tem se tornado prevalente como contaminante ambiental devido à
eficiência, baixo custo e fácil aplicação (GRIBOFF et al., 2014; JABLONOWSKI;
SCHÄFFER; BURAUEL, 2011). Foi introduzido como herbicida em 1957, patenteado na
Suíça em 1958 e registrado para uso comercial nos Estados Unidos em 1959. A atrazina é
amplamente utilizada para o controle de certas ervas daninhas anuais de folhas largas e
gramíneas em diversas plantações, como a de cana-de-açúcar e de milho, destacando-se maior
uso nesta última. (VAN DER KRAAK et al., 2014). Um estudo recente mostrou que atrazina
foi encontrada em quase todos os locais de amostragem coletadas no Brasil (SPOSITO et al.,
2018)

Atrazina (2-chloro-4-ethylamino-6isopropylamino-1,3,5-triazine) é um composto

organofosforado da família das triazinas (MARCUS; FIUMERA, 2016), cujas propriedades
incluem alto potencial de escoamento, persistência prolongada em solos, hidrólise lenta, baixa
pressão de vapor e moderada adsorção na matéria orgânica do solo (GRILLO et al., 2012). A
hidrosolubilidade da atrazina (33 mg / mL a 22 ºC), favorece a movimentação da substância
química no estado dissolvido das águas do subsolo durante a irrigação ou chuva. Com base
nessas propriedades, a ATZ pode ser encontrada em águas superficiais e também
subterrâneas. Uma vez que a atrazina esteja dissolvida em água, a hidrólise relativamente
pequena e as taxas de fotólise aquosas podem resultar em uma presença prolongada em água
estacionária (SOLOMON et al., 1995).

A contaminação de água e alimentos pela atrazina é comum, e a exposição

subsequente representa um fator de risco para organismos não-alvo, incluindo seres humanos,
de acordo com a espécie, tipo e faixa de concentração de herbicidas, além da forma e tempo
de exposição. O uso inadequado de herbicidas pode contaminar o ar, o solo e a água e levar à
 12

extinção de espécies sensíveis (GRILLO et al., 2012; MARCUS; FIUMERA, 2016; SILVA et
al., 2011; THORNTON et al., 2010)

Devido ao seu potencial tóxico e por ser regularmente encontrada em solo e água
potável, ATZ tornou-se objeto de preocupação contínua. Pesquisas mostram que este
composto persiste por décadas no solo. Pesquisadores sugeriram que a ATZ pode ser
transportada no ar (VAN DIJK; GUICHERIT, 1999). De fato, a ATZ tem sido encontrada
regularmente em águas superficiais e precipita a grandes distâncias de onde é usada, embora
em baixas concentrações (VAN DIJK; GUICHERIT, 1999).

Somado à persistência ao solo, há o fato de que grande quantidade desse composto é

aplicado anualmente em grandes plantações, representando uma ameaça pontencial a longo
prazo para o meio ambiente. Na Europa ATZ já esta banida ou estritamente restrito o uso
desde 1990. Mais de 18 anos depois de ter sido proibido na Alemanha, a ATZ continua a ser o
pesticida mais abundante em amostras de águas subterrâneas (JABLONOWSKI;
SCHÄFFER; BURAUEL, 2011; MARCUS; FIUMERA, 2016). Os limites determinados
pelas diretrizes da Agência de Proteção Ambiental dos EUAé 3 mgL 1, (USEPA, 2014).

Um dos desafios na avaliação de segurança desse composto é que os efeitos biológicos

são altamente controversos (MCCOY, 2010). A toxicidade de um composto é avaliada nos
organismos aquáticos por serem estas espécies a de primeiro contato e as mais sensíveis à
compostos potencialmente tóxicos. Efeitos negativos encontrados nessas espécies são,
portanto, forte indicativos de contaminação do meio ambiente. O herbicida ATZ está sob
revisão científica e regulatória por mais de uma década devido aos seus efeitos potenciais no
crescimento, reprodução e desenvolvimento em vertebrados aquáticos, particularmente
anfíbios. A literatura científica contém numerosos estudos ligando respostas à exposição à
ATZ, enquanto muitos outros estudos não relatam associação da ATZ com efeitos tóxicos
(VAN DER KRAAK et al., 2014).

Embora grande parte dos trabalhos tenham se concentrado em organismos aquáticos,

devido à sua maior concentração nesses ambientes, a ATZ também é um potencial tóxico para
sistemas terrestres. Experimentos de laboratório mostraram que ratos expostos ao composto
apresentaram uma ampla gama de efeitos fisiológicos (LIM et al., 2009). Na caracterização de
efeitos com estudos laboratoriais, os parâmetros de medida incluíram respostas tóxicas agudas
e crônicas, como sobrevivência, crescimento e reprodução (SOLOMON et al., 1995).
 13

Em Drosophila, a ATZ demonstrou alterar a produção de proteínas associadas à

produção de energia e ao estresse oxidativo (THORNTON et al., 2010) e afetar a expressão de
genes de resposta ao estresse (LE GOFF et al., 2006).

A ATZ não se bioacumula nos organismos e não se biomagnifica através da cadeia

alimentar, devido ao seu metabolismo rápido em animais.(VAN DER KRAAK et al., 2014)
Essa característica somada a degradação biótica e abiótica amenizam, de certa forma, o fato
de serem relativamente persistentes nos ambientes (SOLOMON et al., 1995)

Embora existam divergências nas estimativas da meia-vida, que é influenciada por:

temperatura, fonte de luz, tipo de sedimento e concentração, a meia-vida de fotólise aquosa
foi relatada como sendo 335 dias sob luz natural e um pH neutro (MCCOY, 2010;
SOLOMON et al., 1995).

O principal mecanismo de ação é através da inibição da fotossíntese em fotossistema

II. ATZ liga-se irreversivelmente aos sítios de ligação da plastoquinona do complexo
fotossistêmico II nas membranas tilacóides dos cloroplastos (Figura 1), inibindo assim o
transporte de elétrons (SOLOMON et al., 1995). Como os complexos da cadeia de transporte
de elétrons mitocondriais I e III também possuem sítios de ligação Q semelhantes (Figura 2),
hipotetiza-se que a ATZ possa se ligar a esses sítios mitocondriais, resultando em prejuízos na
fosforilação oxidativa mitocondrial. (LIM et al., 2009)

Figura 1: Esquema do mecanismo de inibição do fotosistema II, em cloroplastos, do herbicida Atrazina.

ATZ se liga em sítios Q da Plastoquinona prejudicando o transporte de elétrons e consequentemente
prejudicando a fotossíntese. Como consequência, essa inibição pode levar à morte da planta.

Fonte: (TUCCI et al., 2019)

 14

Figura 2: Figura mostrando a cadeia de transporte de elétrons em mitocôndrias

Fonte: Lehninger

As informações disponíveis na literatura sugerem claramente que levará décadas para

a ATZ e os metabólitos acumulados serem degradados no meio ambiente. Dessa forma,
estudos contínuos da atrazina e seus metabólitos em águas subterrâneas e superficiais e solos
é essencial, não apenas em áreas de aplicação direta, mas também em áreas remotas.
Pesquisas adicionais sobre o comportamento ambiental da atrazina e seus produtos de
degradação são de ampla relevância (JABLONOWSKI; SCHÄFFER; BURAUEL, 2011).

1.2 MODELO DROSOPHILA

Muitos obstáculos práticos e éticos limitam severamente os experimentos com seres

humanos. Muito do que sabemos sobre a biologia subjacente de células e tecidos vem de
estudos usando organismos modelo mais simples, como camundongos. A Drosophila tem
sido usada como um organismo modelo por mais de um século para estudar uma gama de
variedade de processos biológicos, incluindo genética e herança, aprendizado,
desenvolvimento embrionário, comportamento e envelhecimento. Ficou bem estabelecido que
a maioria dos mecanismos biológicos e vias fundamentais que controlam o desenvolvimento e
a sobrevivência são conservados através da evolução entre humanos e Drosophila, apesar
dessas espécies serem visivelmente deferentes (JENNINGS, 2011). Isso foi demonstrado, por
 15

exemplo, para vários comportamentos em Drosophila, como ritmos circadianos, aprendizado,

memória e sono (GREENSPAN et al., 2004).

Comparações entre os genomas de Drosophila e humanos, totalmente seqüenciados,

mostraram que aproximadamente 75% dos genes conhecidos de doenças humanas têm uma
correspondência reconhecível no genoma das moscas-das-frutas (JENNINGS, 2011). Apesar
de ser significativa, ainda não é o suficiente para se fazer uma correlação direta com o ser
humano, por isso deve-se ter cautela nas associações. O interessante é que esse modelo seja
uma escolha alternativa para triagem de compostos para posterior testes em modelos
mamíferos, como camundongos e ratos. Vale destacar que a utilização de Drosophila permite
um n amostral substancialmente maior do que esses organismos mamíferos superiores, como
ratos e camundongos.

A manutenção de Drosophila em laboratório é um processo relativamente fácil e

barato. Outra vantagem é que há poucas restrições éticas ao uso de Drosophila. Cada mosca
fêmea pode acumular até 100 ovos por dia por até 20 dias. Leva aproximadamente 10 dias a
25 ° C para um embrião se transformar em uma mosca adulta fértil. Dessa forma, é
relativamente fácil gerar um grande número de embriões ou moscas para uma abordagem
experimental, caso necessário. Apesar da Drosophila ser conhecida popularmente como
mosca da fruta por ser freqüentemente encontrada em vinhedos e pomares, ela se alimenta
mais de leveduras que crescem na fruta do que a fruta em si. Inicialmente moscas de
laboratório foram mantidas em frascos contendo polpa de banana em decomposição, mas
atualmente é mais comum mantê-las em frascos contendo alimentos gelatinosos. A geléia
precisa ser consistente o suficiente para que as moscas não fiquem presas nela, mas macias o
suficiente para as larvas rastejarem e se alimentarem (JENNINGS, 2011). É necessário manter
as linhagens de moscas como estoques vivos. Normalmente, os estoques de moscas são
mantidos a 18 °C, pois nessa temperatura a vida útil aumenta para até aproximadamente 28
dias (JENNINGS, 2011).

