Université́ Claude Bernard Lyon1

Master Mention « Génie des procédés et Bioprocédés » Spécialité́ Procédés Physico-

Chimiques

Lyophilisation des souches

probiotiques
UE : Séchage et Lyophilisation

Figure 1 : vue microscopique d'une souche probiotique

FERNANDES DARIO
Encadré par : Séverine CRASTES-VESSOT
Lyophilisation des souches probiotiques

Résumé
Ce rapport est le résultat d’un travail donné par Séverine VESSOT (enseignant de UE Séchage
et Lyophilisation) sur forme dans projet auquel un sujet à notre choix à notre choix,
néanmoins en lien avec la lyophilisation. A l’issue de mon choix, le rapport est basé sur la
lyophilisation d’une souche probiotique. Il est présenté en deux parties principales ; principe
du procédé de la lyophilisation et puis dans la deuxième partie j’aborde la lyophilisation
appliques aux probiotiques.

Première partie : Après un rappel sur les probiotiques, je présenterai les aspects clés du
procédé de lyophilisation, néanmoins les problématiques liés aux mécanismes de transferts
de chaleur et de matière ne seront pas traités.

Dans la deuxième partie j’aborde sur le procédé de lyophilisation des souches probiotique.
Les différentes étapes du procédé depuis la culture jusqu’au stockage du lyophilisat.

Mots clés : lyophilisation, probiotiques, Lyophilisation probiotique, microorganismes

FERNANDES Dario 1
Lyophilisation des souches probiotiques

Table de matières
Résumé ............................................................................................................................. 1
1. Introduction ............................................................................................................... 3
2. Principe active : souche probiotique ........................................................................... 4
3. Description et principe de la lyophilisation ........................................................................ 4
3.1. Congélation .................................................................................................................................... 6
3.2. Sublimation : dessication première ............................................................................................... 6
3.3. Désorption : Dessication secondaire : ............................................................................................ 7
4. Le lyophilisateur ................................................................................................................ 7
5. Lyophilisation : appliquées aux probiotiques .............................................................. 8
5.1. Utilisation des excipients ............................................................................................... 8
5.2. Étapes du procédé de lyophilisation probiotique ........................................................... 8
5.2.1. Culture bactérienne : échelle laboratoire ...................................................................................... 8
5.2.2. Formulation.................................................................................................................................... 9
5.2.3. Congélation .................................................................................................................................... 9
5.2.4. Sublimation : dessication primaire................................................................................................. 9
5.2.5. Désorption : dessication secondaire ............................................................................................ 10
6. Conclusion et perspective ......................................................................................... 10
6.1. Bilan personnelle ..........................................................................................................10
7. Annexes ................................................................................................................... 11
8. Références bibliographiques .................................................................................... 12

Table de figures
Figure 1 : vue microscopique d'une souche probiotique ......................................................... 0
Figure 2 : boissons riches en probiotiquesi (à droite – Actimel et à gauche – Yakult) ............. 3
Figure 3 : les différents changements d’états de l’eau durant la lyophilisation ....................... 5
Figure 4 : diagramme de l'état d'eau pure ............................................................................... 5
Figure 5 : Aperçu des trois étapes du processus de lyophilisation. .......................................... 6
Figure 6 : Schéma des mécanismes liés à la congélation ou la déshydratation lente ou rapide
[8] ............................................................................................................................................. 6
Figure 7 : Après le séchage secondaire, les flacons et les ampoules doivent être scellés........ 8
Figure 8 : Culture de la souche probiotique ............................................................................. 8
Figure 9 : Séparation du culot bactérien du milieu de culture par centrifugation ................... 9
Figure 10 : Lyophilisat après la dessication secondaire, stocke à température de 4°C .......... 10
Figure 11 : Exemples de souches considérées comme probiotiques ([17],[18]) .................... 11
Figure 12 : composition du milieu de culture MRS [8] ........................................................... 11

