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Índice
1. Introdução............................................................................................................................2
2. Objectivos............................................................................................................................2
2.1. Geral..................................................................................................................................2
2.2. Especifico..........................................................................................................................2
3. Metodologia.........................................................................................................................3
3.1. Microbiologia de Alimentos..............................................................................................4
3.2.Técnicas aplicadas a microbiologia de alimentos...............................................................4
3.2.1. Métodos de análise dos alimentos..................................................................................5
3.2.2. Analise Microbiológica dos alimentos............................................................................5
3.2.2.1. Técnicas de cultura......................................................................................................6
a) Inoculação............................................................................................................................7
b) Semeadura............................................................................................................................7
3.2.2.1.1 Cultura pura...............................................................................................................7
3.2.2.1.2. Isolamento de culturas puras....................................................................................7
3.2.2.1.3. Conservação de culturas puras..................................................................................8
3.2.2.2. Técnica Microscópica..................................................................................................8
3.2.2.2.1. Microscópio luminoso..............................................................................................9
3.2.2.2.2. Microscópio Eletrónico............................................................................................9
3.2.2.2.3. Técnicas de coloração de microrganismos..............................................................10
a) Coloração de Gram............................................................................................................10
3.2.2.2.4. Técnicas básicas de contagem microbiológica........................................................11
a) Contagem direta ou microscópica......................................................................................11
4. Conclusão...........................................................................................................................13
5. Referências bibliográficas..................................................................................................14
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1. Introdução
A Microbiologia é classicamente definida como a área da ciência que dedica-se
ao estudo de organismos que somente podem ser visualizados ao microscópio. Com
base neste conceito, a microbiologia aborda um vasto e diverso grupo de organismos
unicelulares de dimensões reduzidas, que podem ser encontrados como células isoladas
ou agrupados em diferentes arranjos. Assim, a microbiologia envolve o estudo de
organismos procarióticos (bactérias, archaeas), eucarióticos (algas, protozoários,
fungos) e também seres acelulares (vírus) (Microbiologia de alimentos, 2012, p.1)
Esta área do conhecimento teve seu início com os relatos de Robert Hooke e
Antony van Leeuwenhoek, que desenvolveram microscópios que possibilitaram as
primeiras observações de bactérias e outros microrganismos a partir da análise de
diversos espécimes biológicos. Embora van Leeuwenhoek seja considerado o "pai" da
microbiologia, os relatos de Hooke, descrevendo a estrutura de um bolor, foram
publicados anteriormente aos de Leeuwenhoek. Assim, embora Leeuwnhoek tenha
fornecido importantes informações sobre a morfologia bacteriana, estes dois
pesquisadores devem ser considerados como pioneiros nesta ciência.
Nas últimas décadas, houve uma "revolução" na microbiologia, a qual passou e
ainda vem passando por profundas modificações, especialmente no que se refere aos
conhecimentos sobre ecologia e classificação dos microrganismos. Anteriormente, os
microrganismos (principalmente os procarióticos) eram considerados seres unicelulares
de comportamento independente, mesmo que fossem encontrados em agrupamentos
contendo diversas células. Assim, a maior parte dos conhecimentos foram obtidos a
partir de culturas puras. Isto é, o microrganismo era isolado da natureza e, após ser
"separado" dos demais microrganismos, era cultivado em laboratório, gerando
populações contendo um único tipo celular (Microbiologia dos alimentos, 2012).

2. Objectivos

2.1. Geral
Compreender as técnicas microbiológicas aplicadas a microbiologia de alimentos.

2.2. Especifico
Entender como essas técnicas irão auxiliar no Agro-Processamento.
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3. Metodologia
Para a realização deste trabalho recorreu-se a manuais electrónicos bem como a
manuais físicos em uma biblioteca, entrevistamos também algumas pessoas.
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3.1. Microbiologia de Alimentos

A microbiologia dos alimentos é a parte da microbiologia que trata dos processos
em que os microrganismos influenciam nas características dos produtos de consumo
alimentício humano ou animal. A microbiologia dos alimentos, por consequência,
engloba aspectos da ecologia microbiana e de biotecnologia para a produção
(Microbiologia de alimentos, 2012, p.2).
Os Microrganismos podem ser:
 Agentes de deterioração dos alimentos;
 Agentes patogênicos transmitidos por alimentos;
 Produtores de alimentos.