Nos últimos anos, esse modelo vem emergindo como um sistema valioso para uso no
processo de descoberta clínica de drogas (Bell, A. J., et al., Fly (2009) 3, 39. 31/ Gia comotto,
J. and Segalat, L., (2010) Br J Phar macol 160, 204). Sugere-se que a Drosophila seja um
excelente modelo para testar os efeitos de novas drogas nas vias bioquímicas conservadas em
humanos que controlam muitas atividades celulares, como a divisão celular, diferenciação e
movimento. Novas drogas podem ser testadas em Drosophila muito mais rápido do que nos
modelos de mamíferos. Podem até ser usados para o processo inicial de triagem como
 16

alternativa à cultura de células. O rastreio em um organismo inteiro promove a seleção de

compostos que possuem um perfil de segurança aprimorado para testes subsequentes em
modelos caros de mamíferos. Além disso, quando se utiliza Drosophila, pode se manipular de
maneira relativamente fácil a genética para simular uma doença para testar a eficácia de
medicamentos ou pesquisas de vias metabólicas conservadas envolvidas no processo.
(JENNINGS, 2011). Como exemplo, vários estudos mostram interesse em criar modelos de
Drosophila para doenças humanas que afetam o sistema nervoso, como a doença de
Huntington, a doença de Parkinson e a doença de Alzheimer. Estes foram criados não apenas
com o propósito de tentar entender os mecanismos genéticos e moleculares subjacentes à
doença, mas também como uma plataforma para o rastreamento de drogas. Da mesma forma,
as respostas da mosca à drogas como etanol, cocaína e nicotina também vem sendo estudadas
como possíveis modelos para o vício (GREENSPAN et al., 2004).

Assim, esse organismo modelo têm sido empregado em uma série de estudos,
facilitando o desenvolvimento científico dentro da ecologia, comportamento, genética, e
biologia molecular (MATTOS DE AGUIAR et al., 2016). Além disso, o uso de insetos como
uma poderosa ferramenta toxicológica foi proposto anteriormente (RAND, 2010). Estudos
mostram que a Drosophila é um excelente modelo para estudar a toxicidade de
nanopartículas. (POMPA et al., 2011).

A mosca da fruta assumiu novos papéis surpreendentes como um modelo potencial

para a biologia humana e a genética. Todos tentam capitalizar as manipulações genéticas
versáteis possíveis na mosca, e então procuram transferibilidade para os seres humanos, seja
no nível do mecanismo fundamental, seja no nível da triagem terapêutica preliminar
(GREENSPAN et al., 2004).

Embora existam deficiências no modelo de Drosophila que o excluem de testes

toxicológicos efetivos em certas áreas, a conservação de mecanismos celulares e de
desenvolvimento fundamentais entre moscas e o homem é extensiva o suficiente para garantir
um papel central para o modelo de Drosophila nos testes toxicológicos de hoje (RAND,
2010).

1.3 NANOCÁPSULA

Avanços tecnológicos trouxeram muitos novos e inovadores sistemas de distribuição

de medicamentos. Diferentes sistemas carreadores têm sido extensivamente estudados com o
 17

objetivo de controlar a liberação de substâncias ativas e melhorar a eficácia e seletividade das

formulações (FLORES et al., 2011). Os sistemas de liberação controlada são projetados para
fornecer resposta apropriada no local de ação necessário por períodos de tempo prolongados,
melhorando o tratamento (VAUTHIER et al., 2003)

Os sistemas de liberação controlada têm sido amplamente aplicados nas indústrias

alimentícia e farmacêutica para a liberação de substâncias ativas, como nutrientes, fármacos e
aromas (SILVA et al., 2010).

Determinados sistemas transportadores de drogas apresentam ainda a capacidade de

proteção para fármacos, que são instáveis in vivo e que normalmente exigem dosagens em
intervalos frequentes (BIZERRA; SILVA, 2016)

Sistemas de liberação nanoestruturados poliméricos representam uma excelente

estratégia para incorporação de substâncias ativas e apresentam vantagens que justificam sua
aplicação, dentre elas, a boa estabilidade física, química e biológica, e boa reprodutividade,
além de serem aplicáveis a uma ampla variedade de substâncias visando melhorar suas
propriedades químicas. Em comparação com as cápsulas grandes, as nanocápsulas oferecem
as vantagens de um tamanho subcelular, uma área superficial maior por unidade de volume
(GRANATA et al., 2018). Um outro fator importante é que o material que compõe as
partículas produza metabólitos não-tóxicos e seja degradado facilmente, daí a preocupação
para formulações obtidas a partir de polímeros biodegradáveis naturais (SILVA et al., 2010).

Os custos mais elevados que o das formulas farmacêuticas convencionais ocorrem em

função dos materiais e processos de microencapsulação utilizados. Por outro lado utiliza uma
menor quantidade do princípio ativo, podendo resultar em menor custo.(BIZERRA; SILVA,
2016)

Entre as diferentes abordagens, sistemas nanoestruturados, que são suspensões

aquosas coloidais, foram desenvolvidos (GUTERRES; ALVES; POHLMANN, 2007).

Os principais nanossistemas utilizados para carregamento de fármacos utilizam

nanopartículas poliméricas, lipossomas, ciclodextrinas e dendrímeros. As nanopartículas
poliméricas apresentam diâmetro inferior a 1 mícron, que podem ser denominados
nanocápsulas ou nanoesferas, dependendo de sua composição, estrutura e procedimento
adotado (BIZERRA; SILVA, 2016; GRILLO et al., 2012; GUTERRES; ALVES;
POHLMANN, 2007). ). Considerando os métodos de encapsulamento, o fármaco pode ser
 18

aprisionado, disperso, dissolvido ou adsorvido nas nanopartículas (GUTERRES; ALVES;

POHLMANN, 2007).

Inúmeros métodos permitem microencapsular um material ativo, sendo estes métodos

dependentes do tipo do material, da aplicação e do mecanismo de liberação desejado para sua
ação. Para a preparação de nanopartículas encapsuladas, destacam-se os seguintes métodos:
método de polimerização em emulsão em fase aquosa contínua, polimerização em emulsão
em fase orgânica contínua, polimerização interfacial, disposição interfacial, evaporação de
solvente, dessolvatação de macromoléculas e método de diálise (BIZERRA; SILVA, 2016;
SINHA et al., 2004).

As nanocápsulas são sistemas do tipo reservatório, sendo essa configuração

constituída por um núcleo contendo a substancia ativa e revestida por uma membrana
polimérica ou parede permeável (Figura 3 a e b). Já as nanoesferas são características dos
sistemas matriciais ou monolíticos, nos quais a substância ativa se encontra incorporada ou
adsorvida homogeneamente na estrutura de um polímero ou de co-polímeros, de composição
química e propriedades variáveis (Figura 3 c e d) (BIZERRA; SILVA, 2016; GRILLO et al.,
2012; SILVA et al., 2010; SINHA et al., 2004).

Figura 3 – Representação esquemática de nanocápsulas e nanoesferas poliméricas. a) ativo

dissolvido no núcleo oleoso das nanocápsulas; b) ativo adsorvido à parede polimérica nas nanocápsulas; c) ativo
retido na matriz polimérica das nanoesferas; d) ativo adsorvido ou disperso molecularmente na matriz polimérica

das nanoesferas.

Fonte: Adaptada de: (SCHAFFAZICK; GUTERRES, 2003).

A liberação do princípio ativo pode ocorrer por, basicamente, dois mecanismos:

difusão ou erosão. A difusão ocorre por meio de gradiente de concentração. No processo de
 19

erosão, o controle químico ocorre por meio da degradação da matriz. A substancia bioativa
também pode estar ligada covalentemente ao polímero e ser liberada pela ação de enzimas
especificas. As taxas de liberação de sistemas poliméricos podem ser controladas pela
natureza, composição e estrutura do material. Sistemas tipo reservatórios são adequados para
liberação a taxas quase constantes, enquanto que sistemas matriciais são menos dispendiosos
(BIZERRA; SILVA, 2016; SINHA et al., 2004).

A taxa de degradação “in vivo” do polímero é um importante fator que influencia na

cinética de liberação de fármacos a partir de tais sistemas, além de outros como: a
solubilidade e o coeficiente de difusão da droga no polímero e a carga do agente ativo. Para
esses sistemas, portanto, é interessante que os polímeros sejam biodegradáveis. Os polímeros
biodegradáveis mais utilizados atualmente são os poliésteres, tais como o poli-ε-caprolactona
(PCL), o ácido poli-lático (PLA) e os diferentes tipos de ácido poli-lático glicólico (PLGA)
(BIZERRA; SILVA, 2016).