FERNANDES Dario 2
Lyophilisation des souches probiotiques

1. Introduction

Au vu de la demande et des besoins croissants du marché́ en produits contenant des

organismes vivants, à la fois pour des applications alimentaires (yaourts, boissons, etc.) ainsi
que pour des applications médicales, leur production est d’un très grand intérêt. L’utilisation
de micro-organismes par l’industrie nécessite le recours à des procédés de production et de
conservation afin de trouver une solution pratique pour stabiliser des populations
microbiennes et faciliter leur manipulation et stockage. Contrairement aux procédés de
séchage classiques qui font appel à la chaleur, entrainant souvent d’importantes pertes des
viabilités 1 pendant le séchage et ensuite pendant le stockage, la lyophilisation
convenablement réalisée, reste est la méthode la plus répandue permet d’obtenir les taux de
viabilité des probiotiques les plus élevés. [1].

Figure 2 : boissons riches en probiotiquesi (à droite – Actimel et à gauche – Yakult)

1
Taux de survie inférieurs et des pertes de fonctionnalité des souches

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Lyophilisation des souches probiotiques

2. Principe active : souche probiotique

Les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont administrés en
quantités adéquates, produisent un effet bénéfique pour la santé de l'hôte. Afin qu’un
microorganisme soit considéré comme probiotique, il doit répondre à certains critères non-
exhaustifs [2] :
§ Absence de toxicité́ ou de pathogénie ;
§ Possibilité́ de production en grande échelle ;
§ Possibilité́ de cryoprotection ;
§ Propriétés organoleptiques.
§ Résistance à l’acide et à la bile ;
§ Adhérence à diverses lignées de cellules intestinales et/ou au mucus.
§ Production de substances d’intérêt (bactériocines...).

Les probiotiques sont généralement des bactéries, champignons ou encore des levures. Les
probiotiques ont de nombreux effets positifs pour la santé humaine. Ils tendent à réduire les
inflammations intestinales. Les effets bénéfiques associés aux probiotiques peuvent varier
suivant la souche bactérienne choisie [3].

Effets préventifs :

§ Prévention des troubles intestinaux (diarrhées, maladie du voyageur, inflammation...).

§ Prévention et traitement de certaines allergies.
§ Réduction du taux de cholestérol dans le foie.
§ Prévention du cancer du côlon.
§ Prévention des infections buccales.

Effets bénéfiques :

§ Augmentation de la biodisponibilité́ du fer.

§ Amélioration de la digestion du lactose.

Pour réaliser un procédé de lyophilisation probiotique, il est tout d’abord nécessaire de choisir
une souche modèle, présentant à la fois un réel intérêt économique, industriel et scientifique.
L’annexe 1, propose quelques exemples de souches probiotiques présentent dans des
aliments, utilisées comme médicaments ou les compléments alimentaires :

3. Description et principe de la lyophilisation

La lyophilisation est une opération de déshydratation à basse température et à basse
pression. Cette technique consiste à éliminer l’eau par sublimation de la glace cristalline. La
lyophilisation suit des mécanismes physiques basés sur les phénomènes de transfert de
matière et de chaleur impliqués dans le phénomène de sublimation. [4]. Elle repose donc sur
les changements d’états de l’eau (figure 2). La figure 3 présente le diagramme d’état de l’eau
pure montrant le chemin suivi lors des transformations de phase impliquées dans les étapes
de congélation et de séchage primaire (sublimation de la glace et condensation de la vapeur
d’eau sur le condenseur) d’un cycle de lyophilisation.

Pendant la lyophilisation, l'eau passe donc par les changements d'états suivants :

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Lyophilisation des souches probiotiques

Figure 3 : les différents changements d’états de l’eau durant la lyophilisation

§ La congélation consiste à faire passer le produit en solution de l'état liquide à l'état

solide.
§ Lorsqu'on abaisse la pression dans l'enceinte de l'appareil, l'eau solide passe à l'état
gazeux et s'élimine progressivement du produit. C'est la sublimation (Figure 1). Lors
de cette phase, on élimine l'eau libre, de mouillage. C'est la dessiccation primaire. La
dessiccation secondaire permet d'éliminer l'eau liée par adsorption à la surface des
produits lors de la sublimation (Figure 1). Cette eau ne représente que 5%, mais la
dessiccation demande un vide plus poussé [3].
§ Le piégeage a lieu lorsque les molécules d'eau (sous forme de gaz) éliminées du
produit sont piégées sur une surface refroidie. Elles se transforment en glace. C'est le
piégeage (Figure 3).