A presença de microrganismos em alimentos não significa necessariamente um

risco para o consumidor ou uma qualidade inferior destes produtos. Excetuando‐se um
numero reduzido de produtos submetidos a esterilização comercial, os diferentes
alimentos podem conter bolores, leveduras, bactérias e outros microrganismos. Muitos
alimentos tornam‐se potencialmente perigosos ao consumidor somente quando os
princípios de sanitização e higiene são violados. Se o alimento tem estado sujeito a
condições que poderiam permitir a entrada e/ou crescimento de agentes infecciosos ou
toxigenicos, pode se tornar um veículo de transmissão de doenças (Silva, 2002, p.3).

De acordo com o mesmo autor, o exame rotineiro de alimentos para detecção de

uma numerosa serie de microrganismos patogénicos é impraticável na maioria dos
laboratórios devido ao facto de esses estarem inadequadamente equipados. Tem‐se,
portanto, tornado normal a pratica de analisar nos alimentos a existência de bactérias,
cuja presença indica a possibilidade da presença de bactérias produtoras de toxinfecções
alimentares.

3.2.Técnicas aplicadas a microbiologia de alimentos

Uma população microbiana, sob condições naturais, contém muitas espécies
diferentes, não somente espécies de bactérias, mas também espécies de leveduras,
bolores, algas e protozoários. Talvez também possam existir milhares de vírus.
Frequentemente é importante identificar quantos e quais tipos de microrganismos estão
presentes em um ambiente particular. Por exemplo, os microbiologistas fundamentam
um dos testes rotineiramente empregados para determinar a segurança de águas potáveis
públicas pela presença ou ausência da bactéria Escherichia coli. Águas potáveis seguras
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não contêm esses organismos, que fazem parte da população microbiana normal que
habita o intestino. Além disso, você pode querer determinar o número total e os tipos de
espécies em uma amostra de água corrente, com a finalidade de compreender como a
população de microrganismos interage em um ambiente aquático. Um outro exemplo
comum é separar bactérias que causam doenças, como aquelas responsáveis pela
inflamação de garganta, de outros microrganismos saprófitas que vivem no corpo
humano. Isolar esses microrganismos faz parte do diagnóstico e tratamento médico. Por
esta razão, os micro-biologistas devem ser capazes de isolar, enumerar e identificar os
microrganismos em uma amostra. Este capítulo descreverá alguns dos métodos
utilizados para caracterizar e identificar os microrganismos (Pelczar, Chan & Krieg
volume 1, 2º Edição).

3.2.1. Métodos de análise dos alimentos

Em análise de alimentos, os objetivos se resumem em determinar um componente
específico do alimento, ou vários componentes, como no caso da determinação da
composição centesimal. A determinação do componente deve ser através da medida de
alguma propriedade física, como: medida de massa ou volume, medida de absorção de
radiação, medida do potencial elétrico, etc. (Métodos de analise de alimentos, 2013,
p.7).
Segundo o mesmo manual (Métodos de analise de alimentos, 2013, p.8), existem
dois tipos básicos de métodos em análise de alimentos: métodos convencionais e
métodos instrumentais. Os primeiros são aqueles que não necessitam de nenhum
equipamento sofisticado, isto é, utilizam apenas a vidraria e reagentes, e geralmente são
utilizados em gravimetria e volumetria. Os métodos instrumentais, como o próprio
nome diz, são realizados em equipamentos eletrônicos mais sofisticados. São utilizados,
sempre que possível os métodos instrumentais no lugar dos convencionais.

