Tese Completa Original

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO
Caracterização molecular de linhagens de Campylobacter jejuni

de origens diversas isoladas no Brasil
Miliane Rodrigues Frazão
Ribeirão Preto
2018
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO
Caracterização molecular de linhagens de Campylobacter jejuni

de origens diversas isoladas no Brasil
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biociências Aplicadas à Farmácia para
obtenção do Título de Doutor em Ciências
Área de Concentração: Biociências Aplicadas à Farmácia
Orientada: Miliane Rodrigues Frazão

Orientadora: Profª Drª Juliana Pfrimer Falcão
Ribeirão Preto
2018
FICHA CATALOGRÁFICA
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Frazão, Miliane Rodrigues
Caracterização molecular de linhagens de Campylobacter jejuni de origens

diversas isoladas no Brasil. Ribeirão Preto, 2018.
147 p. : il. ; 30cm.
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de

Ribeirão Preto/USP - Área de Concentração: Biociências Aplicadas à Farmácia.
Orientadora: Falcão, Juliana Pfrimer
1. Campylobacter jejuni 2. Genes de virulência 3. Perfil de resistência a

antimicrobianos 4. PFGE 5. SVR do gene flaA 6. Análise do locus CRISPR
por HRMA 7. MLST 8. Sequenciamento do genoma completo
FOLHA DE APROVAÇÃO
Miliane Rodrigues Frazão

Caracterização molecular de linhagens de Campylobacter jejuni de origens diversas isoladas
no Brasil
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biociências Aplicadas à Farmácia para
obtenção do Título de Doutor em Ciências
Área de Concentração: Biociências Aplicadas à Farmácia
Orientadora: Profª Drª Juliana Pfrimer Falcão
Aprovado em:
Banca Examinadora
Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Instituição: ______________________________ Assinatura:__________________________
Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Este trabalho foi realizado nos seguintes laboratórios de pesquisa:
Laboratório de Bacteriologia, Epidemiologia Molecular, Virulência Bacteriana e

Estudos da Genômica de Microrganismos do Departamento de Análises Clínicas,
Toxicológicas e Bromatológicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto
da Universidade de São Paulo (FCFRP-USP), sob a orientação da Profa. Dra. Juliana Pfrimer
Falcão.
Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN) - Food and Drug Administration
(FDA), na cidade de College Park, Maryland, Estados Unidos, onde foram realizados, durante
o período de doutorado sanduíche no exterior, os experimentos do sequenciamento do genoma
completo sob a orientação do Dr. Marc W. Allard.
Dedico este trabalho aos meus pais
Jair e Onélia, pelo apoio e amor incondicionais
que me fizeram chegar até aqui!
Agradecimentos
A Deus por me iluminar e me guiar durante toda a minha trajetória me concedendo forças e
esperança para sempre prosseguir, mesmo diante dos obstáculos;
À minha orientadora Profª Drª Juliana Pfrimer Falcão pela oportunidade em realizar este
trabalho, pelos ensinamentos concedidos durante toda a minha trajetória na pós-graduação,
por toda a paciência e confiança em mim depositada e por sempre se mostrar tão disponível
em todas as situações. Os meus mais sinceros agradecimentos!
Aos amigos do laboratório, Amanda, Carolina, Fábio, Felipe, Júlia e Roberto, pela
disposição em ajudar, pelas inúmeras sugestões, pelas valiosas discussões científicas e pelos
agradáveis momentos de descontração. É uma honra fazer parte desse grupo!
Aos meus pais Jair e Onélia, às minhas irmãs Liliane e Viviana por sempre me apoiarem,
pelo amor incondicional e por compreenderem as minhas ausências. Em especial à minha
mãe, por sempre estar comigo, por ser o meu refúgio e por me fazer enxergar esperança em
todos os percalços da vida. Aos meus sobrinhos Rafael e Isabela por me ensinarem o
verdadeiro significado do amor na sua forma mais pura e sincera e por me fazerem enxergar
alegria nas coisas mais simples da vida. Amo todos vocês!
Às queridas amigas Heliara e Renata pelo ótimo convívio, por tornarem os meus dias em
Ribeirão Preto mais divertidos e felizes, e por estarem sempre presentes na minha vida mesmo
depois que a distância física nos foi imposta;
À Vania Claudia de Albuquerque pelo auxílio administrativo, pela ajuda com o resumo em
espanhol e pela amizade;
À Jaqueline Passaglia e Eliane Figueiredo pelo apoio técnico no decorrer deste trabalho;
À Pesquisadora Dra. Marta Inês Cazentini Medeiros do Instituto Adolfo Lutz de Ribeirão
Preto (IAL-RP), pela valiosa colaboração estabelecida;
À Pesquisadora Dra. Ana Luzia Lauria Filgueiras da Coleção de Campylobacter da

Fundação Oswaldo Cruz do Rio de Janeiro (FIOCRUZ-RJ) e à Curadora da Coleção Dra.
Sheila da Silva Duque pela importante colaboração com o nosso grupo de pesquisa. Obrigada
Ana Luzia, Sheila, Jacqueline, Wagner e Gabriela por me receberem tão bem durante o meu
período de estágio no laboratório. Sem a colaboração de vocês a realização desse trabalho não
seria possível;
Ao Prof. Dr. Dimas Tadeu Covas pelo uso do sequenciador no Laboratório de Genética
Molecular e Bioinformática da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de
São Paulo (FMRP-USP) nas dependências da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto;
À Adriana Aparecida Marques, funcionária da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto, pelos

sequenciamentos realizados;
Ao Dr. Marc W. Allard pela oportunidade de estágio em seu laboratório no Food and Drug
Administration (FDA), durante o período de doutorado sanduíche no exterior para a realização
da metodologia de sequenciamento do genoma completo, à Guojie Cao pelo auxílio com a
análise dos dados, à Daniela Miller pelo apoio técnico com os experimentos de
sequenciamento e à Maria Sanchez Leon pelo trabalho de depósito e liberação dos dados do
sequenciamento junto ao NCBI;
Aos funcionários da FCFRP-USP, especialmente aos funcionários da pós-graduação

Henrique Theodoro, Rosemary Ioshimine Gerolineto e Rosana Florêncio;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) e ao Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de
doutorado (Processo CNPq: 141495/2016-2);
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pela concessão da

bolsa de doutorado sanduíche no exterior (Processo: 88881.133716/2016-01);
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo suporte

financeiro a esse projeto de pesquisa (Processo 2014/13029-0) e por todo o suporte financeiro
concedido ao nosso laboratório;
E finalmente, os meus mais sinceros agradecimentos a todos que direta ou indiretamente

contribuíram para a realização deste trabalho.
“... Porque eu sou do tamanho do que vejo
E não do tamanho da minha altura ...”
Alberto Caeiro, em O guardador de rebanhos, de Fernando Pessoa

RESUMO
Frazão, M. R. Caracterização molecular de linhagens de Campylobacter jejuni de origens

diversas isoladas no Brasil. 2018. 147 f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2018.
Campylobacter jejuni é a espécie bacteriana mais comumente relacionada como causa de

gastroenterite em humanos em vários países. Porém, o isolamento e o estudo de C. jejuni não
são muito frequentes no Brasil, o que dificulta avaliar a dimensão dessa bactéria como
causadora de doença em humanos e animais, bem como, determinar o impacto de sua
presença em alimentos e no meio-ambiente. O objetivo desse trabalho foi avaliar a
diversidade genética por cinco diferentes técnicas de tipagem molecular, o potencial
patogênico pela pesquisa de 16 genes de virulência por PCR e o perfil de resistência pela
concentração inibitória mínima por Etest ® frente a quatro antimicrobianos e pela análise in
silico de genes de resistência e pontos de mutação de linhagens de C. jejuni isoladas no Brasil.
Foram estudadas 121 linhagens de C. jejuni isoladas de humanos (51), animais (35),
alimentos (33) e ambiente (02) nos estados de Minas Gerais, São Paulo, Rio de Janeiro e Rio
Grande do Sul, no período de 1996 a 2016. Todas as linhagens apresentaram os genes flaA,
flhA, iamA, docA, ciaB, cdtA, cdtB, cdtC, racR, dnaJ, pldA, cadF, sodB e csrA. O gene wlaN
foi detectado em 15 linhagens, e uma linhagem apresentou o gene virB11. Dentre as 121
linhagens estudadas, 68 linhagens foram resistentes a pelo menos um dos antimicrobianos
testados. A resistência à ciprofloxacina, doxiciclina, tetraciclina e eritromicina foi observada
em 43,8%, 34,7%, 34,7% e 4,9% das linhagens, respectivamente. O dendrograma de
similaridade genética de Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) agrupou as 121 linhagens
estudadas em três grupos com similaridade genômica de 46,9% entre eles. Apesar da alta
diversidade genômica entre as linhagens estudadas, algumas linhagens isoladas de diferentes
fontes, locais e anos, apresentaram uma similaridade genotípica acima de 80% entre elas e,
foram agrupadas em 21 subgrupos. Pelas sequências da SVR do gene flaA as linhagens
estudadas foram agrupadas em dois grupos com linhagens isoladas de fontes clínicas e não
clínicas e de humanos e animais com similaridade acima de 80,9 % entre elas e tipadas em 40
SVR-flaA alelos, sendo os alelos 57, 49 e 45 os mais frequentemente detectados. A análise do
locus CRISPR por HRMA tipou as linhagens de C. jejuni em 23 diferentes variantes sendo
que algumas variantes continham linhagens de origem clínica e não clínica e de humanos e
animais. A árvore de SNPs gerada a partir dos dados do sequenciamento do genoma completo
alocou as 116 linhagens sequenciadas em dois principais grupos. O grupo SNP-A agrupou 97
linhagens e o grupo SNP-B agrupou 19 linhagens, com linhagens de fontes clínicas e não
clínicas e de humanos e animais, respectivamente. A técnica de Multilocus sequence typing
(MLST) tipou as 116 linhagens de C. jejuni em 46 STs, e não foi observada a predominância
de um ST. O índice de discriminação das metodologias de análise de SNPs no genoma
completo, PFGE, MLST, sequenciamento das SVR do gene flaA e análise do locus CRISPR
por HRMA foi 1,0, 0,982, 0,941, 0,939 e 0,874, respectivamente. Na análise in silico de genes
de resistência e pontos de mutação, 95 linhagens apresentaram ao menos um gene de
resistência ou ponto de mutação conhecido, sendo que a porcentagem de correlação entre os
resultados de resistência fenotípicos e genotípicos foi maior que 66,7%; 94,6% e 96,8% para
eritromicina, tetraciclina e ciprofloxacina, respectivamente. Conclui-se que a alta frequência
da maioria dos genes de virulência pesquisados evidenciou o potencial patogênico das
linhagens de C. jejuni estudadas. A resistência a antimicrobianos de primeira escolha
utilizados para o tratamento da campylobacteriose encontrada nas linhagens estudadas é
preocupante, podendo levar à falha terapêutica quando o tratamento é necessário. Os
resultados obtidos pelas metodologias de tipagem molecular realizadas sugerem que uma
possível contaminação possa ter ocorrido entre fontes clínicas e não clínicas e entre humanos
e animais, ao longo de 20 anos no Brasil. Pelo índice de discriminação, foi observado que as
metodologias de análise de SNPs no genoma completo e PFGE, em comparação com as
outras técnicas de tipagem, foram as mais eficientes em discriminar as linhagens de C. jejuni
do presente estudo.
Palavras-chave: Campylobacter jejuni, genes de virulência, perfil de resistência a

antimicrobianos, PFGE, SVR do gene flaA, Análise do locus CRISPR por HRMA, MLST,
sequenciamento do genoma completo.
ABSTRACT
Frazão, M. R. Molecular characterization of Campylobacter jejuni strains isolated from

different sources in Brazil. 2018. 147 f. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2018.
Campylobacter jejuni is the most commonly bacterial species related as a cause of

gastroenteritis in humans in several countries. However, the isolation and the study of C.
jejuni have not been very frequently in Brazil, which makes it difficult to evaluate the
involvement of this bacterium as a cause of diseases in humans and animals, as well as to
determine the impact of its presence in food and the environment. The aim of this study was
to evaluate the genetic diversity by five different molecular typing techniques, the pathogenic
potential by searching for the presence of 16 virulence genes by PCR and the resistance
profile by the minimum inhibitory concentration by Etest ® against four antibiotics and by the
in silico analyses of resistance genes and mutation points of C. jejuni strains isolated in
Brazil. A total of 121 C. jejuni strains isolated from humans (51), animals (35), food (33) and
the environment (02) in the States of Minas Gerais, Sao Paulo, Rio de Janeiro and Rio Grande
do Sul, between 1996 to 2016 were studied. All strains presented the genes flaA, flhA, iamA,
docA, ciaB, cdtA, cdtB, cdtC, racR, dnaJ, pldA, cadF, sodB and csrA. The wlaN gene was
detected in 15 strains, and one strain presented the virB11 gene. Among the 121 strains
studied, 68 strains were resistant to at least one of the antibiotics tested. Resistance to
ciprofloxacin, doxycycline, tetracycline and erythromycin was observed in 43.8%, 34.7%,
34.7% and 4.9% of the strains, respectively. The Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)
dendrogram of genetic similarity clustered the 121 strains studied in three groups with a
genomic similarity of 46.9% among them. Despite the high genomic diversity among the
strains studied, some strains isolated from different sources, places and years, presented a
genotypic similarity above 80% among them and were grouped into 21 subgroups. By flaA-
SVR sequencing the strains studied were clustered into two groups with strains isolated from
clinical and non-clinical sources and from humans and animals with a similarity above 80.9%
among them and typed in 40 flaA-SVR alleles, being the alleles 57, 49 and 45 the most
frequently detected. The analysis of the CRISPR locus by HRMA typed the C. jejuni strains
in 23 different variants, with some variants containing strains from clinical and non-clinical
origin and from humans and animals. The SNP tree generated from the whole genome
sequencing data grouped the 116 strains sequenced into two major groups. SNP-A grouped 97
strains and SNP-B grouped 19 strains, with strains from clinical and non-clinical sources and
from humans and animals, respectively. Multilocus sequence typing (MLST) technique typed
the 116 C. jejuni strains in 46 STs, and it was not observed a predominant ST. The
discrimination index of the analysis of SNPs in the whole genome, PFGE, MLST, flaA-SVR
sequencing and analysis of the CRISPR locus by HRMA was 1.0, 0.982, 0.941, 0.939 and
0.874, respectively. In the in silico analyses of resistance genes and mutation points, 95
strains showed at least one resistance gene or known mutation point, and the percentage of
correlation between phenotypic and genotypic resistance results was greater than 66.7%;
94.6% and 96.8% for erythromycin, tetracycline and ciprofloxacin, respectively. In
conclusion, the high frequency of the majority of the virulence genes studied highlighted the
pathogenic potential of the C. jejuni strains studied. Resistance to antimicrobials of first
choice used for the treatment of campylobacteriosis found in the strains studied is worrying
and may lead to therapeutic failure when treatment is required. The results obtained by the
molecular typing methodologies performed suggest that a possible contamination may have
occurred between clinical and non-clinical sources and between humans and animals over 20
years in Brazil. By the discrimination index, it was observed that the methodologies of
analysis of SNPs in the whole genome and PFGE, in comparison to the other typing
techniques, were the most efficients in discriminating the C. jejuni strains of the present
study.
Keywords: Campylobacter jejuni, virulence genes, antimicrobial resistance profile, PFGE,

flaA-SVR sequencing, analysis of the CRISPR locus by HRMA, MLST, whole genome
sequencing.
RESUMEN
Frazão, M. R. Caracterización molecular de linajes de Campylobacter jejuni de diversos

orígenes aislados en Brasil. 2018. 147f. Tesis (Doctorado). Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão Preto - Universidad de São Paulo, Ribeirão Preto, 2018.
Campylobacter jejuni es la especie bacteriana más comúnmente relacionada como causa de

gastroenteritis en humanos en varios países, pero el aislamiento y el estudio de C. jejuni no
han sido muy frecuentes en Brasil, lo que dificulta que la evaluación de la dimensión de esa
bacteria como causadora de enfermedades en humanos y en animales, así como determinar el
impacto de su presencia en alimentos y en el medio ambiente. El objetivo de ese trabajo fue
evaluar la diversidad genética por medio de cinco diferentes técnicas de tipificación
molecular, el potencial patogénico por medio de la investigación de 16 genes de virulencia
por PCR, el perfil de resistencia de concentración inhibitoria mínima por Etest ® frente a
cuatro antimicrobianos y el análisis in silico de genes de resistencia y puntos de mutación de
linajes de C. jejuni aislados en Brasil. Se estudió 121 linajes de C. jejuni aislados de humanos
(51), animales (35), alimentos (33) y ambiente (02) en los estados de Minas Gerais, São
Paulo, Rio de Janeiro y Rio Grande do Sul, del 1996 a 2016. Todos los linajes presentaron los
genes flaA, flhA, iamA, docA, ciaB, cdtA, cdtB, cdtC, racR, dnaJ, pldA, cadF, sodB y csrA. El
gene wlaN fue detectado en 15 linajes y solamente un linaje presentó el gene virB11. Entre los
121 linajes estudiados, 68 linajes fueron resistentes a por lo menos uno de os antimicrobianos
probados. La resistencia a ciprofloxacino, doxiciclin, tetracycline y erythromycin fue
observada en 43,8%, 34,7%, 34,7% e 4,9% de los linajes, respectivamente. El dendrograma
de similitud genético de Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) agrupó los 121 linajes
estudiados en tres grupos con similitud genómica de 46,9% entre ellos. A pesar de la alta
diversidad genómica entre los linajes estudiados, algunos linajes aislados de diferentes
fuentes, locales y años presentaron una similitud genotípica mayor que 80% entre ellos y
fueron agrupados en 21 subgrupos. Por las secuencias de la SVR del gene flaA los linajes
estudiados fueron agrupados en dos grupos con linajes aislados con historiales clínicos y no-
clínicos de humanos y animales con similitud arriba de 80,9 % entre ellos y tipadas en 40
SVR-flaA alelos, siendo los alelos 57, 49 y 45 los más frecuentemente detectados. El análisis
del locus CRISPR por HRMA tipificó los linajes de C. jejuni en 23 diferentes variantes siendo
que algunas variantes contenían linajes con historiales clínicos y no-clínicos de humanos y
animales. El árbol de SNPs generado a partir de los datos de secuenciación del genoma
completo alocó los 116 linajes secuenciados en dos grupos principales. El grupo SNP-A
agrupó 97 linajes y el grupo SNP-B agrupó 19 linajes, con linajes de fuentes clínicas y no
clínicas y de humanos y animales, respectivamente. La técnica de Multilocus sequence typing
(MLST) tipificó los 116 linajes de C. jejuni en 46 STs y no se observó un ST predominante.
El índice de discriminación de las metodologías de análisis de SNPs en el genoma completo,
PFGE, MLST, secuenciación de las SVR del gene flaA y análisis del locus CRISPR por
HRMA fue 1,0, 0,982, 0,941, 0,939 y 0,874, respectivamente. En el análisis in silico de genes
de resistencia y puntos de mutación, 95 linajes presentaron al menos un gene de resistencia o
punto de mutación conocido, siendo que el porcentaje de correlación entre los resultados de
resistencia fenotípicos y genotípicos fue mayor que 66,7%; 94,6% y 96,8% para
erythromycin, tetracycline y ciprofloxacino, respectivamente. Se concluyó que la alta
frecuencia de la mayoría de los 16 genes de virulencia investigados evidenció el potencial
patogénico de los linajes de C. jejuni estudiados. La resistencia a antimicrobianos de primera
elección para el tratamiento de la campilobacteriosis en los linajes estudiados es preocupante,
pudiendo llevar a falla terapéutica cuando el tratamiento se hace necesario. Los resultados
obtenidos por las metodologías de tipificación molecular realizadas sugieren que una posible
contaminación pueda tener ocurrido entre fuentes clínicas y no clínicas y aún entre humanos y
animales a lo largo de 20 años en Brasil. Por el índice de discriminación se observó que las
metodologías de análisis de SNPs en el genoma completo y PFGE, a comparación con las
demás técnicas de tipificación fueron las más eficientes en la discriminación de los linajes de
C. jejuni en el presente estudio.
Palabras-llave: Campylobacter jejuni, genes de virulencia, perfil de resistencia a

antimicrobianos, PFGE, SVR del gene flaA, Análisis del locus CRISPR por HRMA, MLST,
secuenciación del genoma completo
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Gel representativo dos produtos da extração do DNA genômico

seguido de eletroforese horizontal em gel de agarose 0,8% ................. 69
Figura 2 - Gel representativo da PCR de reconfirmação da espécie seguida de
eletroforese em gel de agarose 1,5% ..................................................... 70
Figura 3 - Perfil de resistência das 121 linhagens de C. jejuni estudadas ............. 72
Figura 4 - Gel de agarose 1% representativo do ensaio de PFGE de algumas
linhagens de C. jejuni estudadas digeridas com a enzima SmaI ........... 73
Figura 5 - Dendrograma de similaridade genotípica gerado pelo método
UPGMA e coeficiente de similaridade DICE a partir do padrão de
bandas obtido pelo PFGE com a enzima SmaI para as 121 linhagens
de C. jejuni estudadas ............................................................................ 75
Figura 6 - Dendrograma gerado a partir dos dados do sequenciamento das SVR
(small variable region) do gene flaA utilizando o modelo de correção
de distância de dois parâmetros de Jukes & Cantor e o algoritmo
UPGMA ................................................................................................ 79
Figura 7 - Gráfico representativo das curvas de melting das variantes V1, V2,
V3, V4, V5, V8, V10, V15 e V19 das 121 linhagens de C. jejuni
estudadas ............................................................................................... 81
V9, V12, V16, V18, V20 e V22 das 121 linhagens de C. jejuni
estudadas ............................................................................................... 81
V14, V17, V21, e V23 das 121 linhagens de C. jejuni estudadas ......... 82
Figura 10 - Distribuição por fonte de isolamento das 121 linhagens de C. jejuni
estudadas dentre as 23 variantes obtidas ............................................... 83
Figura 11 - Árvore filogenética baseada na análise de SNPs encontrados nos
genomas completos sequenciados das 116 linhagens de C. jejuni
isoladas de humanos (47), animais (35), alimentos (32) e ambiente
(02)........................................................................................................ 85
Figura 12 - Diagrama de similaridade genética gerado pelo programa eBURSTv3
com os dados de todas as 60830 linhagens de C. jejuni e C. coli e
9083 perfis disponíveis no banco de dados ........................................... 92
Figura 13 - Diagrama de similaridade genética gerado pelo programa eBURSTv3
com os 46 STs das 116 linhagens de C. jejuni tipadas no presente
estudo, destacadas em rosa, em conjunto com linhagens do banco de
dados ..................................................................................................... 93
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Características das 121 linhagens de C. jejuni estudadas ........................ 48

Tabela 2 - Primers utilizados na PCR para amplificação dos genes 16S rRNA,
mapA e ceuE e tamanho dos produtos de amplificação gerados ............. 53
Tabela 3 - Descrição dos reagentes utilizados na reconfirmação da espécie por
PCR ......................................................................................................... 53
Tabela 4 - Descrição dos reagentes utilizados na pesquisa dos genes de virulência
por PCR ................................................................................................... 55
Tabela 5 - Primers utilizados na PCR para a amplificação dos genes de virulência
estudados, tamanho dos produtos de amplificação gerados e
temperatura de hibridação ....................................................................... 55
Tabela 6 - Descrição dos reagentes utilizados para a amplificação do gene flaA 60
Tabela 7 - Descrição dos reagentes utilizados para as reações de PCR em tempo
real ........................................................................................................... 62
Tabela 8 - Frequência dos genes de virulência pesquisados nas 121 linhagens de
C. jejuni estudadas ................................................................................... 71
Tabela 9 - Perfil de resistência a antimicrobianos das 68 linhagens de C. jejuni
resistentes ................................................................................................ 72
Tabela 10 - Perfil de resistência a antimicrobianos das 121 linhagens de C. jejuni
estudadas isoladas de humanos, animais, alimentos e ambiente ............. 72
Tabela 11 - Distribuição das 121 linhagens de C. jejuni estudadas entre as 23
variantes obtidas ...................................................................................... 82
Tabela 12 - Combinação dos alelos obtidos e dos 46 STs gerados nas 116
linhagens de C. jejuni tipadas por MLST ................................................ 86
Tabela 13 - Distribuição dos complexos clonais (CC) e sequence types (ST) das
116 linhagens de C. jejuni estudadas de acordo com a fonte de
isolamento ............................................................................................... 90
Tabela 14 - Perfil de genes de resistência e pontos de mutação conhecidos em 116
linhagens de C. jejuni gerado a partir do sequenciamento do genoma
completo .................................................................................................. 94
Tabela 15 - Correlação entre os resultados dos testes fenotípicos e genotípicos de
resistência para as 116 linhagens de C. jejuni estudadas ......................... 95
Tabela 16 - Linhagens sem correlação entre os resultados fenotípicos e genotípicos
de resistência a antimicrobianos .............................................................. 96
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ala Alanina
Asn Asparagina
Asp Aspartato
ATCC American Type Culture Collection
BHI Brain heart infusion
C. Campylobacter
CCAMP Coleção de Campylobacter
CCD Cromatografia de camada delgada
CDC Centers for Disease Control and Prevention
CIM Concentração inibitória minima
Cip Ciprofloxacina
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CRISPR Clustered regularly interspaced short palindromic repeats
D Índice de discriminação
DNA Ácido desoxirribonucleico
dNTP Desoxinucleotídeos trifosfatados
D.O. Densidade óptica
Dox Doxiciclina
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
EFSA European Food Safety Authority
Eri Eritromicina
FBP Solução redutora de oxigênio
FDA Food and Drug Administration
FIOCRUZ Fundação Oswaldo Cruz
GARLI genetic algorithm for rapid likelihood inference
HRMA High resolution melting analysis
IDT Integrated DNA Technologies
Ile Isoleucina
Lys Lisina
MG Minas Gerais
MLST Multilocus sequence typing
ND Não detectado
Pb Pares de bases
PCR Polymerase chain reaction
PFGE Pulsed field gel electrophoresis
qPCR PCR em tempo real
q.s.p. Quantidade suficiente para
RJ Rio de Janeiro
RPM Rotações por minuto
rRNA RNA ribossômico
RS Rio Grande do Sul
SNP Single nucleotide polymorphism
SP São Paulo
spp. Espécies
ST Sequence type
Subesp. Subespécie
SVR Small variable region
TAE Tris Acetato EDTA
TBE Tris Borato EDTA
TE Tris EDTA
Temp Temperatura
Tet Tetraciclina
Thr Treonina
Tris Hidroximetilaminometano
TSA Tryptone soya agar
UFC Unidade formadora de colônia
UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean
Val Valina
LISTA DE SÍMBOLOS
% Porcentagem
™ Trademark
® Marca registrada
°C Graus Celsius
Ʃ Somatório
≥ Maior ou igual a
µg Micrograma (s)
µL Microlitro (s)
A Adenina
C Citosina
cm Centímetro (s)
g Grama (s)
G Guanina
HCl Ácido clorídrico
Kb Quilobase (s)
L Litro (s)
M Molar
mg Miligrama (s)
MgCl2 Cloreto de magnésio
MgSO4 Sulfato de Magnésio
mL Mililitro (s)
mm Milímetro (s)
mM Milimolar
NaCl Cloreto de sódio
NaOH Hidróxido de sódio
ng Nanograma (s)
nm Nanômetro (s)
pmol Picomol
T Timina
U Unidade (s)
V Volt (s)
X Vez (es)
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 25
1.1. História e Taxonomia ................................................................................................ 25
1.2. O gênero Campylobacter ........................................................................................... 26
1.2.1. Características do microrganismo ........................................................................... 27
1.2.2. Manifestações clínicas e patogênese ...................................................................... 29
1.2.3. Genes e fatores de virulência .................................................................................. 30
1.2.4. Tratamento e susceptibilidade a antimicrobianos ................................................... 32
1.2.5. Mecanismos de resistência em Campylobacter ...................................................... 33
1.3. Métodos de tipagem bacteriana ................................................................................. 35
1.3.1. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) ………………………………………… 36
1.3.2. Sequenciamento da pequena região variável (small variable region, SVR) do
gene flaA ........................................................................................................................... 37
1.3.3. Análise do locus CRISPR por HRMA .................................................................... 37
1.3.4. Multilocus sequence typing (MLST) ...................................................................... 38
1.3.5. Sequenciamento do genoma completo ................................................................... 39
1.4. Isolamento de Campylobacter ................................................................................... 40
2. RELEVÂNCIA DO ESTUDO ................................................................................... 44
3. OBJETIVOS ............................................................................................................... 46
3.1. Objetivo geral ............................................................................................................ 46
3.2. Objetivos específicos ................................................................................................. 46
4. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 48

4.1. Linhagens Bacterianas ............................................................................................... 48
4.2. Extração e verificação da pureza do DNA genômico ................................................ 51
4.3. Reconfirmação da espécie por multiplex PCR .......................................................... 53
4.4. Armazenamento das linhagens bacterianas ............................................................... 54
4.5. Pesquisa dos genes de virulência por PCR ................................................................ 54
4.6. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) ........................................ 57
4.7. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) …………………………………………... 57
4.7.1 Preparo das amostras ............................................................................................... 57
4.7.2. Digestão dos plugs .................................................................................................. 58
4.7.3. Corrida eletroforética .............................................................................................. 59
4.7.4. Análise do padrão de bandas gerados com os dados de PFGE ............................... 59
4.7.5. Construção do dendrograma de similaridade genômica gerado com os dados de
PFGE ................................................................................................................................. 59
4.8. Sequenciamento da pequena região variável (SVR) do gene flaA ............................ 60
4.8.1. Análise do sequenciamento da SVR do gene flaA .................................................. 61
4.8.2. Construção do dendrograma de similaridade genômica gerado com os dados do
sequenciamento da SVR do gene flaA .............................................................................. 61
4.9. Análise do locus CRISPR por HRMA ....................................................................... 62
4.10. Sequenciamento do genoma completo .................................................................... 63
4.10.1. Diluição do DNA genômico ................................................................................. 63
4.10.2. Fragmentação do DNA genômico ........................................................................ 63
4.10.3. Amplificação das bibliotecas ................................................................................ 64
4.10.4. Purificação das bibliotecas ................................................................................... 64
4.10.5. Normalização das bibliotecas ............................................................................... 64
4.10.6. Mistura das bibliotecas ......................................................................................... 65
4.10.7. Análise dos dados gerados pelo sequenciamento do genoma completo ............... 65
4.11. Multilocus sequence typing (MLST) ....................................................................... 66
4.11.1. Construção do diagrama de similaridade genética com os dados de MLST ........ 66
4.12. Análise in silico de genes de resistência e pontos de mutação ................................ 66
4.13. Cálculo do índice de discriminação ......................................................................... 66
5. RESULTADOS ........................................................................................................... 69
5.1. Extração e verificação da pureza do DNA genômico ................................................ 69
5.2. Reconfirmação da espécie por multiplex PCR .......................................................... 70
5.3. Pesquisa dos genes de virulência por PCR ................................................................ 70
5.4. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) ........................................ 71
5.5. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) …………………………………………... 72
PFGE ................................................................................................................................. 73
5.6. Sequenciamento da pequena região variável (SVR) do gene flaA ............................ 78
5.6.1. Construção do dendrograma de similaridade gerado com os dados do
sequenciamento da SVR do gene flaA .............................................................................. 78
5.7. Análise do locus CRISPR por HRMA ....................................................................... 81
5.8. Sequenciamento do genoma completo ...................................................................... 84
5.8.1. Construção da árvore filogenética baseada em SNPs gerada com os dados do
sequenciamento do genoma completo .............................................................................. 84
5.9. Multilocus sequence typing (MLST) ......................................................................... 86
5.10. Análise in silico de genes de resistência e pontos de mutação ................................ 94
5.10.1. Correlação entre o perfil de resistência fenotípico e genotípico ........................... 94
5.11. Cálculo do índice de discriminação ......................................................................... 96
6. DISCUSSÃO ............................................................................................................... 98
7. CONCLUSÕES ........................................................................................................... 111
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………………….. 113
APÊNDICES …………………………………………………………………………... 132
ANEXOS ……………………………………………………………………………….. 147