Entre as possíveis nanoparticulas, a, nanopartícula baseada em poliéster alifático (ɛ-

caprolactona) (PCL) encontram aplicações interessantes nos campos médico e alimentar
devido à sua eficiência de custo e propriedades físico-químicas favoráveis (WOODRUFF;
HUTMACHER, 2010)

No campo da indústria alimentícia, um exemplo seria Oléos essenciais como

importantes antimicrobianos. A nanopartícula é uma boa estratégia para melhorar obstáculos
como mascarar o sabor, diminuir a volatilidade, aumentar a solubilidade e a estabilidade física
e reduzir a interação com os ingredientes alimentares, melhorando a bioacessibilidade e a
biodisponibilidade (WOODRUFF; HUTMACHER, 2010). Nanossistemas são candidatos
atraentes para uso no setor de alimentos. Eles podem representar uma alternativa natural aos
conservantes químicos na prevenção da disseminação de doenças transmitidas por alimentos e
na garantia de maior segurança em alimentos processados (GRANATA et al., 2018).

No campo da indústria farmacêutica, as nanopartículas apresentaram grande

capacidade em facilitar o contato de substâncias ativas com o estrato córneo, levando à alta
permeação das substâncias transportadas através da pele viável (Jenning et al. al., 2000b;
Maia et al., 2000). Elas são capazes de modificar a atividade dos fármacos, atrasar e controlar
a liberação, além de aumentar a adesividade ou seu tempo de permanência na pele
(GUTERRES; ALVES; POHLMANN, 2007)
 20

Em comparação com polímeros hidrofílicos, o PCL é capaz de controlar a liberação de

ingredientes ativos por mais tempo (GRANATA et al., 2018). A propriedade biodegradável
deste polímero sintético foi identificada pela primeira vez em 1973. A degradação do PCL em
comparação com o ácido poliglicólico e outros polímeros é lenta, tornando-o adequado para
entrega a longo prazo, que se estende ao longo de um período de mais de um ano (DJURDJIC
et al., 2015; SINHA et al., 2004). Com relação à degradabilidade, os produtos de degradação
são naturalmente metabólitos bioabsorvíveis (MANGEON et al., 2017). Como resultado,
vários copolímeros em bloco anfifílicos funcionais com PCL como segmento hidrofóbicos
ganharam atenção substancial (DJURDJIC et al., 2015). Isto levou à sua aplicação na
preparação de diferentes sistemas de distribuição na forma de microesferas, nanoesferas e
implantes. Muitos estudos avaliaram diferentes categorias de drogas encapsuladas em PCL
para a liberação direcionada e controlada, como em ingredientes ativos para plantas (A.-L.
LE ROY BOEHM, R. ZERROUK, H.; ZERROUK; FESSI, 2000), fármacos de administração
ocular (MARCHAL-HEUSSLER et al., 1993), digitoxina (M. GUZMÁN, M. R.
ABERTURAS, M. RODR et al., 2000), antineoplásicos (DJURDJIC et al., 2015), esteróides
contraceptivos, implantes subdérmicos, dispositivos intra-uterinos (Progestasert) (BIZERRA;
SILVA, 2016),e insulina no tratamento de diabetes (SHENOY et al., 2003).

A PCL é solúvel em solventes orgânicos como clorofórmio, diclorometano,

tetracloreto de carbono, benzeno, tolueno, ciclohexanona e 2-nitropropano à temperatura
ambiente. Tem uma baixa solubilidade em acetona, 2-butanona, acetato de etilo,
dimetilformamida e acetonitrilo e é insolúvel em álcool, éter de petróleo e éter
dietílico.(GRILLO et al., 2012; SINHA et al., 2004) O PCL é insolúvel em água, resistente a
óleo e possui degradação lenta em meio aquoso (GRANATA et al., 2018).

Considerando o amplo uso global de herbicidas, a aplicação de sistemas de liberação

controlada é de interesse tanto do ponto de vista ecológico quanto econômico (GRILLO et al.,
2012). Os herbicidas atualmente empregados também apresentam diversos problemas
relacionados à estabilidade química, dentre eles: solubilidade, biodisponibilidade,
fotodegração e sorção no solo. Além destes aspectos, esses agentes químicos e sua
transferência para os sistemas aquáticos através de processos de lixiviação podem contaminar
águas superficiais e/ou subterrâneas, influenciar na qualidade da água e trazer consequências
adversas ao homem, ambiente e biota. Desta forma, é importante o desenvolvimento de
sistemas que permitam a alteração de propriedades físico-químicas e liberação
 21

controlada/adequada de herbicidas sem prejuízos significativos ao ambiente.(SILVA et al.,

2010)

Após as inúmeras vantagens apresentadas acima, pode-se sugerir que o sistema de

transporte de nanocapsulas tem potencial para ser um método alternativo para a liberação
sustentada de herbicidas, como a ATZ. Como vantagens, a literatura sugere que impactos
ambientais diminuiriam, pois a quantidade de produtos químicos necessários para o controle
de ervas daninhas nas plantações também reduziriam (GRILLO et al., 2012). Apesar disso, a
literatura descreve apenas alguns trabalhos relacionados à nanossistemas de liberação
controlado de compostos com aplicações em agronegócio (SILVA et al., 2010), como o
trabalho recente de pesquisadores que nanoencapsularam ATZ em PLGA (SCHNOOR et al.,
2018),

Vale destacar que avaliar a toxicidade desses bioativos nanoencapsulados é necessária,

pois, apesar de diminuir a concentração do composto no meio ambiente, esses nanomateriais
podem potencializar os riscos à saúde. Há uma falta de avaliação aprofundada do potencial de
toxicidade dos nanomateriais e novas tecnologias na literatura. Evidência experimental de alta
toxicidade in vivo de material em nanoescala, que é amplamente considerado seguro e
biocompatível em sua forma a granel, tem várias implicações e abre questões importantes.
Uma maior conscientização desses potenciais problemas, juntamente com uma estratégia séria
para a avaliação de risco e segurança são necessários nos próximos anos, já que vários
nanomateriais estão sendo cada vez mais explorados. O conceito bem estabelecido de
biocompatibilidade esta experimentando algumas limitações, devido ao grande advento de
materiais em nanoescala e um novo campo, conhecido como nanotoxicologia, vem emergindo
nos últimos tempos (POMPA et al., 2011).
 22

2 OBJETIVO GERAL

A agroindústria vem se utilizando da nanotecnologia como uma possível abordagem

eficiente para a diminuição dos riscos ambientais de herbicidas tóxicos como Atrazina. Os
nanossistemas permitem uma liberação lenta e prolongada desses herbicidas, além de proteger
o ativo da degradação, e, dessa forma, a quantidade e frequência de aplicação desse
agroquímico nas grandes plantações diminui significativamente. Diminuindo a quantidade de
resíduos desses produtos, diminui-se então os impactos ambientais.

Levando em consideração esse novo sistema de liberação e que estudos recentes

mostram que os nanossistemas vem apresentando alta toxicidade, o questionamento feito
neste estudo foi sobre como seriam os efeitos desse novo composto (Atrazina
nanoencapsulada) em organismos não alvo. Para responder a esse questionamento, testou-se
então a toxicidade de atrazina em diferentes formas: livre ou nanoencapsulada, e em várias
concentrações, no modelo de Drosophila melanogaster, por meio de observações
comportamentais, de sobrevivência, parâmetros mitocondriais, de estresse oxidativo e
atividade neurotransmissora.

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Verificar se a ATZ livre e/ou ATZ nanoencapsulada alteram:

- o tempo de sobrevivência;

- a porcentagem de larvas que pupam e eclodem, e o volume no estagio prépupa;

- a habilidade de escalada;

- o conteúdo e metabolismo mitocondriais em tórax;

- o estado redox intracelular relacionado ao metabolismo mitocondrial;

- o sistema colinérgico por meio da medida da atividade da enzima Acetilcolinesterase

(AChe).
 23

3 MATERIAIS E MÉTODOS

Cultivo e ciclo de vida de Drosophila melanogaster

As linhagens de Drosophila melanogaster eram mantidas à temperatura constante de

25ºC, temperatura na qual o ciclo de vida dura aproximadamente 12 dias. Eram mantidas em
frascos de 500 ml, 250 mL ou de 50 ml contendo cerca de 50 ml, 25 ou 10 ml,
respectivamente, de meio padrão de Drosophila (Agar 0,5%; dextrose 5,15%; sacarose
2,62%; farinha de milho 8,5%; extrato de levedura de cerveja 1,55%; nipagin 1,15%, ácido
propiônico 0,5%; ácido fosfórico 0,02%). Garrafas e frascos eram tampados com espuma ou
algodão para evitar que as moscas escapassem e também para manter longe de ácaros e outros
animais. Para manipulação das moscas, as mesmas foram anestesiadas com segurança em
dióxido de carbono. As moscas eram colocadas em almofadas porosas conectadas a uma fonte
de dióxido de carbono e movidas com um pincel de ponta fina, enquanto vistas com um
estereomicroscópio.

O ciclo de vida de Drosophila compreende a fase embrionária, três estadios larvais e

as fases prépupal e adulta. Larvas de primeiro estadio (L1), à 25ºC, eclodem cerca de 24 horas
após a postura e logo começam a se alimentar na superfície do meio, onde permanecem até
sofrerem a primeira muda que ocorre cerca de 24 horas após a eclosão. As larvas de segundo
estadio (L2) migram para o interior do meio, onde ocorre a segunda muda cerca de 24 horas
mais tarde. O terceiro estadio larval (L3) dura cerca de 48 horas, sendo que as larvas
permanecem imersas no meio até um pouco antes do final desse estadio (cerca de 110 horas
após a postura). No final do terceiro estadio as larvas param de se alimentar, saem do meio e
começam a movimentar-se pela parede do frasco de cultura por aproximadamente 12 horas.
Ao final deste período ocorre a formação do pupario, que é caracterizado pela observação dos
espiráculos anteriores evertidos, imobilidade dos animais e ausência de coloração na cutícula.
Este estágio é denominado prépupa 0 hora. A ausência de coloração permanece por 30
minutos no máximo e este estágio é utilizado como parâmetro para estagiamento em idades
posteriores. O estagio prépupa compreende 12 horas. Ao término deste período, inicia-se o
estagio denominado de pupa que tem duração de 4 a 4,5 dias e que culmina com o surgimento
dos imagos (ASHBURNER, 1989)

Cruzamentos
 24

Todos os cruzamentos deste trabalho foram realizados a 25°C em tubos de cultura

individuais (“vials”) ou garrafas de 250 mL, sendo o número de fêmeas virgens duas vezes
maior do que o número de machos. Os parentais eram retirados do tubo dois dias após o
cruzamento.