3.2.2. Analise Microbiológica dos alimentos

A análise microbiológica para se verificar quais e quantos microrganismos estão
presentes é fundamental para se conhecer as condições de higiene em que o alimento foi
preparado, os riscos que o alimento pode oferecer à saúde do consumidor e se o
alimento terá ou não a vida útil pretendida. Essa análise é indispensável também para
verificar se os padrões e especificações microbiológicos para alimentos, nacionais ou
internacionais, estão sendo atendidos adequadamente. Muitos métodos e variações de
diferentes métodos que podem ser utilizados para detecção quantitativa e qualitativa de
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microrganismos em alimentos, estão relatados na literatura. Entretanto, é desejável

utilizar métodos que tenham sido aprovados por órgãos reguladores. Estes podem ser
métodos padrões ou recomendados. Atualmente esses métodos são comumente
divididos em métodos convencionais e métodos rápidos (Silva, 2002, p.4).

Os resultados das análises microbiológicas fornecem informações sobre a

qualidade da matéria-prima empregada, a limpeza das condições de preparo do alimento
e a eficiência do método de preservação. No caso de alimentos deteriorados, é possível
identificar o microrganismo responsável pela deterioração e sua fonte, como também as
condições que permitiram que a deterioração ocorresse. Assim, medidas corretivas
podem ser instituídas para prevenir a deterioração futura.

A análise microbiológica de alimentos utiliza a técnicas microscópicas especiais e

os procedimentos de cultura. O procedimento a ser empregado é determinado pelo tipo
de alimento que esta sendo analisado e pelo propósito especifico da analise. A escolha
também pode depender dos tipos de microrganismos que poderão estar presentes, como
é o caso dos diferentes microrganismos a ser pesquisados em um alimento suspeito de
ter causado uma doença (transmitida por alimento).

3.2.2.1. Técnicas de cultura

Esses podem ser definidos como o conjunto de nutrientes necessários para haver
multiplicação ou manutenção dos microrganismos. Existe uma grande variedade de
procedimentos e preparações nutricionais utilizadas para induzir tal crescimento, de
acordo com as exigências nutritivas e das condições físicas requeridas pelos diversos
tipos de fungos e bactérias (Vieira & Fernandes, 2012, p.39).
De acordo o mesmo autor, para a contagem de bactérias em geral, vários meios de
cultivos podem ser utilizados, como: ágar-nutriente, dextrose-triptona ágar, ágar-leite
desnatado, agar-suco de tomate, MRS-agar, etc. Já para a contagem de leveduras, os
meios mais comummente utilizados são: extracto de levedura-peptona-dextrose-ágar,
extrato de malte e agar-batata-dextrose. A maior parte dos meios de cultura esta
disponível comercialmente na forma desidratada e para seu uso, faz-se a dissolução em
água e esterilização. Os meios de cultura diferenciais ou seletivos para isolamento e
quantificação de populações de leveduras contaminantes baseiam-se em características
fisiológicas comuns as leveduras selvagens, mas ausentes em linhagens iniciadoras do
processo da fermentação. Dentre essas, destacam-se as nutricionais (variações nas
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fontes de carbono, nitrogénio e nos factores de crescimento) e resistência a certos

compostos como antibióticos e corantes.
Estes podem apresentar uma grande variação, quanto ao estado físico e quanto a
sua composição, de acordo com a necessidade dos microrganismos e os objetivos a que
se destinam. Para se obter resultados seguros e eficientes quando se trabalha com meios
de cultura é importante observar técnicas assépticas de inoculação e semeadura (Vieira
& Fernandes).

a) Inoculação
É a transferência de um determinado número de microrganismos para um meio de
cultura a fim de que estes se desenvolvam e permitam a sua identificação. A inoculação
em diferentes meios envolve várias técnicas de semeadura.

b) Semeadura
As técnicas de semeadura são os métodos pelo qual se transfere inóculos de um
meio de cultura ou material a ser analisado para um outro meio de cultura. Para garantir
que apenas o microrganismo desejado seja semeado, são utilizadas as técnicas
assépticas (procedimentos que devem ser adoptados visando a não contaminação de
materiais, meios e culturas, para obtenção de culturas puras).