I n t r o d u ç ã o | 24
1. INTRODUÇÃO
1. INTRODUÇÃO
1.1. História e Taxonomia
Campylobacter foi descrito pela primeira vez em 1886 por Theodor Escherich que
identificou bactérias de forma espiralada em amostras fecais de neonatos com diarreia, porém
não obteve sucesso no crescimento desses microrganismos em meio sólido. Em 1909,
McFaydean e Stockman obtiveram pela primeira vez a cultura pura de um “vibrio”, que hoje é
conhecido como Campylobacter fetus, a partir do útero de ovelhas. Smith e Taylor
propuseram em 1919 o nome Vibrio fetus para os microrganismos isolados em casos de
abortos em rebanho bovino (ENGBERG, 2006).
Um surto relacionado ao consumo de leite cru que afetou 355 pessoas em maio de
1938 em Illinois, EUA, é atualmente reconhecido como o primeiro caso documentado de
infecção humana causada por C. jejuni, na época denominado como Vibrio jejuni
(BUTZLER, 2004; ENGBERG, 2006).
O gênero Campylobacter foi proposto em 1963 por Sebald e Véron, que transferiram
V. fetus e V. bubulus (hoje conhecido como C. sputorum) para um novo gênero, denominado
de Campylobacter (ON, 2001; ENGBERG, 2006). Baseados na relação Citosina e Guanina do
DNA, o gênero Vibrio foi separado do gênero Campylobacter após verificarem que o teor de
Guanina e Citosina das bactérias do gênero Vibrio era em torno de 47% enquanto que para o
gênero Campylobacter era de 30 a 35% (KETLEY, 1997). Dez anos mais tarde, Véron e
Chatelain em 1973 publicaram um estudo baseado na taxonomia de microrganismos
microaerófilos “Vibrio-like” e consideraram quatro espécies distintas pertencentes ao gênero
Campylobacter, sendo elas, C. jejuni, C. coli, C. fetus e C. sputorum (VÉRON;
CHATELAIN, 1973).
A partir dos anos 80, microrganismos então classificados como “Campylobacter-like”
foram isolados de diversas fontes, tais como, humanos, animais e ambiente. Dentre os anos de
1974 a 1988, doze novas espécies e/ou subespécies de Campylobacter foram criadas e,
baseado na sequência do gene 16S rRNA, foram identificados diferentes clades dentro do
gênero Campylobacter e o gênero Helicobacter foi então proposto por Goodwin e
colaboradores (1989).
Em 1991, uma completa revisão da taxonomia e nomenclatura do gênero
Campylobacter foi proposta (VANDAMME et al., 1991) a partir da análise dos dados de
hibridização DNA-rRNA e análise de dados fenotípicos e genéticos. Estes microrganismos
ficaram agrupados na rRNA superfamília VI que compreende os grupos homólogos I, II e III
representados pelos gêneros Campylobacter, Arcobacter e Helicobacter, respectivamente.
Devido a essa estreita relação filogenética e características fenotípicas e genotípicas similares

entre os grupos I e II foi proposto a criação e inclusão de ambos na família
Campylobacteraceae (ENGBERG, 2006).
1.2. O gênero Campylobacter

O gênero Campylobacter pertence à família Campylobacteriaceae e atualmente é
composto por 26 espécies denominadas como, Campylobacter jejuni (Campylobacter jejuni
subesp. jejuni, Campylobacter jejuni subesp. doylei), Campylobacter coli, Campylobacter lari
(Campylobacter lari subesp. lari, Campylobacter lari subesp. concheus), Campylobacter
fetus (Campylobacter fetus subesp. fetus, Campylobacter fetus subesp. veneralis,
Campylobacter fetus subesp. testudium), Campylobacter upsaliensis, Campylobacter
helveticus, Campylobacter insulaenigrae, Campylobacter peloridis, Campylobacter
hyointestinalis (Campylobacter hyointestinalis subesp. hyointestinalis, Campylobacter
hyointestinalis subesp. lawsonii), Campylobacter lanienae, Campylobacter sputorum
(Campylobacter sputorum bv. sputorum, Campylobacter sputorum bv. faecalis,
Campylobacter sputorum bv. paraureolyticus), Campylobacter concisus, Campylobacter
curvus, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter ureolyticus,
Campylobacter gracilis, Campylobacter hominis, Campylobacter mucosalis, Campylobacter
avium, Campylobacter canadensis, Campylobacter cuniculorum, Campylobacter
subantarticus, Campylobacter volucris, Campylobacter corcagiensis e Campylobacter
iguaniorum (FITZGERALD, 2015).
A espécie C. jejuni se subdivide em duas subespécies, C. jejuni subesp. jejuni e C.
jejuni subesp. doylei, porém, C. jejuni subesp. jejuni apresenta a maior frequência de
isolamento dentre essas duas subespécies, e é referida simplesmente como C. jejuni
(FITZGERALD; NACHAMKIN, 2007). Linhagens da subespécie C. doylei se diferem
bioquimicamente de C. jejuni pela inabilidade de reduzir nitrato e pela incapacidade de se
multiplicar a 42ºC (PARKER et al., 2007; EPPS et al., 2013).
Dentre todas as espécies de Campylobacter, C. jejuni é a mais comumente relacionada
como causa de gastroenterite em humanos, sendo responsável por aproximadamente 90% dos
casos de infecções causadas por bactérias pertencentes ao gênero Campylobacter (MOORE et
al., 2005; SILVA et al., 2011; BRONOWSKI; JAMES; WINSTANLEY, 2014;
FITZGERALD, 2015; CDC, 2015; EFSA, 2017a; EFSA, 2017b).
As espécies C. jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis estão intimamente relacionadas
como causa de gastroenterite em humanos e são as espécies consideradas como
termotolerantes, ou seja, têm a sua temperatura ótima de crescimento em torno de 42ºC. O

restante das espécies pode ser dividido em três grupos, sendo, espécies que com pouca
frequência causam doença em humanos e estão relacionados a bovinos, ovinos ou suínos,
como por exemplo, C. fetus, C. lanienae, C. sputorum e C. hyointestinalis; espécies que estão
relacionadas com doença periodontal e que foram isolados em humanos, por exemplo, C.
curvus, C. rectus, C. showae, C. gracilis e C. concisus; e espécies que não foram isoladas de
água ou alimentos contaminados e não estão associados como causa de doença em humanos,
como por exemplo, C. subantarticus, C. volucris, C. corcagiensis, C. insulaenigrae e C.
canadensis (MOORE et al., 2005; MAN, 2011; FITZGERALD, 2015).
1.2.1. Características do microrganismo

O gênero Campylobacter é composto por bacilos Gram-negativos que se apresentam,
usualmente, na forma espiral ou curva e possuem de 0,2 a 0,8 µm de diâmetro por 0,5 a 5,0
µm de comprimento. São móveis devido à presença de flagelo polar em uma ou ambas as
extremidades, com exceção da espécie C. gracilis que não possui flagelo e da espécie C.
showae que possui múltiplos flagelos (KETLEY, 1997; SILVA et al., 2011; EPPS et al.,
2013; FITZGERALD, 2015).
As bactérias pertencentes ao gênero Campylobacter são nutricionalmente exigentes e
incapazes de se proliferar na presença do ar atmosférico, porém também não crescem em
anaerobiose, sendo assim considerados microaerófilos estritos que necessitam de uma
atmosfera com aproximadamente 5% de O2, 10% de CO2 e 85% de N2 para se proliferarem
(KETLEY, 1997; MOORE et al., 2005; SNELLING et al., 2005).
O metabolismo oxidativo está presente em todas as espécies de Campylobacter, com
exceção da espécie C. gracilis. A obtenção de energia é feita pela oxidação de aminoácidos ou
ácidos intermediários do ciclo do ácido tricarboxílico, uma vez que os membros desse gênero
não utilizam carboidratos como fonte de energia. Especificamente a espécie C. jejuni, é capaz
de hidrolisar hipurato e acetato de hidroxila, produzir oxidase e catalase e reduzir nitrato a
nitrito (SNELLING et al., 2005; FITZGERALD; NACHAMKIN, 2007; SILVA et al., 2011).
Campylobacter spp. não é capaz de crescer em pH menor que 4,9 e maior que 9,0 sendo o pH
ótimo para o crescimento na faixa de 6,5 a 7,5. O crescimento não ocorre em ambiente com
atividade de água menor que 0,987, e nem a concentrações de cloreto de sódio maiores que
2% m/v (BUTZLER, 2004; SILVA et al., 2011).
Com um conteúdo de citosina e guanina que varia de 30% a 35%, o tamanho do
genoma de Campylobacter é de aproximadamente 1,600 a 1,800 kilobases (kb), o que é
considerado relativamente pequeno quando comparado a outros enteropatógenos como, por

exemplo, Escherichia coli que tem o genoma com aproximadamente 4,500 kb (KETLEY,
1997; VAN VLIET; KETLEY, 2001; POLY; GUERRY, 2008). Esse pequeno tamanho do
genoma de Campylobacter possivelmente é reflexo do seu exigente ambiente para
crescimento e da sua incapacidade de fermentar carboidratos e degradar substâncias
complexas (KETLEY, 1997).
As espécies de Campylobacter crescem em uma faixa de temperatura que varia de
25ºC a 42ºC, porém as espécies termotolerantes, C. jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis,
possuem temperatura ótima de crescimento em torno de 42ºC, sendo capazes de crescer a
37ºC, porém incapazes de se desenvolver a 25ºC (BUTZLER, 2004; SILVA et al., 2011;
FITZGERALD, 2015).
Em culturas armazenadas em condições adversas, as células de Campylobacter spp.
podem adquirir um formato cocóide (forma viável, porém não cultivável) que representa o
estágio degenerativo deste microrganismo, no entanto, a capacidade infectante se mantém.
Esta condição pode ser facilmente reversível quando as condições de armazenamento e
cultivo tornam-se favoráveis, e assim o microrganismo assume novamente a sua forma
característica em espiral e se multiplica normalmente (BUTZLER, 2004; SILVA et al., 2011;
BRONOWSKI; JAMES; WINSTANLEY, 2014).
As espécies de Campylobacter estão amplamente distribuídas na natureza, podendo
ser isoladas de humanos e animais, tais como, aves, mamíferos, répteis, animais domésticos,
moluscos e protozoários (YOUNG; DAVIS; DIRITA, 2007; FITZGERALD; NACHAMKIN,
2007; FITZGERALD, 2015). O trato gastrointestinal de animais e de aves selvagens e
domésticas é considerado como reservatório de infecção (HUMPHREY; O’BRIEN;
MADSEN, 2007; FITZGERALD, 2015). Porém, no que se refere a aves, o maior potencial de
fonte de infecção humana por C. jejuni está intimamente relacionado ao consumo de carne de
frango crua ou mal cozida (YOUNG; DAVIS; DIRITA, 2007; SKARP; HANNINEN;
RAUTELIN, 2016; EFSA, 2017a; EFSA, 2017b).
C. jejuni, diferentemente de Salmonella, é geralmente incapaz de se multiplicar em
alimentos e por esse motivo, não existem geralmente grandes surtos de campylobacteriose.
Mais de 90% dos casos da doença são esporádicos, e nos países com grande incidência,
acontecem principalmente no verão (KETTLEY 1997; SNELLING et al., 2005).
1.2.2. Manifestações clínicas e patogênese

A doença causada por C. jejuni é denominada de campilobacteriose e a sua
transmissão ocorre pela ingestão de alimentos que estejam contaminados pela bactéria, tais
como, carne de aves, bovinos e suínos, água não tratada, leite não pasteurizado, contato com
animais portadores e também pelo contato direto com material fecal de humanos ou animais
contaminados (ALLOS, 2001; MOORE et al., 2005; HUMPHREY; O’BRIEN; MADSEN,
2007).
A infecção por C. jejuni é clinicamente indistinguível das infecções causadas por
outros importantes enteropatógenos, como Salmonella, Shigella e algumas espécies de
Yersinia, e a baixa dose infectante de Campylobacter, de aproximadamente 500 UFC/mL,
pode ser considerada um agravante (ROBINSON, 1981; BLACK et al., 1988; ALLOS, 2001;
SNELLING et al., 2005).
A campilobacteriose caracteriza-se por ser uma diarreia autolimitada, que pode se
apresentar sanguinolenta ou não, acompanhada de febre, vômitos, cefaleia e dores
abdominais. O período de incubação da doença é normalmente de 2 a 5 dias, podendo se
estender por até 10 dias (BUTZLER, 2004; MOORE et al., 2005; HUMPHREY; O’BRIEN;
MADSEN, 2007). Na maioria dos casos, não é necessário o uso de antimicrobianos para
tratamento da campilobacteriose, com exceção de pacientes imunocomprometidos e em casos
de complicações da doença (KETLEY, 1997; FITZGERALD; NACHAMKIN, 2007;
FITZGERALD, 2015).
Em alguns casos, a infecção por C. jejuni pode evoluir para algumas manifestações
extra intestinais e complicações pós-infecção, como por exemplo, bacteremia, sepse,
meningite, endocardite, periodontite, celulite, abscessos, artrite reativa, síndrome de Guillain-
Barré, dentre outras (BUTZLER, 2004; SNELLING et al., 2005; EPPS et al., 2013;
FITZGERALD, 2015).
A síndrome de Guillain-Barré é uma complicação pós-infecção grave e que se destaca
por ser uma doença autoimune pós-infecção pela bactéria, e é caracterizada pelo aparecimento
de fraqueza muscular e perda de reflexos (ALLOS, 2001; MOORE et al., 2005;
TAKAHASHI et al., 2005; BAE et al., 2014). O desenvolvimento da síndrome de Guillain-
Barré se dá através de um mecanismo de mimetismo antigênico entre os lipopolissacarídeos
da parede celular bacteriana e os gangliosídeos da membrana dos nervos periféricos. Uma vez
que a estrutura do gangliosídeo GM1 presente na membrana das células nervosas é
semelhante aos glicolipídios do polissacarídeo de parede celular do C. jejuni, os anticorpos
produzidos devido à infecção pela bactéria podem produzir uma reação cruzada e atacar os
nervos, interferindo na condução dos estímulos nervosos, causando fraqueza muscular que
pode evoluir para paralisia muscular aguda (YUKI et al., 1997; HADDEN; GREGSON, 2001;
TAKAHASHI et al., 2005; SEBASTIAN, 2012; BAE et al., 2014). Estima-se que C. jejuni
seja responsável por 30% dos casos confirmados da síndrome de Guillain-Barré no mundo
(YUKI; HARTUNG, 2012; FITZGERALD, 2015).
Após a ingestão da bactéria, o C. jejuni é capaz de migrar pelo estômago e atingir o
lúmen intestinal. A presença de flagelo confere às bactérias dessa espécie a capacidade de
movimentar-se através da camada mucosa que reveste o epitélio intestinal, com consequente
adesão e invasão dessas células. Essa translocação pode ocorrer tanto por via transcelular
como também por via paracelular (SNELLING et al., 2005; MAN, 2011). Ao atravessaram a
camada do epitélio intestinal e atingirem a camada submucosa as bactérias são capazes de
resistir à fagocitose devido a uma camada protetora que reveste a bactéria, impedindo assim a
deposição do sistema complemento na superfície bacteriana, característica essa que é muito
importante no processo de infecção sistêmica. Ademais, as bactérias injetam proteínas
efetoras nas células hospedeiras através de um sistema de secreção do tipo IV (T4SS) (VAN
VLIET; KETLEY, 2001; YOUNG; DAVIS; DIRITA, 2007; MAN, 2011).
A produção de toxinas também está intimamente relacionada ao processo de
patogênese de C. jejuni. A toxina distensora citoletal (cytolethal distending toxin, CDT),
composta pelas proteínas CdtA, CdtB e CdtC, liga-se à superfície celular hospedeira através
das proteínas CdtA e CdtC seguida da entrega de CdtB ao núcleo celular do hospedeiro
causando danos ao DNA da célula hospedeira, promovendo a interrupção do ciclo celular com
consequente alteração da morfologia da célula e manifestação da doença (VAN VLIET;
KETLEY, 2001; MAN, 2011; EPPS et al., 2013).
1.2.3. Genes e fatores de virulência

Os mecanismos específicos de virulência de C. jejuni ainda não estão totalmente
elucidados, porém acredita-se que a motilidade mediada por flagelos, a adesão da bactéria à
mucosa intestinal, a capacidade de invasão e a habilidade de produzir toxinas sejam
importantes fatores de virulência (KETLEY, 1997; VAN VLIET; KETLEY, 2001;
WIECZOREK; OSEK, 2008; SILVA et al., 2011; BOLTON, 2015).
A colonização do intestino requer a habilidade de mover-se através da camada mucosa
que recobre as células intestinais. Essa habilidade é conferida pela motilidade que ocorre
devido ao flagelo polar presente em C. jejuni, permitindo assim a bactéria penetrar na barreira
mucosa (SOLOMON; HOOVER, 1999; VAN VLIET; KETLEY, 2001). O flagelo é
codificado pelos genes flaA e flaB, sendo que o gene flaA mostrou ser essencial no processo
de invasão de células epiteliais, uma vez que, mutações nesse gene geram um flagelo truncado
com severa redução na motilidade bacteriana. No entanto, mutações no gene flaB não
acarretam em mudanças significativas na estrutura flagelar (GUERRY, 2007; SILVA et al.,
2011). Ademais, estudos demonstram que a expressão do gene flhA também está diretamente
ligada ao processo de motilidade em C. jejuni (CARRILLO et al., 2004; YOUNG; DAVIS;
DIRITA, 2007).
A adesão de C. jejuni às células do epitélio intestinal do hospedeiro é um importante
pré-requisito para a colonização que é mediada por várias adesinas na superfície bacteriana
que podem ser expressas pelos genes cadF, racR, dnaJ e docA (KETLEY, 1997; MULLER et
al., 2006; POLY; GUERRY, 2008). Monteville e colaboradores (2003) demonstraram que
linhagens de C. jejuni cadF mutantes apresentaram uma redução significativa na
internalização de células intestinais INT 407. Portanto, a ausência das proteínas codificadas
pelos genes envolvidos no processo de adesão, pode reduzir a capacidade de colonização de
C. jejuni (MONTEVILLE et al., 2003; MULLER et al., 2006; DATTA et al., 2003). O gene
dnaJ, que codifica uma proteína de choque térmico (heat shock), está intimamente ligado à
adesão e colonização na célula hospedeira, pois, de acordo com Konkel e colaboradores
(1998), mutações nesse gene provocaram uma severa redução no processo de colonização.
Os genes pldA, ciaB e iamA estão intimamente relacionados aos processos de invasão
e sobrevivência na célula hospedeira (DATTA et al., 2003; DASTI et al., 2010;
WIECZOREK et al., 2013). Rivera-Amill e colaboradores (2001) demonstraram que
linhagens de C. jejuni mutantes para o gene ciaB resultaram em um fenótipo não invasivo. O
gene pldA codifica uma fosfolipase A de membrana externa que está envolvida no processo
de invasão das células hospedeiras (ZIPRIN et al., 2001).
O gene virB11, localizado no plasmídeo pVir, codifica proteínas do sistema de
secreção do tipo IV (T4SS), que é uma maquinaria que a bactéria utiliza para introduzir
proteínas efetoras nas células do hospedeiro (BACON et al., 2000). Os estudos de Bacon e
colaboradores (2000) demonstraram o envolvimento do gene virB11 nos processos de adesão
e invasão celular, uma vez que, linhagens C. jejuni mutantes para esse gene tiveram a adesão
e invasão reduzidas em seis e onze vezes, respectivamente, quando comparados à linhagem
selvagem, além de uma diminuição da patogenicidade in vivo (BACON et al., 2000;
WIECZOREK; OSEK, 2008).
O gene wlaN, de acordo com Linton et al. (2000), codifica a produção da β-1,3
galactosiltransferase que é responsável pelas estruturas específicas do lipopolissacarideo
(LPS) bacteriano, consideradas cruciais para o desenvolvimento de neuropatias pós-infecção

causadas por C. jejuni, como por exemplo, a Síndrome de Guillain-Barré.
A toxina distensora citoletal (cytolethal distending toxin, CDT) é descrita como um
importante fator de virulência de C. jejuni (YOUNG; DAVIS; DIRITA, 2007; SILVA et al.,
2011). CDT é composto por três subunidades codificadas pelos genes cdtA, cdtB e cdtC, e a
citotoxidade é causada pelo bloqueio da fase G2 do ciclo celular na célula hospedeira, levando
à morte celular (DASTI et al., 2010; SILVA et al., 2011; BOLTON, 2015). CDT está
intimamente envolvido no processo de desenvolvimento da diarreia, uma vez que, as toxinas
promovem um distúrbio na maturação das cristas celulares e nas vilosidades das células
intestinais, causando uma erosão temporária com subsequente perda da absorção de nutrientes
(KETLEY, 1997; VAN VLIET; KETLEY, 2001).
A enzima superóxido desmutase, codificada pelo gene sodB, confere proteção contra o
anion superóxido. Sendo assim, esse gene é importante para a sobrevivência da bactéria em
condições adversas, como por exemplo, no estresse oxidativo causado pela presença de
oxigênio (BOLTON, 2015). Fields e Thompson (2008) demonstraram que o gene csrA
também possui envolvimento com a sobrevivência bacteriana no estresse oxidativo, uma vez
que, linhagens de C. jejuni mutantes para esse gene demonstraram menor sobrevivência sob
condições de estresse.
1.2.4. Tratamento e susceptibilidade a antimicrobianos

A gastroenterite causada por C. jejuni é, na maioria dos casos, autolimitada e não
necessita do uso de antimicrobianos, apenas de uma reposição hidroeletrolítica. No entanto, a
presença de sangue nas fezes, uma diarreia persistente com sintomas que perdurem por mais
de uma semana, pacientes imunocomprometidos ou infecções sistêmicas e crônicas associadas
à infecção por C. jejuni devem ser tratadas com antibioticoterapia, e nesses casos os
medicamentos de escolha são fluoroquinolonas, macrolídeos e tetraciclinas. Porém o
crescente surgimento de linhagens de Campylobacter resistentes a essas três classes de
antimicrobianos pode comprometer a eficácia do tratamento (SOLOMON; HOOVER, 1999;
ALLOS, 2001; SILVA et al., 2011; DUARTE et al., 2014; BOLTON, 2015; SKARP;
HANNINEN; RAUTELIN, 2016). Vale ainda mencionar, que todas as espécies de
Campylobacter possuem resistência intrínseca a penicilinas, à maioria das cefalosporinas,
vancomicina, rifampicina, sulfametoxazol e trimetoprim (ALLOS, 2001; WIECZOREK;
OSEK, 2013).
Nos últimos anos, tem havido um aumento crescente no número de linhagens de

Campylobacter resistentes à fluoroquinolona ao redor do mundo (ALLOS, 2001; ZILBAUER
et al., 2008; SILVA et al., 2011). O primeiro relato de linhagens de humanos resistentes a essa
classe antimicrobiana foi feito no início dos anos 90 em alguns países da Europa, como,
Espanha, Holanda e Suécia. O surgimento da resistência coincidiu com o início da
administração de enrofloxacina na medicina veterinária nesses países (ENDTZ et al., 1991).
Evento similar foi observado no Reino Unido após a aprovação do uso de fluoroquinolonas na
veterinária (SAM; LYONS; WAGHORN, 1999), reforçando assim a evidência de que o uso
indiscriminado de antibióticos para o tratamento e como promotor de crescimento em animais
para o consumo humano tem uma estreita relação com o espalhamento da resistência
antimicrobiana em linhagens de Campylobacter (SILVA et al., 2011; WIECZOREK, OSEK,
2013).
Dessa forma, a utilização de uma política com o intuito de regular a limitação do uso
de antibióticos na medicina veterinária resulta em uma redução da resistência a
fluoroquinolonas (GALLAY et al., 2007; HAN et al., 2009). Porém, alguns estudos sugerem
que essa resistência possa persistir por longos períodos de tempo (NELSON et al., 2007;
PRICE et al., 2007).
Campylobacter demonstra menores taxas de resistência à eritromicina, um antibiótico
da classe dos macrolídeos, também considerado como droga de escolha para o tratamento da
campylobacteriose. Diferentemente das tetraciclinas e fluoroquinolonas, a eritromicina pode
ser administrada com segurança em crianças e mulheres grávidas (ALLOS, 2001). O menor
número de resistência à eritromicina pode ser explicado pelo fato de que é necessária uma
prolongada exposição a essa droga para que a bactéria possa adquirir resistência,
principalmente quando comparado a fluoroquinolonas (WIECZOREK; OSEK, 2013).
Em países na União Europeia, a resistência a tetraciclinas tem se mostrado similar aos
dados relatados para fluoroquinolonas, enquanto que para macrolídeos, que possui uso
limitado na produção de carnes para o consumo humano, o número de linhagens de
Campylobacter resistentes é bem menor (EFSA, 2017b).
1.2.5. Mecanismos de resistência em Campylobacter

As quinolonas inibem a síntese do DNA bacteriano causando a morte celular. As
enzimas bacterianas DNA girase e topoisomerase IV, responsáveis pela replicação,
transcrição, recombinação e reparos no DNA são os alvos de ação de tais antimicrobianos. A
DNA girase e a topoisomerase IV são constituídas por dois pares de subunidades,
denominadas GyrA e GyrB e ParC e ParE, respectivamente (PAYOT et al., 2006). A

resistência às fluoroquinolonas é devida principalmente à substituição de aminoácidos na
região QRDR (quinolone resistance determining region), denominada de região determinante
de resistência às quinolonas, que está localizada no domínio de ligação na superfície dessas
enzimas. Há várias mutações no GyrA associadas à resistência a fluoroquinolonas em
espécies de Campylobacter, como por exemplo as substituições de aminoácidos Thr86Ile,
Asp90Asn, Thr86Lys, Thr86Ala, Thr87Val e Asp90Tyr. Porém, a mutação mais frequente
que confere resistência a quinolonas é a troca de uma citosina por uma timina na posição 257
no gene gyrA (C257T), que promove a substituição de uma treonina por uma isoleucina na
posição 86 (Thr86Ile) e confere um alto nível de resistência a antimicrobianos desta classe
(GE et al., 2013; IOVINE, 2013; WIECZOREK; OSEK, 2013; YANG et al., 2017).
Os macrolídeos, que tem a eritromicina como um membro dessa classe, são
antimicrobianos considerados seguros e efetivos e seu espectro de ação cobre a maioria dos
microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos, incluindo espécies de Campylobacter. Os
macrolídeos interrompem a síntese proteica do ribossomo bacteriano na subunidade 50S e a
resistência a essa classe de antimicrobianos é dada por modificação no sítio de ligação
ribossomal causada por mutações no gene 23S rRNA ou alterações nas proteínas ribossomais
L4 e L22 (WIECZOREK; OSEK, 2013; BOLINGER, KATHARIOU, 2017). Substituições de
base nas posições 2074 e 2075 nos resíduos de adenina no gene 23S rRNA conferem
resistência à eritromicina em Campylobacter, sendo as substituições A2074C, A2074G e
A2075G as mais comumente encontradas e que conferem alto nível de resistência, com MIC
≥ 128 mg/L para eritromicina. Várias modificações nas proteínas ribossomais L4 e L22 têm
sido reportadas, e acredita-se que estejam associadas a baixos níveis de resistência aos
macrolídeos. No entanto, o exato papel das modificações em tais proteínas ainda não está
totalmente elucidado (PAYOT et al., 2006; GE et al., 2013; IOVINE, 2013; WIECZOREK;
OSEK, 2013; BOLINGER, KATHARIOU, 2017).
A bomba de efluxo multidroga CmeABC tem sido descrita como o principal
mecanismo de efluxo a drogas em Campylobacter causando resistência a vários
antimicrobianos, dentre eles, fluoroquinolonas e macrolídeos. Ademais, a bomba de efluxo
pode agir em sinergismo com os mecanismos acima descritos de resistência a
fluoroquinolonas e macrolídeos. CmeABC é codificada por um operon composto por três
genes, cmeA, cmeB e cmeC que codificam uma proteína de fusão periplasmática, um
transportador de membrana interna e uma proteína de membrana externa, respectivamente
(IOVINE, 2013; WIECZOREK; OSEK, 2013; YANG et al., 2017).
A resistência à tetraciclina em Campylobacter é conferida pelo gene tet(O), que está

amplamente distribuído nas espécies C. jejuni e C. coli, principalmente. Uma vez que a ação
da tetraciclina ocorre pela ligação do antimicrobiano à subunidade ribossomal 30S, o gene
tet(O) age codificando proteínas de proteção ribossômicas (RPPs) e a sua presença pode
conferir altos níveis de resistência à tetraciclina (512 mg/L) (WIECZOREK; OSEK, 2013).
1.3. Métodos de tipagem bacteriana

Os métodos clássicos de tipagem molecular baseavam-se em metodologias fenotípicas
tais como fagotipo, biotipo, sorotipo, padrão de resistência a antimicrobianos, entre outros.
Entretanto, esses métodos convencionais são muitas vezes limitados devido a sua baixa
capacidade em discriminar linhagens pertencentes a uma mesma espécie e a problemas
referentes à reprodutibilidade intra e inter laboratoriais (OLIVE; BEAN, 1999; FOXMAN et
al., 2005).
Assim, na tentativa de suprir os problemas com reprodutibilidade e o baixo poder de
discriminação, métodos genotípicos têm sido utilizados com grande sucesso na
caracterização, identificação e em estudos epidemiológicos de tipagem bacteriana. Tais
estudos de investigação epidemiológica molecular permitem determinar a fonte e os veículos
de transmissão, além de informar se os micro-organismos envolvidos nos surtos representam
ou não um único clone (OLIVE; BEAN, 1999; VAN BELKUM et al., 2001).
Vários métodos genotípicos como pulsed field gel electrophoresis (PFGE),
sequenciamento da pequena região variável (short variable region, SVR) do gene flaA,
multilocus sequence typing (MLST), clustered regularly interspaced short palindromic
repeats (CRISPR), high-resolution melting analysis (HRMA), sequenciamento do genoma
completo, dentre outros, vêm sendo utilizados com sucesso na tipagem molecular e nos
estudos epidemiológicos e filogenéticos de linhagens de C. jejuni (MEINERSMANN et al.,
1997; DINGLE et al., 2001; SAILS et al., 2003; CLARK et al., 2005; KARENLAMPI et al.,
2007; PRICE et al., 2007; SHEPPARD et al., 2009; AQUINO et al., 2010; OPORTO et al.,
2011; AHAMED et al., 2012; WIECZOREK et al., 2013; ABAY et al., 2014; DUARTE et
al., 2014; REVEZ et al., 2014; LLARENA et al., 2015; MAROTTA et al., 2015; CLARK et
al., 2016; SILVA et al., 2016; FRAZÃO et al., 2017; LLARENA; TABOADA; ROSSI, 2017;
OHISHI et al., 2017).
1.3.1. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)