Sistema UAS-GAL4 em D. melanogaster

O sistema UAS/GAL4 permite a expressão dirigida de sequências gênicas em D.

melanogaster. O gene GAL4 codifica uma proteína identificada em S. cerevisae como um
regulador da expressão de genes induzidos por galactose (LAUGHON et al., 1984). GAL4
regula a transcrição dos genes gal10 e gal1 pela ligação direta a quatro sítios relacionados
localizados entre estes loci (GINIGER; VARNUM; PTASHNE, 1985) que definem
sequências de ativação a montante (Upstream Activating Sequence, ou elemento UAS)
essenciais para a ativação transcricional dos genes regulados por GAL4. Fisher e
colaboradores (FISCHER et al., 1988) demonstraram que a expressão de GAL4 foi capaz de
estimular a transcrição de um gene repórter sob o controle da região promotora UAS em
Drosophila. Brand e Perrimon (BRAND; PERRIMON, 1993) descreveram o
desenvolvimento do sistema UAS/GAL4 para a expressão dirigida in vivo em Drosophila
melanogaster. Como a expressão do gene de interesse depende da presença de GAL4, a
ausência de GAL4 na progênie mantém a progênie num estado silenciado de sua expressão.
Para ativar sua expressão a linhagem contendo o gene de interesse controlado por sequências
UAS são cruzadas com moscas que expressam GAL4 em um determinado padrão, as quais
são denominadas “drivers”, pois dirigem a expressão de GAL4. A progênie resultante, que
contém ambos os elementos, expressa o gene de interesse num padrão transcricional que
reflete o padrão de expressão do respectivo “driver” de GAL4 (BRAND; PERRIMON, 1993)
(Figura 4).

Figura 4: Figura esquemática do Sistema UAS-GAL4. Expressão dirigida do gene repórter.

 25

Fonte: (KELLY; ELCHERT; KAHL, 2017)

Sobrevivência, Contagem de pupas e moscas e Volume pupal.

O início do processo de obtenção de L1 consistia na transferência de grandes

quantidades de adultos, linhagem Canton S, para frascos de 500 ml contendo meio padrão de
Drosophila, durante 24 horas, na presença de levedo para permitir o pleno desenvolvimento
dos ovários das fêmeas. Passadas as 24 horas, os mesmos adultos eram transferidos para um
novo frasco de mesmo volume repetindo as condições do meio e incubação. Ao final desta
etapa, os adultos eram transferidos para um béquer de plástico contendo pequenos furos,
tampado por uma placa de petri contendo meio de ovoposição (Agar 2,2%; sacarose 8,7%;
suco de uva 45,5%; NaOH 50 mM; ácido propiônico 4,88%; ácido fosfórico 4,88%). Nestas
condições as fêmeas depositam seus ovos no meio e é possível realizar coletas com tempos
determinados. Os adultos eram mantidos por 16h (Over night) e no dia seguinte eram
transferidos para um novo béquer de plástico e nova placa de petri contendo meio de
ovoposição. Após 4 horas, trocava-se a placa de petri com meio de ovoposiçao e mantinha-se
por mais 4 horas. Após esse tempo as moscas eram descartadas e essa ultima placa era
mantida à 25ºC para posterior coleta das larvas (L1), baseado na morfologia. Apesar de ter
havido 4 horas de diferença entre as larvas, essa variação esteve presente em todos os grupos
testados. Foram coletadas de 35 a 45 larvas L1 para cada vial contendo os seguintes
tratamentos: meio padrão de Drosophila, meio padrão (comida) + Atrazina (concentração
 26

final de 2 ppm), meio padrão + Atrazina (20 ppm), meio padrão + Nanocapsula (2 ppm), meio
padrão + Nanocapsula (20 ppm), meio padrão + Atrazina nanoencapsulada (2 ppm), meio
padrão + Atrazina nanoencapsulada (20 ppm). Os passos seguintes se diferiam conforme a
seguir:

Para o ensaio de sobrevivência: Após eclosão das moscas, as mesmas eram

transferidas para meio novo, sendo que os meios eram trocados a cada 3 dias. A contagem das
moscas mortas era realizada todos os dias durante 25 dias. Foram feitos 7 blocos de
experimentos independentes e simultaneamente para cada tratamento.

Para os ensaios de desenvolvimento: 1) Contagem pupas e moscas. As larvas que

pupavam e, posteriormente, as moscas que eclodiam eram contadas. 2)Volume pupal:
Drosophila no estagio de prepupa eram sexadas e com auxilio de uma câmera acoplada ao
estereomicroscópio, utilizando papel milimetrado como referência, eram coletadas as
imagens. Os volumes foram calculados utilizando-se o programa ImageJ.

Ensaio de resposta geotática

Os experimentos geotáticos foram realizados num aparato contracorrente (fig. 5). Esse
aparato é uma adaptação do método proposto inicialmente por Benzer (1967) (BENZER,
1967).

O aparato consiste em 5 conjuntos de tubos (10 cm cada) verticalmente opostos. Os

tubos eram mantidos em uma estrutura de madeira que permitia que os mesmos se movessem
horizontalmente pelo aparato. Inicialmente foram feitos testes com linhagem Canton S para
padronizar o tempo em que as moscas escalassem cada conjunto de tubos. O tempo
determinado foi então 15 segundos. Cerca de 15 moscas, com 15 dias, separadas por sexo, por
tratamento, foram usadas por rodada. As moscas eram condicionadas no primeiro tubo e se
esperava 1 minuto para que elas se ambientassem. Iniciava-se então a rodada. O aparato era
batido levemente sobre uma superfície macia para que as moscas fossem para a parte inferior
do tubo. Após 15 segundos, o conjunto de tubos superiores eram deslizados para a direita e
novamente se batia o aparato para que as moscas que tivessem escalado até o tubo superior
fossem para a parte inferior do tubo adjacente. Então se repetia esse processo até que os 5 sets
se completassem. Para cada rodada, uma pontuação era dada para quantificar a habilidade de
escalada das moscas. Para o cálculo, primeiro era multiplicado a quantidade de moscas dos
 27

tubos 1, 2, 3, 4, 5 por 0; 0,25; 0,5; 0,75 e 1,0, respectivamente. Depois esses valores eram
somados obtendo-se assim a pontuação (BENZER, 1967; BOYLE et al., 2010).

Figura 5: Foto do aparato adaptado para ensaio de geotaxia negativa.

Fonte: foto tirada pela própria autora.

Consumo de oxigênio mitocondrial

Para avaliação do consumo de oxigênio mitocondrial foi utilizado o sistema de

respirometria de alta resolução Oxygraph-2k (O2k, Oroboros Instruments). Os procedimentos
experimentais foram precedidos da lavagem das 2 câmaras do sistema pelo menos 3 vezes
com álcool 70% e com água deionizada e pelo menos 1 vez com álcool 98%, e da
estabilização do sinal à temperatura de 25ºC após adição de meio MIR05 (EGTA 0.5 mM,
MgCl2 3 mM, K-lactobionato 60 mM, taurina 20 mM, KH2PO4 10 mM, HEPES 20 mM,
sacarose 110 mM, albumina bovina sérica livre de ácidos gráxos 1 g/L, pH 7,1). Foram
adicionados 5 tórax de adultos, com 15 dias, separados por sexo, por tratamento, em cada
câmara contendo 2 mL de tampão MIR05. Após o fechamento das câmaras, foram fornecidos
substratos oxidáveis para suprir elétrons à cadeia respiratória: 12 μL de Piruvato 1,3 M, 4 μL
de Malato 1 M, 10 μL Glutamato 1,8 M. A respiração máxima acoplada (Estado P) foi
estimulada pela adição de 10 μL adenosina difosfato (ADP 43,75 mM), substrato da ATP-
sintase, e posteriormente inibida com 1 μL de Oligomicina 5 mM (Estado L, leak). Após
estabilização, a respiração máxima desacoplada (Estado E) foi estimulada pela adição de 2 μL
de CCCP 0,5 mM (carbonilcianeto-m-clorofenilidrazina), um ácido fraco de caráter
 28

hidrofóbico que quando protonado consegue atravessar a membrana interna mitocondrial

carregando prótons para a matriz. Por fim, foram adicionados 2 μL de antimicina A (500
μg/mL), inibidor do complexo III, e dessa forma mensurava-se o consumo de oxigênio não
relacionado à respiração mitocondrial (Estado Rox) (GNAIGER; PESTA; GNAIGER, 2012).

Após termino da respiração, o conteúdo de cada câmara era coletado em tubos

contendo 500 μl de KOH 5M para posterior quantificação proteica.

Quantificação proteica

A quantificação proteica foi feita através do método de Bradford que permite determinar a
concentração de proteínas totais das amostras (BRADFORD, 1976).