3.2.2.1.1 Cultura pura

Ao determinar as características de um microrganismo, ele deve estar em cultura
pura, em que todas as células na população são idênticas no sentido de que elas se
originaram de uma mesma célula parental. Os microrganismos na natureza normalmente
existem em culturas mistas, com muitas espécies diferentes ocupando o mesmo
ambiente. Portanto, o primeiro passo é isolar as dite-rentes espécies contidas em um
espécime (Pelczar, Chan & Krieg volume 1, 2º Edição, p.76).

3.2.2.1.2. Isolamento de culturas puras

De acordo com a mesma autoria, em laboratório, os microrganismos são
cultivados ou desenvolvidos em material nutriente denominado meio de cultura,
Caminhar em um laboratório de preparo de meios de cultura é como entrar em uma
cozinha alinhada com jarras de alimentos para dietas especiais. Alguns laboratórios
preparam seus próprios meios a partir de pós-desidratados, enquanto outros compram
meios preparados ("prontos para uso") em placas de Petri ou tubos de ensaio. Existe à
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disposição uma extensa lista de meios comerciais, e o tipo utilizado depende de muitos
fatores. Esses fatores incluem considerações sobre a origem do material a ser analisado,
a espécie que se imagina estar presente nesta amostra e as necessidades nutricionais dos
organismos. O ágar, nutriente constituído por extrato de carne e proteína digerida
(peptonas), é um tipo desse meio. Meios mais específicos podem conter compostos
químicos ou substâncias como bile ou sangue que inibem ou acentuam o crescimento
microbiano. Como um bom detetive ao resolver um mistério, os microbiologistas usam
meios em combinação que ajudam a revelar a identidade dos microrganismos.

3.2.2.1.3. Conservação de culturas puras

Uma vez que os microrganismos tenham sido isolados em cultura pura, e
necessário manter as culturas vivas por um período de tempo com o objetivo de estudá-
las. Se a cultura é mantida por somente um curto período (dias a meses, dependendo da
resistência do microrganismo), ela pode ser armazenada à temperatura de refrigeradores
(4 a 10°C).
Alguns microrganismos, tal como Haemophilus influenzae, devem ser
transferidos diariamente a um novo meio, caso eles não estejam estocados por longo
período. Para armazenar por um longo período, as culturas são mantidas em nitrogênio
líquido a -196°C ou em freezers a -70 a -120°C, ou são congeladas e então desidratadas
e fechadas a vácuo em um processo denominado liofilização. Amplamente utilizado em
laboratório (também conhecido como o congelamento seco), este processo mantem a
viabilidade das culturas por muitos anos e é o elemento-chave para construir uma
coleção de microrganismos de referência (Pelczar, Chan & Krieg volume 1, 2º Edição,
p.78).

3.2.2.2. Técnica Microscópica

O microscópio é o instrumento mais frequentemente utilizado em um laboratório
que estuda os microrganismos. Utilizando um sistema de lentes e fontes de iluminação,
o microscópio torna o objecto visível. Os microscópios podem ampliar de 100 a
centenas de milhares de vezes o tamanho original, revelando a simetria simples dos
vírus ou estruturas internas complexas de protozoários (Pelczar, Chan & Krieg volume
1, 2º Edição, p.80).

De acordo a mesma autoria, existem duas categorias de microscópios em uso

correspondente: microscópio luminoso e microscópio eletrónico. Eles diferem no
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princípio pelo qual a sua ampliação é produzida. Para ampliar um objecto, microscópios
luminosos modernos usam um sistema de lentes para direcionar o caminho que um feixe
de luz percorre entre o objecto a ser estudado e o olho. Em vez de usar uma fonte de luz
e um conjunto de lentes, o microscópio eletrónico utiliza um feixe de elétrons
controlado por um sistema de campo magnético.

3.2.2.2.1. Microscópio luminoso

O microscópio luminoso ou óptico apresenta o poder de ampliar um objecto. Os
microscópios comumente empregados em microbiologia são equipados com três
objetivas denominadas de: baixo poder, alto poder e de imersão, cada uma com lentes
que fornecem diferentes ampliações. Elas são montadas sobre um revólver porta-
objetivas que pode ser girado para mover qualquer uma delas em alinhamento com o
condensador.