A técnica de PFGE foi descrita pela primeira vez em 1984 como uma ferramenta para
estudar o DNA cromossômico de organismos eucariotos. Subsequentemente, o PFGE provou
ser uma técnica de tipagem molecular bacteriana altamente eficaz (TENOVER; ARBEIT;
GOERING, 1997).
Nessa técnica, é feita a construção de plugs de agarose a partir de uma suspensão
bacteriana. Posteriormente, a bactéria inteira que se encontra embebida no plug, é lisada com
o uso de detergentes e proteinase K, obtendo-se assim, o DNA bacteriano livre, que é então
digerido com uma enzima de restrição que possui poucos sítios de reconhecimento, gerando
um perfil com aproximadamente 10 a 30 fragmentos de restrição que variam de 10 a 800 Kb
em tamanho. Essencialmente, todos esses fragmentos podem ser separados em um padrão de
bandas distintas por PFGE. Ao invés de se aplicar a corrente elétrica em uma única direção,
como em uma eletroforese convencional, nessa técnica, a corrente é aplicada, primeiramente,
em uma direção a partir de um conjunto de eletrodos, em seguida, a corrente elétrica migra
para o segundo conjunto de eletrodos por um curto período de tempo e então, migra para um
terceiro conjunto de eletrodos. Assim, o campo elétrico que causa a migração do DNA no gel
de agarose é produzido por pulsos que se alternam entre três conjuntos de eletrodos. Dessa
maneira, o DNA migra de forma serpentiforme através do gel, e os fragmentos gerados pela
digestão com a enzima de restrição, podem então, serem separados com eficiência
(TENOVER; ARBEIT; GOERING, 1997; GOERING, 2010).
A análise do padrão de bandas gerado pelo PFGE é realizada através de softwares
especializados que comparam as linhagens estabelecendo, assim, a similaridade genotípica
entre elas (SINGH et al., 2006).
Todas as espécies bacterianas podem ser tipadas por PFGE, embora o isolamento do
DNA intacto seja tecnicamente difícil para algumas espécies. Como exemplo, o DNA
cromossômico de algumas linhagens de Clostridium difficile, Pseudomonas aeruginosa e
Vibrio cholerae pode degradar-se espontaneamente durante o processo de lise celular, devido
à atividade de nuclease, tornando essa técnica impraticável (GOERING, 2010). Entretanto, o
PFGE é uma das técnicas de tipagem molecular mais reprodutível, com maior poder
discriminatório e que vem sendo aplicado com sucesso no mundo todo para tipagem
molecular de linhagens de C. jejuni (RIBOT et al., 2001; FITZGERALD et al., 2001;
KARENLAMPI et al., 2007; RAGIMBEAU et al., 2008; BEHRINGER; MILLER;
OYARZABAL, 2011; MELERO et al., 2012; WIECZOREK et al., 2013, ABAY et al., 2014;
SILVA et al., 2016; FRAZÃO et al., 2017).
1.3.2. Sequenciamento da pequena região variável (small variable region, SVR) do gene
flaA
O locus do gene que codifica a flagelina é composto pelos genes flaA e flaB, que estão
arranjados em tandem no genoma de Campylobacter e que possuem 95% de homologia entre
as suas sequências. Ambos possuem aproximadamente 1.730 pares de bases (pb) e estão
separados por uma região intergênica em torno de 170 pb (WASSENAAR; NEWELL, 2000).
Porém, a expressão do gene flaA parece estar intimamente ligada ao processo de colonização,
pois, linhagens com mutações no gene flaB demonstraram uma diferença sutil nos processos
de motilidade e colonização (WASSENAAR et al., 1991).
O gene flaA, especificamente, possui duas regiões de alta variabilidade, sendo, uma
grande região localizada aproximadamente entre as bases de posição 700 a 1.450 e uma região
menor, denominada pequena região variável (small variable region, SVR) entre as bases de
posição 450 a 600, que tem sido a região utilizada para tipar as linhagens de Campylobacter
(EL-ADAWY et al., 2013).
Essa metodologia foi desenvolvida por Meinersmann e colaboradores em 1997 e se
baseia, portanto, no sequenciamento da pequena região variável do gene flaA, analisando
assim a variabilidade dessa região presente nas linhagens de Campylobacter. A tipagem
molecular através dessa técnica vem sendo utilizada com sucesso no mundo todo em estudos
de diversidade de linhagens de C. jejuni (MEINERSMANN et al., 1997; SAILS et al., 2003;
RAGIMBEAU et al., 2008; WASSENAAR et al., 2009; SCHWEITZER et al., 2011;
GIACOMELLI et al., 2012; DUARTE et al., 2014; MAROTTA et al., 2015; FRAZÃO et al.,
2017).
Considerada uma metodologia simples e altamente reproduzível, essa técnica
apresenta como notável vantagem a possibilidade de comparação das linhagens estudadas
com outras linhagens isoladas em diferentes locais do mundo através da obtenção do flaA
alelo, que é obtido pela inserção da sequência que contem a pequena região variável do gene
flaA, de aproximadamente 320 pares de base, no banco de dados disponível online
http://pubmlst.org/campylobacter (MEINERSMANN et al., 1997; WASSENAAR; NEWELL,
2000; AHMED et al., 2012).
1.3.3. Análise do locus CRISPR por HRMA

A análise do locus CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic
repeats) de linhagens C. jejuni através da técnica de high resolution melting analysis
(HRMA) foi desenvolvida no ano de 2007 por Price e colaboradores (PRICE et al., 2007).
O sistema CRISPR é formado por sequências repetidas (direct repeats, DR) contendo
de 21 a 47 pb separadas por espaçadores de tamanho similar. Os espaçadores são compostos
por ácidos nucleicos que não pertencem à célula bacteriana, como por exemplo, DNA de
plasmídeos ou fagos (SOREK; KUNIN; HUGENHOLTZ, 2008; HORVATH;
BARRANGOU, 2010). Tais elementos podem proteger a bactéria contra elementos genéticos
móveis, em particular os bacteriófagos, plasmídeos e transposons (SOREK; KUNIN;
HUGENHOLTZ, 2008; BIKARD et al., 2012). Devido ao alto polimorfismo característico
das sequências CRISPRs, as mesmas vêm sendo utilizadas com sucesso para genotipar
linhagens de C. jejuni (SCHOULS et al., 2003; KOVANEN et al., 2014).
A técnica de high resolution melting analysis (HRMA) é uma metodologia pós-PCR,
utilizada para identificar variações na sequência de nucleotídeos em um locus específico
através da análise dos perfis das temperaturas de melting. Essa metodologia compreende a
análise de uma curva de dissociação de alta resolução de amplicons para a determinação
precisa da relação entre temperatura e desnaturação da dupla fita de DNA (REED; KENT;
WITTWER, 2007; LEVESQUE et al., 2011).
O HRMA é considerado o método mais simples para genotipar e para determinar
mutações, pois não é necessário o processamento das amostras posteriormente à PCR. Após a
amplificação por PCR, as curvas de melting são geradas por monitoramento da fluorescência
de um corante (dye) intercalante de DNA dupla fita que apresenta elevada fluorescência
quando ligado ao DNA e baixa fluorescência quando não ligado (REED; KENT; WITTWER,
2007; HOFINGER et al., 2009). Após a amplificação, o produto de PCR passa por uma etapa
de desnaturação térmica e nesse momento, as moléculas do agente intercalante de DNA são
liberadas gerando mudanças na fluorescência. Assim, o resultado é um perfil de melting
característico para cada amplicon (REED; KENT; WITTWER, 2007; RUSKOVA;
RACLAVSKY, 2011).
1.3.4. Multilocus sequence typing (MLST)

A metodologia de MLST foi proposta por Maiden e colaboradores como uma
metodologia capaz de superar os problemas de reprodutibilidade inter-laboratoriais
enfrentados nas metodologias de tipagem tradicionais (MAIDEN et al., 1998).
Essa metodologia baseia-se no sequenciamento de genes essenciais ou de manutenção,
que são denominados genes housekeeping. Após o sequenciamento, as sequências obtidas são
depositadas em um banco de dados disponível online, sendo que cada sequência corresponde
a um alelo. O conjunto de alelos de cada amostra bacteriana dá origem ao sequence typing
(ST) que é utilizado para análises filogenéticas, populacionais e evolucionárias de inúmeros

patógenos bacterianos (MAIDEN et al., 1998; URWIN; MAIDEN, 2003).
A técnica de MLST apresenta a vantagem de ser altamente reprodutível, além do fato
de que os seus resultados podem ser disponibilizados e compartilhados em bancos de dados
específicos e disponíveis online, possibilitando assim, a análise comparativa da diversidade
genética de diversas espécies bacterianas isoladas em diferentes regiões do mundo (MAIDEN
et al., 1998).
Especificamente para C. jejuni, a metodologia de MLST foi estabelecida no ano de
2001 por Dingle e colaboradores, e os sete genes housekeeping utilizados foram aspA, glnA,
gltA, glyA, pgm, tkt e unc que são responsáveis por codificar aspartase A, glutamato sintetase,
citrato sintase, serina hidroximetil transferase, fosfoglutamase, transquetolase e ATP sintase
unidade α, respectivamente (DINGLE et al., 2001; AHMED et al., 2012). Desde a criação
dessa técnica para C. jejuni, esta vem sendo utilizada com sucesso na tipagem molecular e nos
estudos filogenéticos de bactérias pertencentes a essa espécie no mundo todo (SCHOULS et
al., 2003; KARENLAMPI et al., 2007; RAGIMBEAU et al., 2008; SHEPPARD et al., 2009;
OPORTO et al., 2011; BEHRINGER; MILLER; OYARZABAL, 2011; DE HAAN et al.,
2013; DUARTE et al., 2014; LLARENA et al., 2015; COLLADO et al., 2018).
1.3.5. Sequenciamento do genoma completo

O advento do sequenciamento de nova geração (new generation sequencing, NGS)
tem revolucionado a pesquisa genômica através da possibilidade de sequenciar, com precisão
e rapidez, genomas inteiros de diversos organismos (GILMOUR et al., 2013; VAN DIJK et
al., 2014; ALLARD, 2016).
As tecnologias de sequenciamento podem ser divididas em três gerações, sendo, a
primeira geração baseada no método de sequenciamento de Sanger, a segunda geração
baseada no sequenciamento de “high-throughput”, e a terceira geração que tem como base o
sequenciamento de reads longas. Sendo assim, o sequenciamento de nova geração é composto
pelas metodologias de segunda e terceira gerações (VAN DIJK et al., 2014; LOMAN;
PALLEN, 2015; GOODWIN; MCPHERSON; MCCOMBIE, 2016). A notável vantagem do
sequenciamento de nova geração, quando comparado ao método de Sanger, é a capacidade de
gerar milhões de reads (com tamanhos de aproximadamente 35 a 700 pb para as metodologias
de segunda geração) em uma única corrida (SABAT et al., 2013; LOMAN; PALLEN, 2015).
As plataformas da Illumina (MiSeq®, NextSeq® e HiSeq®) são exemplos de
sequenciadores de segunda geração amplamente utilizados no sequenciamento do genoma
completo de diversos gêneros bacterianos (LIU et al., 2012). A metodologia de

sequenciamento nessas plataformas é denominada de sequenciamento por síntese e pode ser
dividida em quatro etapas, sendo: preparação das amostras, onde é feito a clivagem do DNA e
a implementação de adaptadores que servirão como códigos de barra para as diferentes
amostras que são processadas na mesma corrida; geração de cluster, que é o processo onde
cada fragmento é amplificado através de uma reação de PCR; sequenciamento e finalmente, a
análise de dados utilizando softwares de acordo com cada abordagem que se queira seguir
(METZKER, 2010; LIU et al., 2012).
Apesar do alto custo que ainda envolve a metodologia de sequenciamento do genoma
completo, esta vem se tornando uma ferramenta poderosa e altamente atrativa para estudos de
investigação epidemiológica, podendo agregar valor aos resultados que foram obtidos através
das técnicas de tipagem molecular convencionais, como PFGE, MLST, dentre outras
(GILMOUR et al., 2013; SABAT et al., 2013).
A metodologia de sequenciamento do genoma completo vem sendo utilizada com
êxito em linhagens de C. jejuni, tanto em estudos que abrangem linhagens advindas de surtos,
na tentativa de traçar as possíveis rotas de contaminação, quanto em estudos filogenéticos
para avaliar a diversidade genética dessa espécie bacteriana (BIGGS et al., 2011; REVEZ et
al., 2014; CLARK et al., 2016; DEARLOVE et al., 2016; CODY et al., 2017; LAHTI et al.,
2017; LLARENA; TABOADA; ROSSI, 2017).
1.4. Isolamento de Campylobacter

A campilobacteriose é uma zoonose de ampla distribuição mundial com repercussões
significativas na saúde pública e com um elevado impacto socioeconômico, que vem
adquirindo uma crescente importância a partir do início dos anos 2000, sendo mais
frequentemente reportada do que a gastroenterite causada por outros importantes
enteropatógenos como Salmonella spp., Shigella spp. e E. coli (KETLEY, 1997; SILVA et al.,
2011; CDC, 2015; FITZGERALD, 2015; EFSA, 2017a). Vale mencionar que dentre as
espécies do gênero Campylobacter, C. jejuni é a espécie mais comumente isolada como causa
de gastroenterite em humanos em diversos países da Europa e na América do Norte
(KETLEY, 1997; MOORE et al., 2005; SILVA et al., 2011; EFSA, 2017a).
De acordo com a European Food Safety Authority (EFSA), Campylobacter continua a
ser o patógeno bacteriano mais reportado como causa de gastroenterite em humanos em 27
países da União Europeia, desde o ano de 2005. O número de casos confirmados de
campylobacteriose em humanos no ano de 2016 foi de mais de 246 mil, com um aumento de
6,1 % em relação ao ano anterior, apresentando uma taxa de 66,3 casos para cada 100 mil
habitantes, contabilizando mais de 19 mil casos de hospitalização, porém com uma taxa de
mortalidade de 0,03% (EFSA, 2017a). Os dados da EFSA mostraram que o segundo patógeno
bacteriano mais isolado foi Salmonella, com 94.530 casos. Dentre os casos de
campylobacteriose confirmados na União Europeia no ano de 2016, 83,6% foram causados
pela espécie C. jejuni, seguidos por 8,5% causados por C. coli, 0,2% C. lari, 0,06% C. fetus e
0,05% C. upsaliensis. Apesar do grande número de casos notificados de campylobacteriose,
foram reportados apenas 461 surtos alimentares relacionados à Campylobacter, o que
representou 8,8% dos surtos nos países europeus no ano de 2016. Carne de origem aviária foi
reportada como o alimento mais relacionado como causa de campylobacteriose em humanos,
porém, leite cru e carne de outros animais também foram reportados (EFSA, 2017a).
Os dados disponibilizados pelo Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
nos Estados Unidos mostraram que bactérias pertencentes ao gênero Campylobacter são a
principal causa de gastroenterite em humanos no país, causando doença em aproximadamente
2,4 milhões de pessoas a cada ano (CDC, 2015).
Em Quebec, no Canadá, mais de 28 mil casos de campylobacteriose foram reportados
entre os anos de 1996 e 2006, com uma incidência de 35,2 casos para cada 100 mil habitantes.
Uma incidência de 49,69 casos para cada 100 mil habitantes foi reportada em Ontário, uma
província localizada no Canadá (KEEGAN et al., 2009; ARSENAULT et al., 2012;
KAAKOUSH et al., 2015).
A campylobacteriose foi a causa mais comum de gastroenterite relacionada a
alimentos na Austrália no ano de 2010, com aproximadamente 17 mil casos notificados,
gerando uma taxa de 112,3 casos para cada 100 mil habitantes do país. O mesmo foi
observado na Nova Zelândia, que no período de 2002 a 2006 foram reportados 353,8 casos
para cada 100 mil habitantes (KAAKOUSH et al., 2015).
Em geral, a grande maioria dos países em desenvolvimento, o que inclui o Brasil, não
possui um programa de vigilância para notificação de campylobacteriose, e
consequentemente, não é possível a estimativa real do número de casos de gastroenterite em
humanos que sejam causados por espécies pertencentes ao gênero Campylobacter, bem como,
a incidência da doença em termos de densidade populacional (COKER et al., 2002; EPPS et
al., 2013).
Dessa forma, e de acordo com o exposto acima, o isolamento e o estudo de C. jejuni
não são muito frequentes no nosso país, o que dificulta avaliar a real dimensão do
envolvimento dessa espécie bacteriana como causadora de doença nos seres humanos e em
animais, bem como, determinar o impacto da sua presença em alimentos e no meio-ambiente

(AQUINO et al., 2002; SCARCELLI et al., 2005; ANDRADE et al., 2007; AQUINO et al.,
2010; BIASI et al., 2011; QUETZ et al., 2012; ROSSI et al., 2012; MELO et al., 2013).
R e l e v â n c i a d o e s t u d o | 43
2. RELEVÂNCIA DO ESTUDO
R e l e v â n c i a d o e s t u d o | 44
2. RELEVÂNCIA DO ESTUDO
O isolamento de C. jejuni como causa de gastroenterite em humanos nos países da
Europa e na América do Norte é muito frequente e em alguns casos superior a outros
importantes enteropatógenos como Salmonella spp., Shigella spp. e Escherichia coli (CDC,
2015; EFSA, 2017a). No entanto, o isolamento e o estudo de C. jejuni não são muito
frequentes no Brasil, o que dificulta avaliar a dimensão do envolvimento dessa espécie
bacteriana como causadora de doença em seres humanos e animais, bem como, determinar o
impacto da sua presença em alimentos e no meio-ambiente (SCARCELLI et al., 2005;
ANDRADE et al., 2007; AQUINO et al., 2010; BIASI et al., 2011; ROSSI et al., 2012).
Grande parte dos estudos realizados no Brasil está relacionada ao uso de técnicas
fenotípicas, tais como isolamento, prevalência e perfil de resistência de linhagens de C. jejuni
(AQUINO et al., 2002; GOMES et al., 2006; FRANCHIN et al., 2007). Ademais, há uma
escassez no país de estudos que utilizaram técnicas moleculares para genotipar linhagens de
C. jejuni (SCARCELLI et al., 2005; AQUINO et al., 2010; QUETZ et al., 2012; SILVA et al.,
2016; FRAZÃO et al., 2017).
O Brasil produziu, no ano de 2016, aproximadamente 13 milhões de toneladas de
carne de frango e exportou mais de quatro milhões de toneladas. Esses valores ranquearam o
Brasil como o maior exportador de carne de frango desde 2004 e o segundo maior produtor,
sendo ultrapassado somente pelos Estados Unidos (ABPA, 2017). Devido à carne de frango
ser uma das maiores fontes de contaminação por Campylobacter, faz-se necessário um maior
monitoramento na tentativa de se evitar contaminação e assim garantir uma maior segurança
alimentar. Dessa forma, a realização de estudos que caracterizem molecularmente linhagens
de C. jejuni isoladas de diversas fontes durante décadas no Brasil são de grande importância.
No presente estudo, linhagens de C. jejuni isoladas de fontes clínicas e não clínicas no
país foram tipadas molecularmente pelas técnicas de PFGE, sequenciamento da pequena
região variável do gene flaA, análise do locus CRISPR por HRMA, MLST e análise de SNPs
no genoma completo. Ademais, a presença de 16 genes de virulência foi analisada por PCR
para verificar o potencial patogênico e o perfil de resistência foi avaliado pela concentração
inibitória mínima obtida por Etest ® frente a quatro antimicrobianos e pela análise in silico de
genes de resistência e pontos de mutação conhecidos.
Os resultados obtidos no presente trabalho deverão contribuir para uma melhor
caracterização das linhagens de C. jejuni isoladas de fontes clínicas e não clínicas no Brasil
quanto ao seu potencial patogênico, perfil de resistência, diversidade genotípica e
epidemiologia.
O b j e t i v o s | 45
3. OBJETIVOS
O b j e t i v o s | 46
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Avaliar a diversidade genética, o potencial patogênico e o perfil de resistência de
linhagens de C. jejuni isoladas de humanos, animais, alimentos e ambiente no Brasil.
3.2. Objetivos específicos

3.2.1. Analisar o potencial patogênico das linhagens de C. jejuni pela pesquisa por PCR dos
genes de virulência flaA, flhA, cadF, dnaJ, racR, docA, cdtA, cdtB, cdtC, ciaB, iamA, wlaN,
virB11, pldA, sodB e csrA;
3.2.2. Determinar o perfil de suscetibilidade a antimicrobianos das linhagens de C. jejuni pela
técnica da concentração inibitória mínima por Etest®;
3.2.3. Analisar a diversidade genotípica de linhagens de C. jejuni por PFGE, comparando os
isolados de humanos, animal, alimentos e ambiente;
3.2.4. Analisar a diversidade genotípica de linhagens de C. jejuni pelo sequenciamento da
pequena região variável (SVR) do gene flaA, comparando os isolados de humanos, animal,
alimentos e ambiente entre si e com outras linhagens isoladas em diferentes locais do mundo;
3.2.5. Analisar a diversidade genotípica de linhagens de C. jejuni pela análise do locus
CRISPR por HRMA, comparando os isolados de humanos, animal, alimentos e ambiente;
3.2.6. Analisar a diversidade genotípica de linhagens de C. jejuni por MLST, comparando os
isolados de humanos, animal, alimentos e ambiente entre si e com outras linhagens isoladas
em diferentes locais do mundo;
3.2.7. Analisar a diversidade genotípica de linhagens de C. jejuni pela análise de SNPs através
do sequenciamento do genoma completo;
3.2.8. Comparar a capacidade das metodologias de tipagem molecular acima citadas em
diferenciar as linhagens de C. jejuni e fornecer informações epidemiológicas consistentes;
3.2.9. Analisar in silico nas linhagens de C. jejuni a presença de genes e mutações que
conferem resistência a antimicrobianos através do sequenciamento do genoma completo e
comparar com os resultados fenotípicos obtidos por Etest ®.
M a t e r i a l e m é t o d o s | 47
4. MATERIAL E MÉTODOS
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Linhagens Bacterianas
Foram estudadas 121 linhagens de C. jejuni provenientes das coleções de
Campylobacter spp. (CCAMP) da Fundação Oswaldo Cruz do Rio de Janeiro (FIOCRUZ-RJ)
e do Instituto Adolfo Lutz de Ribeirão Preto (IAL-RP), isoladas de humanos (51), animais
(35), alimentos (33) e ambiente (02) nos estados de Minas Gerais, São Paulo, Rio de Janeiro e
Rio Grande do Sul, no período de 1996 a 2016 (Tabela 1).
Tais linhagens foram selecionadas dos Laboratórios de Referência acima mencionados
e sistematicamente escolhidas para representarem isolados de casos esporádicos de fontes
clínicas e não-clínicas de diferentes anos.
As linhagens C. jejuni ATCC 33291 e C. coli WHOC 7.2, cedidas pelo Instituto
Adolfo Lutz de Ribeirão Preto, foram utilizadas como controle positivo na reconfirmação da
espécie por multiplex PCR e na pesquisa dos genes de virulência por PCR.
A Tabela 1 traz de forma mais detalhada as características das 121 linhagens de C.
jejuni utilizadas nesse estudo.
Tabela 1 - Características das 121 linhagens de C. jejuni estudadas

Local de
Linhagens Origem Fonte de isolamento Ano
isolamento
CCAMP 487 Humana Fezes diarreicas RJ 1996
Cj 01 Humana Fezes diarreicas SP 2002
Cj 07 Humana Sangue SP 2003
continua
continuação
Local de
isolamento
CCAMP 1491 Humana Sangue RJ 2011
CCAMP 770 Animal Fezes não diarreicas primatas RJ 1996
continua
continuação
Local de
isolamento
CCAMP 470 Animal Fezes não diarreicas aves MG 2004
CCAMP 672 Animal Fezes não diarreicas RJ 2006
CCAMP 1538 Animal Fezes de frango RS 2015
CCAMP 1555 Animal Fezes de frango RJ 2015
CCAMP 1574 Animal Fezes de frango RJ 2016
CCAMP 1013 Alimento Cortes de frango MG 2008
continua
conclusão
Local de
isolamento
CCAMP 1065 Alimento Cortes de frango RJ 2010
CCAMP 1518 Alimento Carcaça de frango RS 2015
CCAMP 764 Ambiente Esgoto RJ 1996
CCAMP 830 Ambiente Esgoto RJ 1999
MG: Minas Gerais; SP: São Paulo; RJ: Rio de Janeiro; RS: Rio Grande do Sul
4.2. Extração e verificação da pureza do DNA genômico

O DNA genômico bacteriano foi extraído de todas as 121 linhagens de C. jejuni
listadas na Tabela 1, e das duas linhagens de referência descritas no item 4.1 segundo
protocolo descrito por Campioni e Falcão (2014), com algumas modificações. O DNA
genômico extraído foi utilizado nos experimentos de reconfirmação da espécie por multiplex
PCR, pesquisa dos genes de virulência por PCR, sequenciamento da pequena região variável
(SVR) do gene flaA, análise do locus CRISPR por HRMA e sequenciamento do genoma
completo.
As linhagens foram crescidas em meio BBLTM Agar Base Columbia (Becton
Dickinson) suplementado com 0,4% (m/v) de carvão ativado (Neon) (Anexo A) e 5% (v/v) de
solução redutora de oxigênio FBP [0,5% de sulfato ferroso (Labsynth), 0,5% de piruvato de
sódio (Vetec) e 0,5% de metabisulfito de sódio (Labsynth) diluído em água estéril] (Anexo B)
a 42°C por 24 horas em microaerofilia, que foi obtida através da técnica de passivação do
cobre descrita por Filgueiras e Hofer (1989), com algumas modificações. Para uma jarra de
3,5 L foi utilizada uma pastilha de carbonato de cálcio (Sonrisal®) triturada, 10g de esponja de
aço (Bombril®) embebida em 100 mL de solução acidulada de cobre [Sulfato de cobre II P.A
(Vetec), Ácido sulfúrico P.A. (Pro-Analysis) e Tween 80 (Merck) diluído em água destilada]
(Anexo C). Essa mistura foi colocada em um recipiente e inserida na jarra que foi
imediatamente vedada para que os níveis gasosos atingissem as proporções desejáveis.
O crescimento bacteriano foi adicionado a 250 µL de solução I (20% de sacarose, 50
mM Tris-HCl pH 8,0 e 50 mM EDTA) a 4°C. Após 10 minutos de incubação no gelo, as
células foram lisadas com 500 µL de solução II (50 mM NaCl, 1% sarcosil) adicionados de
0,05 mg/mL de proteinase K e incubadas em banho de água a 37°C por 2 horas.
Posteriormente, as linhagens foram submetidas à purificação do DNA genômico com
750 μL de uma mistura de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1) e centrifugadas a
14000 rpm por 10 minutos, em centrífuga 5810 R da marca Eppendorf. O sobrenadante foi
coletado e transferido para um novo tubo plástico cônico de 2,0 mL e a este foi adicionado
750 μL de uma solução de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1), e em seguida centrifugado a
14000 rpm por 10 minutos em centrifuga 5810 R da marca Eppendorf. O sobrenadante foi
coletado e novamente transferido para um novo tubo plástico cônico de 2,0 mL e a este foi
adicionado 1 mL de etanol a 4ºC e mantido em gelo overnight.
No dia seguinte, o DNA foi sedimentado por centrifugação a 4ºC e 14000 rpm durante
30 minutos em centrífuga 5810 R da marca Eppendorf. O sobrenadante foi cuidadosamente
desprezado e o sedimento seco a vácuo em Speed Vac (Concentrator 5301, Eppendorf) e
posteriormente, suspenso em 400 μL de água destilada ultra pura livre de DNase e RNase
(Life Technologies). Aos 400 μL de suspensão de DNA, foram adicionados 2 μL de RNase 50
μg/mL e incubados em banho de água a 37ºC por 1 hora.
A integridade do DNA extraído foi avaliada em eletroforese horizontal em gel de
agarose 0,8% preparado com TAE (Tris Acetato EDTA) 1X. A 5 μL do DNA extraído foram
adicionados 3 μL de solução de azul de bromofenol (40% de sacarose, 0,25% de azul de
bromofenol e água destilada q.s.p.). A eletroforese foi conduzida a 80 volts por 90 minutos. O
gel foi corado com solução de brometo de etídeo (0,5 μg/mL) por 30 minutos, observado em
transluminador ultravioleta (Gel Doc XR, Bio-Rad) e registrado em software fotográfico
(Quantity One 4.6.1, Bio-Rad).
A concentração e a pureza do DNA genômico extraído foram analisadas em
NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) com comprimentos de onda em 260 nm e 280 nm
conforme descrito por Sambrook e Russel (2001). Foram consideradas como adequadas as
extrações de pureza ≥1,8 (A260nm/A280nm), uma vez que esses valores demonstram que a
amostra de DNA está com baixo nível de impurezas. Para amostras abaixo desse valor, uma
nova extração do DNA genômico foi realizada.
4.3. Reconfirmação da espécie por multiplex PCR

A reconfirmação da espécie foi realizada para todas as 121 linhagens de C. jejuni
descritas na Tabela 1 através de um multiplex PCR conforme descrito por Denis et al. (2001).
Os DNAs genômicos foram extraídos e quantificados conforme descrito no item 4.2. Os
genes utilizados para a identificação do gênero Campylobacter, C. jejuni e C. coli foram o
gene 16S rRNA (LINTON et al., 1997), o gene mapA (STUCKI et al., 1995) e o gene ceuE
(GONZALEZ et al., 1997), respectivamente.
As sequências dos três pares de primers utilizados, para a amplificação dos genes,
estão descritas na Tabela 2.
A reação de PCR foi realizada utilizando reagentes para o volume final de 20 µL,
descritos detalhadamente na Tabela 3 e as condições utilizadas para a PCR foram as
previamente descritas por Denis et al. (1999).
Tabela 2 - Primers utilizados na PCR para amplificação dos genes 16S rRNA, mapA e ceuE e
tamanho dos produtos de amplificação gerados
Genes Primers Sequência dos primers (5’ – 3’) Amplicon (pb)
16S MD16S1 ATC TAA TGG CTT AAC CAT TAA AC
857
rRNA MD16S2 GGA CGG TAA CTA GTT TAG TAT T
MDmapA1 CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG
mapA 589
MDmapA2 GCT TTA TTT GCC ATT TGT TTT ATT A
COL3 AAT TGA AAA TTG CTC CAA CTA TG
ceuE 462
MDCOL2 TGA TTT TAT TAT TTG TAG CAG CG
Tabela 3 - Descrição dos reagentes utilizados na reconfirmação da espécie por PCR

Componentes Volume (µL) Concentração Final
a
10x Tampão PCR Buffer 2 1X
10 mM dNTP Mixture a 0,4 0,2 mM de cada dNTP
Primer forward MD16S1b 1 25 pmol
Primer reverse MD16S2b 1 25 pmol
b
Primer forward MDmapA1 1 25 pmol
Primer reverse MDmapA2b 1 25 pmol
Primer forward COL3b 1 25 pmol
b
Primer reverse MDCOL2 1 25 pmol
50 mM MgCl2 a 1,6 2 mM
DNA genômico (10 ng/µL) 2 20 ng
Taq DNA Polimerase a 5U 0,4 1U
H2O destilada ultra pura livre ____________
q.s.p. 20
de DNase e RNase a
a
Produto da Life Technologies; b Produto da Integrated DNA Technologies (IDT)
Reações sem a adição de DNA genômico foram utilizadas como branco, as linhagens
C. jejuni ATCC 33291 e C. coli WHOC 7.2 foram utilizadas como controle positivo e uma
linhagem de Yersinia enterocolitica biotipo 2 foi utilizada como controle negativo. O
termociclador DNAEngine® Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad) foi utilizado para a realização
dos experimentos.
Inicialmente o DNA genômico foi desnaturado por aquecimento a 95°C por 10
minutos, seguido de 35 ciclos constituídos de:
 Separação das fitas de DNA: 95°C por 30 segundos.
 Hibridação dos primers: 59°C por 1 minuto e 30 segundos.
 Extensão: 72°C por 1 minuto.
Após os 35 ciclos, foi realizada uma etapa de extensão final a 72°C por 10 minutos.
O produto amplificado foi visualizado em gel de agarose 1,5% preparado em tampão
TAE 1X. O marcador de peso molecular 1 Kb plus DNA Ladder (Invitrogen) foi aplicado ao
gel e a eletroforese foi conduzida a 80 volts por 90 minutos. Após a eletroforese, os géis
foram corados em solução de brometo de etídeo (0,5 µg/mL) por 20 minutos, visualizados em
transluminador ultravioleta (Gel Doc XR, Bio-Rad) e registrados em software fotográfico
(Quantity One 4.6.1, Bio-Rad).
4.4. Armazenamento das linhagens bacterianas

Após a realização da PCR para a reconfirmação da espécie, as 121 linhagens de C.
jejuni foram ressemeadas em ágar Base Columbia suplementado com carvão ativado e FBP
para posterior estocagem. Após a incubação por 24 horas a 42°C em condições de
microaerofilia, conforme descrito no item 4.2, uma quantidade de bactéria suficiente para
turvar 1,5 mL de meio para a criopreservação das linhagens foi adicionada ao tubo de
crioestoque, homogeneizada em agitador tipo vortex e levada ao freezer -80°C o mais rápido
possível.
As linhagens foram criopreservadas em água peptonada e glicerol (Anexo D). Quando
necessário, alíquotas das culturas armazenadas em freezer -80°C foram semeadas em ágar
Base Columbia suplementado com carvão ativado e FBP.
4.5. Pesquisa dos genes de virulência por PCR