A curva padrão foi feita com albumina de soro bovino (do inglês, BSA) nas
concentrações: 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 e 0,05 mg/ml. Como branco, foram utilizados os tampões em
que cada amostra analisada estava solubilizada (tampão MIR05 para as amostras analisadas no
Oxígrafo, tampão de homogeinização para as que foram utilizadas na analise da Citrato sintase,
tampão fosfato para as utilizadas na analise da Acetilcolinesterase). Em todas as amostras foram
adicionados 200μl do reagente de Bradford (BioRad). A leitura foi feita utilizando um
comprimento de onda de 595nm, em leitora de microplaca, modelo Epoch2, marca BioTek.

Atividade da Citrato Sintase

Para análise da atividade da citrato sintase, foram utilizados um total de 5 tórax de

adultos, com 15 dias, separados por sexo, por tratamento. O tecido foi solubilizado em tampão
de homogeinização (Tris 20mM, KCl 40mM e EGTA 2mM, pH7,4), e macerados com auxilio
de pistilo para microtubos. Um volume de 5 μL do homogenato foi incubado à 37ºC em
200μL de tampão (Tris-HCl 50 mM ph 7,4, Triton X-100 0,1% e DTNB -ácido 5,5-ditiobis-
[2-nitrobenzóico]-100μM) e 2,5μL acetil-CoA 10mM (preparado na hora do uso). A reação
foi iniciada adicionando-se 2,5μL de ácido oxaloacetico 10mM. A absorbância foi monitorada
em espectrofotômetro a 412 nm por 5 minutos (SPINAZZI et al., 2012). A concentração de
proteínas das amostras foi determinada pelo método de Bradford, e a quantidade de enzima
foi determinada pela fórmula abaixo.

Unidades (μmols/min/mL)= ((ΔA412/min) x V(mL) x dil)/ (εmM x L x Venz )

Onde:
 29

ΔA412/min= (Absorbância final – Absorbância inicial) / (tempo final – tempo inicial);

V(mL) = Volume do teste: em placa de 96 poços (0,2 mL); dil = Volume do teste (mL)/
volume da amostra (mL); εmM = Coeficiente de extinção molar (13,6 mM-1. cm-1); L = Caminho
ótico: em placa de 96 poços (0,552cm); Venz = volume da amostra.

Atividade da Acetilcolinesterase

Para análise da atividade enzimática da Acetilcolinesterase, foram coletadas 30

cabeças de adultos, com 15 dias, separadas por sexo, por tratamento. As amostras foram
homogeinizadas em tampão fosfato 0,1M, pH 7,4. Para homogeinização foi utilizado
Sonicador, nas configurações: 15segundos, 30%. As amostras homogeinizadas eram então
centrifugadas (9000g, 20 minutos, 4ºC). O sobrenadante foi coletado em novo tubo. A
atividade enzimática foi medida utilizando 36µL desse sobrenadante e 180uL de mix (15 mL
tampão Fosfato 0,1M, pH 7,4; 500 µL DTNB 10mM; 100 µL de Acetilcolina0,075M).
(MAHARAJAN et al., 2018; MATTOS DE AGUIAR et al., 2016) A absorbância foi
monitorada em espectrofotômetro a 412 nm por 10 minutos (ELLMAN et al., 1961). O
cálculo foi feito a partir da fórmula a seguir:

R= 5,74.10-14 (ΔA/Co)

onde:

R= taxa, em mols de substratos hidrolizados por minuto por grama de tecido;

ΔA= variação da absorbância por minuto;

Co= concentração (proteína) original do tecido.

Análise de Estresse Oxidativo

Para análise do estresse oxidativo foi utilizado método baseado em Laker (LAKER et
al., 2014). Machos da linhagem transgênica UAS-Mitotimer foram cruzadas com fêmeas
virgens da linhagem Mef-Gal4. Cerca de 40 larvas de primeiro estagio (L1) foram transferidas
para vails contendo meio com os tratamentos. Após a eclosão das moscas, trocava-se os meios
a cada 3 dias. Adultos com 15 dias foram então separados por sexo, por tratamento. As
moscas foram dissecadas em tampão PBS 1x, sendo que foi feito um corte sagital no tórax. O
tecido foi fixado com paraformaldeído 4% por 30 min. Após fixação, foram realizadas três
 30

lavagens com PBS 1x, sendo cada lavagem de 5 minutos. Os tórax foram transferidos para
lamina e cobertos com FluoromountTM.

O gene repórter pMitoTimer, adicionado a sequência de direcionamento mitocondrial

do gene da subunidade VIII do citocromo c oxidase ao terminal N da região codificadora de
Timer, sob o controle de promotor constitutivo, codifica um mutante DsRed (DsRed1-E5) que
possui fluorescência verde quando recém-sintetizado, e desloca o espectro fluorescente
irreversivelmente para vermelho quando ocorre desidrogenação no resíduo Tyr-67. Como o
espectro de fluorescência muda com a oxidação, MitoTimer, acionado por um promotor
constitutivamente ativo, apresenta um histórico cumulativo redox das mitocôndrias marcadas
(LAKER et al., 2014). As imagens foram adquiridas por microscopia confocal e os sinais de
fluorescência, assim como as razões vermelho:verde foram analisados no programa Matlab.

Materiais biológicos

Neste trabalho foram utilizados embriões, larvas, pupas e adultos de Drosophila

melanogaster, mantidas em cultura no Laboratório de Analise de Metabolismo Mitocondrial e
Exercício da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto–USP. As linhagens
transgênicas, linhagens balanceadoras *, “drivers” de GAL4 e as linhagens selvagens
utilizadas nesse trabalho encontram-se relacionadas abaixo.

• Canton Special (CS): linhagem selvagem. Obtida do Laboratório do Dr. Spyros

Artavanis- Tsakonas, Yale University (E.U.A.).

• Mef2-GAL4(y1 w*; P{GAL4-Mef2.R}3): linhagem em que a expressão de GAL4 é

modulada pelo promotor do gene Mef2 (Myoblast enhance factor 2), o qual é expresso
somente em células miogênicas. Disponível no “Bloomington Drosophila Stock Center
#BL23790”.

• UAS-mitotimer (w[1118]; P{w[+mC]=UAS-MitoTimer}3): linhagem em que há

expressão sob o controle de UAS de uma variante DsRed direcionada para mitocôndria que
muda de verde para vermelha, irreversivelmente, quando oxidada e pode ser usada para
avaliar o envelhecimento mitocondrial e o estresse oxidativo.

Nanocápsulas
 31

As nanocápsulas de PCL foram preparadas por Grillo (2012) de acordo com a

deposição interfacial do método de polímero pré-formado, descrito pela primeira vez por
Fessi (1989) (FESSI et al., 1989), que envolve a mistura de uma fase orgânica em uma fase
aquosa.

Análise dos dados

Foram utilizados o software Graph Pad Prism (versão 5.0) e programa R (versão 3.4.1)
para a análise dos dados desse estudo. O nível de significância adotado para todos os testes foi
de 5%.

Para o teste de sobrevivência os dados foram apresentados como distribuições de

sobrevivência de Kaplan-Meier. A análise estatística utilizou teste de Log-Rank (Mantel-Cox)

A análise estatística para os ensaios de desenvolvimento, habilidade de escalada,

repirometria e atividades de citrato sintase e Acetilcolinesterase foi realizada utilizando
ANOVA de uma via. Os valores das variáveis quantitativas são expressos em média ± erro
padrão da média.

Para a análise dos dados de estresse oxidativo, utilizou-se o programa cell profile
(versão 3.1.5) para processamento das imagens e o programa Matlab para cálculo dos sinais
de fluorescência e razões vermelho:Verde. A análise estatística utilizou ANOVA de uma via.
 32

4 RESULTADOS

Sobrevivência e Desenvolvimento

O primeiro teste de toxicidade realizado foi o de sobrevivência. Foram escolhidos três

tratamentos: Atrazina livre (ATZ), Nanocápsula de PCL (NC) e Atrazina nanoencapsulada
(ATZ-NC). Para cada tratamento, utilizamos duas concentrações: 2 ppm e 20 ppm (9,3 e 93
μM, respectivamente). As concentrações utilizadas se basearam em trabalhos sobre toxicidade
em modelo de Drosophila utilizando ATZ livre (FIGUEIRA; AGUIAR; ROSA, 2017;
MARCUS; FIUMERA, 2016; MATTOS DE AGUIAR et al., 2016).

Figura 6- Curva de sobrevivência de Drosophila melanogaster. Curva de sobrevivência nas

concentrações de 2 ppm (A) e 20 ppm (B), para os tratamentos: Controle (CTRL), Atrazina (ATZ), Nanocapsula
de PCL (NC) e Atrazina Nanoencapsulada (ATZ-NC). (*) representa diferença estatística em relação ao grupo
controle (p< 0,05)
 33

Como pode ser visto no figura 6, todos os tratamentos diminuiram a sobrevida de

Drosophila no tempo determinado. Para a concentração de 2 ppm foram encontradas
diferenças estatísticas no grupo ATZ e ATZ-NC. Já para a concentração de 20 ppm, todos os
grupos apresentaram diferenças em relação ao controle.