Usando a objetiva de imersão, uma gota de óleo especial é colocada na lâmina da

amostra, e a parte inferior da objetiva é emergida no óleo. A imagem é focalizada,
mantendo a lente da objetiva em contacto com o óleo. O óleo ajuda a manter os raios de
luz juntos quando eles passam entre o espécime e as lentes da objetiva (isto é, o índice
de refração do vidro e do óleo são os mesmos); isto permite que as lentes formem uma
imagem mais detalhada e mais clara, resultando em ampliação máxima possível, com o
microscópio. A objetiva do óleo de imersão é comumente usada para o exame de
microrganismos, por causa do seu tamanho reduzido (Pelczar, Chan & Krieg volume 1,
2º Edição, p.81).

3.2.2.2.2. Microscópio Eletrónico

Por causa do seu alto poder de ampliação, o microscópio eletrónico permite
maiores ampliações do que pode ser obtido com o microscópio luminoso. Isto só é
possível por causa do comprimento de onda muito curto dos feixes de elétrons
utilizados, em vez da luz. Esses feixes têm comprimento de onda que varia de 0,005 a
0,0003 nm, muito curto quando comparado com os comprimentos de onda da luz
visível. Portanto, o poder de resolução é centenas de vezes maior que o do microscópio
luminoso. É possível, com o auxílio do microscópio eletrónico, decifrar objectos
separados a uma distância de 0,003 μm, em comparação com 0,25 μm do microscópio
luminoso. Uma imagem pode ser ampliada de 1 milhão de vezes, fotografando-se a
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imagem e depois ampliando-se a fotografia (Pelczar, Chan & Krieg volume 1, 2º

Edição, p.82).

Para preparar os microrganismos para o exame por meio de um microscópio

eletrónico, uma amostra é inicialmente seca em um filme de plástico extremamente fino
sustentado por uma grade blindada. O espécime é, então, colocado no instrumento em
um ponto entre o condensador magnético e as objetivas magnéticas, que são
comparáveis ao condensador e as objetivas do microscópio óptico (Pelczar, Chan &
Krieg volume 1, 2º Edição).

3.2.2.2.3. Técnicas de coloração de microrganismos

A observação de microrganismos apresenta alguns fatores limitantes, como o fato
de possuírem tamanhos reduzidos e serem praticamente incolores. Por isso, a maioria
dos microrganismos para serem visualizados ao microscópio óptico devem ser
previamente corados. Antes disso, o microrganismo deve ser fixado a lâmina,
realizando-se a secagem por simples exposição ao ar e, em seguida, rápida passagem da
lâmina pela chama do bico de Bunsen. Os corantes podem ser ácidos ou básicos. A
célula bacteriana atrai corantes básicos. Os corantes básicos mais comuns são: cristal
violeta, azul-de-metileno, fucsina e safranina (Vieiras & Fernandes, 2012, p.47).
A não ser que a amostra esteja densamente contaminada, esfregaços corados do
material geralmente não fornecem informações úteis. Entretanto, técnicas microscópicas
padrões são utilizadas para análise de alguns produtos alimentícios. As técnicas de
coloração de Gram ou com azul metileno são normalmente empregadas para corar
esfregaços fixados, mas outros procedimentos estão disponíveis (Pelczar, Chan & Krieg
volume 2, 2º Edição, p.374).

a) Coloração de Gram
A coloração de Gram e um método muito utilizado na identificação de bactérias,
separando-as em dois grandes grupos: bactérias Gram-positivas (+) e bactérias Gram-
negativas (-). Estas podem ser diferenciadas por variações na estrutura da parede
celular. Assim a parede celular de bactérias ditas Gram (+) e formada por um camada
espessa de peptidoglicano, enquanto a parede celular de bactérias Gram (-) e formada
por uma camada fina de peptidoglicano, rodeada por uma camada externa de
lipopolissacarideo e proteína. E um método de coloração diferencial, baseado nas
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diferenças de permeabilidade destas membranas aos reagentes químicos. Nessa técnica

são utilizados um corante primário (cristal violeta), um contracorante (safranina) e uma
solução de lugol, denominada de mordente, pois se combina com o cristal-violeta para
formar um composto colorido insolúvel. O mordente intensifica a cor por ser capaz de
aumentar a afinidade do corante com a molécula alvo. Após a formação do complexo
cristal-violeta-lugol e feita a descolorizarão com álcool. Em seguida, aplica-se o
contracorante safranina (Vieira & Fernandes, 2012, p.48).