Foram pesquisados 16 genes de virulência por PCR para as 121 linhagens de C. jejuni
listadas na Tabela 1. Os DNAs genômicos utilizados nas PCRs foram extraídos e
quantificados conforme descrito no item 4.2. A PCR foi realizada utilizando reagentes para o
volume final de 20 µL. A Tabela 4 traz de forma detalhada os reagentes utilizados para a
amplificação dos genes de virulência.
Tabela 4 - Descrição dos reagentes utilizados na pesquisa dos genes de virulência por PCR
10X Tampão PCR Buffer a 2 1X
10 mM dNTP Mixture a 0,4 0,2 mM de cada dNTP
Primer forward b 1 25 pmol
Primer reverseb 1 25 pmol
50 mM MgCl2 a 1.6 2 mM
DNA Genômico (10 ng/µL) 2 20 ng
Taq DNA Polimerase a 5U 0.4 1U
H2O destilada ultra pura livre ________________
q.s.p. 20
de DNase e RNase a
a
Os 16 genes de virulência pesquisados foram flaA (WASSENAAR; NEWELL, 2000),

flhA, iamA, docA (MULLER et al., 2006), ciaB (RIVERA-AMILL et al., 2001), cdtA
(HICHEY et al., 2000), cdtB, cdtC, virB11, racR, dnaJ, pldA (DATTA et al., 2003), cadF
(KONKEL et al., 1999), wlaN (WASSENAAR et al., 2002), sodB (BISWAS et al., 2011) e
csrA (FIELDS; THOMPSON, 2008), cujas sequências dos primers, tamanho dos amplicons e
temperatura de hibridação utilizados estão na Tabela 5.
Tabela 5 - Primers utilizados na PCR para a amplificação dos genes de virulência estudados,
tamanho dos produtos de amplificação gerados e temperatura de hibridação
Amplicon Temp. (°C)
Genes Sequência dos primers (5’ - 3’)
(pb) Hibridação
ATG GGA TTT CGT ATT AAC AC
flaA 1.713 45
CTG TAG TAA TCT TAA AAC ATT TTG
GGA AGC GGC ACT TGG TTT GC
flhA 735 54
GCT GTG AGT GAG ATT ATA GCA GC
TTT CCA AAT TTA GAT GAT GC
ciaB 1.165 48
GTT CTT TAA ATT TTT CAT AAT GC
GCA CAA AAT ATA TCA TTA CAA
iamA 518 52
TTC ACG ACT ACT ATG AGG
CCT TGT GAT GCA AGC AAT C
cdtA 370 55
ACA CTC CAT TTG CTT TCT G
CAG AAA GCA AAT GGA GTG TT
cdtB 620 55
AGC TAA AAG CGG TGG AGT AT
continua
conclusão
Amplicon Temp. (°C)
Genes Sequência dos primers (5’ - 3’)
(pb) Hibridação
CGA TGA GTT AAA ACA AAA AGA TA
cdtC 182 55
TTG GCA TTA TAG AAA ATA CAG TT
TTG AAG GTA ATT TAG ATA TG
cadF 400 45
CTA ATA CCT AAA GTT GAA AC
ATA AGG TGC GGT TTT GGC
docA 725 50
GTC TTT GCA GTA GAT ATG
TGC TGG GTA TAC AAA GGT TGT G
wlaN 330 60
AAT TTT GGA TAT GGG TGG GG
GAA CAG GAA GTG GAA AAA CTA GC
virB11 708 60
TTCCGCATTGGGCTATATG
GAT GAT CCT GAC TTT G
racR 584 45
TCT CCT ATT TTT ACC C
AAG GCT TTG GCT CAT C
dnaJ 720 46
CTT TTT GTT CAT CGT T
ATG ATA CCA ATG CTT TTG GTG ATT T
sodB TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC ATT TGC 638 50
ATA AAA GCT AAC TGA TCC
CAC AGT CAG TGA AGG TGC TT
csrA 878 58
ACT CGC ACA ATC GCT ACT TC
AAG CTT ATG CGT TTT T
pldA 913 45
TAT AAG GCT TTC TCC A
Reações sem a adição do DNA genômico foram utilizadas como branco, as linhagens
C. jejuni ATCC 33291 e C. coli WHOC 7.2 foram utilizadas como controle positivo. O
termociclador DNAEngine® Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad) foi utilizado para a realização
dos experimentos.
Inicialmente o DNA genômico foi desnaturado por aquecimento a 94°C por 5 minutos,
seguido de 30 ciclos constituídos de:
 Separação das fitas de DNA: 94°C por 45 segundos.
 Hibridação dos primers: X°C por 45 segundos.
 Extensão: 72°C por 1minuto.
Após os 30 ciclos, foi realizada uma etapa de extensão final a 72°C por 15 minutos.
A temperatura X°C foi estabelecida de acordo com a temperatura de hibridação dos
primers de cada um dos 16 genes pesquisados. O produto amplificado foi visualizado em gel
de agarose 1,5% preparado em tampão TAE 1X. O marcador de peso molecular 1 Kb plus
DNA Ladder (Invitrogen) foi aplicado ao gel e a eletroforese foi conduzida a 80 volts por 90
minutos. Após a eletroforese, os géis foram corados em solução de brometo de etídeo (0,5
µg/mL) por 20 minutos, visualizados em transluminador ultravioleta (Gel Doc XR, Bio-Rad)
e registrados em software fotográfico (Quantity One 4.6.1, Bio-Rad).
4.6. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

A determinação da CIM foi realizada por Etest® para as 121 linhagens de C. jejuni
listadas na Tabela 1, de acordo com as normas e procedimentos do documento M45-A2,
contido no CLSI 2010 (Clinical and Laboratory Standards Institute). Após crescimento em
ágar Base Columbia suplementado com carvão ativado e FBP a 42°C por 24 horas sob
condições de microaerofilia, o crescimento bacteriano foi ressuspenso em solução salina 0,8%
até a escala 0,5 de McFarland. Utilizando um swab estéril, a suspensão bacteriana foi semeada
em placa de 145 mm contendo ágar Mueller-Hinton suplementado com 5% de sangue de
carneiro (Biomerieux) em quatro campos sobrepostos de maneira a formar um “tapete
bacteriano” homogêneo. O Etest ® (Biomerieux) dos antibióticos eritromicina, ciprofloxacina,
tetraciclina e doxiciclina, foram dispostos sobre a placa de maneira a permitir a posterior
leitura dos halos de inibição do crescimento. As placas foram incubadas em jarra, sob
condições de microaerofilia por 24 horas a 42°C. A linhagem padrão C. jejuni ATCC 33560
foi utilizada como controle de qualidade das fitas de Etest ® utilizadas.
4.7. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)

4.7.1 Preparo das amostras
O ensaio de PFGE foi realizado para as 121 linhagens de C. jejuni listadas na Tabela 1
seguindo o protocolo do PulseNet para C. jejuni (RIBOT et al., 2001), com algumas
modificações.
As linhagens foram crescidas em ágar Base Columbia suplementado com carvão
ativado e FBP, em jarra sob condições de microaerofilia, a 42°C por 24 horas. O crescimento
bacteriano foi adicionado, utilizando um swab estéril, a 2,0 mL de PBS (0,01M, pH 7,4) até
que atingisse uma D.O.610nm de 0,68 (faixa de 0,57 a 0,82). Em seguida, 200 µL dessa
suspensão de células foram transferidos para um tubo plástico cônico de 2,0 mL e colocados
em gelo para cessar o crescimento bacteriano.
Para a confecção dos plugs da Salmonella sorovariedade Braenderup linhagem H9812,
que foi utilizada como marcador de peso molecular, as linhagens foram crescidas em caldo
BHI (brain heart infusion) da marca Oxoid a 37°C por 24 horas. Em seguida foram semeadas
em placas contendo ágar TSA (tryptone soya agar) da marca Himedia e incubadas a 37°C
durante 24 horas. O crescimento bacteriano foi adicionado a 2,0 mL de PBS (0,01 M, pH 7,4)
até que atingisse uma D.O.610nm de 1,0 (faixa de 0,8 a 1,0). Em seguida, 200 µL dessa
suspensão de células foram transferidos para um tubo plástico cônico de 2,0 mL, colocados
em gelo para cessar o crescimento bacteriano e os passos descritos a seguir foram iguais tanto
para as linhagens de C. jejuni do estudo quanto para a linhagem de S. Braenderup utilizada
como padrão de peso molecular.
A cada tubo contendo 200 µL da suspensão de células, foram adicionados 10 µL de
proteinase K (20 mg/mL) e então os tubos foram colocados em banho seco a 60°C. Em
seguida foram adicionados 200 µL de agarose 1% Seakem Gold (Lonza) em cada tubo e
aproximadamente 70 µL dessa mistura foram transferidos para cada poço do molde
apropriado para a confecção dos plugs de agarose.
Após a solidificação dos plugs, estes foram transferidos para tubos de prolipropileno
de fundo cônico de 15 mL contendo 5 mL de tampão de lise celular (50 mM Tris; 50 mM
EDTA pH 8,0; 1% Sarcosil) e 25 µL de proteinase K (20 mg/mL) e incubados em banho de
água a 54°C por duas horas. Após isso, os tubos foram agitados em agitador por 30 minutos.
Em seguida, o tampão de lise celular foi removido e os plugs foram lavados duas vezes com
10 mL de água MilliQ pré-aquecida a 54°C por 15 minutos em cada lavagem. Posteriormente
às lavagens com água MilliQ, os plugs foram lavados quatro vezes com 10 mL de tampão de
lavagem TE (10 mM Tris; 1 mM EDTA, pH 8,0) pré-aquecido a 54°C por 15 minutos cada
lavagem. Após o término das lavagens, os plugs foram estocados em 1 mL de tampão de
lavagem TE em tubo plástico cônico de 2 mL a 4°C.
4.7.2. Digestão dos plugs

A digestão dos plugs foi feita separando-se 1 plug em um tubo plástico cônico de 2,0
mL, seguido de quatro lavagens por 15 minutos com tampão de lavagem TE pré-aquecido a
54°C. Em seguida, foi preparado uma mistura para cada enzima de restrição a ser utilizada
(SmaI e XbaI) contendo o tampão comercial de restrição 10X e água MilliQ na proporção
1:10.
Os plugs das linhagens de C. jejuni foram digeridos com a enzima SmaI e portanto,
nessa etapa foi adicionado 300 µL da mistura contendo o tampão comercial de restrição desta
enzima a cada tubo e incubou-se a 25ºC por 15 minutos. Os plugs das linhagens de
Salmonella Braenderup foram digeridos com XbaI e dessa maneira foi adicionado 300 µL da
mistura contendo o tampão comercial de restrição desta enzima a cada tubo e incubou-se a
37ºC por 15 minutos. Após a incubação, 40 unidades de enzima foram adicionadas ao tampão
e os plugs foram incubados por duas horas a 25°C para a enzima SmaI e a 37°C para a enzima
XbaI.
4.7.3. Corrida eletroforética

Após a digestão, o tampão com a enzima foi removido e 300 µL de tampão TBE (1
mM EDTA, pH 8,0; 45 mM Tris; 45 mM ácido bórico) 0,5X foram adicionados e os plugs
foram lavados sob leve agitação por 10 minutos. Em seguida, estes foram transferidos para
um gel de agarose 1% Seakem Gold preparado com TBE 0,5X, selados com uma fina camada
de agarose 1% Seakem Gold e submetidos à corrida no aparelho CHEF-DRIII System (Bio-
Rad), sob as seguintes condições de corrida:
 Tempo de corrida: 19 horas
 Voltagem: 6 V/cm
 Pulso inicial: 6,8 segundos
 Pulso final: 35,4 segundos
 Ângulo: 120°
 Temperatura da corrida: 14°C
Após as corridas, os géis foram corados em solução de brometo de etídeo (0,5 mg/mL)
por 30 minutos, descorados em água MilliQ por 80 minutos, visualizados em transluminador
ultravioleta (Gel Doc XR, Bio-Rad) e registrados em software fotográfico (Quantity One
4.6.1, Bio-Rad).
4.7.4. Análise do padrão de bandas gerados com os dados de PFGE

A análise dos dados foi feita utilizando-se o software BioNumerics versão 7.1
(Applied Maths, Keistraat, Belgium). Para a técnica de PFGE, somente os fragmentos entre
20,5 e 1.135 Kb em tamanho foram incluídos na análise. Os plugs de Salmonella Braenderup
H9812, linhagem que foi utilizada como padrão de peso molecular, foram incluídos três vezes
em cada gel com o intuito de normalizar as imagens para a validação da técnica nos diferentes
géis obtidos por PFGE.

PFGE
A construção do dendrograma de similaridade genômica foi realizada pelo software
BioNumerics versão 7.1 (AppliedMaths, Keistraat, Belgium) com tolerância de 1,5%,
utilizando-se o método UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) e o
cálculo de similaridade utilizando-se o índice DICE, segundo as instruções do manual do
programa.
4.8. Sequenciamento da pequena região variável (SVR) do gene flaA

O sequenciamento da SVR do gene flaA foi realizado para as 121 linhagens de C.
jejuni listadas na Tabela 1. Os DNAs genômicos foram extraídos e quantificados conforme
descrito no item 4.2. Inicialmente, foi realizada a amplificação do gene flaA de 1.713 pb,
utilizando reagentes para um volume final de reação de 50 µL. A Tabela 6 traz de forma
detalhada os reagentes utilizados para a amplificação do gene flaA.
Tabela 6 - Descrição dos reagentes utilizados para a amplificação do gene flaA

a
10X Tampão PCR Buffer 5 1X
10 mM dNTP Mixture a 1 0,2 mM de cada dNTP
Primer forward b 2,5 25 pmol
Primer reverseb 2,5 25 pmol
a
50 mM MgSO4 2 2 mM
DNA Genômico (10 ng/µL) 5 50 ng
Taq DNA Polymerase High Fidelity (1U/µL) 1 1U
a
H2O destilada ultra pura livre de DNase e RNase q.s.p. 50 -----------------
a
O par de primer utilizado para a amplificação do fragmento de 1.713 pb do gene flaA

está descrito na Tabela 5, item 4.5. Reações sem DNA foram utilizadas como branco e as
condições da corrida foram as mesmas utilizadas no item 4.6. O produto amplificado foi
visualizado em gel de agarose 1,5% preparado em tampão TAE 1X. O marcador de peso
molecular 1Kb plus DNA Ladder (Invitrogen) foi aplicado ao gel e a eletroforese foi
conduzida a 80 volts por 90 minutos. Após a eletroforese, os géis foram corados em solução
de brometo de etídeo (0,5 µg/mL) por 30 minutos, visualizados em transluminador
ultravioleta (Gel Doc XR, Bio-Rad) e registrados em software fotográfico (Quantity One
4.6.1, Bio-Rad).
Após verificar a amplificação do fragmento desejado, estes foram purificados através
da utilização do Kit PureLinkTM Quick PCR Purification (Life Technologies), seguindo as
recomendações do fabricante.
Em seguida, os amplicons purificados foram submetidos à amplificação da SVR do
gene flaA, em placa de 96 poços, utilizando reagentes para um volume final de reação de 10
µL sendo, 4 µL de água destilada ultra pura livre de DNase e RNase (Life Technologies), 2
µL de Big Dye terminator v 1.1, v 3.1-5X Sequencing Buffer (Life Technologies), 2 µL de
Big Dye terminator v 3.1 (Life Technologies), 1 µL do amplicon e 1 µL do primer 5’-CTA
TGG ATG AGC AAT T(AT)A AAA T-3’ e 5’-CAA G(AT)C CTG TTC C(AT)A CTG AAG
-3’, conforme descrito por Meinersmann et al. (1997). Em seguida, a reação foi submetida à
amplificação no termociclador DNAEngine® Peltier Thermal Cycler (Bio-Rad), onde as
condições de corrida foram as seguintes: 95º por 1 minuto, 95ºC por 10 segundos, 51ºC por 5
segundos, 60ºC por 4 minutos, repetindo essas três últimas condições por 35 vezes.
O DNA foi precipitado, seguindo-se o protocolo de precipitação sugerido pelo manual
do kit de sequenciamento. O sequenciamento foi realizado no Hemocentro de Ribeirão Preto
no sequenciador ABI 3500xL (Life Technologies) e os resultados foram salvos em
eletroferogramas na extensão ab1.
Os eletroferogramas são as representações gráficas dos sequenciamentos realizados,
sendo que cada pico no gráfico representa a intensidade luminosa emitida pelas bases
fluorescentes quando ocorre a incidência do laser de leitura, detectadas pela câmara de
cromatografia em camada delgada (CCD), havendo assim a montagem das sequências em
bases.
Para cada uma das linhagens estudadas foi feita uma reação de sequenciamento com o
primer forward e uma reação com o primer reverse.
4.8.1. Análise do sequenciamento da SVR do gene flaA

Os resultados salvos em eletroferogramas na extensão ab1 foram analisados
individualmente através do programa ChromasPro versão 1.41 (Technelysium Pty Ltd). Em
seguida, essas sequências foram depositadas no banco de dados disponível online,
http://pubmlst.org/campylobacter, que permite a comparação com outras sequências
depositadas através de um número de alelo específico gerado para cada sequência.
4.8.2. Construção do dendrograma de similaridade genômica gerado com os dados do

sequenciamento da SVR do gene flaA
Após o alinhamento das sequências o dendrograma foi construído utilizando-se o
método UPGMA, baseado no critério de máxima parcimônia com o modelo de correção de
distância de dois parâmetros de Jukes & Cantor, no software BioNumerics versão 7.1
(Applied Maths). Visando aumentar a confiabilidade dos resultados das análises filogenéticas,
foi utilizado o valor de bootstrap (1.000 replicatas) para agregar maior confiança ao
dendrograma de similaridade genética construído.
4.9. Análise do locus CRISPR por HRMA

A análise do locus CRISPR por HRMA foi realizada para as 121 linhagens de C.
jejuni listadas na Tabela 1 seguindo o protocolo descrito por Souza e Falcão (2012).
Primeiramente, foi realizada uma PCR em tempo real (qPCR) utilizando-se o termociclador
7500 FAST Real-Time PCR System (Life Technologies). As reações foram realizadas em
placa de 96 poços MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate (Life Technologies) cobertas
com adesivo ótico MicroAmp® Optical Adhesive Film (Life Technologies). A Tabela 7 mostra
os reagentes utilizados para as reações de qPCR.
Tabela 7 - Descrição dos reagentes utilizados para as reações de PCR em tempo real
Componentes Volume (µL)
a
MeltDoctor™ HRM Master Mix 10,0
Primer Forward (5 pmol/µL) b 1,2
b
Primer Reverse (5 pmol/µL) 1,2
DNA genômico (4,5 - 5,5 ng/µL) 4,0
a
Água destilada ultra pura livre de DNase e RNase 3,6
a
Produto Life Technologies; b Produto Integrated DNA Technologies (IDT)
O par de primer utilizado foi 5´-GCA ACC TCC TTT TAG TGG AGT AAT TAG-3´e
5´-AAG CGG TTT TAG GGG ATT GTA AC-3´ (Integrated DNA Technologies, Inc),
conforme descrito por Price et al. (2007). As condições das reações de qPCR foram as
seguintes:
 Desnaturação e ativação enzimática: 95ºC por 10 minutos
 Em seguida, 45 ciclos constituídos de:
 Desnaturação: 95ºC por 15 segundos
 Hibridação e extensão: 58ºC por 1 minuto
Todas as reações foram realizadas em duplicata. Reações sem DNA foram utilizadas
como branco.
A etapa de HRMA foi realizada imediatamente após a reação de qPCR. Os amplicons
foram aquecidos a 95ºC por 10 segundos e, então, resfriados a 60ºC por 1 minuto. As curvas
de melting de cada amplicon foram geradas a partir do aumento gradual de temperatura de
60ºC a 95ºC com incrementos de 1,6ºC/s e detecção da fluorescência a cada 0,1 segundo. A
fim de uniformizarem-se os dados, as curvas de melting brutas anteriormente obtidas foram
normalizadas a partir da seleção manual de duas regiões, uma delas ocorrendo anteriormente
ao início da dissociação do amplicon (100% de fluorescência) e outra, após a completa
separação da dupla fita de DNA (0% de fluorescência). As curvas de melting normalizadas
foram analisadas com o software HRM versão 2.0.1 (Life Technologies) de acordo com as
instruções do fabricante. O software agrupa amplicons que possuem curvas de melting
normalizadas similares e, dessa maneira, as diferenças entre grupos de amplicons distintos
podem ser facilmente identificadas.
4.10. Sequenciamento do genoma completo

O sequenciamento do genoma completo foi realizado para todas as 121 linhagens de
C. jejuni estudadas e listadas na Tabela 1. Essa metodologia foi realizada no laboratório
Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN) - Food and Drug Administration
(FDA), na cidade de College Park, Maryland, Estados Unidos.
A plataforma NextSeq®500 (Illumina) foi utilizada para o sequenciamento do genoma
completo das 121 linhagens de C. jejuni. Os DNAs genômicos das linhagens foram extraídos
conforme exposto no item 4.2. A pureza dos DNAs foi analisada em NanoDrop 2000
(Thermo Scientific) e a concentração foi verificada em fluorômetro Qubit ® (Life
Technologies) de acordo com as instruções do fabricante.
4.10.1. Diluição do DNA genômico

Para o sequenciamento do genoma completo foi utilizado 1 ng de DNA para cada
linhagem. Assim, após a quantificação, o DNA foi diluído com água destilada ultra pura livre
de DNase e RNase (Life Technologies) para que atingisse a concentração de 0,2 ng/µL, e
então foram utilizados 5 µL dessa diluição, totalizando assim, 1 ng de DNA.
As etapas descritas a seguir foram realizadas utilizando-se o Nextera XT Sample Prep
Kit (Illumina).
4.10.2. Fragmentação do DNA genômico

Em uma placa de 96 poços foram adicionados 5 µL de DNA genômico (0,2 ng/µL), 10
µL de TD buffer (tagment DNA buffer) e 5 µL de ATM (amplicon tagment mix) em cada poço
por amostra. A mistura foi homogeneizada, a placa foi selada com adesivo Microseal B e
centrifugada a 400 rpm por 1 minuto a 20ºC. Após a centrifugação, a placa foi colocada em
termociclador a 55ºC por 5 minutos e mantida a 10ºC. O adesivo foi retirado da placa e
adicionou-se 5 µL de NT buffer (neutralize tagment buffer) em cada poço, homogeneizou-se,
selou-se a placa com adesivo Microseal B que foi novamente centrifugada a 400 rpm por 1
minuto a 20ºC. Por fim, a placa foi mantida em temperatura ambiente por 5 minutos.
4.10.3. Amplificação das bibliotecas

Nesta etapa foram adicionados 5 µL de cada adaptador index 1 (i7) e 5 µL de cada
adaptador index 2 (i5). Ademais, foram adicionados 15 µL de NPM (nextera PCR master mix)
em cada poço contendo os adaptadores. A mistura foi homogeneizada e centrifugada a 400
rpm por 1 minuto a 20ºC. A placa foi selada com adesivo Microseal B e colocada em
termociclador, seguindo as seguintes condições de corrida: 72ºC por 3 minutos, 95ºC por 30
segundos, 12 ciclos de 95ºC por 10 segundos, 55ºC por 30 segundos e 72ºC por 30 segundos,
seguidos de extensão final de 72ºC por 5 minutos. Ao fim da corrida, a placa foi mantida a
10ºC.
4.10.4. Purificação das bibliotecas

Após a amplificação das bibliotecas, a placa foi centrifugada a 400 rpm por 1 minuto a
20ºC e 50 µL da reação foram transferidos para uma nova placa de 96 poços.
Adicionou-se 30 µL de AMPure XP beads em cada poço e então a placa foi selada,
colocada em agitador a 1800 rpm por 2 minutos e centrifugada a 400 rpm por 1 minuto a
20ºC. Após 5 minutos em temperatura ambiente, a placa foi colocada em estante magnética
por 2 minutos ou até que o sobrenadante se tornasse límpido. O sobrenadante foi removido e
descartado. Foram adicionados 200 µL de etanol 80% em cada poço e o sobrenadante foi
removido e descartado. Essa lavagem com etanol 80% foi realizada novamente. A placa foi
mantida na estante magnética para secagem do etanol por 15 minutos, e após esse tempo, foi
retirada da estante magnética e foram adicionados 52,5 µL de RSB (resuspension buffer) em
cada poço. A placa foi selada e colocada em agitador a 1800 rpm por 2 minutos e centrifugada
a 400 rpm por 1 minuto a 20ºC. Após 2 minutos em temperatura ambiente, a placa foi
colocada em estante magnética por 2 minutos ou até o que o sobrenadante se tornasse
límpido. Foram transferidos 50 µL do sobrenadante para uma nova placa de 96 poços.
4.10.5. Normalização das bibliotecas

Em um tubo de polipropileno de fundo cônico de 15 mL foram adicionados 4,4 mL de
LNA1 (library normalization additives 1) e 800 µL de LNB1 (library normalization beads 1).
20 µL de cada biblioteca purificada, conforme descrito no item 4.10.4, foram transferidos
para uma nova placa de 96 poços e 45 µL da mistura LNA1/LNB1 foram adicionados em
cada poço. A placa foi selada e colocada em agitador a 1800 rpm por 30 minutos. Após a
agitação, a placa foi colocada sob a estante magnética por 2 minutos e o sobrenadante foi
removido e descartado. Retirou-se a placa da estante magnética, adicionou-se 45 µL de
LNW1 (library normalization wash 1) e então a placa foi selada e colocada em agitador a
1800 rpm por 30 minutos. Após a agitação, a placa foi colocada sob a estante magnética por 2
minutos e o sobrenadante foi removido e descartado. Essa lavagem com LNW1 foi feita
novamente. A placa foi removida da estante magnética e foram adicionados em cada poço 30
µL de NaOH 0,1N. A placa foi selada, submetida a agitação a 1800 rpm por 5 minutos e
colocada sob a estante magnética por 2 minutos. Em uma nova placa de 96 poços foram
adicionados 30 µL do sobrenadante e 30 µL de LNS1 (library normalization storage buffer
1), e então a placa foi selada e centrifugada a 1400 rpm por 1 minuto.
4.10.6. Mistura das bibliotecas

Em tubo plástico cônico de 2 mL foram adicionados 5 µL de cada biblioteca. Essa
mistura foi bem homogeneizada e então 3 µL foram colocados em um novo tubo plástico
cônico de 2 mL, acrescidos de 997 µL de HT1 (hibridization buffer) e homogeneizados em
agitador tipo vortex a 400 rpm por 1 minuto. A 750 µL dessa mistura foram adicionados 750
µL de HT1 (hibridization buffer) e a mistura foi homogeneizada em agitador tipo vortex a 400
rpm por 1 minuto. Após a agitação, o tubo foi colocado em banho seco a 96ºC por 2 minutos e
imediatamente em seguida, incubado em gelo por 5 minutos. Foram adicionados 1,3 mL da
mistura final no Reagent Cartridge, que contem todos os reagentes utilizados no
sequenciamento. E, finalmente, o Reagent Cartridge foi inserido no sequenciador
NextSeq®500 e o sequenciamento foi realizado.
4.10.7. Análise dos dados gerados pelo sequenciamento do genoma completo

O assembly gerado a partir das reads das 121 linhagens de C. jejuni sequenciadas e
listadas da Tabela 1 foi feito através do programa CLC Genomics Workbench version 10.0.1.
A árvore filogenética foi gerada através do CFSAN SNP Pipeline (DAVIS et al.,
2015) baseada em uma matriz de single nucleotide polymorphism (SNP). O algoritmo GARLI
(genetic algorithm for rapid likelihood inference) sob o critério de máxima verossimilhança
foi utilizado para construir a árvore filogenética.
4.11. Multilocus sequence typing (MLST)

A metodologia de MLST foi realizada para 116 linhagens de C. jejuni do presente
estudo (sendo as 121 linhagens listadas na tabela 1 com exceção das cinco linhagens Cj 14, Cj
21, Cj 28, CCAMP 698 e CCAMP 1065), a partir dos assemblies gerados pelo
sequenciamento do genoma completo das linhagens, conforme descrito no item 4.10. O perfil
alélico, bem como o ST (sequence type), foram obtidos através da submissão do genoma
completo no banco de dados disponível online: http://pubmlst.org/perl/bigsdb/bigsdb.pl?
db=pubmlst_campylobacter_seqdef&page=sequenceQuery.
4.11.1. Construção do diagrama de similaridade genética com os dados de MLST

O diagrama de similaridade genética foi construído através do programa eBURSTv3,
disponível online (http:/eburst.mlst.net/). O diagrama foi construído baseado nos STs das
linhagens de C. jejuni estudadas e das linhagens de Campylobacter spp. disponíveis no banco
de dados. O programa eBURSTv3 permite a análise das linhagens estudadas em relação às
linhagens de diferentes localidades geográficas contidas no banco de dados possibilitando
assim uma análise global.
4.12. Análise in silico de genes de resistência e pontos de mutação

A partir dos assemblies gerados pelo sequenciamento do genoma completo de 116
linhagens de C. jejuni do estudo (sendo as 121 linhagens listadas na Tabela 1 com exceção
das cinco linhagens Cj 14, Cj 21, Cj 28, CCAMP 698 e CCAMP 1065), foram pesquisados
genes de resistência e pontos de mutação cromossomal conhecidos para o gênero
Campylobacter no ResFinder 3.0 disponível online: https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder.
Os genes de resistência investigados foram os que conferem resistência a aminoglicosídeos,
beta-lactâmicos, colistina, fluoroquinolonas, fosfomicina, glicopeptídeos, macrolídeos,
lincosamida, nitroimidazol, oxazolidinona, fenicol, rifampicina, sulfonamida, tetraciclina e
trimetoprim. Já para os pontos de mutação conhecidos, foram pesquisadas mutações na L22,
rpsL, cmeR, gyrA e 23S rRNA.
4.13. Cálculo do índice de discriminação

Para o cálculo do índice de discriminação das metodologias de tipagem molecular
realizadas no presente trabalho, foi utilizada uma variação do índice de diversidade de
Simpson (SIMPSON, 1949). O índice de discriminação (D) utilizado (HUNTER; GASTON,
1988) baseia-se na probabilidade de que duas linhagens não relacionadas escolhidas
aleatoriamente dentro de uma população se localizem dentro de grupos de tipagem distintos.