O próximo passo foi verificar qual o efeito dos tratamentos sobre o desenvolvimento
de Drosophila. Para isso, foram medidas a porcentagem de larvas que pupavam e a
porcentagem de pupas que eclodiam (Figuras 7A e 7B). Além disso, também foram medidos
os volumes das pré pupas (Figura 7 C e D)

Figura 7- Efeitos da exposição à ATZ, NC e ATZ-NC durante o desenvolvimento embrionário e

larval de Drosophila melanogaster. Porcentagem de larvas que puparam (A), porcentagem de moscas que
eclodiram (B), volume pupal -concentração de 2 ppm (C), concentração de 20 ppm (D). Dados apresentados em
média ± Erro padrão da média. (*) representa diferença estatística em relação ao grupo controle (p< 0,05)

Pode-se observar na figura 7A que ATZ-NC diminui significativamente a

porcentagem de larvas que puparam, sendo que na concentração de 20 ppm observa-se um
efeito ainda maior. Quanto à eclosão das moscas, nao houveram diferenças estatísticas em
nenhuma concentração (Figura 7B). Em relação ao volume pupal, observa-se aumento no
tratamento na concentração de 2 ppm para ATZ (mais evidente) e NC, tanto em macho quanto
 34

em femea. Nos tratamentos com a concetração de 20 ppm, observamos diferenças em ATZ e

ATZ-NC em machos, e em todos os grupos para as fêmeas (Figura 7D).

Teste comportamental

Testes comportamentais são muito utilizados em testes de toxicidade. O teste de

escalada é bem validado para o modelo de Drosophila (BENZER, 1967) e é um teste
relativamente simples de ser executado. Conforme podemos observar na figura 8, para os
machos houve redução significativa na habilidade de escalada somente no grupo tratado com
ATZ na concentração de 2 ppm. Para as fêmeas, apesar de nao haver diferença estatística, o
grafico mostra que há uma tendência, em todos os tratamentos, de prejuízos na geotaxia
desses animais.

Figura 8- Resposta geotática de Drosophila melanogaster. Geotaxia de Drosophila, separada por sexo,
nas concentrações de 2 ppm (A) e 20 ppm (B), para os tratamentos: Controle (CTRL), Atrazina (ATZ),
Nanocapsula de PCL (NC) e Atrazina Nanoencapsulada (ATZ-NC). Dados apresentados em média ± Erro
padrão da média .(*)representa diferença estatística em relação ao grupo controle (p< 0,05)
 35

Analise da função mitocondrial.

Na literatura diversos trabalhos mostram que ATZ leva a prejuízos na função

mitocondrial e ao estresse oxidativo (GRIBOFF et al., 2014; HASE et al., 2008; LIM et al.,
2009; MA et al., 2018; SAGARKAR et al., 2016a; ZHANG et al., 2018). Dessa forma,
testamos os efeitos na respiração mitocondrial de tórax para os diferentes tratamentos
propostos nesse estudo (Figura 9). Após medirmos as taxas respiratórias nos estados de
fosforilação oxidativa (P), não-fosforilante (L) e máxima capacidade de transporte de elétrons
(E), calculamos as razões de controle de fluxo, as quais indicam vazamento de H+ como
fração da máxima capacidade de transporte de elétrons (L/E), capacidade de fosforilação em
relação ao vazamento de H+ (P/L) e fosforilação como fração da máxima capacidade de
transporte de elétrons (P/E). Para esses dados, observa-se que houve uma melhora na razão de
P/E para ATZ 2 ppm, o que demonstra uma maior capacidade fosforilativa . Os demais grupos
nao apresentaram diferença significativa.
 36

Figura 9- Análise de respirometria em tórax de Drosophila melanogaster. Dados apresentados em

razões, A) L/E (Voligo/Vccp), B) P/E (Vadp/Vcccp), C) P/L (Vadp/Voligo), nas concentrações de 2 ppm e 20
ppm, para os tratamentos: Controle (CTRL), Atrazina (ATZ), Nanocapsula de PCL (NC) e Atrazina
Nanoencapsulada (ATZ-NC). Dados apresentados em média ± Erro padrão da média. (*)representa diferença
estatística em relação ao grupo controle (p< 0,05)
 37

Para avaliar o conteúdo mitocondrial, foi medida a atividade da enzima Citrato Sintase
em tórax de Drosophila de todos os grupos. O resultado (Figura 10) mostra que somente o
grupo ATZ na concentração de 20 ppm em femeas apresentou aumento significativo em
relação ao conteúdo mitocondrial.

Figura 10- Atividade da Citrato Sintase de Drosophila melanogaster. Atividade da citrato sintase em
tórax de Drosophila, separada por sexo, nas concentrações de 2 ppm (A) e 20 ppm (B), para os tratamentos:
Controle (CTRL), Atrazina (ATZ), Nanocapsula de PCL (NC) e Atrazina Nanoencapsulada (ATZ-NC). Dados
apresentados em média ± Erro padrão da média. (*)representa diferença estatística em relação ao grupo controle
(p< 0,05)
 38

Para uma segunda avaliação do conteúdo mitocondrial e análise do estresse oxidativo,

utilizamos o gene repórter MitoTimer. MitoTimer pode ser usado para relatar o conteúdo
mitocondrial, estrutura, estresse e dano in vivo sob condições fisiológicas e patológicas
(LAKER et al., 2014). A baixa intensidade de fluorescência verde observada nos machos que
ingeriram 2 ppm de ATZ ou ATZ-NC, e fêmeas ATZ-NC, indica reduzido conteúdo
mitocondrial (Figura 11), enquanto em fêmeas que ingeriram NC foi observado aumento
desse conteúdo. O calculo da razão entre Mito Timer oxidado (vermelho) pelo total (verde)
mostra que somente ATZ-NC, 2 ppm, fêmea, apresentou aumento significativo do estresse
oxidativo (Figura 12).

Figura 11- Expressão do gene repórter mitotimer em mitocondrias. A análise por microscopia
confocal da expressão do gene repórter MitoTimer foi realizada em tórax de Drosophila. O gráfico mostra a
intensidade de fluorescência verde nos grupos: Controle (CTRL), Atrazina (ATZ), Nanocapsula de PCL (NC) e
Atrazina Nanoencapsulada (ATZ-NC), separados por sexo. (*)representa diferença estatística em relação ao
grupo controle (p< 0,05)

Figura 12- Análise do Estresse oxidativo em Drosophila melanogaster.- Quantificação da razao

vermelho:verde de intensidade de fluorescencia em machos (A) e fêmeas (B). Imagens de microscopia confocal
de tórax de Drosophila- C) expressão do gene mito timer-fluorescencia verde; D) oxidação da proteína
codificada por Mitotimer, fluorescência vermelha. A análise por microscopia confocal da expressão do gene
repórter MitoTimer foi realizada em tórax de Drosophila. As moscas são expostas aos compostos desde L1 até
adulto 15 dias. Grupos: Controle (CTRL), Atrazina (ATZ), Nanocapsula de PCL (NC) e Atrazina
Nanoencapsulada (ATZ-NC), 2 ppm. (*)representa diferença estatística em relação ao grupo controle (p< 0,05)
 39

C D

Acetilcolinesterase

Verificamos também se a diminuição da habilidade de escalada da mosca estaria

relacionada à atividade da Acetilcolinesterase, visto que um trabalho recente sugeriu a
inibição desta enzima como mecanismo de toxicidade para ATZ (MLADENOVIĆ et al.,
 40

2018a). Nossos dados mostram que a atividade de AChe foi aumentada para NC, em ambas as
concentrações, 2 e 20 ppm, e não houve diferença nos demais tratamentos (Figura 12)

Figura 13- Atividade da enzima Acetilcolinesterase. Atividade da Acetilcolinesterase em cabeça de

Drosophila, nas concentrações de 2 ppm (A) e 20 ppm (B), para os tratamentos: Controle (CTRL), Atrazina
(ATZ), Nanocapsula de PCL (NC) e Atrazina Nanoencapsulada (ATZ-NC). (*)p<0,05.
 41

Resumo dos resultados.

A tabela a seguir mostra um resumo dos resultados.

Tabela 1: Resumo dos resultados obtidos no presente estudo. Osinal (-) significa que não houve diferença estatística em relaçao ao controle e as
flechas indicam que houve diferença significativa com aumento (flecha voltada para cima) ou diminuição do efeito (fecha voltada para baixo).

ATRAZINA
ATRAZINA NANOCAPSULA
NANOENCAPSULADA
2 ppm 20 ppm Macho 2 ppm 20 ppm Macho 2 ppm 20 ppm Macho
+ Femea + Femea + Femea
2 20 2 20 2 20
ppm ppm ppm ppm ppm ppm
Sobrevivência -
% Pupa - - - -
Volume - - -
Pupal
% Eclosão - - - - - -
Escalada - - - - - - - - - - -
Ache - - - - - - - - - - -
Estresse - - - - -
oxidativo
Citrato - - - - - - - - - - -
Sintase
P/L - - - - - -
P/E - - - - -
L/E - - - - - -
 42

5 DISCUSSÃO

Sobrevivência e Desenvolvimento

Análises de sobrevivência e desenvolvimento são importantes para avaliação da

toxicidade de compostos como os agroquímicos (MARCUS; FIUMERA, 2016; MIRANDE et
al., 2010; OLIVEIRA et al., 2014; PAKYARI; ENKEGAARD, 2013; RUSSELL; SCHULTZ,
2010). A exposição a pesticidas leva à redução da sobrevida em diversas espécies de insetos
(MIRANDE et al., 2010; OLIVEIRA et al., 2014; PAKYARI; ENKEGAARD, 2013;
POMPA et al., 2011). No presente estudo, moscas mantidas em alimentos com ATZ, livre ou
nanoencapsulada, tiveram vida útil reduzida em ambas as concentrações testadas (2 e 20
ppm). Esse resultado é consistente com um prévio estudo que mostrou o potencial tóxico de
ATZ, nas mesmas concentrações utilizadas neste estudo, com efeito na diminuição de
sobrevida de Drosophila (MARCUS; FIUMERA, 2016).