3.2.2.2.4. Técnicas básicas de contagem microbiológica

Para acompanhar o crescimento de uma população microbiana e poder quantifica-
la podem ser utilizadas algumas técnicas de contagem de microrganismos. A contagem
de microrganismos em uma determinada amostra pode ser realizada por meio de
diferentes métodos (Vieira & Fernandes, 2012, p.49)

a) Contagem direta ou microscópica

É uma técnica de contagem utilizada para quantificar o número total de células
em uma população de microrganismos. A vantagem desse método e a rapidez, no
entanto não permite a diferenciação de células vivas e mortas. Além disso, só é possível
contar partículas que estejam em valores superiores a 104/ml, enquanto a contagem em
placas pode avaliar números bem inferiores (até 30/ml). Pode ser feita através de
câmaras de contagem por observação em microscópio ou ainda por contagem eletrónica
(Vieira & Fernandes, 2012, p.49)
Por exemplo, um procedimento conhecido como esfregaço de Breed é empregado
para a contagem microscópica directa de microrganismos no leite. Neste procedimento,
uma quantidade padronizada de leite é espalhada sobre uma área demarcada de uma
lâmina de vidro. A fina camada de leite é corada com azul metileno, e os
microrganismos ou os seus agrupamentos, observados em diversos "campos" por meio
do microscópio, são quantificados. O número total de microrganismos por mililitro de
leite pode ser calculado (Pelczar, Chan & Krieg volume 2, 2º Edição, p.374).
De acordo com a mesma autoria, outra técnica emprega a contagem de Howard
para fungos, que utiliza uma camara na qual se deposita uma quantidade conhecida de
amostra. Como o nome sugere, essa técnica é empregada para enumerar fragmentos de
fungos em produtos alimentícios, tais como frutas, sucos e vegetais. Quando a contagem
de fungos realizada por esta técnica excede certos limites, o produto é de baixa
qualidade ou foi processado empregando‐se condições sanitárias insatisfatórias.
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Os protozoários podem ser também identificados e quantificados utilizando‐se o

exame microscópico direto. Com os protozoários geralmente estão presentes em número
relativamente pequeno, frequentemente é necessário usar procedimentos como a
centrifugação ou a filtração, que concentrarão esses organismos na amostra do alimento
antes do exame microscópico (Pelczar, Chan & Krieg volume 2, 2º Edição, p.375).
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4. Conclusão
Na conclusão deste trabalho, concluiu-se que a análise microbiológica de
alimentos utiliza a técnicas microscópicas especiais e os procedimentos de cultura. O
procedimento a ser empregado é determinado pelo tipo de alimento que esta sendo
analisado e pelo propósito especifico da analise. A escolha também pode depender dos
tipos de microrganismos que poderão estar presentes, como é o caso dos diferentes
microrganismos a ser pesquisados em um alimento suspeito de ter causado uma doença
(transmitida por alimento).
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5. Referências bibliográficas
1. Microbiologia de alimentos, 2012, Fortaleza-Ceara

2. Darlene Ana de Paula Vieira & Nayara Cláudia de Assunção Queiroz Fernandes:
Microbiologia Aplicada, 2012, Inhumas.

3. Michael J. Pelczar Jr, E. C. S. Chan & Noel R. Krieg volume 1, 2º Edição,

Microbiologia: Conceitos e Aplicações.

4. Michael J. Pelczar Jr, E. C. S. Chan & Noel R. Krieg volume 2, 2º Edição,

Microbiologia: Conceitos e Aplicações.