O índice D é obtido de acordo com a seguinte fórmula:
Onde N representa o número total de linhagens estudadas, s é o número total de tipos

obtidos no dendrograma e nj é o número de amostras que pertencem ao tipo j.
R e s u l t a d o s | 68
5. RESULTADOS
5. RESULTADOS
5.1. Extração e verificação da pureza do DNA genômico
Todas as 121 linhagens de C. jejuni listadas na Tabela 1, bem como as linhagens de C.
jejuni ATCC 33291 e C. coli WHOC 7.2 utilizadas como controle positivo na reconfirmação
da espécie e pesquisa dos genes de virulência por PCR apresentaram DNA íntegro após a
extração. A Figura 1 traz um gel representativo de uma eletroforese para a avaliação da
integridade do DNA genômico.
Todas as linhagens de C. jejuni estudadas apresentaram pureza ≥1,8 e os DNAs foram
utilizados na reconfirmação da espécie por multiplex PCR, na pesquisa dos genes de
virulência por PCR, no sequenciamento da pequena região variável (SVR) do gene flaA,
análise do locus CRISPR por HRMA e sequenciamento do genoma completo.
Figura 1 - Gel representativo dos produtos da extração do DNA genômico seguido de

eletroforese horizontal em gel de agarose 0,8%
M: marcador de peso molecular 1 Kb plus DNA Ladder (Invitrogen). Canaletas de 1 a 18, linhagens
representativas de C. jejuni estudadas: Cj 01 (1), Cj 06 (2), Cj 12 (3), Cj 18 (4), Cj 22 (5), Cj 26 (6), Cj
28 (7), Cj 30 (8), Cj 31 (9), CCAMP 81 (10), CCAMP 159 (11), CCAMP 480 (12), CCAMP 481 (13),
CCAMP 512 (14), CCAMP 612 (15), CCAMP 700 (16), CCAMP 1013 (17), CCAMP 1266 (18).
Fonte: o autor
5.2. Reconfirmação da espécie por multiplex PCR

Todas as 121 linhagens de C. jejuni listadas na Tabela 1 foram confirmadas como
pertencentes a tal espécie por uma multiplex PCR conforme descrito no item 4.3. Os
amplicons foram analisados após eletroforese horizontal para confirmar a presença de dois
fragmentos com peso molecular de 857 pb e 589 pb característicos do gênero Campylobacter
spp. e da espécie C. jejuni, respectivamente. A Figura 2 traz o gel representativo da reação de
reconfirmação da espécie.
Figura 2 - Gel representativo da PCR de reconfirmação da espécie seguida de eletroforese em

gel de agarose 1,5%
850 pb 
650 pb 
500 pb 
850 pb
650 pb
500 pb
M: Marcador de peso molecular 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Branco (1); Controle positivo C.
coli WHOC 7.2 (2); Controle positivo C. jejuni ATCC 33291 (3); Canaletas de 4 a 14, linhagens
representativas de C. jejuni estudadas: Cj 07 (4), Cj 13 (5), Cj 22 (6), Cj 28 (7), Cj 32 (8), CCAMP
162 (9), CCAMP 163 (10), CCAMP 472 (11), CCAMP 674 (12), CCAMP 700 (13), CCAMP 1020
(14).
Fonte: o autor
5.3. Pesquisa dos genes de virulência por PCR

A Tabela 8 mostra a frequência dos genes de virulência pesquisados para as 121
linhagens de C. jejuni listadas na Tabela 1.
Todas as linhagens apresentaram os genes flaA, flhA, iamA, docA, ciaB, cdtA, cdtB,
cdtC, racR, dnaJ, pldA, cadF, sodB e csrA. O gene wlaN foi detectado em 15 (12,4%)
linhagens, sendo sete linhagens de origem humana, sete linhagens de origem animal e uma
linhagem de alimentos. Somente uma (0,8%) linhagem de origem humana apresentou o gene
virB11 (Tabela 8).
Tabela 8 - Frequência dos genes de virulência pesquisados nas 121 linhagens de C. jejuni
estudadas
Número de linhagens positivas (%)
Genes Total Humano Animal Alimentos Ambiente
n = 121 n = 51 n = 35 n = 33 n = 02
flaA 121 (100) 51 (100) 35 (100) 33 (100) 02 (100)
flhA 121 (100) 51 (100) 35 (100) 33 (100) 02 (100)
cadF 121 (100) 51 (100) 35 (100) 33 (100) 02 (100)
docA 121 (100) 51 (100) 35 (100) 33 (100) 02 (100)
cdtA 121 (100) 51 (100) 35 (100) 33 (100) 02 (100)
cdtB 121 (100) 51 (100) 35 (100) 33 (100) 02 (100)
cdtC 121 (100) 51 (100) 35 (100) 33 (100) 02 (100)
sodB 121 (100) 51 (100) 35 (100) 33 (100) 02 (100)
dnaJ 121 (100) 51 (100) 35 (100) 33 (100) 02 (100)
pldA 121 (100) 51 (100) 35 (100) 33 (100) 02 (100)
racR 121 (100) 51 (100) 35 (100) 33 (100) 02 (100)
csrA 121 (100) 51 (100) 35 (100) 33 (100) 02 (100)
ciaB 121 (100) 51 (100) 35 (100) 33 (100) 02 (100)
iamA 121 (100) 51 (100) 35 (100) 33 (100) 02 (100)
wlaN 15 (12,4) 07 (13,7) 07 (20) 01 (3) ND
virB11 01 (0,8) 01 (1,9) ND ND ND
ND: não detectado
5.4. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)

As Tabelas 9 e 10 e a Figura 3 mostram o perfil de resistência encontrado nas 121
linhagens de C. jejuni estudadas frente aos antimicrobianos ciprofloxacina, eritromicina,
tetraciclina e doxiciclina. Dentre as 121 linhagens estudadas, 53 (43,8%) linhagens foram
susceptíveis a todos os antimicrobianos testados e 68 (56,2%) linhagens foram resistentes a
pelo menos um dos antimicrobianos testados, sendo 19 (54.3%) linhagens isoladas de animal,
24 (47.1%) linhagens isoladas de humanos e 25 (75.7%) linhagens isoladas de alimentos
(Tabela 9). A resistência à ciprofloxacina, doxiciclina, tetraciclina e eritromicina foi
observada em 53 (43.8%), 42 (34.7%), 42 (34.7%) e 06 (4.9%) linhagens, respectivamente
(Figura 3 e Tabela 10). Ademais os valores das CIMs para cada um dos quatro
antimicrobianos testados estão listados no Apêndice A.
Tabela 9 - Perfil de resistência a antimicrobianos das 68 linhagens de C. jejuni resistentes

Número de linhagens resistentes (%)
Antimicrobianos Humano Animal Alimentos Total
n=24 n=19 n=25 n = 68
Ciprofloxacina 09 (37,5) 04 (21,1) 13 (52,0) 26 (38,2)
Dox-Tet 05 (20,8) 03 (15,8) 05 (20,0) 13 (19,1)
Cip-Dox-Tet 08 (33,3) 12 (63,1) 03 (12,0) 23 (33,8)
Dox-Tet-Eri 02 (8,4) ND ND 02 (3,0)
Cip-Dox-Tet-Eri ND ND 04 (16,0) 04 (5,9)
ND: não detectado; Cip: ciprofloxacina; Dox: doxiciclina; Eri: eritromicina; Tet: tetraciclina
Tabela 10 - Perfil de resistência a antimicrobianos das 121 linhagens de C. jejuni estudadas

isoladas de humanos, animais, alimentos e ambiente
Número de linhagens resistentes (%)
Antimicrobianos Humano Animal Alimentos Ambiente Total
n = 51 n = 35 n = 33 n = 02 n = 121
Ciprofloxacina 17 (33,3) 16 (45,7) 20 (60,6) ND 53 (43,8)
Eritromicina 02 (3,9) ND 04 (12,1) ND 06 (4,9)
Doxiciclina 15 (29,4) 15 (42,9) 12 (36,3) ND 42 (34,7)
Tetraciclina 15 (29,4) 15 (42,9) 12 (36,3) ND 42 (34,7)
ND: não detectado
Figura 3 - Perfil de resistência das 121 linhagens de C. jejuni estudadas
60
Número de linhagens
50
40
30
20
10
0 Alimentos
Animal
Humano
Antimicrobianos
Fonte: o autor
5.5. Pulsed field gel electrophoresis (PFGE)

A Figura 4 traz um gel representativo após eletroforese em campo pulsado de algumas
linhagens de C. jejuni estudadas.
O padrão de bandas variou em número entre cinco e 12 bandas, e somente as bandas
de peso molecular entre 20,5 Kb e 1.135 Kb foram consideradas na análise.
Figura 4 - Gel de agarose 1% representativo do ensaio de PFGE de algumas linhagens de C.

jejuni estudadas digeridas com a enzima SmaI
1.135 Kb 
244,4 Kb 
20,5 Kb 
M: marcador de peso molecular (Salmonella Braenderup H9812) digerido com XbaI. Canaletas de 1 a
12, linhagens representativas de C. jejuni estudadas: Cj 02 (1), CCAMP 489 (2), CCAMP 1497 (3), Cj
24 (4), Cj 25 (5), Cj 26 (6), Cj 30 (7), Cj 34 (8), CCAMP 621 (9), CCAMP 689 (10), CCAMP 470
(11) e CCAMP 1478 (12).
Fonte: o autor

PFGE
A Figura 5 ilustra o dendrograma de similaridade genômica gerado a partir da análise
do perfil de bandas de PFGE para as 121 linhagens de C. jejuni listadas na Tabela 1. A análise
do dendrograma revelou 71 PFGE-tipos e agrupou as 121 linhagens estudadas em três
grandes grupos denominados PFGE-A, PFGE-B e PFGE-C com similaridade genômica de
46,9% entre eles.
O grupo PFGE-A agrupou 55 (45,45%) linhagens com similaridade genômica acima
de 48,4% entre elas, sendo 32 linhagens isoladas de humanos, 19 linhagens isoladas de
animais, três linhagens isoladas de alimentos e uma linhagem isolada de ambiente entre os
anos de 1996 a 2016. Apesar da alta diversidade genômica entre as linhagens estudadas,
algumas linhagens apresentaram uma alta similaridade genotípica acima de 80% entre elas e,
foram agrupadas em 11 subgrupos denominados PFGE-A1, PFGE-A2, PFGE-A3, PFGE-A4,

PFGE-A5, PFGE-A6, PFGE-A7, PFGE-A8, PFGE-A9, PFGE-A10 e PFGE-A11. O subgrupo
PFGE-A1 foi composto por três linhagens isoladas de humanos, nos anos de 2001 e 2003, nos
estados de São Paulo e Rio de Janeiro, com similaridade ≥80,1%. PFGE-A2 compreendeu
seis linhagens com similaridade maior que 82,5%, sendo quatro linhagens isoladas de
humanos e duas linhagens isoladas de animais, entre os anos de 2000 a 2016, no estado do
Rio de Janeiro. PFGE-A3 agrupou duas linhagens isoladas de humanos e quatro linhagens
isoladas de animais, nos estados de Minas Gerais, São Paulo e Rio de Janeiro, entre os anos
de 1999 a 2013, com similaridade ≥89,8%. PFGE-A4 foi composto por duas linhagens
indistinguíveis entre si isoladas de humano e ambiente no estado de Rio de Janeiro no ano de
1999 (Figura 5).
PFGE-A5 compreendeu três linhagens, sendo duas isoladas de alimentos e uma
isolada de humano, nos anos de 2003 e 2008 nos estados de Minas Gerais e São Paulo, com
similaridade entre as linhagens maior que 94,1%. PFGE-A6 agrupou sete linhagens isoladas
de humanos e uma linhagem isolada de animal, nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro,
entre os anos de 1997 a 2014, com similaridade ≥93,3%. PFGE-A7 foi composto por duas
linhagens isoladas de humanos, nos anos de 2003 e 2005, nos estados de São Paulo e Rio de
Janeiro, com similaridade de 85,7%. PFGE-A8 compreendeu três linhagens isoladas de
humanos, entre os anos de 2004 a 2009 no estado de São Paulo, com similaridade entre as
linhagens maior que 82,9%. PFGE-A9 agrupou três linhagens isoladas de animais, no estado
do Rio de Janeiro no ano de 2006, com similaridade ≥90,4%. PFGE-A10 foi composto por
duas linhagens indistinguíveis entre si, isoladas de humanos nos anos de 2001 e 2004 no
estado do Rio de Janeiro. PFGE-A11 agrupou seis linhagens isoladas de animais e duas
linhagens isoladas de humanos, entre os anos de 1996 a 2003, no estado do Rio de Janeiro,
com similaridade entre as linhagens maior que 80,8% (Figura 5).
Figura 5 - Dendrograma de similaridade genotípica gerado pelo método UPGMA e

coeficiente de similaridade DICE a partir do padrão de bandas obtido pelo PFGE com a
enzima SmaI para as 121 linhagens de C. jejuni estudadas
PFGE-SmaI
Linhagens Material Ano Estado flaA alelo CRISPR Perfil resistência
100
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
94.1
...
CCAMP 588 fezes diarreicas 2001 RJ 9 9 - .
PFGE-A1 80.1 ... 04
Cj fezes diarreicas 2003 SP 36 5 - .
... 11
Cj fezes diarreicas 2003 SP 14 5 Cip-Dox-Tet .
73.3 94.7
...
91.5 ...
PFGE-A2 ...
CCAMP 730 fezes não diarreicas 2000 RJ 190 5 - .
82.5
...
CCAMP 1574 fezes não diarreicas 2016 RJ 190 5 Cip-Dox-Tet .
...
CCAMP 601 fezes diarreicas 2003 RJ 190 7 Cip-Dox-Tet .
...
CCAMP 678 fezes diarreicas 2006 RJ XXX 7 Cip-Dox-Tet .
69.6
...
CCAMP 1493 fezes não diarreicas 2013 RJ 551 11 Cip .
93.3 ... 02
Cj fezes diarreicas 2002 SP 551 3 Dox-Tet-Ery .
91.4 ...
CCAMP 480 fezes não diarreicas 2004 MG 551 5 Cip-Dox-Tet .
90.4
...
PFGE-A3 89.8
...
76.3 ... 03
PFGE-A4 ...
CCAMP 830 esgoto 1999 RJ 595 4 - .
63.2
...
...
CCAMP 1039 cortes de frango 2008 MG 855 14 Cip-Dox-Tet .
PFGE-A5 94.1 ...
CCAMP 1048 cortes de frango 2008 MG 855 14 Cip .
79.9 ... 12
Cj fezes diarreicas 2003 SP 975 3 Cip .
... 19
...
...
CCAMP 1497 fezes diarreicas 2014 RJ 49 22 Cip .
60.7
74.0
...
CCAMP 489 fezes diarreicas 1997 RJ 49 2 Dox-Tet .
... 23
... 24
... 31
54.1 PFGE-A6 93.3
... 33
...
78.3
... 16
... 17
...
CCAMP 1065 cortes de frango 2010 RJ 23 11 - .
PFGE-A7 85.7 ...
78.6 ... 09
Cj fezes diarreicas 2003 SP 161 1 Dox-Tet .
... 32
66.7
93.3
... 14
53.4
PFGE-A8 82.9 ... 25
... 30
60.1
93.3
...
CCAMP 672 fezes não diarreicas 2006 RJ 49 10 Dox-Tet .
PFGE-A9 90.4 ...
73.3 ...
PFGE-A10 ...
67.3
...
...
PFGE-A ...
48.4 55.5
85.7 ...
...
48,4% PFGE-A11 ...
80.8
...
...
73.0
94.1
...
64.8 ...
... 18
... 21
...
87.5
85.7
94.1
90.0
79.2
80.8
73.0
94.1
64.8
Linhagens Material Ano Estado flaA alelo CRISPR Perfil resistência
...
CCAMP 1518 carcaça de frango 2015 RS 287 3 Cip-Dox-Tet-Ery .
...
...
87.5
...
...
CCAMP 1538 fezes não diarreicas 2015 RS 287 23 Cip-Dox-Tet .
PFGE-B1 ...
85.7
...
94.1 ...
90.0
...
CCAMP 1519 carcaça de frango 2015 RS 54 19 Cip-Dox-Tet .
79.2
...
...
...
PFGE-B2 94.1 ...
... 20
73.6
...
CCAMP 1014 cortes de frango 2008 MG 45 3 - .
46.9 ...
...
...
65.0
97.5
...
PFGE-B3 82.4
...
60.9 ... 15
PFGE-B PFGE-B4 ... 06
52.3 ... 07
Cj Sangue 2003 SP 45 6 Cip .
... 28
...
52,3%
... 01
... 27
... 26
...
...
98.0
...
...
...
84.8
...
... 22
PFGE-C1
80.0
...
...
...
...
...
CCAMP 1015 cortes de frango 2008 MG 21 3 Dox-Tet .
...
50.4
...
76.7
...
...
...
CCAMP 1491 sangue 2011 RJ 21 3 Cip-Dox-Tet .
...
67.8
...
85.7
...
81.7
...
CCAMP 1555 fezes não diarreicas 2015 RJ 1661
1661 16 Cip .
PFGE-C2
...
CCAMP 764 esgoto 1996 RJ 149 3 - .
63.3
...
85.7
...
PFGE-C3 80.0 ...
74.3 ...
60.0
PFGE-C4 ...
...
...
PFGE-C5 85.7 ... 29
66.7 ...
59.0
...
PFGE-C ...
...
59,0% 94.1 ...

PFGE-C6 91.9
... 13
75.0
...
... 34
MG: Minas Gerais; SP: São Paulo; RJ: Rio de Janeiro; RS: Rio Grande do Sul; Cip: Ciprofloxacina; Dox:
Doxiciclina; Tet: Tetraciclina; Ery: Eritromicina; XXX: aguardando envio do número do alelo; vermelho:
humano; azul: animal; amarelo: alimentos; verde: ambiente.
Fonte: o autor
O grupo PFGE-B compreendeu 25 (20,66%) linhagens com similaridade genômica

maior que 52,3%, isoladas de humanos (9), animais (4) e alimentos (12) no período de 1996 a
2015. As linhagens que apresentaram similaridade genotípica acima de 80% foram agrupadas
em quatro subgrupos denominados PFGE-B1, PFGE-B2, PFGE-B3 e PFGE-B4. O subgrupo
PFGE-B1 foi composto por 10 linhagens, sendo quatro linhagens isoladas de humanos, cinco
linhagens isoladas de alimentos e uma linhagem isolada de animal, entre os anos de 1996 e
2015, nos estados do Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul, com similaridade ≥85,7%. PFGE-
B2 compreendeu quatro linhagens com similaridade maior que 94,1%, sendo uma linhagem
isolada de humano e três linhagens isoladas de animais, nos anos de 2004 a 2006, nos estados
de São Paulo e Minas Gerais. PFGE-B3 agrupou uma linhagem isolada de humano e seis
linhagens isoladas de alimentos, nos estados de Minas Gerais e São Paulo, entre os anos de
2004 a 2009, com similaridade ≥82,4%. PFGE-B4 foi composto por duas linhagens
indistinguíveis entre si, isoladas de humanos no estado de São Paulo no ano de 2003 (Figura
5).
PFGE-C agrupou 41 (33,89%) linhagens com 59,0% de similaridade genômica, sendo
que 10 linhagens foram isoladas de humanos, 12 linhagens foram isoladas de animais, 18
linhagens foram isoladas de alimentos e uma linhagem foi isolada de ambiente entre os anos
de 1996 a 2015. Da mesma maneira, as linhagens que exibiram similaridade genômica acima
de 80% foram agrupadas em seis subgrupos denominados PFGE-C1, PFGE-C2, PFGE-C3,
PFGE-C4, PFGE-C5 e PFGE-C6. O subgrupo PFGE-C1 foi composto por 14 linhagens
isoladas de humanos (4), animais (2) e alimentos (8) entre os anos de 1997 a 2009, nos
estados de Minas Gerias, São Paulo e Rio de Janeiro, com similaridade ≥80,0%. PFGE-C2
compreendeu 11 linhagens com similaridade maior que 81,7%, sendo cinco linhagens isoladas
de alimentos, uma linhagem isolada de humano, quatro linhagens isoladas de animais e uma
linhagem isolada de ambiente, entre os anos de 1996 a 2015, nos estados de Minas Gerais e
Rio de Janeiro. PFGE-C3 agrupou três linhagens isoladas de alimentos, no estado de Minas
Gerais, nos anos de 2008 e 2009, com similaridade ≥80,0%. PFGE-C4 foi composto por duas
linhagens indistinguíveis entre si isoladas de alimentos no estado de Minas Gerais no ano de
2009. PFGE-C5 compreendeu três linhagens, sendo duas linhagens isoladas de humanos e
uma linhagem isolada de animal, nos anos de 1996 e 2009 nos estados de São Paulo e Rio de
Janeiro, com similaridade entre as linhagens maior que 85,7%. PFGE-C6 agrupou uma
linhagem isolada de humano e quatro linhagens isoladas de animal, nos estados de São Paulo
e Rio de Janeiro, nos anos de 2003 e 2009, com similaridade ≥91,9% (Figura 5).
5.6. Sequenciamento da pequena região variável (SVR) do gene flaA

Os resultados salvos em eletroferogramas foram analisados individualmente através do
Programa ChromasPro (Technelysium Pty Ltd). Em seguida, essas sequências foram
depositadas no banco de dados http://pubmlst.org/campylobacter, o que gerou um número de
alelo específico para cada sequência, como pode ser observado na Figura 6.
O presente estudo revelou 40 SVR-flaA alelos para as 121 linhagens de C. jejuni
estudadas sendo que os alelos 1661 e XXX (aguardando envio do número do alelo pelo banco
de dados) não estavam descritos no banco de dados. Os alelos mais frequentemente
detectados foram o alelo 57 com 19 (15,7%) linhagens, alelo 49 com 14 (11,6%) linhagens,
alelo 45 com 13 (10,7%) linhagens, alelo 21 com nove (7,44%) linhagens, alelos 51, 100, 230
e 280 com cinco (4,13%) linhagens, alelos 190 e 551 com quatro (3,3%) linhagens, alelos 53
e 161 com três (2,48%) linhagens, alelos 14, 274, 595 e 855 com duas (1,65%) linhagens. Os
alelos 2, 5, 9, 11, 22, 23, 24, 36, 48, 54, 67, 149,153, 162, 198, 239, 260, 975, 1336, 1379,
1440, 1651, 1661 e XXX foram detectados em apenas uma linhagem (Figura 6).
5.6.1. Construção do dendrograma de similaridade gerado com os dados do

sequenciamento da SVR do gene flaA
A partir do alinhamento das sequências da SVR do gene flaA foi gerado um
dendrograma de similaridade genômica (Figura 6) que apresentou 40 SVR-flaA tipos e foi
dividido em dois grupos denominados SVR-A e SVR-B que apresentaram 80,9% de
similaridade entre eles (Figura 6).
SVR-A agrupou 20 (16,53%) linhagens com similaridade entre elas ≥88,0%, isoladas
de humanos (13), animais (6) e ambiente (1), nos estados de Minas Gerais, São Paulo e Rio de
Janeiro entre os anos de 1999 e 2016. SVR-B compreendeu 101 (83,47%) linhagens com
similaridade entre elas acima de 90,6%, isoladas de humanos (38), animais (29), alimentos
(33) e ambiente (1) entre os anos de 1996 e 2015 nos estados de Minas Gerais, São Paulo, Rio
de Janeiro e Rio Grande do Sul (Figura 6).
Figura 6 - Dendrograma gerado a partir dos dados do sequenciamento das SVR (small
variable region) do gene flaA utilizando o modelo de correção de distância de dois parâmetros
de Jukes & Cantor e o algoritmo UPGMA
flaA Linhagens Material Ano Estado flaA alelo CRISPR Perfil resistência
100
82
84
86
88
90
92
94
96
98
...
100
100
...
100 ...
96.5
54 ...
95.1
43 ... 19
...
CCAMP 678 fezes diarreicas 2006 RJ XXX 7 Cip-Dox-Tet .
...
94
94
... 09
94.0
30
... 32
99.1
82 ...
100
100
...
93.2
92 97.9
99 94 ...
... 02
89.2
... 21
67
...
CCAMP 830 esgoto 1999 RJ 595 4 - .
100
SVR-A 88.0
...
99
...
... 14
100
99.4
100
... 25
88,0% ... 30
...
100
100
...
100 ...
100 ...
97.5
12 ...
CCAMP 1538 fezes não diarreicas 2015 RS 287 23 Cip-Dox-Tet .
... 28
98.7
...
CCAMP 1065 cortes de frango 2010 RJ 23 11 - .
36
...
...
100
100
...
100 ...
100 ...
100 ...
100 ...
98.4
20
97.2
83 ...
0
83 ...
83 ...
83 ...
83 ... 06
83 ... 07
Cj Sangue 2003 SP 45 6 Cip .
99.4
42 ... 15
98.8
34 ...
... 16
...
100
99.7
54
...
98.0
6 ... 12
...
85
85
...
83 ...
83 ...
83 ...
99.3
44 83 ...
83 ...
96.9
0
83 ...
81 ... 03
81 ... 17
98.6
15
81 ... 23
81 ... 24
81 ... 31
... 33
...
96
96
...
...
99
99
99
80.9
98
98.4
21
98.0
10
99.4
96.7
97.3 51
4 3
99.1
56
99.3
44 83
83
96.9
0
83
81
98.6
15
81
81
81
81
96
96 Linhagens Material Ano Estado flaA alelo CRISPR Perfil resistência
...
99
99
...
99 ...
80.9
98 ...
98.4
21 ... 18
98.0
10 ... 04
...
CCAMP 764 esgoto 1996 RJ 149 3 - .
96.7
99.4
51
...
97.3
4 3
99.1
56
... 34
...
...
98.2 100
31
100
...
100 ...
99 ...
...
98.4
...
30
...
...
100
100
...
100 ...
100 ...
97.9
14
100 ...
94 ...
CCAMP 1491 sangue 2011 RJ 21 3 Cip-Dox-Tet .
94 ...
94 ...
99.1
55 ...
97.0
498.5 50 ...
CCAMP 1519 carcaça de frango 2015 RS 54 19 Cip-Dox-Tet .
... 20
...
100
96.3 100
...
9
100 ...
100 ...
... 29
...
100
100
...
100 ...
100 ...
100 ...
100 ...
100 ...
100 ...
95.9
94
100 ...
100 ...
100 ...
100 ...
100 ...
100 ...
63 ...
93.2
92
63 ...
63 ... 22
63 ... 26
99.7
99 ... 27
SVR-B 90.6
100
...
... 01
... 11
99
... 13
90,6% 98.1
100
...
...
O valor do Bootstrap encontra-se na frente dos nós enquanto que os valores de similaridade estão atrás
do nó. MG: Minas Gerais; SP: São Paulo; RJ: Rio de Janeiro; RS: Rio Grande do Sul; Cip:
Ciprofloxacina; Dox: Doxiciclina; Tet: Tetraciclina; Ery: Eritromicina. XXX: aguardando envio do
número do alelo; vermelho: humano; azul: animal; amarelo: alimentos; verde: ambiente.
Fonte: o autor
5.7. Análise do locus CRISPR por HRMA

A análise do locus CRISPR por HRMA dividiu as 121 linhagens de C. jejuni
estudadas em 23 diferentes perfis de melting. As Figuras 7, 8 e 9 trazem os 23 perfis de
melting gerados pela análise do locus CRISPR por HRMA. A Tabela 11 e a Figura 10
mostram a distribuição das linhagens estudadas entre as 23 variantes obtidas.
Figura 7 - Gráfico representativo das curvas de melting das variantes V1, V2, V3, V4, V5,
V8, V10, V15 e V19 das 121 linhagens de C. jejuni estudadas
Fonte: o autor
Figura 8 - Gráfico representativo das curvas de melting das variantes V6, V7, V9, V12, V16,
V18, V20 e V22 das 121 linhagens de C. jejuni estudadas
Fonte: o autor
Figura 9 - Gráfico representativo das curvas de melting das variantes V11, V13, V14, V17,
V21, e V23 das 121 linhagens de C. jejuni estudadas
Fonte: o autor
Tabela 11- Distribuição das 121 linhagens de C. jejuni estudadas entre as 23 variantes obtidas
Var. Linhagens Local Origem Período Total
V1 Cj09, Cj14 e Cj30 SP Humano 2003 a 2009 3
CCAMP 488, Cj03, Cj16, SP e
V2 Humano 1996 a 2010 6
Cj31, CCAMP 489 e CCAMP 1478 RJ
Cj02, Cj12, CCAMP 476,
CCAMP 478, CCAMP 479, CCAMP 685,
CCAMP 1019, CCAMP 1020, CCAMP 1021, SP, Humano,
CCAMP 1023, CCAMP 1024, CCAMP 1025, MG, Animal
V3 1996 a 2015 36
CCAMP 1032, CCAMP 1047, CCAMP 1050, RJ e Alimento,
CCAMP 1051, CCAMP 1052, CCAMP 1053, RS Ambiente
CCAMP 1520, CCAMP 1521 e CCAMP 1523
CCAMP 497, CCAMP 687, CCAMP 689, Humano,
V4 CCAMP 696, CCAMP 828, CCAMP 830, RJ Animal, 1997 a 1999 8
CCAMP 845 e CCAMP 980 Ambiente
Cj01, Cj04, Cj11, Cj15,
Cj17, Cj22, Cj28, Cj29, SP,
Humano,
V5 CCAMP 470, CCAMP 471, CCAMP 472, MG e 1996 a 2016 17
Animal
CCAMP 480, CCAMP 481, CCAMP 699, RJ
SP e Humano,
V6 Cj06, Cj07 e CCAMP 789 1997 a 2003 3
RJ Animal
Cj18, Cj23, Cj24, CCAMP 601, SP e Humano,
V7 1996 a 2006 7
CCAMP 621, CCAMP 678 e CCAMP 698 RJ Animal
continua
conclusão
Var. Linhagens Local Origem Período Total
SP,
Humano,
V8 Cj20, Cj25, Cj26, Cj27, MG 1998 a 2011 7
Animal
Cj32, CCAMP 473 e CCAMP 493 e RJ
SP e
V9 Cj33 e CCAMP 588 RJ Humano 2001 e 2012 2
V10 RJ Animal 2003 a 2006 6
Cj13, Cj19, Cj34, CCAMP 487, CCAMP 506, Humano,
SP e
V11 Animal, 1996 a 2015 8
CCAMP 512, CCAMP 1065 e CCAMP 1493 RJ
Alimento
Humano,
V12 CCAMP 159, CCAMP 700 e CCAMP 991 RJ 1999 a 2004 3
Animal
V13 CCAMP 501 RJ Humano 1999 1
CCAMP 594, CCAMP 1039, Humano,
MG e
V14 Animal, 2001 a 2009 4
RJ
CCAMP 1048 e CCAMP 1266 Alimento
SP e Humano,
V16 Cj21 e CCAMP 1555 2006 e 2015 2
RJ Animal
V17 CCAMP 1061 MG Alimento 2009 1
V18 CCAMP 1080 RJ Animal 2009 1
V19 CCAMP 1519 RS Alimento 2015 1
V23 CCAMP 1538 RS Animal 2015 1
Var.: Variante; MG: Minas Gerais; SP: São Paulo; RJ: Rio de Janeiro; RS: Rio Grande do Sul
Figura 10 - Distribuição por fonte de isolamento das 121 linhagens de C. jejuni estudadas
dentre as 23 variantes obtidas
40
35
Número de linhagens
30
25
Ambiente
20
Alimentos
15
Animal
10 Humano
5
0
V10
V11
V12
V13
V14
V15
V16
V17
V18
V19
V20
V21
V22
V23
V7
V1
V2
V3
V4
V5
V6
V8
V9
Variantes
Fonte: o autor
5.8. Sequenciamento do genoma completo

Dentre as 121 linhagens de C. jejuni sequenciadas, o sequenciamento do genoma
completo não funcionou para cinco linhagens, sendo elas as linhagens Cj 14, Cj 21, Cj 28,
CCAMP 698 e CCAMP 1065. Devido a um grande número de contigs e/ou ao tamanho do
genoma não característico para o gênero Campylobacter, essas cinco linhagens foram
excluídas de todas as análises que utilizaram os dados do sequenciamento do genoma
completo.
Dessa forma, as 116 linhagens de C. jejuni que tiveram um sequenciamento
satisfatório apresentaram um tamanho de genoma que variou de 1,6 a 1,8 Megabases (Mb),
com uma média de conteúdo Citosina+Guanina de 30,35%, número de contigs por assembly
que variou de 24 a 338, e uma cobertura de sequenciamento de 66X a 521X (Apêndice B).
5.8.1. Construção da árvore filogenética baseada em SNPs gerada com os dados do

sequenciamento do genoma completo
A Figura 11 ilustra a árvore filogenética baseada em SNPs gerada a partir da análise
dos dados do sequenciamento do genoma completo para as 116 linhagens de C. jejuni do
presente estudo (sendo as 121 linhagens listadas na Tabela 1 com exceção das cinco linhagens
Cj 14, Cj 21, Cj 28, CCAMP 698 e CCAMP 1065, para as quais o sequenciamento não
funcionou) acrescida da linhagem C. jejuni ATCC 33291.
A árvore foi dividida em dois principais grupos denominados SNP-A e SNP-B. O
grupo SNP-A agrupou 97 (83%) linhagens, sendo 37 linhagens isoladas de humanos, 26 de
animais, 32 de alimentos e duas de ambiente, entre os anos de 1996 a 2016 nos estados de São
Paulo, Minas Gerais, Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul. O grupo SNP-A foi subdividido em
dois subgrupos denominados SNP-A1 e SNP-A2. O subgrupo SNP-A1 compreendeu 30
linhagens, sendo 18 isoladas de humanos, nove isoladas de animal e três isoladas de
alimentos, entre os anos de 1997 e 2014, nos estados de Minas Gerais, São Paulo e Rio de
Janeiro. O subgrupo SNP-A2 agrupou 63 linhagens, sendo 18 isoladas de humanos, 15
isoladas de animal, 29 isoladas de alimentos e uma isolada de ambiente, entre os anos de 1996
a 2015, nos estados de Minas Gerais, São Paulo, Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul. O grupo
SNP-B agrupou 19 (17%) linhagens, sendo 10 linhagens isoladas de humanos e nove isoladas
de animais, entre os anos de 1996 a 2011 nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro (Figura
11).
Figura 11 - Árvore filogenética baseada na análise de SNPs encontrados nos genomas

completos sequenciados das 116 linhagens de C. jejuni isoladas de humanos (47), animais
(35), alimentos (32) e ambiente (02)
SNP-A
SNP-A1
SNP-A2
SNP-B
MG: Minas Gerais; SP: São Paulo; RJ: Rio de Janeiro; RS: Rio Grande do Sul
Fonte: o autor
5.9. Multilocus sequence typing (MLST)