Diversos ativos, destacando os agroquímicos, que são nanoencapsulados ou

nanoparticulados podem aumentar seu potencial de toxicidade com diminuição da
sobrevivência de organismos não alvo (AHAMED et al., 2010; HAN et al., 2014; SABAT et
al., 2016). Existem poucos estudos que foram realizados com a PCL nanocapsula e herbicidas.
Apesar de alguns estudos apontarem que herbicidas nanoencapsulados em PCL apresentaram
menor toxicidade que na forma livre (GRILLO et al., 2012), os resultados de sobrevivência do
presente estudo, para os grupos tratados com ATZ-NC, em ambas as concentrações testadas
(2 e 20 ppm), mostraram que houve também prejuízos na sobrevida da mesma forma que
ATZ livre.

O tamanho da partícula é uma característica que pode influenciar nos efeitos tóxicos
dos compostos, sendo que aqueles que são biocompativeis na sua forma a granel apresentaram
efeitos negativos quando formulados como nanossistemas (HAN et al., 2014). Na mesma
lógica, a idéia foi avaliar se, apesar do polímero PCL ser biodegradável e biocompatível, o
tamanho da partícula poderia ter efeito negativo para o organismo modelo testado. No
presente estudo, a NC apresentou uma redução na longevidade somente na concentração de
20 ppm. Esse resultado mostra que nanocápsulas de PCL podem ser tóxicas e que essa
toxicidade é dependente da concentração.

Uma explicação para a redução observada na sobrevida de moscas adultas pode ser
devido à hipótese sugerida de que a ATZ interage com o sistema de transporte de elétrons
 43

mitocondrial. Sabe-se que ATZ se liga irreversivelmente aos sítios de ligação da

plastoquinona do complexo fotossistêmico II nas membranas tilacóides dos cloroplastos,
inibindo assim o transporte de elétrons (SOLOMON et al., 1995). Como resultado, há um
prejuízo na fotossíntese e consequentemente morte da planta. Sugere-se que na mitocôndria
ATZ se ligue aos complexos I e III por possuírem sítios de ligação Q semelhantes, resultando
na supressão da fosforilação oxidativa (OXPHOS). Dessa forma podendo interferir na função
mitocondrial (LIM et al., 2009).

Esta hipótese é corroborada por trabalhos que mostraram que a exposição à ATZ
provoca alterações nos níveis de proteínas para genes conhecidos por responderem ao estresse
mitocondrial em D. melanogaster (THORNTON et al., 2010) e trabalhos que mostram que a
atrazina está associada com prejuízos mitocondriais em ratos (LIM et al., 2009). Essa
disfunção mitocondrial pode levar à superprodução de espécies reativas de oxigênio que
podem gerar um quadro de estresse oxidativo. Diversos estudos mostram que o estresse
oxidativo tem se mostrado um componente significativo do envelhecimento e expectativa de
vida (BECKMAN; AMES, 1998; FINKEL; HOLBROOK, 2000; HARSHMAN; HABERER,
2000).

Assim como a sobrevivência, o desenvolvimento também é afetado quando

organismos são expostos à compostos tóxicos, como os pesticidas e herbicidas (FIGUEIRA;
AGUIAR; ROSA, 2017; MARCUS; FIUMERA, 2016; MIRANDE et al., 2010). Sabe-se que
a exposição à ATZ é toxica para embriões e larvas de Drosophila, podendo afetar o
desenvolvimento e o metabolismo energético (FIGUEIRA; AGUIAR; ROSA, 2017). Em
relação ao desenvolvimento, aqui foi avaliada a toxicidade da ATZ, livre e nanoencapsulada,
em larvas e pupas. Para a porcentagem de larvas que puparam, apesar da literatura mostrar
que ATZ diminui essa taxa em Drosophila (FIGUEIRA; AGUIAR; ROSA, 2017; MARCUS;
FIUMERA, 2016), nossos resultados mostraram que, embora o grupo exposto à ATZ livre
tenha apresentado uma diminuição nessa porcentagem, somente o grupo ATZ-NC apresentou
essa mesma alteração com diferença estatística. Para o estagio larval então, pode-se observar
nos resultados obtidos que ATZ livre é menos tóxica do que ATZ-NC. Reduções na
viabilidade larval da mosca da fruta observadas são prováveis conseqüências do estresse
oxidativo induzido pela exposição à atrazina (FIGUEIRA; AGUIAR; ROSA, 2017). Nesse
sentido, para este ensaio, pode-se dizer que a ATZ nanoencapsulada teve a toxicidade
potencializada, quando comparada a ATZ livre.
 44

Em relação à porcentagem de eclosão das pupas, não observamos diferenças nos

tratamentos propostos, apesar de estudos mostrarem que a taxa de eclosão diminui em
Drosophila expostas à ATZ em ambas as concentrações 10 e 100 µM (FIGUEIRA; AGUIAR;
ROSA, 2017; MARCUS; FIUMERA, 2016). Já o volume pupal apresentou bastante
alteração, sendo que somente para a ATZ-NC na concentração de 2 ppm não foi encontrada
diferença significativa. Para os demais grupos, incluindo os tratados com 20 ppm, o volume
pupal aumentou significativamente, demonstrando que somente quando em baixa
concentração (2 ppm) a toxicidade da ATZ é menor quando nanoencapsulada. Na
concentração de 20 ppm, estudo prévio já havia mostrado que há um aumento no tamanho
corporal em moscas expostas à ATZ (MARCUS; FIUMERA, 2016).

Existem várias hipóteses de mecanismos possíveis para os efeitos da atrazina no

desenvolvimento. Uma delas é que a ATZ pode interagir com a ecdisona e, portanto, com a
via de sinalização da insulina, causando assim a aceleração no tempo de desenvolvimento e a
alteração no tamanho corporal. Isso poderia ser mediado por uma alteração na ingestão de
alimentos, uma vez que as larvas de Drosophila podem alterar sua ingestão de alimentos em
resposta a uma variedade de toxinas em seu ambiente (MUELLER; BARTER, 2015).
Fiumera (2016) sugere que mudanças no tamanho corporal podem estar relacionadas à ação
da ATZ na ruptura endócrina (EDC), consequentemente afetando alguns componentes do
sistema endócrino, como a via de sinalização da insulina. Outra hipótese é de que durante o
desenvolvimento embrionário e larval as moscas apresentem aumento significativo na
produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e desequilíbrio redox, podendo acarretar
em prejuízos no desenvolvimento quando expostas à ATZ (FIGUEIRA; AGUIAR; ROSA,
2017; MARCUS; FIUMERA, 2016).

Comportamental

O efeito comportamental de diferentes formas de exposição crônica de ATZ em

Drosophila melanogaster foi avaliado. O teste de escalada permite observar o quanto o
composto altera a capacidade locomotora desses animais. Alguns estudos mostram que avaliar
as características comportamentais são importantes marcadores para avaliação de toxicidade
de compostos (BARDULLAS; GIORDANO; RODRÍGUEZ, 2011; BELLONI et al., 2011;
FIGUEIRA et al., 2017; HORZMANN et al., 2018).
 45

É reconhecido que os poluentes ambientais podem causar alterações comportamentais

nas moscas. A exposição crônica ao bisfenol A, por exemplo, induz um aumento no número
de episódios de higiene em D. melanogaster (KAUR et al., 2015). Além disso, moscas
expostas a nanopartículas de titânio durante o desenvolvimento demonstraram uma
diminuição nos ensaios de escalada (SABAT et al., 2016).

Sabe-se que ATZ altera a locomoção de diferentes organismos. A administração da

ATZ resulta em comprometimento da coordenação motora e maior atividade locomotora
espontânea, além de levar a alterações comportamentais e neuroquímicas, em exposição
crônica, em ratos (BARDULLAS; GIORDANO; RODRÍGUEZ, 2011; MA et al., 2018;
WALTERS et al., 2015). A exposição a ATZ, mesmo em uma dosagem muito baixa, afetou
claramente a expressão de alguns perfis comportamentais críticos em camundongos jovens e
adultos (BELLONI et al., 2011). Organismos aquáticos, como zebra fish, também alteraram a
locomoção quando expostos à ATZ (HORZMANN et al., 2018). Em Drosophila mostrou-se
que ATZ, nas mesmas concentrações utilizada neste estudo, prejudica a habilidade de
escalada em ensaios de geotaxia negativa (FIGUEIRA et al., 2017).

Como pode ser visto, os resultados deste estudo são consistentes com Figueira (2017)
para o grupo tratado com ATZ 2 ppm, macho. Este grupo apresentou uma perda da habilidade
de escalada significativa. Os demais grupos também diminuíram a habilidade de escalada,
porém esse efeito não foi significativo.

A dose pode ser particularmente relevante porque, em alguns casos, a menor

exposição à ATZ (1 μg/Kg/dia) se apresentou mais efetiva do que a exposição mais alta (100
μg/Kg/dia) na modificação de resposta comportamental (BELLONI et al., 2007).

Sendo assim, para o teste comportamental escolhido neste estudo, habilidade de

escalada, ATZ-NC mostrou-se menos tóxica do que ATZ livre.

Há evidências na literatura que suportam a hipótese de que modulações

comportamentais podem estar relacionadas a alterações no sistema neurológico causadas por
compostos tóxicos (FIGUEIRA et al., 2017).

Atividade da Acetilcolinesterase
 46

Considerando que a exposição à atrazina e situações associadas ao estresse oxidativo

provavelmente levam a distúrbios neurológicos, a atividade da AChe pode ser útil para
monitorar os efeitos associados aos compostos neurotóxicos (BOILY et al., 2013).