O assembly de cada uma das 116 linhagens de C. jejuni foi submetido ao banco de
dados: http://pubmlst.org/perl/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_campylobacter_seqdef&page=se
quenceQuery. Este procedimento foi realizado para cada linhagem individualmente de forma
a se obter um número de alelo para cada um dos sete genes housekeeping. A combinação
desses alelos deu origem a um número de ST, como pode ser observado na Tabela 12.
Tabela 12 - Combinação dos alelos obtidos e dos 46 STs gerados nas 116 linhagens de C.
jejuni tipadas por MLST
Linhagens aspA glnA gltA glyA pgm tkt uncA ST CC
CCAMP 487 8 2 2 2 11 345 6 3852 ST-354
CCAMP 488 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 489 2 4 1 4 19 62 5 475 ST-48
CCAMP 493 4 7 10 4 1 7 1 45 ST-45
CCAMP 497 10 27 59 19 10 5 7 1775 ST-403
CCAMP 501 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 506 62 4 5 2 74 1 5 332 ST-48
CCAMP 512 83 84 5 10 11 3 46 1071 NA
CCAMP 588 2 1 1 3 2 1 5 21 ST-21
CCAMP 594 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
Cj 01 7 2 2 2 11 5 6 6257 ST-354
Cj 02 2 4 5 25 11 1 5 2086 ST-206
CCAMP 696 10 27 59 19 10 5 7 1775 ST-403
Cj 03 83 84 1 10 11 3 46 2289 NA
Cj 04 2 1 12 3 2 1 5 50 ST-21
Cj 06 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
Cj 07 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
Cj 09 1 3 6 4 54 91 3 660 ST-22
Cj 11 8 2 5 53 11 3 1 607 ST-607
Cj 12 2 1 52 10 11 1 5 9081 ST-21
Cj 13 7 669 5 2 11 1 5 9082 NA
CCAMP 601 2 4 5 93 11 3 6 1398 ST-658
CCAMP 699 2 4 52 93 11 3 6 8745 ST-658
CCAMP 700 10 27 16 19 10 5 7 403 ST-403
Cj 15 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
Cj 16 7 17 571 2 89 710 6 9083 ST-353
Cj 17 7 97 5 2 135 68 26 791 NA
CCAMP 612 1 3 6 4 54 91 3 660 ST-22
CCAMP 678 2 4 5 93 11 3 6 1398 ST-658
Cj 18 10 27 16 19 10 5 7 403 ST-403
continua
continuação
Cj 19 7 84 5 2 11 203 6 1522 ST-353
Cj 20 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
Cj 22 2 17 5 10 11 3 6 8741 ST-353
Cj 23 2 4 1 4 19 62 5 475 ST-48
Cj 24 2 4 1 4 19 62 5 475 ST-48
Cj 25 1 2 3 4 5 9 6 469 ST-42
Cj 26 9 25 2 10 22 3 6 52 ST-52
Cj 27 9 25 2 10 22 3 6 52 ST-52
Cj 29 8 10 2 2 11 12 6 354 ST-354
Cj 30 1 2 3 4 457 9 3 3997 ST-42
Cj 31 2 4 1 4 19 62 5 475 ST-48
CCAMP 1478 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 1491 24 17 2 15 23 12 12 463 ST-443
Cj 32 1 3 6 4 54 91 3 660 ST-22
Cj 33 2 4 1 4 19 62 5 475 ST-48
CCAMP 1497 2 4 1 4 19 62 5 475 ST-48
Cj 34 9 2 2 10 10 3 1 8742 ST-464
CCAMP 770 10 27 16 19 10 5 7 403 ST-403
CCAMP 621 10 27 16 19 10 5 7 403 ST-403
CCAMP 687 10 27 59 19 10 5 7 1775 ST-403
CCAMP 689 10 27 59 19 10 5 7 1775 ST-403
CCAMP 789 10 27 16 19 10 5 7 403 ST-403
CCAMP 828 8 17 5 2 11 12 6 8747 ST-354
CCAMP 845 10 27 59 19 10 5 7 1775 ST-403
CCAMP 980 7 21 5 2 4 61 44 8748 NA
CCAMP 991 3 1 5 10 11 3 6 8749 ST-49
CCAMP 730 2 4 52 93 11 3 6 8745 ST-658
CCAMP 685 2 2 42 4 90 25 8 2042 NA
CCAMP 81 9 25 2 10 22 3 6 52 ST-52
CCAMP 159 10 27 16 19 10 5 7 403 ST-403
CCAMP 162 9 25 2 10 22 3 6 52 ST-52
CCAMP 163 9 25 2 10 22 3 6 52 ST-52
CCAMP 470 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 471 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 472 9 17 5 2 10 3 6 8743 ST-353
CCAMP 473 8 17 2 2 11 12 6 1723 ST-354
CCAMP 476 7 17 2 15 23 3 12 51 ST-443
CCAMP 478 7 17 2 15 23 3 12 51 ST-443
CCAMP 479 7 17 2 15 23 3 12 51 ST-443
CCAMP 480 2 4 5 25 11 3 5 2304 NA
CCAMP 481 2 4 5 25 11 3 5 2304 NA
continua
continuação
CCAMP 672 2 4 5 2 882 1 5 8744 ST-48
CCAMP 674 2 4 5 2 882 1 5 8744 ST-48
CCAMP 675 2 4 5 2 882 1 5 8744 ST-48
CCAMP 1080 8 10 2 2 11 12 6 354 ST-354
CCAMP 1140 9 25 2 10 22 3 6 52 ST-52
CCAMP 1266 2 4 1 4 19 62 5 475 ST-48
CCAMP 1466 55 172 21 49 125 83 51 1962 NA
CCAMP 1493 2 4 5 25 11 203 5 6091 NA
CCAMP 1538 7 17 5 724 11 3 6 8752 ST-353
CCAMP 1555 9 25 5 2 10 11 26 8753 NA
CCAMP 1574 2 4 5 93 11 3 6 1398 ST-658
CCAMP 1013 2 17 5 10 11 3 6 8741 ST-353
CCAMP 1014 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 1015 24 17 2 15 23 12 12 463 ST-443
CCAMP 1016 24 17 2 15 23 12 12 463 ST-443
CCAMP 1018 2 17 5 10 11 3 6 8741 ST-353
CCAMP 1019 2 17 5 10 11 3 6 8741 ST-353
CCAMP 1020 24 17 2 15 23 12 12 463 ST-443
CCAMP 1021 24 17 2 15 23 12 12 463 ST-443
CCAMP 1023 2 17 5 10 11 3 6 8741 ST-353
CCAMP 1024 2 17 5 10 11 3 6 8741 ST-353
CCAMP 1025 24 17 2 15 23 12 12 463 ST-443
CCAMP 1032 2 17 5 10 11 3 6 8741 ST-353
CCAMP 1039 2 1 5 10 2 1 5 1359 ST-21
CCAMP 1047 2 17 5 10 11 3 6 8741 ST-353
CCAMP 1048 2 1 5 10 2 1 5 1359 ST-21
CCAMP 1050 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 1051 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 1052 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 1053 2 17 5 10 11 3 6 8741 ST-353
CCAMP 1054 2 17 5 10 11 3 6 8741 ST-353
CCAMP 1055 2 17 5 10 11 3 6 8741 ST-353
CCAMP 1056 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 1057 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 1058 2 17 5 10 482 3 6 9084 ST-353
CCAMP 1059 2 17 5 10 11 3 6 8741 ST-353
CCAMP 1060 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 1061 462 4 5 10 11 3 46 8751 NA
CCAMP 1518 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 1519 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 1520 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
continua
conclusão
CCAMP 1521 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 1523 7 17 5 2 10 3 6 353 ST-353
CCAMP 764 55 21 2 10 11 37 6 8746 NA
CCAMP 830 7 21 5 2 4 61 44 8748 NA
NA: não associado a nenhum complexo clonal; ST: Sequence Type; CC: Complexo Clonal
Alelos / STs novos: escrito em itálico, negrito e sublinhado
A combinação dos sete alelos para cada uma das 116 linhagens de C. jejuni tipadas por
esta metodologia gerou 46 STs, dos quais 30 já existiam no banco de dados. Dezesseis STs
(8741, 8742, 8743, 8744, 8745, 8746, 8747, 8748, 8749, 8751, 8752, 8753, 9081, 9082, 9083
e 9084) não haviam sido descritos no banco de dados e foram, portanto, descritos pela
primeira vez. Ademais, seis novos alelos pertencentes aos genes aspA (CCAMP 1061), glyA
(CCAMP 1538), pgm (CCAMP 672, CCAMP 674 e CCAMP 675), gltA (Cj 16), tkt (Cj 16) e
glnA (Cj 13) foram obtidos (Tabela 12).
O ST mais prevalente nas linhagens estudadas foi o ST 353, composto por 22 (19%)
linhagens (Cj 06, Cj 07, Cj 15, Cj 20, CCAMP 470, CCAMP 471, CCAMP 488, CCAMP
501, CCAMP 594, CCAMP 1014, CCAMP 1050, CCAMP 1051, CCAMP 1052, CCAMP
1056, CCAMP 1057, CCAMP 1060, CCAMP 1478, CCAMP 1518, CCAMP 1519, CCAMP
1520, CCAMP 1521, CCAMP 1523) isoladas de humanos e alimentos, entre os anos de 1996
e 2015, nos estados de Minas Gerais, São Paulo, Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul. Em
seguida, o ST 8741 compreendeu 12 (10%) linhagens (Cj 22, CCAMP 1013, CCAMP 1018,
CCAMP 1019, CCAMP 1023, CCAMP 1024, CCAMP 1032, CCAMP 1047, CCAMP 1053,
CCAMP 1054, CCAMP 1055 e CCAMP 1059) isoladas de humano e alimentos entre os anos
de 2007 e 2009 nos estados de São Paulo e Minas Gerais. O ST 475 foi composto por sete
linhagens (Cj 23, Cj 24, Cj 31, Cj 33, CCAMP 489, CCAMP 1266 e CCAMP 1497) isoladas
de humanos e animal de 1997 a 2014 nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro.
Os STs 52, 403 e 463 compreenderam seis linhagens cada um, sendo que, o ST 52 foi
composto por linhagens isoladas de humanos e animais de 2003 a 2009 nos estados de São
Paulo e Rio de Janeiro, o ST 403 compreendeu linhagens isoladas de humanos e animais de
1996 a 2004 nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro e o ST 463 foi composto por linhagens
isoladas de alimentos e humano nos anos de 2008 e 2011 nos estados de Minas Gerais e Rio
de Janeiro. O ST 1775 foi composto por cinco linhagens, isoladas de animais e humanos nos
anos de 1997 a 2002 no estado do Rio de Janeiro. Os STs 51, 660, 1398 e 8744
compreenderam três linhagens cada um deles, enquanto que os STs 354, 1359, 2304, 8745 e
8748 foram compostos por duas linhagens. E, finalmente, os STs 21, 45, 50, 332, 469, 607,
791, 1071, 1522, 1723, 1962, 2042, 2086, 2289, 3852, 3997, 6091, 6257, 8742, 8743, 8746,
8747, 8749, 8751, 8752, 8753, 9081, 9082, 9083 e 9084 foram STs únicos e compreenderam,
portanto, somente uma linhagem (Tabela 12).
Dentre os 46 STs obtidos, 34 STs estavam relacionados a algum complexo clonal e 12
STs não estavam relacionados a nenhum complexo clonal. O complexo clonal ST-353 foi o
mais frequente abrangendo sete STs. O complexo clonal ST-354 compreendeu cinco STs. O
complexo clonal ST-21 abrangeu quatro STs e o complexo clonal ST-48 compreendeu três
STs. Já os complexos clonais, ST-42, ST-403, ST-443 e ST-658 compreenderam dois STs
cada um, e por fim, os complexos clonais ST-22, ST-45, ST-49, ST-52, ST-206, ST-464 e ST-
607 apresentaram somente um ST em cada um deles (Tabela 13).
Tabela 13 - Distribuição dos complexos clonais (CC) e sequence types (ST) das 116
linhagens de C. jejuni estudadas de acordo com a fonte de isolamento
Humano Animal Alimentos Ambiente Total
CC ST
n=47 n=35 n=32 n=2 n=116
21 21 1 5
50 1
1359 2
9081 1
22 660 3 3
42 469 1 2
3997 1
45 45 1 1
48 332 1 11
475 6 1
8744 3
49 8749 1 1
52 52 2 4 6
206 2086 1 1
353 353 8 2 12 39
1522 1
8741 1 11
8743 1
8752 1
9083 1
9084 1
354 354 1 1 6
1723 1
3852 1
6257 1
8747 1
continua
conclusão
CC ST
n=47 n=35 n=32 n=2 n=116
403 403 2 4 11
1775 2 3
443 51 3 9
463 1 5
464 8742 1 1
607 607 1 1
658 1398 2 1 5
8745 1 1
NA 791 1 1
NA 1071 1 1
NA 1962 1 1
NA 2042 1 1
NA 2289 1 1
NA 2304 2 2
NA 6091 1 1
NA 8746 1 1
NA 8748 1 1 2
NA 8751 1 1
NA 8753 1 1
NA 9082 1 1
NA: não associado a nenhum complexo clonal; STs novos: escrito em itálico, negrito e sublinhado
A Figura 12 traz o diagrama gerado a partir da análise das 60.830 linhagens de C.

jejuni e C. coli e 9.083 perfis disponíveis no banco de dados até a data de 22 de janeiro de
2018 juntamente com as 116 linhagens de C. jejuni tipadas por MLST no presente estudo, que
encontram-se circuladas em rosa. A Figura 13 traz o diagrama mais detalhado, gerado a partir
das 116 linhagens de C. jejuni tipadas por MLST no presente estudo em conjunto com as
linhagens relacionadas aos STs encontrados.
Figura 12 - Diagrama de similaridade genética gerado pelo programa eBURSTv3 com os dados de todas as 60.830 linhagens de C. jejuni e C.
coli e 9.083 perfis disponíveis no banco de dados
Em rosa estão representados os 46 STs das 116 linhagens de C. jejuni estudadas; azul, STs centrais de complexos clonais; amarelo, são subgrupos centrais;
preto, demais linhagens de C. jejuni e C. coli. OBS: Dados com linhagens depositadas até 22 de janeiro de 2018.
Fonte: o autor
Figura 13 - Diagrama de similaridade genética gerado pelo programa eBURSTv3 com os 46 STs das 116 linhagens de C. jejuni tipadas no
presente estudo, destacadas em rosa, em conjunto com linhagens do banco de dados
Em rosa estão representados os 46 STs das 116 linhagens de C. jejuni estudadas; azul, STs centrais de complexos clonais; amarelo, são subgrupos centrais;
preto, demais linhagens de C. jejuni. OBS: Dados com linhagens depositadas até 22 de janeiro de 2018.
Fonte: o autor
5.10. Análise in silico de genes de resistência e pontos de mutação

A Tabela 14 mostra detalhadamente o perfil dos genes de resistência e pontos de
mutação encontrados nas 116 linhagens de C. jejuni gerado a partir dos dados obtidos pelo
sequenciamento do genoma completo. Noventa e cinco (82%) linhagens apresentaram ao
menos um gene de resistência ou ponto de mutação conhecido e 21 (18%) linhagens não
apresentaram nenhum gene ou ponto de mutação (Apêndice A).
Foram encontrados seis diferentes genes de resistência, sendo eles, blaOXA-61, blaOXA-
184, e blaOXA-449 que conferem resistência a beta-lactâmicos; tet(O) que confere resistência à
tetraciclina; aadE e aph(3`)III que conferem resistência a aminoglicosídeos. Já os pontos de
mutação conhecidos encontrados foram a substituição de um aminoácido treonina por uma
isoleucina na posição 86 do gene gyrA (gyrA p.T86I) e a substituição de uma adenina por uma
guanina na posição 2075 do gene 23S rRNA (23S rRNA A2075G) que conferem resistência a
quinolonas e à eritromicina, respectivamente.
Tabela 14 - Perfil de genes de resistência e pontos de mutação conhecidos em 116 linhagens

de C. jejuni gerado a partir do sequenciamento do genoma completo
Perfil de genes de resistência e pontos de mutação conhecidos (%)
Genes de resistência
n=47 n=35 n=32 n=2 n=116
blaOXA-61 24 (51) 19 (54) 7 (22) 2 (100) 52 (45)
Beta-lactâmicos blaOXA-184 2 (4) 3 (8) 5 (16) ND 10 (9)
blaOXA-449 ND 1 (3) ND ND 1 (1)
Tetraciclina tet(O) 15 (32) 15 (43) 14 (44) ND 44 (38)
aadE 3 (7) ND ND ND 3 (3)
Aminoglicosídeos
aph(3`)III 1 (2) ND 5 (16) ND 6 (5)
Pontos de mutação conhecidos
Quinolonas gyrA p. T86I 18 (38) 16 (45) 20 (62) ND 54 (47)
Eritromicina 23S rRNA A2075G ND ND 4 (12) ND 4 (3)
ND: não detectado
5.10.1. Correlação entre o perfil de resistência fenotípico e genotípico

Dentre os quatro antimicrobianos utilizados nos testes fenotípicos de determinação da
resistência (item 5.4), três deles puderam ser utilizados na comparação com os resultados
genotípicos (item 5.10). Assim, a resistência à tetraciclina, ciprofloxacina e eritromicina foi
comparada à presença ou ausência do gene tet(O) e os pontos de mutação gyrA p. T86I e 23S
rRNA A2075G, respectivamente.
A resistência fenotípica à tetraciclina foi encontrada em 41 linhagens, já o gene tet(O)

foi encontrado em 44 linhagens. Cinquenta e duas linhagens apresentaram resistência
fenotípica à ciprofloxacina e o ponto de mutação gyrA p. T86I foi observado em 54 linhagens.
Seis linhagens foram resistentes à eritromicina fenotipicamente e somente quatro dessas
linhagens apresentaram a mutação 23S rRNA A2075G, que é característica para essa
resistência.
A Tabela 15 traz a porcentagem de correlação encontrada entre os resultados dos testes
fenotípicos e genotípicos para determinação da resistência.
Tabela 15 - Correlação entre os resultados dos testes fenotípicos e genotípicos de resistência

para as 116 linhagens de C. jejuni estudadas
nº de linhagens R Presença de gene de resistência % de
Antimicrobianos
ou S por Etest® ou ponto de mutação correlação
R = 41 R = 40 97,5 (41/40)
Tetraciclina
S = 75 S=4 94,6 (75/71)
R = 52 R = 51 98,1 (52/51)
Ciprofloxacina
S = 64 S=3 96,8 (64/61)
R=6 R=4 66,7 (6/4)
Eritromicina
S = 110 S=0 100 (110/110)
R: resistente; S: sensível
A Tabela 16 mostra as dez linhagens que apresentaram discrepância entre os

resultados fenotípicos e genotípicos de resistência aos antimicrobianos. Especificamente, a
linhagem CCAMP 506 foi resistente fenotipicamente à tetraciclina, porém não apresentou o
gene tet(O). As linhagens Cj 02 e Cj 03 apresentaram resistência fenotípica à eritromicina, no
entanto a mutação pontual 23S rRNA A2075G não foi encontrada em tais linhagens. As
linhagens Cj 06, Cj 16 e CCAMP 1054 apresentaram o ponto de mutação gyrA p.T86I que
determina resistência à ciprofloxacina, porém não foram resistentes a esse antimicrobiano no
teste fenotípico. As linhagens Cj 16, Cj 20, CCAMP 1018 e CCAMP 1048 apresentaram o
gene tet(O), porém foram sensíveis a este antimicrobiano no teste fenotípico. A linhagem
CCAMP 1057 não apresentou o ponto de mutação gyrA p.T86I característico para a
resistência à ciprofloxacina, no entanto foi resistente fenotipicamente à esse antimicrobiano
(Tabela 16).
Tabela 16 - Linhagens sem correlação entre os resultados fenotípicos e genotípicos de

resistência a antimicrobianos
Linhagens Resistência Etest® Genes de resistência Pontos de mutação
CCAMP 506 Cip-Dox-Tet blaOXA-61; aadE gyrA p. T86I
Cj 02 Dox-Tet-Eri blaOXA-61; tet(O) ND
Cj 03 Dox-Tet-Eri tet(O) ND
Cj 06 ND aadE gyrA p. T86I
Cj 16 ND blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I
Cj 20 ND tet(O) ND
CCAMP 1018 Cip tet(O) gyrA p. T86I
CCAMP 1048 Cip blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I
CCAMP 1054 ND ND gyrA p. T86I
CCAMP 1057 Cip ND ND
ND: não detectado; Cip: ciprofloxacina; Tet: tetraciclina; Eri: eritromicina.
Obs: as não correlações estão sublinhadas na tabela.
5.11. Cálculo do índice de discriminação

O índice de discriminação (D) das metodologias de PFGE, sequenciamento da
pequena região variável (short variable region, SVR) do gene flaA e análise do locus CRISPR
por HRMA realizadas para as 121 linhagens de C. jejuni foi 0,982, 0,939 e 0,874,
respectivamente. Já o índice de discriminação para as 116 linhagens de C. jejuni tipadas pela
análise de SNPs no genoma completo e por MLST foi 1,0 e 0,941, respectivamente.
D i s c u s s ã o | 97
6. DISCUSSÃO
6. DISCUSSÃO
C. jejuni é o principal patógeno bacteriano que causa gastroenterite relacionada à
ingestão de alimentos contaminados em vários países (ALLOS, 2001; CDC, 2015; EFSA,
2017a). No entanto, esse patógeno tem sido sub-diagnosticado e pouco estudado no Brasil, e
estudos moleculares que caracterizaram a diversidade genotípica de C. jejuni são escassos no
país (SCARCELLI et al., 2009; MELO et al., 2013; SILVA et al., 2016; FRAZÃO et al.,
2017). A maioria dos estudos realizados no Brasil investigou a ocorrência e o perfil de
resistência a antimicrobianos de isolados desse patógeno (AQUINO et al., 2002; FRANCHIN
et al., 2007; QUETZ et al., 2010; VAZ et al., 2014; KONELL et al., 2014).
O presente estudo utilizou as técnicas de PFGE, sequenciamento da SVR do gene flaA,
análise do locus CRISPR por HRMA, MLST e sequenciamento do genoma completo para
tipar genotipicamente 121 linhagens de C. jejuni isoladas de humanos, animais, alimentos e
ambiente nos estados de São Paulo, Minas Gerais, Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul, entre
os anos de 1996 e 2016. O perfil de resistência foi avaliado pela concentração inibitória
mínima obtida por Etest® frente a quatro antimicrobianos e pela análise in silico de genes de
resistência e pontos de mutação conhecidos. Ademais, a presença de 16 genes de virulência
foi analisada por PCR para verificar o potencial patogênico das linhagens de C. jejuni
estudadas.
Todas as 121 linhagens de C. jejuni estudadas apresentaram a grande maioria dos
genes pesquisados. Os genes flaA, flhA, cadF, docA, cdtA, cdtB, cdtC, iamA, ciaB, sodB,
dnaJ, pldA, racR e csrA foram detectados em todas as linhagens estudadas. O gene wlaN foi
detectado em 15 (12,4%) linhagens e o gene plasmidial virB11 foi encontrado em apenas uma
(0,8%) linhagem (Tabela 8). Assim, a alta frequência da maioria dos 16 genes de virulência
pesquisados evidenciou o potencial patogênico das linhagens de C. jejuni estudadas no
presente estudo (FRAZÃO et al., 2017).
Corroborando com nosso estudo, os mesmos genes de virulência foram detectados em
alta frequência em linhagens de C. jejuni isoladas em outros países (DATTA et al., 2003;
WIECZOREK e OSEK, 2008; BISWAS et al., 2011; KOOLMAN et al., 2015). Em um
estudo realizado por Datta e colaboradores (2003), foram pesquisados 11 genes de virulência
em 111 linhagens de C. jejuni isoladas de humanos, carne de frango, fezes de frango e fezes
bovinas no Japão. Os genes flaA, cadF, cdtA, cdtB e cdtC foram detectados em todas as
linhagens. A maioria das linhagens apresentou os genes dnaJ, ciaB, racR e pldA, enquanto
que os genes wlaN e virB11 foram detectados em baixas taxas. Wieczorek e Osek (2008)
mostraram a alta prevalência dos genes flaA, cdtA, cdtB, cdtC e cadF em 92 linhagens de C.
jejuni isoladas de fezes de humanos e de carcaças de frango na Polônia. No estudo de Biswas

e colaboradores (2011) foi mostrada a alta frequência dos genes dnaJ, pldA, ciaB, docA, sodB,
racR, iamA e cadF em 102 linhagens de C. jejuni isoladas de fezes de humanos e de gado no
Canadá. Koolman et al. (2015) avaliaram a presença de vários genes de virulência em 17
linhagens de C. jejuni isoladas de fezes de frangos e de humanos na Irlanda, e encontraram
que todas as linhagens apresentaram os genes flaA, flhA, cadF, dnaJ, ciaB, sodB, cdtB e cdtC.
O gene virB11 foi detectado em cinco (29%) linhagens e o gene wlaN foi detectado somente
em duas (11%) linhagens.
A baixa detecção do gene virB11 no presente trabalho e nos estudos mencionados
acima pode ser explicada devido ao fato deste gene ser plasmidial, e com sucessivos repiques
e procedimentos laboratoriais, a bactéria possa expulsar e, portanto perder o plasmídio que
contem o gene virB11 (BACON et al., 2000).
No Brasil, Melo e colaboradores (2013) pesquisaram sete genes de virulência em 55
linhagens de C. jejuni isoladas de carcaça de frango. Os genes flaA, pldA, cadF, ciaB e o
complexo CDT foram detectados em 41 (74,5%), 35 (63,6%), 37 (67,3%), 37 (67,3%) e 36
(65,5%) linhagens respectivamente. No estudo de Quetz et al. (2012) foi avaliada a presença
dos genes ciaB, dnaJ, racR, flaA, pldA e cdtABC em 60 linhagens de C. jejuni isoladas de
fezes de humanos no nordeste do país. Os genes ciaB, racR e cdtABC foram encontrados em
57 (95%) linhagens e os genes dnaJ, flaA e pldA foram detectados em 52 (86,7%), 48 (80%) e
27 (45%) linhagens, respectivamente. Os dois estudos mencionados acima realizados no
Brasil apresentaram menores frequências de genes de virulência quando comparado com os
resultados obtidos no presente trabalho.
O uso de antimicrobianos não é usualmente requerido para tratar os casos de
gastroenterite causada por C. jejuni. No entanto, pacientes imunodeprimidos, infecções
sistêmicas ou crônicas e complicações decorrentes da doença necessitam de antibioticoterapia,
sendo que, para esses casos, fluoroquinolonas, macrolídeos e tetraciclina são os
antimicrobianos de escolha para o tratamento (SILVA et al., 2011; DUARTE et al., 2014;
BOLTON, 2015).
De acordo com dados do Sistema de monitoramento nacional de resistência a
antimicrobianos em bactérias entéricas (NARMS), nos Estados Unidos no ano de 2011
ocorreram aproximadamente 310 mil casos de infecção por Campylobacter droga-resistente,
resultando em mais de 13 mil hospitalizações e 120 mortes, sendo que cerca de 25% das
linhagens de Campylobacter foram resistentes à ciprofloxacina (CDC, 2013). Em 17 países da
União Europeia em 2015, foram observadas altas taxas de resistência em linhagens de C.
D i s c u s s ã o | 100
jejuni isoladas de humanos, sendo 60,8% das linhagens resistentes à ciprofloxacina e 44,6%
das linhagens resistentes à tetraciclina (EFSA, 2017b).
O uso indiscriminado de antimicrobianos, particularmente fluoroquinolonas, na
produção animal, está intimamente associado à propagação de linhagens resistentes de
Campylobacter, trazendo potenciais efeitos na segurança alimentar, bem como, na saúde
humana, visto que a ciprofloxacina é um antimicrobiano de escolha quando o tratamento faz-
se necessário (SILVA et al., 2011; SKARP; HANNINEN; RAUTELIN, 2016).
No presente trabalho, dentre as 121 linhagens de C. jejuni estudadas, 68 (56,2%)
linhagens foram resistentes a pelo menos um dos antimicrobianos testados (Tabela 9). A
resistência à ciprofloxacina, doxiciclina, tetraciclina e eritromicina foi observada em 53
(43.8%), 42 (34.7%), 42 (34.7%) e 06 (4.9%) linhagens, respectivamente (Tabela 10).
Estudos realizados em diversos países corroboraram com os nossos resultados e
também relataram uma maior taxa de resistência à ciprofloxacina e à tetraciclina em
comparação a uma menor taxa de resistência à eritromicina em linhagens de C. jejuni
(GOUALIÉ et al., 2012; POLLETT et al., 2012; DUARTE et al., 2014; SIERRA-
ARGUELLO et al., 2016; CAREV et al., 2017). Duarte e colaboradores (2014) estudaram 89
linhagens de C. jejuni isoladas de humanos, animais e alimentos em Portugal e observaram
resistência à ciprofloxacina, tetraciclina e eritromicina em 82, 59 e seis linhagens,
respectivamente. Em 39 linhagens de C. jejuni isoladas de frangos na Costa do Marfim, 15
(38,5%) linhagens foram resistentes à ciprofloxacina e sete (17,9%) linhagens resistentes à
eritromicina (GOUALIÉ et al., 2012). Um estudo realizado em três diferentes regiões do Peru,
além de retratar a resistência à ciprofloxacina em linhagens de C. jejuni isoladas de humanos,
também mostrou o aumento da resistência a este antimicrobiano entre os anos de 2001 a 2010,
que variou de 72,6% a 82,8% em Cusco, 24,1% a 48,9% em Iquitos e 73,1% a 89.8% em
Lima, Peru (POLLETT et al., 2012). Carev e colaboradores (2017) estudaram 153 linhagens
de C. jejuni isoladas de humanos na Croácia e relataram 60% das linhagens resistentes à
ciprofloxacina, 24% de resistência à tetraciclina e uma baixa porcentagem (0.7%) de
linhagens resistentes à eritromicina. No Brasil, Sierra-Arguello e colaboradores (2016)
estudaram 50 linhagens de C. jejuni isoladas de frangos de abatedouros no estado do Rio
Grande do Sul e a porcentagem de resistência observada por esses autores à ciprofloxacina e
eritromicina foi de 94% e 2%, respectivamente.
Assim, a resistência à ciprofloxacina, tetraciclina e doxiciclina encontradas em uma
porcentagem significativa nas linhagens de C. jejuni estudadas no presente estudo, é
preocupante, pois, são os antimicrobianos de escolha para o tratamento da campylobacteriose
D i s c u s s ã o | 101
quando necessário. Ademais, mesmo em uma menor porcentagem, a resistência à eritromicina

também é motivo de preocupação pelo mesmo motivo acima exposto.
A partir dos nossos resultados fenotípicos de resistência aos antimicrobianos
tetraciclina, ciprofloxacina e eritromicina, foi possível estabelecer uma correlação com os
resultados obtidos pela presença ou ausência do gene de resistência tet(O) e os pontos de
mutação gyrA p.T86I e 23S rRNA A2075G (item 5.10.1). Dentre os antimicrobianos
tetraciclina e ciprofloxacina a correlação entre a resistência ou sensibilidade obtida por Etest ®
e a presença ou ausência do gene tet(O) e o ponto de mutação gyrA p.T86I foi maior que
94,6%. Já o resultado de resistência fenotípico para eritromicina e a comparação entre a
presença do ponto de mutação 23S rRNA A2075G foi de 66,7% e 100% para a sensibilidade e
a resistência esse antimicrobiano, respectivamente (Tabela 15). Uma explicação plausível
para a não ocorrência de correlações de 100% entre os resultados fenotípicos e genotípicos
pode ser a presença de outros mecanismos de resistência que não foram aqui pesquisados,
como por exemplo, a bomba de efluxo multidroga cmeABC (LIN; MICHEL; ZHANG, 2002).
Zhao e colaboradores (2016), semelhante ao presente trabalho, também estabeleceram
uma alta correlação entre resultados fenotípicos e genotípicos de resistência a
antimicrobianos. Tais autores avaliaram a resistência entre 32 linhagens de C. jejuni e 82
linhagens de C. coli isoladas de humanos e alimentos nos Estados Unidos e encontraram
correlações de 100% para os antimicrobianos tetraciclina e ciprofloxacina simultaneamente, e
correlações maiores que 95,4% para eritromicina (ZHAO et al., 2016). Dessa forma, o
trabalho acima mencionado demonstra a capacidade do sequenciamento do genoma completo
como uma ferramenta eficaz na determinação do perfil de resistência.
Métodos de tipagem molecular, tais como pulsed field gel electrophoresis (PFGE),
sequenciamento da pequena região variável (SVR) do gene flaA, clustered regularly
interspaced short palindromic repeats (CRISPR), high resolution melting analysis (HRMA),
multilocus sequence typing (MLST), sequenciamento do genoma completo, dentre outros, têm
sido utilizados nos estudos epidemiológicos e na avaliação da diversidade genotípica de
bactérias do gênero Campylobacter (PRICE et al., 2007; AQUINO et al., 2010; AHMED et
al., 2012; WIECZOREK et al., 2013; DUARTE et al., 2014; GOMES et al., 2016; FRAZÃO
et al., 2017; LLARENA; TABOADA; ROSSI, 2017; OHISHI et al., 2017; PEDONESE et al.,
2017; COLLADO et al., 2018).
No presente estudo, a análise da diversidade genotípica das 121 linhagens de C. jejuni
isoladas de humanos (51), animais (35), alimentos (33) e ambiente (02) entre os anos de 1996
e 2016 nos estados de Minas Gerais, São Paulo, Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul, foi
D i s c u s s ã o | 102
verificada através das metodologias de PFGE, sequenciamento de SVR do gene flaA, análise
do locus CRISPR por HRMA, MLST e sequenciamento do genoma completo.
Dentre tantos métodos de tipagem molecular, a técnica de PFGE é atualmente
considerada uma das metodologias mais discriminatórias para a tipagem de linhagens de C.
jejuni (RIBOT et al., 2001; WASSENAAR e NEWELL, 2000; AHMED et al., 2012). No
presente estudo, a metodologia de PFGE revelou 71 PFGE tipos e agrupou as 121 linhagens
de C. jejuni em três grupos, denominados PFGE-A, PFGE-B e PFGE-C, com similaridade
genotípica maior que 46,9%. Apesar desta análise ter demonstrado uma alta diversidade
genômica entre todas as linhagens estudadas, 107 (88.4%) linhagens isoladas de diferentes
fontes, estados e anos de isolamento, apresentaram uma alta similaridade genotípica de mais
de 80% entre elas e foram agrupadas em 21 diferentes subgrupos (Figura 5). Desta forma,
podemos dizer que os resultados obtidos pela técnica de PFGE sugerem que uma possível
contaminação possa ter ocorrido entre linhagens de C. jejuni de origem clínica e não clínica, e
entre linhagens de humanos e animais durante duas décadas no Brasil (FRAZÃO et al., 2017).
Em contraste, alguns estudos realizados em outros países revelaram uma alta
diversidade genotípica entre linhagens de C. jejuni pela metodologia de PFGE (OPORTO et
al., 2011; SCHWEITZER et al. 2011; ABAY et al., 2014; PEDONESE et al., 2017). Oporto e
colaboradores (2011) tiparam 87 linhagens de C. jejuni isoladas de animais nos Países Bascos
entre os anos de 2003 a 2006 e revelaram 55 PFGE tipos com uma diversidade genotípica de
mais de 30%, com apenas dez linhagens apresentando uma similaridade maior que 80%. O
estudo de Schweitzer et al. (2011) mostrou uma diversidade genotípica maior que 50% entre
60 linhagens de C. jejuni isoladas de animais na Hungria. De acordo com Abay e
colaboradores (2014), 115 diferentes perfis foram obtidos de 174 linhagens de C. jejuni
isoladas de humanos e frangos na Turquia com similaridade genotípica maior que 27,1%. No
estudo de Pedonese e colaboradores (2017), 36 linhagens de C. jejuni isoladas de carne de
frango na Itália apresentaram similaridade genotípica maior que 31,3%.
No Brasil há poucos estudos que genotiparam linhagens de C. jejuni por PFGE. Um
recente trabalho feito no sul do país por Silva et al. (2016) mostrou a alta diversidade de 61
linhagens de C. jejuni isoladas de carne de frango, fezes de frango e de humanos. Neste
trabalho, o dendrograma de similaridade genética foi construído com uma tolerância de 3%, e
as linhagens apresentaram similaridade genética maior que 30%, enquanto que a tolerância
utilizada para a construção do dendrograma de similaridade genética com os dados do PGFE
no nosso estudo foi de 1,5%. Ademais, linhagens isoladas de humanos não apresentaram
nenhuma correlação com as linhagens isoladas de frango. Desta forma, o nosso trabalho
D i s c u s s ã o | 103
forneceu informações adicionais sobre a diversidade genotípica de linhagens de C. jejuni

isoladas de humanos, animais, alimentos e ambiente em diferentes estados do Brasil durante o
período de 20 anos (FRAZÃO et al., 2017).
O sequenciamento da SVR do gene flaA foi descrito pela primeira vez por
Meinersmann e colaboradores no ano de 1997 (MEINERSMANN et al., 1997) e desde então,
esta metodologia tem sido utilizada com sucesso para tipar linhagens de C. jejuni no mundo
todo (WASSENAAR e NEWELL, 2000; AHMED et al., 2012). No presente estudo a análise
do dendrograma construído a partir das sequências da SVR do gene flaA das 121 linhagens de
C. jejuni estudadas, agrupou as linhagens em dois principais grupos, denominados SVR-A e
SVR-B, exibindo similaridade de 80,9% entre eles. SVR-A agrupou 20 linhagens com
similaridade entre elas ≥88,0%, isoladas de humanos, animais e ambiente, nos estados de
Minas Gerais, São Paulo e Rio de Janeiro entre os anos de 1999 e 2016. SVR-B compreendeu
101 linhagens com similaridade entre elas acima de 90,6%, isoladas de humanos, animais,
alimentos e ambiente entre os anos de 1996 e 2015 nos estados de Minas Gerais, São Paulo,
Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul (Figura 6). Dessa forma, a partir da análise do
dendrograma da SVR do gene flaA, e a alta similaridade genética de linhagens isoladas de
diferentes fontes, anos e locais, podemos sugerir, assim como já foi feito com os resultados do
PFGE, que uma possível contaminação tenha ocorrido entre fontes clínicas e não clínicas e
entre humanos e animais, ao longo de 20 anos no Brasil (FRAZÃO et al., 2017).
As sequências da SVR do gene flaA foram depositadas no banco de dados disponível
online (http://pubmlst.org/campylobacter) e a cada sequência obtida foi dado um número de
alelo, o que permitiu a comparação das linhagens estudadas com os alelos descritos no banco
de dados. Foram obtidos, no presente estudo, 40 diferentes flaA alelos, sendo que destes, dois
alelos não haviam sido previamente descritos no banco de dados (alelos 1661 e XXX, este
último aguardando o envio do número do alelo pelo banco de dados). Os alelos mais
frequentemente detectados foram os alelos 57, 49 e 45, com 19, 14 e 13 linhagens,
respectivamente. O alelo 57 compreendeu 19 linhagens isoladas de humanos (3), animais (4) e
alimentos (12), dentre os anos de 2003 a 2009 nos estados de São Paulo, Minas Gerais e Rio
de Janeiro. O alelo 49 foi composto por 14 linhagens isoladas de humanos (9), animais (4) e
alimentos (1), dentre os anos de 1997 a 2014 nos estados de São Paulo, Minas Gerais e Rio de
Janeiro. O alelo 45 compreendeu 13 linhagens isoladas de humanos (6) e alimentos (7), dentre
os anos de 1996 a 2010 nos estados de São Paulo, Minas Gerais e Rio de Janeiro. Já os alelos
2, 5, 9, 11, 22, 23, 24, 36, 48, 54, 67, 149,153, 162, 198, 239, 260, 975, 1336, 1379, 1440,
1651, 1661 e XXX foram detectados em apenas uma linhagem (Figura 6).
D i s c u s s ã o | 104
Em estudos realizados em outros países, os alelos mais frequentemente observados

foram diferentes dos alelos mais frequentes obtidos no presente estudo (SAILS et al., 2003;
CLARK et al., 2005; WASSENAAR et al., 2009; GIACOMELLI et al., 2012; DUARTE et
al., 2014; MAROTTA et al., 2015) . Sails e colaboradores (2003) estudaram 47 linhagens de
C. jejuni isoladas de humanos nos Estados Unidos, e os alelos mais prevalentes foram os
alelos 3 e 6 com oito e sete linhagens, respectivamente. Giacomelli et al. (2012) estudou 30
linhagens de C. jejuni isoladas de frangos de corte na Itália, e o alelo 36 foi o mais frequente.
No Canadá, 81 linhagens de C. jejuni isoladas de humanos, frango e bovinos apresentaram o
alelo 36 como o mais frequentemente isolado (CLARK et al., 2005). Um estudo feito em
Portugal (DUARTE et al., 2014) com 89 linhagens de C. jejuni isoladas de animais, alimentos
e humanos, entre os anos de 2009 e 2012 revelou o alelo 34 como o mais frequente,
compreendendo 10 linhagens. Wassenaar e colaboradores (2009) investigaram a diversidade
genotípica de 293 linhagens de C. jejuni isoladas de humanos e aves nos Países Bascos,
Noruega e Islândia e observaram que os alelos 36, 32 e 34 foram os mais prevalentes com 25,
20 e 19 linhagens, respectivamente. Marotta et al. (2015) avaliou a diversidade de 693
linhagens de C. jejuni isoladas de carne de frango em fazendas na Itália e observou que os
alelos 36, 222 e 1638 foram os mais frequentemente detectados com 124, 115 e 90 linhagens,
respectivamente.
Assim como foi observado pela técnica de PFGE, a análise do dendrograma da SVR
do gene flaA, bem como a obtenção do mesmo flaA alelo para linhagens isoladas de diferentes
fontes, anos e locais, sugere que uma possível contaminação tenha ocorrido entre fontes
clínicas e não clínicas, ao longo de 20 anos no Brasil (FRAZÃO et al., 2017).
De acordo com os dados disponíveis na literatura, o presente trabalho é o primeiro
estudo realizado no Brasil que utilizou a técnica de sequenciamento da SVR do gene flaA para
tipar molecularmente linhagens de C. jejuni isoladas no período de 20 anos de diferentes
fontes no país (FRAZÃO et al., 2017). Pelo nosso conhecimento, um único trabalho tipou
linhagens de C. jejuni isoladas de humanos e animais no Brasil por RFLP (restriction
fragment length polymorphism) do gene flaA utilizando três diferentes endonucleases
(SCARCELLI et al., 2009). Dessa maneira, o presente trabalho foi pioneiro em fornecer
dados inéditos sobre a diversidade de linhagens de C. jejuni isoladas no Brasil e tipadas pelo
sequenciamento da SVR do gene flaA.
A técnica de análise do locus CRISPR por HRMA em linhagens de C. jejuni foi
descrita pela primeira vez por Price e colaboradores (2007). No referido estudo, o locus
CRISPR de 29 linhagens de C. jejuni foi analisado por HRMA e oito perfis de melting
D i s c u s s ã o | 105
distintos foram identificados em isolados contendo uma única sequência repetida, sendo que
perfis contendo sequências idênticas foram indistinguíveis. Dessa forma, esses autores
demonstraram a capacidade da técnica de HRMA em discriminar em perfis iguais ou
diferentes os genótipos do CRISPR (PRICE et al., 2007).
No nosso estudo foram obtidos 23 diferentes variantes pela análise do locus CRISPR
por HRMA para as 121 linhagens de C. jejuni estudadas. Algumas variantes agruparam
linhagens isoladas de diferentes fontes. A variante V3, a mais prevalente, compreendeu 36
linhagens isoladas de humanos, animais, alimentos e ambiente, dentre os anos de 1996 a
2015, nos estados de Minas Gerais, São Paulo, Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul. A
variante V5, a segunda mais prevalente, agrupou 17 linhagens isoladas de humanos e animais,
dentre os anos de 1996 a 2016, nos estados de Minas Gerais, São Paulo e Rio de Janeiro. A
variante V4 agrupou linhagens isoladas de ambiente, animais e humanos, as variantes V11 e
V14 compreenderam linhagens isoladas de humanos, animais e alimentos, e as variantes V5,
V6, V7, V8, V12 e V16 agruparam linhagens isoladas de humanos e animais. Nove variantes
apresentaram perfis únicos (Tabela 11 e Figura 10). Apesar desta técnica ter apresentado o
menor índice de discriminação (0,874) dentre todas as técnicas de tipagem realizadas no
presente estudo (item 5.11), os resultados aqui obtidos, assim como foi observado pelas
técnicas de PFGE e sequenciamento da SVR do gene flaA, sugerem que uma possível
contaminação possa ter ocorrido entre fontes clínicas e não clínicas e entre humanos e
animais, ao longo de 20 anos no Brasil, visto que algumas variantes agruparam linhagens
isoladas de diferentes fontes, anos e locais de isolamento (Tabela 11).
Vale mencionar que não houve uma concordância na distribuição das linhagens de C.
jejuni estudadas entre os PFGE tipos, flaA alelos e CRISPR tipos obtidos, ou seja, como pode
ser observado na Figura 5, o mesmo flaA alelo e/ou mesmo CRISPR tipo pertenceram a
diferentes PFGE tipos (Apêndice C).
Com o advento do sequenciamento de nova geração, a pesquisa genômica tem sido
revolucionada através da possibilidade do sequenciamento de genomas inteiros de diversos
organismos (GILMOUR et al., 2013; VAN DIJK et al., 2014). Assim, a metodologia de
sequenciamento do genoma completo vem sendo utilizada com sucesso em linhagens de C.
jejuni, tanto na investigação de surtos, quanto em estudos filogenéticos para avaliar a
diversidade genética dessa espécie bacteriana (BIGGS et al., 2011; REVEZ et al., 2014;
CLARK et al., 2016; DEARLOVE et al., 2016; CODY et al., 2017; LAHTI et al., 2017;
LLARENA; TABOADA; ROSSI, 2017).
D i s c u s s ã o | 106
No presente estudo, a análise dos SNPs gerada através do sequenciamento do genoma

completo das 116 linhagens de C. jejuni dividiu as linhagens em dois grupos denominados
SNP-A e SNP-B (Figura 11). No grupo SNP-A ficaram agrupadas 97 (83%) linhagens
isoladas de humanos, animais, alimentos e ambiente, entre os anos de 1996 a 2016 nos
estados de São Paulo, Minas Gerais e Rio de Janeiro. O grupo SNP-A foi subdividido em dois
subgrupos denominados SNP-A1 e SNP-A2, sendo que o subgrupo SNP-A1 compreendeu 30
linhagens, isoladas de humanos (18), animal (9) e alimentos (3), entre os anos de 1997 e 2014,
nos estados de Minas Gerais, São Paulo e Rio de Janeiro e o subgrupo SNP-A2 agrupou 63
linhagens, isoladas de humanos (18), animal (15), alimentos (29) e ambiente (1), entre os anos
de 1996 a 2015, nos estados de Minas Gerais, São Paulo, Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul.
O grupo SNP-B agrupou 19 (17%) linhagens, sendo 10 linhagens isoladas de humanos e nove
isoladas de animais, entre os anos de 1996 a 2011 nos estados de São Paulo e Rio de Janeiro
(Figura 11).
Similarmente ao que foi observado nos resultados das outras técnicas moleculares
utilizadas no presente trabalho, algumas linhagens de diferentes fontes, anos e locais de
isolamento se mostraram bem relacionadas pela análise de SNPs, o que, como já foi
mencionado e observado pelas outras técnicas, sugere que uma possível contaminação tenha
ocorrido entre fontes clínicas e não clínicas e entre humanos e animais, ao longo de 20 anos
no Brasil. Ademais, foi possível notar que esta técnica foi capaz de diferenciar linhagens que
foram pertencentes ao mesmo ST, sendo assim capaz de diferenciar todas as 116 linhagens de
C. jejuni (Figura 11 e Apêndice C).
A metodologia de sequenciamento do genoma completo tem sido utilizada com várias
abordagens em linhagens de C. jejuni (ZHAO et al., 2016; CANTERO et al., 2017; LAHTI et
al., 2017). Por exemplo, Lahti e colaboradores (2017) utilizaram as técnicas de PFGE e a
análise de SNPs pelo sequenciamento do genoma completo e puderam traçar a rota de
contaminação de um surto alimentar causado por C. jejuni na Suécia. Além disso, este estudo
realizado por Lahti et al. (2017) conseguiu validar os resultados encontrados no PFGE com os
resultados obtidos pelo sequenciamento do genoma completo das linhagens, mostrando que
ambas as técnicas podem ser utilizadas para tal finalidade.
Já Zhao et al. (2016) utilizaram os dados do genoma completo de 32 linhagens de C.
jejuni e 82 linhagens de C. coli isoladas de humanos e alimentos nos Estados Unidos e
encontraram altas correlações na comparação entre os resultados fenotípicos e genotípicos de
resistência a diferentes antimicrobianos. Cantero e colaboradores (2017) pesquisaram diversos
genes de virulência e de resistência em 12 linhagens de C. jejuni e quatro linhagens de C. coli
D i s c u s s ã o | 107
isoladas de cinco diferentes fazendas de frango na Espanha e demonstraram o valioso poder

do sequenciamento do genoma completo na investigação da virulência, clonalidade e perfil de
resistência em Campylobacter.
A metodologia de MLST apresenta grandes vantagens quando comparada às técnicas
de genotipagem descritas anteriormente, como a alta reprodutibilidade, a disponibilidade de
um banco de dados público online (http://pubmlst.org/campylobacter) e uma nomenclatura
comum que possibilita a comparação de resultados obtidos entre estudos realizados em
diferentes locais do mundo todo (MAIDEN et al., 1998). Assim, o MLST vem sendo
amplamente utilizado em estudos de epidemiologia molecular de linhagens de Campylobacter
spp. (KARENLAMPI et al., 2007; SHEPPARD et al., 2009; BEHRINGER; MILLER;
OYARZABAL, 2011; de HAAN et al., 2013; DUARTE et al., 2014; LLARENA et al., 2015;
COLLADO et al., 2018).
No presente estudo a técnica de MLST foi realizada para 116 linhagens de C. jejuni
(sendo as 121 linhagens listadas na Tabela 1 com exceção das cinco linhagens Cj 14, Cj 21,
Cj 28, CCAMP 698 e CCAMP 1065). Essa técnica foi realizada a partir da submissão dos
assemblies que foram obtidos pela metodologia do sequenciamento do genoma completo no
banco de dados disponível online.
Dessa forma, a técnica de MLST para as 116 linhagens de C. jejuni tipadas, gerou 46
STs, dos quais 30 STs já existiam no banco de dados e 16 STs não haviam sido descritos no
banco de dados e foram, portanto, descritos pela primeira vez. Ademais, seis novos alelos
pertencentes aos genes aspA, glyA, pgm, gltA, tkt e glnA foram obtidos (Tabela 12). Algumas
linhagens isoladas de diferentes fontes, anos e locais, pertenceram ao mesmo ST. Por
exemplo, os ST 353, ST 463, ST 8741 e ST 8748 compreenderam linhagens isoladas de
humanos, animal e de alimentos, e os ST 52, ST 475, ST 1398, ST 1775, entre outros,
abrigaram linhagens isoladas de humanos e de animais (Tabelas 12 e 13). Esses achados,
portanto corroboram com os dados obtidos pelo PFGE, sequenciamento da SVR do gene flaA
e análise do locus CRISPR por HRMA e reforçam a hipótese de que uma possível
contaminação possa ter ocorrido entre linhagens de fontes clínicas e não clínicas e entre
humanos e animais, ao longo de 20 anos no Brasil.
O Brasil produziu, no ano de 2016, aproximadamente 13 milhões de toneladas de
carne de frango e exportou mais de quatro milhões de toneladas. Esses valores ranquearam o
Brasil como o maior exportador de carne de frango desde 2004 e o segundo maior produtor,
sendo ultrapassado somente pelos Estados Unidos (ABPA, 2017). Dentre os maiores
importadores estão Arábia Saudita, África do Sul, Turquia e alguns países da União Europeia
D i s c u s s ã o | 108
(ABPA, 2017). A partir desses dados, e do compartilhamento de STs compreendendo

linhagens isoladas de carne de frango e humanos no presente estudo e linhagens isoladas de
várias fontes em outros países do mundo, de acordo com o disposto no banco de dados, faz-se
necessário um maior monitoramento na tentativa de se evitar contaminação e assim garantir
uma maior segurança alimentar.
Os dados extraídos no banco de dados de MLST disponível online mostraram que o
ST 21, ST 45 e ST 50 são os três STs com maior número de linhagens. O ST 21 possui 3.416
linhagens de C. jejuni isoladas dentre os anos de 1991 a 2017, de diversas fontes e de países
como Reino Unido, Austrália, Holanda, Espanha, Estados Unidos, dentre outros. O ST 45
possui 3.084 linhagens de C. jejuni isoladas de diversas fontes, entre os anos de 1982 a 2017
no Reino Unido, Austrália, Estados Unidos, Holanda, Alemanha, Tailândia, França, dentre
outros países. O ST 50 apresenta 2.898 linhagens de C. jejuni depositadas dentre os anos de
1984 a 2017 de origens diversas e isoladas no Reino Unido, Austrália, Canadá, Bélgica,
Alemanha, Estados Unidos, Grécia, dentre outros. Os três STs acima citados estão dentre os
46 STs encontrados nas 116 linhagens de C. jejuni do presente estudo, porém, cada um deles
apresentou somente uma linhagem desse estudo (Tabela 13).
Ademais, pelos resultados obtidos no presente estudo pela metodologia de MLST,
podemos observar que não houve a predominância de um ST dentre as linhagens de C. jejuni
estudadas e isoladas no Brasil (Tabelas 12 e 13). Em contraste, um estudo feito na Finlândia,
por Llarena e colaboradores (2015), demonstrou uma grande prevalência do ST 45 em 380
linhagens de C. jejuni isoladas de frango. Ohishi et al. (2017) estudaram 106 linhagens de C.
jejuni isoladas de humanos no Japão e obtiveram um grande número de linhagens (36%)
pertencentes ao complexo ST-21, em especial os STs 19, 50 e 4526. Por outro lado, Duarte et
al. (2014) estudaram 89 linhagens de C. jejuni isoladas de humanos, animais e alimentos e
obtiveram 48 STs, sendo que somente os STs 51, 52, 354, 475 e 607 coincidiram com os STs
obtidos no presente trabalho.
Quanto à metodologia de MLST, vale ainda mencionar que o nosso grupo de pesquisa
foi o primeiro a depositar no banco de dados disponível online linhagens de C. jejuni que
foram isoladas de diversas fontes e diferentes locais e anos no Brasil.
Em relação ao índice de discriminação, as técnicas de análise de SNPs no genoma
completo, PFGE, sequenciamento da SVR do gene flaA, análise do locus CRISPR por HRMA
e MLST apresentaram os valores de 1,0; 0,982; 0,939; 0,874 e 0,941, respectivamente (item
5.11). Dessa forma, tomando como base os valores do índice de discriminação, podemos
considerar que dentre essas cinco metodologias de tipagem molecular bacteriana utilizadas no
D i s c u s s ã o | 109
presente estudo, a técnica de análise de SNPs no genoma completo foi a mais adequada em
discriminar as linhagens de C. jejuni estudadas. Porém, conjuntamente com tal técnica, e
também pelo alto valor do índice de discriminação e pelas evidências epidemiológicas
concordantes, podemos considerar a técnica de PFGE também muito eficiente em discriminar
as linhagens de C. jejuni do presente estudo.
Similar ao nosso resultado do índice de discriminação obtido para a técnica de PFGE,
Sails e colaboradores (2003) tiparam 47 linhagens de C. jejuni isoladas de humanos usando
PFGE, sequenciamento da SVR do gene flaA e MLST e observaram que o PFGE apresentou o
melhor índice de discriminação dentre as técnicas utilizadas. Oporto et al. (2011) usaram
PFGE, MLST e PCR-RFLP do gene flaA para tipar 71 linhagens de C. jejuni isoladas de
humanos, e observaram que o PFGE foi a técnica mais discriminatória. O mesmo resultado
foi descrito por Behringer e colaboradores (2011) que tiparam 49 linhagens de C. jejuni
isoladas de frangos nos Estados Unidos, e mostraram que o PFGE foi a técnica com o maior
poder discriminatório em comparação com PCR-RFLP do gene flaA, MLST e REP-PCR.
A alta frequência da maioria dos 16 genes de virulência pesquisados evidenciou o
potencial patogênico das linhagens de C. jejuni estudadas no presente estudo. A resistência
aos antimicrobianos de primeira escolha para o tratamento da campylobacteriose em algumas
linhagens de C. jejuni estudadas no presente estudo é preocupante, podendo levar à falha
terapêutica quando o tratamento da campylobacteriose é necessário. Os resultados obtidos
pelas cinco metodologias de tipagem molecular utilizadas sugerem que uma possível
contaminação possa ter ocorrido entre fontes clínicas e não clínicas e entre humanos e
animais, ao longo de 20 anos no Brasil. Pelos resultados obtidos no presente estudo por
MLST, podemos ainda observar que não houve a predominância de um ST dentre as
linhagens de C. jejuni estudadas e isoladas no Brasil. Ademais, a análise de SNPs no genoma
completo sequenciado foi capaz de diferenciar linhagens pertencentes ao mesmo ST. Pelo
índice de discriminação, as metodologias de análise de SNPs no genoma completo e PFGE,
em comparação com as outras técnicas de tipagem, foram as mais eficientes em discriminar as
linhagens de C. jejuni do presente estudo.
Tomados em conjunto, os resultados obtidos no presente estudo possibilitaram ampliar
os conhecimentos sobre o potencial patogênico, o perfil de resistência frente a diferentes
antimicrobianos, a epidemiologia e a diversidade genética de linhagens de C. jejuni isoladas
de humanos, animais, alimentos e ambiente, entre os anos de 1996 e 2016 no Brasil.
C o n c l u s õ e s | 110
7. CONCLUSÕES
C o n c l u s õ e s | 111
7. CONCLUSÕES
 O potencial patogênico das linhagens de C. jejuni estudadas foi evidenciado devido à alta
frequência da maioria dos genes de virulência pesquisados;
 A resistência à ciprofloxacina, tetraciclina e doxiciclina encontrada em uma porcentagem

significativa das linhagens de C. jejuni estudadas é motivo de preocupação, pois, estes são
os antimicrobianos de escolha para o tratamento da campylobacteriose;
 Os resultados de PFGE, sequenciamento da SVR do gene flaA, análise do locus CRISPR

por HRMA, MLST e análise de SNPs no genoma completo demonstraram uma alta
similaridade genética entre algumas linhagens de C. jejuni estudadas, e, portanto, sugerem
que uma possível contaminação possa ter ocorrido entre fontes clínicas e não clínicas e
entre humanos e animais, ao longo de 20 anos no Brasil;
 Pela análise dos alelos obtidos a partir do sequenciamento da SVR do gene flaA podemos
concluir que os alelos prevalentes obtidos nas linhagens de C. jejuni do presente estudo são
diferentes daqueles encontrados em outros países;
 Os dados obtidos pelos resultados do MLST demonstraram que não houve a

predominância de um ST dentre as linhagens de C. jejuni estudadas e isoladas no Brasil e
que as mesmas possuem usualmente uma grande diversidade entre si e em comparação
com as linhagens isoladas em diferentes locais do mundo;
 As metodologias de análise de SNPs no genoma completo e PFGE foram as mais

eficientes, dentre as metodologias de tipagem molecular, em diferenciar as linhagens de C.
jejuni estudadas, de acordo com o valor do índice de discriminação;
 Todas as técnicas de tipagem molecular utilizadas no presente estudo conseguiram

fornecer informações epidemiológicas concordantes e consistentes;
 A alta correlação encontrada entre os resultados de perfil de resistência fenotípico e a