É bem sabido que agroquímicos exercem efeitos neutotóxicos em organismos não alvo
(COBAN; FILIPOV, 2007; FIGUEIRA et al., 2017; LI et al., 2018; SONG et al., 2015).

Abordagens baseadas em ligante e baseadas em estrutura in silico confirmaram os

modos de ligação e a farmacologia de alguns compostos e concluíram que os pesticidas e
herbicidas, em sua maioria, inclusive a ATZ, exercem toxicidade inibindo reversivelmente a
enzima acetilcolinesterase (AChe). Esta enzima atua na fenda sináptica e nas junções
neuromusculares, causando a quebra da acetilcolina (ACh), um neurotransmissor essencial no
sistema nervoso central (SNC) de insetos, roedores e humanos, em seus compostos base, o
acetato e a colina. Os inibidores competitivos da AChe interrompem a fisiologia dos gânglios
autonômicos, bem como das junções efetoras neuromusculares, parassimpáticas e simpáticas,
controladas pela ACh (MLADENOVIĆ et al., 2018b). A inibição da AChe resulta no
acúmulo de neurotransmissores e subsequente interferência com a via colinérgica, causando
hiperestimulação muscular e distúrbios no movimento. Consequentemente, processos
comportamentais, como fuga, podem ser afetados (MATTOS DE AGUIAR et al., 2016).
Diversos estudos associam alterações de comportamento com disfunções neurológicas
(BELLONI et al., 2011; LI et al., 2018; MIRANDE et al., 2010). Dessa maneira, a alteração
observada nos ensaios de geotaxia negativa poderiam ser explicados por possíveis alterações
no sistema colinérgico.

Os resultados do presente estudo mostraram que a atividade da AChe aumentou no

grupo NC, fêmea, nas concentrações de 2 e 20 ppm. O resultado foi inesperado, já que, pelas
evidências da literatura, esperar-se-ia observar alterações nos grupos tratados com ATZ. Além
disso, a alteração observada na habilidade de escalada para ATZ 2 ppm não foi correspondido
então pelos ensaios de AChe.

Uma possível explicação para os resultados observados está no fato de que a inibição
da AChe pela ATZ é dependente da dose, sendo que doses maiores que 0,5 μg/mL de ATZ
não exercem nenhum efeito sobre a inibição de AChe (MLADENOVIĆ et al., 2018b).

Aumento na atividade da AChe pode levar a diminuição da concentração da ACh

interferindo na via colinérgica no sentido de diminuir a estimulação muscular. Para o grupo
NC 20 ppm, fêmea, que teve a atividade de AChe aumentada, esperaríamos ver uma resposta
 47

diminuída na habilidade de escalada. Porém não foi esse resultado observado. Todavia, é
importante ressaltar que não só a via colinérgica é responsável por modular respostas
musculares e, dessa forma, outras vias podem estar interferindo para explicar os resultados
observados no teste de escalada. Sabe-se, por exemplo, que ATZ está associada ao aumento
de produção de EROS em moscas adultas (FIGUEIRA et al., 2017), podendo, dessa forma,
levar ao estresse oxidativo em tecidos musculares resultando em alterações na locomoção
desses animais.

Interessantemente, se observarmos os resultados do teste de sobrevivência, veremos

que o grupo NC diminuiu a sobrevida justamente nessa concentração de 20 ppm. Esse
resultado fornece pistas de possíveis associações de toxicidade da NC. Porém mais estudos
devem ser realizados para se chegar a alguma conclusão consistente.

Mitocôndria

A outra hipótese para explicar a alteração comportamental observada está no fato de

que a exposição à ATZ pode causar efeitos deletérios sobre a função mitocondrial em
diferentes células de diferentes organismos (LIM et al., 2009; MA et al., 2018; SAGARKAR
et al., 2016a; ZHANG et al., 2018). Consequentemente, vários parâmetros bioquímicos e
fisiológicos podem ser afetados após a exposição à atrazina (FIGUEIRA et al., 2017). Estudos
mostram que genes que estão relacionados com a difunção mitocondrial foram alterados
quando linhagens de células musculares foram expostas à ATZ, mostrando uma associação
positiva entre esse herbicida e disfunção mitocondrial (SAGARKAR et al., 2016a). Outro
estudo apoia o papel da atrazina em afetar o transporte de elétrons na mitocôndria de
Drosophila melanogaster (THORNTON et al., 2010). Em musculos de ratos, a administração
crônica de ATZ (30 e 300 μg/Kg/dia) prejudica tanto a função respiratória mitocondrial
quanto sua morfologia (LIM et al., 2009).

Nos resultados apresentados em relação à respiração mitocondrial, observa-se

diferença significativa apenas em ATZ 2 ppm na razão P/E, o que demonstra uma maior
capacidade fosforilativa. No entanto, observamos uma redução (estatisticamente não
significativa) sob alta concentração (20 ppm), o que vai ao encontro de trabalhos anteriores
que mostram que ATZ afeta negativamente a fosforilação oxidativa (OXPHOS) em músculo
esquelético de ratos (LIM et al., 2009) e em células de músculo e fígado de ratos na
concentração de 10-450 μM (SAGARKAR et al., 2016b). A atividade da citrato sintase
 48

mostrou que femeas expostas à ATZ 20 ppm apresentaram aumento significativo do conteúdo
mitocondrial, o qual pode estar relacionado à uma resposta à diminuição da capacidade
fosforilativa ( razão P/E) vista na respiração mitocondrial, apesar desta diminuição não ser
uma diferença estatística. Embora não haja diferenças estatísticas no ensaio da atividade da
cintrato sintase para os tratamentos na concentração de 2 ppm, os dados da intensidade de
fluorescência de GFP indicam que houve uma redução do conteúdo mitocondrial em ATZ-NC
2 ppm tanto para machos como para fêmeas, diminuição para machos ATZ 2 ppm e aumento
desse conteúdo em femeas NC 2 ppm.

Estresse oxidativo

Distúrbios no meio ambiente, como aplicação frequente de herbicidas e pesticidas,

comumente afetam os organismos ao induzir uma situação fisiológica que é chamada de
estresse oxidativo (MONSERRAT et al., 2007). Esta situação é definida como um
desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e o sistema de defesa
antioxidante, em favor do primeiro, culminando na geração de dano oxidativo. A geração de
estresse oxidativo representa um mecanismo de toxicidade que tem sido sugerido para
herbicidas à base de glifosato em organismos não-alvo (MATTOS DE AGUIAR et al., 2016).
Além disso, o herbicida atrazina também induz estresse oxidativo ao interferir com diferentes
desfechos e produção de EROs em diversas espécies (ABARIKWU et al., 2010; FIGUEIRA
et al., 2017; LIU et al., 2006; POMPA et al., 2011; SPOSITO et al., 2018; THORNTON et al.,
2010).

Somado ao aumento de EROs, vários estudos mostram a diminuição da defesa

antioxidante quando organismos são expostos a ATZ (FIGUEIRA; AGUIAR; ROSA, 2017;
GRIBOFF et al., 2014; SEMREN; ŽUNEC; PIZENT, 2018; YANG et al., 2013). Essa
combinação de aumento de ROS e diminuição da defesa antioxidante, causado pela ATZ,
pode levar ao quadro de estresse oxidativo.

Apesar de vários estudos mostrarem associação positiva entre ATZ e estresse

oxidativo, somente o grupo ATZ-NC 2 ppm, fêmea, apresentou um aumento significativo.
Para esse resultado, podemos concluir que ATZ-NC se apresentou mais tóxica do que ATZ
livre na concentração de 2 ppm.
 49

Talvez se a concentração de ATZ fosse maior, veríamos diferenças no estresse

oxidativo. Lim 2009 diz que os resultados dele puderam ser vistos, diferente dos outros
trabalhos, porque ele usou uma dose bem mais alta (LIM et al., 2009).
 50

6 CONCLUSÃO

Pode-se concluir que diante os efeitos tóxicos estatisticamente significativos

promovidos por ATZ livre, na concentração de 2 ppm, sobre parâmetros de sobrevivência
(ambos), habilidade de escalada (macho), volume pupal (ambos), capacidade fosforilativa
(ambos) e conteúdo mitocondrial (macho), a nanoencapsulação da ATZ protegeu a
Drosophila melanogaster apenas da diminuição na habilidade de escalada, do aumento
volume pupal e aumento na capacidade fosforilativa. De forma independente, 2 ppm ATZ
nanoencapsulada induziu o estresse oxidativo mitocondrial (femeas) e diminuiu a
porcentagem de larvas que puparam. A nanocapsula de PCL, na concentração de 2 ppm,
demonstrou efeito tóxico aumentando o volume pupal (ambos) e o conteúdo mitocondrial
(fêmeas).

Já à 20 ppm, dos efeitos tóxicos estatisticamente significativos promovidos pela ATZ

livre sobre parâmetros de sobrevivência (ambos), volume pupal (ambos), e conteúdo
mitocondrial (femeas), a nanoencapsulação da ATZ protegeu a Drosophila melanogaster
apenas do conteúdo mitocondrial. De forma independente, ATZ nanoencapsulada, 20 ppm,
diminuiu a porcentagem de larvas que puparam. À 20 ppm, a nanocápsula de PCL
demonstrou efeito tóxico, diminuindo a sobrevivência (ambos), aumentando o volume pupal
(fêmeas) e aumentando a atividade da AChe (fêmeas).

Analisando o conjunto de dados, pode-se concluir que não houve diferença de

toxicidade entre a ATZ livre e ATZ nanoencapsulada, nos ensaios realizados, quando utiliza-
se como modelo animal Drosophila melanogaster.
 51

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