análise in silico de genes de resistência e pontos de mutação para os antibióticos
ciprofloxacina, tetraciclina e eritromicina demonstra a capacidade do sequenciamento do
genoma completo como uma ferramenta eficaz na determinação do perfil de resistência.
R e f e r ê n c i a s b i b l i o g r á f i c a s | 112
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A p ê n d i c e s | 131
APÊNDICES
A p ê n d i c e s | 132
Apêndice A - Genes de resistência, pontos de mutação e concentração inibitória mínima (CIM) frente a antibióticos das 121 linhagens de C.
jejuni estudadas
CIM (µg/mL)
Resistência
Linhagens Genes de resistência Pontos de mutação conhecidos Cip Dox Tet Eri
Etest®
(R≥4) (R≥8) (R≥16) (R≥32)
CCAMP 487 blaOXA-61 ND ND 0,064 0,047 0,125 0,125
CCAMP 488 ND ND ND 0,25 0,125 0,094 0,25
CCAMP 489 blaOXA-61; tet(O) ND Dox-Tet 0,094 8 32 0,38
CCAMP 493 ND ND ND 0,125 0,094 0,25 0,5
CCAMP 497 ND ND ND 0,064 0,25 0,19 1,5
CCAMP 501 ND gyrA p. T86I Cip ≥32 0,5 2 2
CCAMP 506 blaOXA-61; aadE gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet ≥32 12 64 0,75
CCAMP 512 blaOXA-61 gyrA p. T86I Cip 12 1 0,25 3
CCAMP 594 tet(O) ND Dox-Tet 0,125 8 48 0,25
Cj 01 ND ND ND 0,25 0,125 0,064 1
Cj 02 blaOXA-61; tet(O) ND Dox-Tet-Eri 0,64 8 32 38
CCAMP 696 ND ND ND 0,125 0,064 0,25 0,75
Cj 03 tet(O) ND Dox-Tet-Eri 0,125 16 ≥256 38
Cj 04 blaOXA-61 ND ND 0,25 0,125 0,125 0,75
Cj 06 aadE gyrA p. T86I ND 0,94 1 4 2
Cj 07 aadE gyrA p. T86I Cip ≥32 0,125 0,25 1
Cj 09 blaOXA-61; tet(O) ND Dox-Tet 0,064 8 24 0,25
Cj 11 tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet ≥32 8 32 0,75
Cj 12 blaOXA-61 gyrA p. T86I Cip ≥32 0,064 0,25 0,25
Cj 13 tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet ≥32 8 64 0,25
CCAMP 601 blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet ≥32 32 ≥256 1
CCAMP 698 NR NR ND 0,19 0,125 0,5 1
CCAMP 699 blaOXA-61 ND ND 0,064 0,094 0,19 1
CCAMP 700 ND ND ND 0,125 0,125 0,125 0,75
continua
A p ê n d i c e s | 133
continuação
CIM (µg/mL)
Resistência
Etest®
(R≥4) (R≥8) (R≥16) (R≥32)
Cj 14 NR NR ND 0,094 2 0,047 1,5
Cj 15 tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet ≥32 12 ≥256 0,25
Cj 16 blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I ND 0,125 0,064 0,125 0,125
Cj 17 blaOXA-184; aph(3`)III ND ND 0,125 1 4 0,75
Cj 18 ND ND ND 0,064 0,064 0,125 0,25
Cj 19 ND gyrA p. T86I Cip ≥32 0,064 0,064 0,25
Cj 20 tet(O) ND ND 0,125 0,032 0,064 2
Cj 21 NR NR ND 0,125 0,064 0,25 4
Cj 22 tet(O) ND Dox-Tet 0,125 8 32 1
Cj 23 blaOXA-61 ND ND 0,38 0,25 0,25 2
Cj 24 blaOXA-61 ND ND 0,5 0,5 0,75 2
Cj 25 ND gyrA p. T86I Cip ≥32 0,064 0,19 0,75
Cj 26 blaOXA-61 ND ND 0,125 0,064 0,125 1
Cj 27 blaOXA-61 ND ND 0,25 0,125 0,125 1,5
Cj 28 NR NR Cip-Dox-Tet ≥32 12 ≥256 1,5
Cj 29 blaOXA-61 ND ND 0,25 0,25 0,38 0,75
Cj 30 blaOXA-61 ND ND 0,125 0,094 0,25 0,38
Cj 31 blaOXA-61 ND ND 0,125 0,094 0,125 0,75
CCAMP 1478 ND gyrA p. T86I Cip ≥32 0,064 0,19 0,38
CCAMP 1491 blaOXA-184; tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet ≥32 12 ≥256 0,5
Cj 32 blaOXA-61 ND ND 0,125 1 3 8
Cj 33 blaOXA-61 ND ND 0,125 0,064 0,125 0,5
CCAMP 1497 blaOXA-61 gyrA p. T86I Cip ≥32 0,125 0,38 1
Cj 34 ND gyrA p. T86I Cip ≥32 1 0,5 1
continua
A p ê n d i c e s | 134
continuação
CIM (µg/mL)
Resistência
Etest®
(R≥4) (R≥8) (R≥16) (R≥32)
CCAMP 770 ND ND ND 0,125 0,094 0,125 1,5
CCAMP 621 ND ND ND 0,19 0,125 0,094 1,5
CCAMP 687 ND ND ND 0,125 0,064 0,25 0,75
CCAMP 689 ND ND ND 0,19 0,125 0,5 1
CCAMP 789 ND ND ND 0,094 0,125 0,125 0,25
CCAMP 845 ND ND ND 0,047 0,064 0,19 0,75
CCAMP 159 ND ND ND 0,094 0,064 0,125 0,25
CCAMP 470 tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet ≥32 12 ≥256 0,5
CCAMP 471 tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet ≥32 16 ≥256 0,75
CCAMP 472 tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet ≥32 24 96 0,75
CCAMP 481 blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet ≥32 32 128 0,75
continua
A p ê n d i c e s | 135
continuação
CIM (µg/mL)
Resistência
Etest®
(R≥4) (R≥8) (R≥16) (R≥32)
CCAMP 1080 blaOXA-61 gyrA p. T86I Cip ≥32 0,25 1,5 1,5
CCAMP 1140 blaOXA-61 gyrA p. T86I Cip ≥32 0,064 0,032 0,125
CCAMP 1493 blaOXA-61 gyrA p. T86I Cip ≥32 0,25 0,25 1
CCAMP 1538 tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet ≥32 ≥256 ≥256 0,5
CCAMP 1013 ND gyrA p. T86I Cip 8 0,023 0,032 0,25
CCAMP 1014 ND ND ND 0,19 0,064 0,125 0,5
CCAMP 1015 blaOXA-184; tet(O) ND Dox-Tet 0,19 32 ≥256 1,5
CCAMP 1018 tet(O) gyrA p. T86I Cip ≥32 0,032 0,125 0,5
CCAMP 1025 blaOXA-184; tet(O) ND Dox-Tet 0,25 32 ≥256 2
CCAMP 1047 ND gyrA p. T86I Cip ≥32 0,032 0,19 1
CCAMP 1048 blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I Cip ≥32 0,032 0,047 0,25
CCAMP 1050 ND ND ND 0,125 0,064 0,19 0,5
CCAMP 1051 ND ND ND 0,19 0,25 0,125 6
continua
A p ê n d i c e s | 136
conclusão
CIM (µg/mL)
Resistência
Etest®
(R≥4) (R≥8) (R≥16) (R≥32)
CCAMP 1052 ND ND ND 0,094 0,064 0,19 1
CCAMP 1054 ND gyrA p. T86I ND 0,125 0,25 1,5 0,5
CCAMP 1056 ND ND ND 0,064 0,094 0,25 0,5
CCAMP 1057 ND ND Cip ≥32 0,064 0,125 0,25
CCAMP 1059 ND gyrA p. T86I Cip ≥32 0,032 0,19 1
CCAMP 1060 ND ND ND 0,125 0,064 0,25 0,5
CCAMP 1065 NR NR ND 0,25 0,064 1 2
CCAMP 1518 blaOXA-61; tet(O); aph(3`)III gyrA p. T86I; 23S rRNA A2075G Cip-Dox-Tet-Eri ≥32 12 ≥256 ≥256
CCAMP 1519 blaOXA-61; tet(O); aph(3`)III gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet ≥32 32 ≥256 1
CCAMP 1520 tet(O); aph(3`)III gyrA p. T86I; 23S rRNA A2075G Cip-Dox-Tet-Eri ≥32 24 ≥256 ≥256
ND: não detectado, NR: não realizado, R: resistente, Cip: ciprofloxacina, Dox: doxiciclina, Tet: tetraciclina, Eri: eritromicina; CIM: Concentração Inibitória
Mínima
A p ê n d i c e s | 137
Apêndice B - Características dos assemblies oriundos do sequenciamento do genoma completo de 116* linhagens de C. jejuni
Linhagens No. Contigs Menor Contig Maior Contig Genoma (Mb) No. genes C+G (%) No. Reads Cobertura
CCAMP 487 63 160 302.741 1.685.038 1.773 30,2 1.362.580 117X
CCAMP 488 109 151 189.893 1.683.207 1.770 30,3 798.098 66X
CCAMP 489 34 201 324.951 1.685.408 1.765 30,4 1.176.706 95X
CCAMP 493 38 326 204.679 1.611.209 1.690 30,5 1.226.474 101X
CCAMP 497 116 151 172.286 1.716.424 1.808 30,2 925.700 77X
CCAMP 501 49 242 288.652 1.689.341 1.767 30,3 1.843.828 163X
CCAMP 506 53 187 356.086 1.687.457 1.784 30,5 1.054.076 90X
CCAMP 512 35 200 468.372 1.611.698 1.686 30,4 1.854.156 163X
CCAMP 588 65 151 477.421 1.634.101 1.716 30,5 3.563.972 317X
CCAMP 594 80 149 299.118 1.748.723 1.836 30,2 3.720.046 330X
Cj 01 49 220 483.434 1.678.925 1.765 30,2 2.445.034 209X
Cj 02 42 208 193.839 1.652.297 1.730 30,4 1.253.008 96X
CCAMP 696 83 143 302.102 1.728.963 1.801 30,2 4.617.776 410X
Cj 03 48 210 226.273 1.668.078 1.749 30,4 2.395.764 209X
Cj 04 51 210 303.613 1.707.150 1.824 30,5 2.057.066 179X
Cj 06 55 215 345.375 1.804.215 1.923 30,3 3.629.784 306X
Cj 07 49 147 345.085 1.802.410 1.917 30,3 2.664.666 216X
Cj 09 46 201 335.215 1.687.215 1.779 30,3 2.583.932 220X
Cj 11 68 203 340.554 1.806.596 1.910 30,1 3.149.224 263X
Cj 12 48 228 355.927 1.734.641 1.830 30,2 3.119.752 269X
Cj 13 27 235 463.564 1.702.285 1.814 30,4 2.746.920 237X
CCAMP 601 58 151 278.637 1.768.624 1.865 30,2 4.563.180 401X
CCAMP 699 244 137 134.214 1.778.240 1.898 30,4 1.653.092 240X
CCAMP 700 89 175 235.670 1.783.490 1.860 30,2 2.619.260 233X
Cj 15 48 208 309.710 1.761.819 1.872 30,3 2.716.856 239X
continua
A p ê n d i c e s | 138
continuação
Cj 16 77 211 319.599 1.803.006 1.902 30,1 3.155.320 275X
Cj 17 118 151 300.720 1.769.104 1.858 30,4 1.859.748 154X
CCAMP 612 61 173 373.525 1.694.670 1.783 30,5 3.787.078 337X
CCAMP 678 54 112 278.315 1.767.906 1.866 30,3 3.857.704 343X
Cj 18 47 208 302.747 1.771.462 1.855 30,2 1.893.318 156X
Cj 19 24 206 227.147 1.705.617 1.805 30,4 2.891.238 242X
Cj 20 51 204 322.748 1.772.036 1.883 30,2 2.492.038 216X
Cj 22 37 261 462.854 1.658.649 1.730 30,4 1.499.118 130X
Cj 23 39 209 491.057 1.636.095 1.714 30,5 1.934.502 166X
Cj 24 37 209 472.481 1.637.517 1.714 30,4 2.621.968 222X
Cj 25 190 147 317.957 1.654.857 1.691 30,6 2.540.596 221X
Cj 26 31 240 299.899 1.595.918 1.663 30,5 2.064.460 176X
Cj 27 33 207 450.336 1.596.189 1.657 30,5 2.177.564 192X
Cj 29 67 166 179.498 1.727.160 1.845 30,3 797.052 68X
Cj 30 29 219 224.723 1.594.811 1.666 30,6 1.819.210 158X
Cj 31 36 201 472.140 1.636.720 1.710 30,5 2.970.404 258X
CCAMP 1478 109 40 310.086 1.708.613 1.778 30,3 618.646 93X
CCAMP 1491 105 139 405.635 1.729.770 1.804 30,3 853.630 128X
Cj 32 35 215 335.332 1.636.458 1.728 30,6 3.357.334 300X
Cj 33 31 201 491.069 1.637.414 1.707 30,5 3.140.800 250X
CCAMP 1497 115 151 491.943 1.663.987 1.711 30,5 1.205.354 178X
Cj 34 42 223 308.335 1.683.573 1.769 30,2 2.768.248 231X
CCAMP 770 73 151 324.727 1.784.355 1.857 30,1 4.681.444 419X
CCAMP 621 74 148 324.850 1.785.086 1.859 30,1 3.816.978 341X
CCAMP 687 185 140 95.859 1.727.948 1.827 30,3 909.246 79X
continua
A p ê n d i c e s | 139
continuação
CCAMP 689 101 148 302.434 1.738.975 1.793 30,3 3.849.024 343X
CCAMP 789 93 150 322.196 1.859.503 1.974 30,1 3.056.696 271X
CCAMP 828 66 156 317.028 1.688.461 1.753 30,3 5.854.690 521X
CCAMP 845 81 149 302.532 1.732.437 1.799 30,2 4.659.532 412X
CCAMP 980 60 149 294.616 1.610.707 1.676 30,4 4.917.036 438X
CCAMP 991 53 135 482.926 1.621.260 1.688 30,4 3.627.012 321X
CCAMP 730 43 151 550.932 1.683.506 1.763 30,3 4.554.038 405X
CCAMP 685 67 191 237.292 1.634.518 1.714 30,4 4.685.336 418X
CCAMP 81 47 169 327.522 1.635.800 1.717 30,5 1.130.758 88X
CCAMP 159 38 183 324.914 1.812.324 1.917 30,2 1.940.014 156X
CCAMP 162 35 203 358.478 1.599.331 1.661 30,5 3.358.572 271X
CCAMP 163 38 211 358.478 1.599.208 1.658 30,6 3.542.138 292X
CCAMP 470 41 211 325.007 1.760.234 1.870 30,3 2.919.076 260X
CCAMP 471 46 211 325.022 1.759.697 1.869 30,3 1.725.292 148X
CCAMP 472 40 211 325.002 1.760.447 1.870 30,2 2.402.938 207X
CCAMP 473 42 204 311.792 1.713.063 1.798 30,3 2.115.242 184X
CCAMP 476 29 201 544.965 1.704.094 1.801 30,3 2.241.662 197X
CCAMP 478 31 233 406.385 1.703.651 1.807 30,3 1.926.114 160X
CCAMP 479 37 201 369.321 1.706.050 1.807 30,3 2.078.788 184X
CCAMP 480 26 181 325.038 1.651.015 1.732 30,4 1.082.648 96X
CCAMP 481 25 208 191.552 1.649.512 1.726 30,4 1.785.478 159X
CCAMP 672 81 151 419.469 1.735.916 1.819 30,4 4.580.696 407X
CCAMP 674 75 114 537.697 1.735.575 1.820 30,3 4.717.492 419X
CCAMP 675 79 202 531.106 1.734.937 1.817 30,4 3.635.708 318X
CCAMP 1080 308 149 363.385 1.852.898 1.922 30,2 5.554.528 489X
continua
A p ê n d i c e s | 140
continuação
CCAMP 1140 66 164 457.082 1.608.933 1.664 30,5 2.634.134 239X
CCAMP 1266 64 135 489.917 1.698.726 1.768 30,3 3.952.038 353X
CCAMP 1466 80 199 336.586 1.641.107 1.706 30,4 4.867.806 419X
CCAMP 1493 126 62 476.901 1.632.513 1.677 30,6 2.746.608 350X
CCAMP 1538 241 38 191.166 1.855.211 1.962 30,3 1.117.044 163X
CCAMP 1555 236 42 405.957 1.806.342 1.884 30,4 1.548.628 215X
CCAMP 1574 192 57 395.419 1.806.801 1.877 30,4 1.161.714 163X
CCAMP 1013 71 130 456.073 1.676.660 1.757 30,5 2.653.854 239X
CCAMP 1014 70 148 315.505 1.736.018 1.831 30,3 3.014.172 271X
CCAMP 1015 48 147 527.081 1.712.819 1.800 30,3 1.853.528 163X
CCAMP 1016 46 194 332.262 1.713.751 1.806 30,3 2.476.682 221X
CCAMP 1018 338 149 352.102 1.841.107 1.928 30,4 2.737.422 248X
CCAMP 1019 73 149 352.931 1.618.523 1.674 30,5 2.908.054 260X
CCAMP 1020 60 150 369.083 1.718.399 1.804 30,3 3.814.812 342X
CCAMP 1021 53 170 543.879 1.715.372 1.802 30,3 4.717.596 412X
CCAMP 1023 74 144 462.585 1.620.071 1.674 30,4 4.863.392 429X
CCAMP 1024 67 173 462.583 1.619.031 1.665 30,5 4.869.424 428X
CCAMP 1025 61 187 331.827 1.716.643 1.800 30,3 1.982.220 178X
CCAMP 1032 69 151 462.671 1.619.042 1.672 30,5 2.154.138 194X
CCAMP 1039 86 151 505.331 1.763.753 1.878 30,3 3.217.522 288X
CCAMP 1047 59 167 352.879 1.614.893 1.663 30,4 1.471.116 133X
CCAMP 1048 78 150 506.239 1.760.602 1.874 30,3 3.846.246 344X
CCAMP 1050 72 148 304.697 1.737.009 1.835 30,3 5.107.920 441X
CCAMP 1051 74 198 304.842 1.739.722 1.830 30,3 5.603.160 486X
CCAMP 1052 78 149 314.928 1.740.214 1.830 30,3 4.460.332 396X
continua
A p ê n d i c e s | 141
conclusão
CCAMP 1053 86 151 363.311 1.682.879 1.768 30,5 2.779.916 247X
CCAMP 1054 87 137 473.419 1.681.930 1.766 30,5 3.663.754 327X
CCAMP 1055 87 149 463.330 1.685.406 1.778 30,5 4.911.630 431X
CCAMP 1056 83 145 315.014 1.742.202 1.833 30,3 4.504.158 393X
CCAMP 1057 94 149 188.084 1.745.619 1.834 30,2 3.890.604 350X
CCAMP 1058 75 210 245.665 1.680.673 1.775 30,5 5.389.692 468X
CCAMP 1059 81 150 352.478 1.680.464 1.772 30,5 4.958.462 435X
CCAMP 1060 59 144 315.012 1.735.059 1.832 30,2 5.170.744 456X
CCAMP 1061 81 201 355.306 1.731.243 1.842 30,4 3.574.262 314X
CCAMP 1518 124 81 347.923 1.805.069 1.891 30,3 1.076.160 159X
CCAMP 1519 132 58 305.999 1.767.168 1.834 30,3 1.286.230 190X
CCAMP 1520 217 77 286.827 1.836.048 1.939 30,4 1.212.414 168X
CCAMP 1521 185 35 292.851 1.819.069 1.892 30,3 813.774 116X
CCAMP 1523 185 49 344.874 1.816.718 1.893 30,3 1.111.892 153X
CCAMP 764 69 147 347.609 1.676.314 1.767 30,5 5.251.602 473X
CCAMP 830 53 201 573.016 1.610.333 1.674 30,4 4.705.146 422X
Mb: Megabases; C+G: Contéudo de Citosina + Guanina; X: vezes; *corresponde às 121 linhagens de C. jejuni listadas na Tabela 1 com exceção das cinco
linhagens Cj 14, Cj 21, Cj 28, CCAMP 698 e CCAMP 1065, para as quais o sequenciamento não funcionou.
A p ê n d i c e s | 142
Apêndice C - Correlação entre os grupos obtidos pela análise dos SNPs do sequenciamento do genoma completo e todos os outros grupos obtidos pelas
técnicas moleculares, acrescido dos resultados fenotípicos e genotípicos de resistência antimicrobiana de 116* linhagens de C. jejuni estudadas
SVR flaA HRMA
Linhagens Origem Local Ano PFGE ST CC SNPs Genes de resistência Pontos de mutação Etest®
flaA alelo CRISPR
CCAMP 830 Ambiente RJ 1999 A4 A 595 4 8748 NA A blaOXA-61 ND ND
CCAMP 980 Animal RJ 1999 A4 A 595 4 8748 NA A blaOXA-61 ND ND
Cj 17 Humano SP 2005 A B 153 2 791 NA A blaOXA-184; aph(3`)III ND ND
CCAMP 991 Animal RJ 1999 A3 B 11 12 8749 ST-49 A blaOXA-61 ND ND
Cj 03 Humano SP 2003 A3 B 49 2 2289 NA A1 tet(O) ND Dox-Tet-Eri
CCAMP 512 Humano RJ 2001 A10 B 49 11 1071 NA A1 blaOXA-61 gyrA p. T86I Cip
CCAMP 1061 Alimentos MG 2009 C1 B 49 17 8751 NA A1 blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
Cj 13 Humano SP 2003 C6 B 14 11 9082 NA A1 tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
CCAMP 480# Animal MG 2004 A3 A 551 5 2304 NA A1 blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
CCAMP 481# Animal MG 2004 A3 A 551 5 2304 NA A1 blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
CCAMP 1493# Animal RJ 2013 A3 A 551 11 6091 NA A1 blaOXA-61 gyrA p. T86I Cip
Cj 02# Humano SP 2002 A3 A 551 3 2086 ST-206 A1 blaOXA-61; tet(O) ND Dox-Tet-Eri
CCAMP 699 Humano RJ 2004 A2 A 190 5 8745 ST-658 A1 blaOXA-61 ND ND
CCAMP 730 Animal RJ 2000 A2 A 190 5 8745 ST-658 A1 blaOXA-61 ND ND
CCAMP 1574 Animal RJ 2016 A2 A 190 5 1398 ST-658 A1 blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
CCAMP 601 Humano RJ 2003 A2 A 190 7 1398 ST-658 A1 blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
CCAMP 678 Humano RJ 2006 A2 A XXX 7 1398 ST-658 A1 blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
Cj 19# Humano SP 2006 A A 48 11 1522 ST-353 A1 ND gyrA p. T86I Cip
Cj 12 Humano SP 2003 A5 B 975 3 9081 ST-21 A1 blaOXA-61 gyrA p. T86I Cip
CCAMP 1039 Alimentos MG 2008 A5 B 855 14 1359 ST-21 A1 blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
CCAMP 1048 Alimentos MG 2008 A5 B 855 14 1359 ST-21 A1 blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I Cip
Cj 04# Humano SP 2003 A1 B 36 5 50 ST-21 A1 blaOXA-61 ND ND
CCAMP 588 Humano RJ 2001 A1 B 9 9 21 ST-21 A1 blaOXA-61 ND ND
CCAMP 674 Animal RJ 2006 A9 B 49 10 8744 ST-48 A1 blaOXA-61; tet(O) ND Dox-Tet
CCAMP 506 Humano RJ 2000 A6 B 260 11 332 ST-48 A1 blaOXA-61; aadE gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
Cj 23 Humano SP 2007 A6 B 49 7 475 ST-48 A1 blaOXA-61 ND ND
CCAMP 1266 Animal RJ 2009 A6 B 49 14 475 ST-48 A1 blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
continua
A p ê n d i c e s | 143
continuação
SVR flaA HRMA
flaA alelo CRISPR
CCAMP 489 Humano RJ 1997 A6 B 49 2 475 ST-48 A1 blaOXA-61; tet(O) ND Dox-Tet
CCAMP 1497 Humano RJ 2014 A6 B 49 22 475 ST-48 A1 blaOXA-61 gyrA p. T86I Cip
CCAMP 1538 Animal RS 2015 B1 B 287 23 8752 ST-353 A2 tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
Cj 22 Humano SP 2007 C1 B 57 5 8741 ST-353 A2 tet(O) ND Dox-Tet
CCAMP 1023 Alimentos MG 2008 C1 B 57 3 8741 ST-353 A2 ND gyrA p. T86I Cip
CCAMP 1054 Alimentos MG 2009 C3 B 57 3 8741 ST-353 A2 ND gyrA p. T86I ND
CCAMP 1018 Alimentos MG 2008 C1 B 57 3 8741 ST-353 A2 tet(O) gyrA p. T86I Cip
CCAMP 476 Animal MG 2004 C2 B 21 3 51 ST-443 A2 blaOXA-184; tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
CCAMP 1491 Humano RJ 2011 C2 B 21 3 463 ST-443 A2 blaOXA-184; tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
CCAMP 1025 Alimentos MG 2008 C2 B 21 3 463 ST-443 A2 blaOXA-184; tet(O) ND Dox-Tet
Cj 11 Humano SP 2003 A1 B 14 5 607 ST-607 A2 tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
CCAMP 1140 Animal RJ 2009 C6 B 57 20 52 ST-52 A2 blaOXA-61 gyrA p. T86I Cip
CCAMP 163 Animal RJ 2003 C6 B 57 10 52 ST-52 A2 blaOXA-61 ND ND
Cj 26 Humano SP 2008 C1 B 57 8 52 ST-52 A2 blaOXA-61 ND ND
Cj 01 Humano SP 2002 C1 B 5 5 6257 ST-354 A2 ND ND ND
continua
A p ê n d i c e s | 144
continuação
SVR flaA HRMA
flaA alelo CRISPR
CCAMP 764 Ambiente RJ 1996 C2 B 149 3 8746 NA A2 blaOXA-61 ND ND
Cj 16# + Humano SP 2005 A B 23 11 9083 ST-353 A2 blaOXA-61; tet(O) gyrA p. T86I ND
CCAMP 487 Humano RJ 1996 C5 B 100 11 3852 ST-354 A2 blaOXA-61 ND ND
CCAMP 1080 Animal RJ 2009 C5 B 100 18 354 ST-354 A2 blaOXA-61 gyrA p. T86I Cip
Cj 34 Humano SP 2015 C6 B 67 11 8742 ST-464 A2 ND gyrA p. T86I Cip
CCAMP 1555# Animal RJ 2015 C2 B 1661 6 8753 NA A2 ND gyrA p. T86I Cip
Cj 06 Humano SP 2003 B4 B 45 6 353 ST-353 A2 aadE gyrA p. T86I ND
Cj 07 Humano SP 2003 B4 B 45 6 353 ST-353 A2 aadE gyrA p. T86I Cip
gyrA p. T86I; 23S
CCAMP 1520 Alimentos RS 2015 B1 B 287 3 353 ST-353 A2 tet(O); aph(3`)III Cip-Dox-Tet-Eri
rRNA A2075G
gyrA p. T86I; 23S
CCAMP 1523 Alimentos RS 2015 B1 B 287 3 353 ST-353 A2 blaOXA-61; tet(O); aph(3`)III Cip-Dox-Tet-Eri
rRNA A2075G
gyrA p. T86I; 23S
rRNA A2075G
gyrA p. T86I; 23S
rRNA A2075G
#
CCAMP 501 Humano RJ 1999 B1 B 1440 13 353 ST-353 A2 ND gyrA p. T86I Cip
CCAMP 1519# Alimentos RS 2015 B1 B 54 19 353 ST-353 A2 blaOXA-61; tet(O); aph(3`)III gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
Cj 20# Humano SP 2006 B2 B 162 8 353 ST-353 A2 tet(O) ND ND
CCAMP 1478 Humano RJ 2010 B1 B 45 2 353 ST-353 A2 ND gyrA p. T86I Cip
CCAMP 594 Humano RJ 2001 B1 B 45 14 353 ST-353 A2 tet(O) ND Dox-Tet
Cj 15 Humano SP 2004 B3 B 45 5 353 ST-353 A2 tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
CCAMP 488 Humano RJ 1996 B1 B 45 2 353 ST-353 A2 ND ND ND
CCAMP 470# Animal MG 2004 B2 B 53 5 353 ST-353 A2 tet(O) gyrA p. T86I Cip-Dox-Tet
CCAMP 1050 Alimentos MG 2009 B3 B 45 3 353 ST-353 A2 ND ND ND
CCAMP 1057 Alimentos MG 2009 B B 45 3 353 ST-353 A2 ND ND Cip
continua
A p ê n d i c e s | 145
conclusão
SVR flaA HRMA
Linhagens Origem Local Ano PFGE ST CC SNPs Genes resistência Pontos de mutação Etest®
flaA alelo CRISPR
CCAMP 789 Animal RJ 1997 A B 198 6 403 ST-403 B ND ND ND
CCAMP 159 Animal RJ 2003 A11 B 51 12 403 ST-403 B ND ND ND
CCAMP 700 Humano RJ 2004 A10 B 51 12 403 ST-403 B ND ND ND
Cj 18 Humano SP 2006 A11 B 51 7 403 ST-403 B ND ND ND
CCAMP 493 Humano RJ 1998 C B 2 8 45 ST-45 B ND ND ND
CCAMP 1466 Animal RJ 2009 C B 22 21 1962 NA B blaOXA-449 ND ND
CCAMP 685 Animal RJ 2000 A B 1379 3 2042 NA B blaOXA-61 ND ND
Cj 32 Humano SP 2011 A A 161 15 660 ST-22 B blaOXA-61 ND ND
Cj 09 Humano SP 2003 A7 A 161 1 660 ST-22 B blaOXA-61; tet(O) ND Dox-Tet
CCAMP 612 Humano RJ 2005 A7 A 161 8 660 ST-22 B blaOXA-61; tet(O) ND Dox-Tet
Cj 25# Humano SP 2007 A8 A 274 8 469 ST-42 B ND gyrA p. T86I Cip
Cj 30 Humano SP 2009 A8 A 239 1 3997 ST-42 B blaOXA-61 ND ND
ND: não detectado; MG: Minas Gerais; SP: São Paulo, RJ: Rio de Janeiro; ST: Sequence Type; CC: Complexo Clonal; NA: não associado; Cip:
Ciprofloxacina; Tet: Tetraciclina; Dox: Doxiciclina; Eri: Eritromicina; STs novos: escrito em itálico, negrito e sublinhado; XXX: aguardando envio do flaA
alelo pelo banco de dados; *corresponde às 121 linhagens de C. jejuni listadas na Tabela 1 com exceção das cinco linhagens Cj 14, Cj 21, Cj 28, CCAMP 698
e CCAMP 1065, para as quais o sequenciamento não funcionou; # Linhagens que apresentaram o gene wlaN; + linhagem que apresentou o gene virB11.
A n e x o s | 146
ANEXOS
A n e x o s | 147
ANEXOS
Anexo A - Ágar Base Columbia suplementado com 0,4% de carvão ativado
Base para ágar sangue 4,4 g

Carvão ativo 0,4 g
Água destilada 100 mL
Ajustar o pH para 7,2-7,4. Esterilizar em autoclave a 121ºC por 20 minutos.
Anexo B - Suplemento FBP
Sulfato ferroso 0,5 g

Bissulfito de sódio 0,5 g
Piruvato de Sódio 0,5 g
Esterilizar por filtração em Seitz ou Milipore. Manter em frasco âmbar por até 30 dias em
geladeira (4ºC).
Anexo C - Solução acidulada de sulfato de cobre
Sulfato de cobre II 25,0 g

Ácido sulfúrico 1,6 mL
Tween 80 1,0 mL
Preparar a solução sob constante agitação. Conservar em temperatura ambiente.
Anexo D - Meio para criopreservação das cepas
Neo-peptona 1,0 g
Glicerol 25 mL
Cloreto de sódio 0,5 g
Ajustar o pH para 7,2-7,4. Esterilizar em autoclave a 121ºC por 20 minutos. Conservar em

geladeira (4ºC).

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO

Caracterização molecular de linhagens de Campylobacter jejuni

Miliane Rodrigues Frazão

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO

Caracterização molecular de linhagens de Campylobacter jejuni

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Área de Concentração: Biociências Aplicadas à Farmácia

Orientada: Miliane Rodrigues Frazão

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

Frazão, Miliane Rodrigues

Caracterização molecular de linhagens de Campylobacter jejuni de origens

147 p. : il. ; 30cm.

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas de

Orientadora: Falcão, Juliana Pfrimer

1. Campylobacter jejuni 2. Genes de virulência 3. Perfil de resistência a

Miliane Rodrigues Frazão

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Área de Concentração: Biociências Aplicadas à Farmácia

Orientadora: Profª Drª Juliana Pfrimer Falcão

Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Prof. Dr. ____________________________________________________________________

Laboratório de Bacteriologia, Epidemiologia Molecular, Virulência Bacteriana e

À Pesquisadora Dra. Ana Luzia Lauria Filgueiras da Coleção de Campylobacter da

À Adriana Aparecida Marques, funcionária da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto, pelos

Aos funcionários da FCFRP-USP, especialmente aos funcionários da pós-graduação

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) e ao Conselho

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pela concessão da

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo suporte

E finalmente, os meus mais sinceros agradecimentos a todos que direta ou indiretamente

E não do tamanho da minha altura ...”

Alberto Caeiro, em O guardador de rebanhos, de Fernando Pessoa

Frazão, M. R. Caracterização molecular de linhagens de Campylobacter jejuni de origens

Campylobacter jejuni é a espécie bacteriana mais comumente relacionada como causa de

Palavras-chave: Campylobacter jejuni, genes de virulência, perfil de resistência a

Frazão, M. R. Molecular characterization of Campylobacter jejuni strains isolated from

Campylobacter jejuni is the most commonly bacterial species related as a cause of

Keywords: Campylobacter jejuni, virulence genes, antimicrobial resistance profile, PFGE,

Frazão, M. R. Caracterización molecular de linajes de Campylobacter jejuni de diversos

Campylobacter jejuni es la especie bacteriana más comúnmente relacionada como causa de

Palabras-llave: Campylobacter jejuni, genes de virulencia, perfil de resistencia a

Figura 1 - Gel representativo dos produtos da extração do DNA genômico

Tabela 1 - Características das 121 linhagens de C. jejuni estudadas ........................ 48

2. RELEVÂNCIA DO ESTUDO ................................................................................... 44

4. MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 48

7. CONCLUSÕES ........................................................................................................... 111

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………………….. 113

APÊNDICES …………………………………………………………………………... 132

ANEXOS ……………………………………………………………………………….. 147

Devido a essa estreita relação filogenética e características fenotípicas e genotípicas similares

1.2. O gênero Campylobacter

termotolerantes, ou seja, têm a sua temperatura ótima de crescimento em torno de 42ºC. O

1.2.1. Características do microrganismo

considerado relativamente pequeno quando comparado a outros enteropatógenos como, por

1.2.2. Manifestações clínicas e patogênese

1.2.3. Genes e fatores de virulência

(LPS) bacteriano, consideradas cruciais para o desenvolvimento de neuropatias pós-infecção