Figure 4 : diagramme de l'état d'eau pure

La lyophilisation a commencé à être utilisée à l’échelle industrielle pendant la seconde guerre

mondiale, pour pouvoir acheminer le sang humain sur de longues distances, lorsque la
demande est devenue critique. Elle est devenue aujourd’hui une opération industrielle
particulièrement répandue dans les domaines de l’agroalimentaire et de la pharmacie. Malgré
cette industrialisation et une utilisation croissante, la technologie basée sur le maintien d’un
produit sous vide à basse température pendant de longues durées reste très coûteuse et
utilisée pour des produits à forte valeur ajoutée.

Dans le domaine pharmaceutique, la lyophilisation est utilisée pour conserver les vaccins, et
de nombreux produits pharmaceutiques et biopharmaceutiques, très labiles en solution,
émanant du développement intensif des biotechnologies pour ces derniers.
Le processus de lyophilisation comprend généralement trois étapes principale, successives et
indissociables, à savoir la congélation, le séchage primaire et le séchage secondaire [5] (figure
6). Pendant la congélation, le solvant (habituellement l’eau) cristallise dans des conditions

FERNANDES Dario 5
Lyophilisation des souches probiotiques

atmosphériques et se sépare de l’échantillon résiduel. En conséquence, la fraction non gelée

se concentre. Au cours de l’étape de la dessication primaire, le solvant congelé est retiré en
le transférant directement du solide à l’état gazeux (sublimation). Au cours de l’étape finale
de séchage (dessication secondaire), l’eau non gelé est retirée de l’échantillon par désorption
et l’échantillon atteint sa teneur finale en eau.

Figure 5 : Aperçu des trois étapes du processus de lyophilisation.

3.1. Congélation
La congélation est la première étape du processus de lyophilisation. Elle transforme l’eau libre
en cristaux de glaces. La congélation est l'étape critique, elle conditionne l'aspect final du
produit et la qualité́ du lyophilisat, ceci n'est possible que si, lors de la congélation, les cristaux
formés sont fins et nombreux [6], [7].

§ Lors d'une congélation normale, on observe un palier à 0°C : des cristaux de glace se
forment sur les parois, au fond et grossissent progressivement.
§ Dans le cas d'un refroidissement ralenti, le palier à 0°C disparait, et le produit reste
liquide jusqu'à une température de -10°C. Brusquement, cette température remonte
vers 0°C, ce qui correspond à la formation en une fraction de seconde de très
nombreux petits cristaux dans toute la masse du produit.

Figure 6 : Schéma des mécanismes liés à la congélation ou la déshydratation lente ou rapide [8]2

3.2. Sublimation : dessication première

Le séchage primaire est l’étape la plus critique du processus et occupe la plus longue partie
du temps de cycle total du procédé de lyophilisation. Cette étape consiste en la
déshydratation du produit par sublimation sous vide des cristaux de glace précédemment
formés. Elle fait intervenir les transferts de matière et de la chaleur. Au début de cette étape,
le condenseur est refroidi à une température inférieure à -50 °C et la pression dans la chambre
de séchage est abaissée pour créer le vide. Lorsque la pression atteint une valeur inférieure à

2
Pierre VERLHAC. Étude et optimisation des cycles de lyophilisation d’une souche probiotique modèle

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Lyophilisation des souches probiotiques

la pression de vapeur saturée de la glace à la température du produit congelé, la sublimation

commence. Puisque la sublimation est un processus endothermique, l’énergie latente
nécessaire à la sublimation de l’eau est fournie au produit en augmentant la température du
plateau. [9].
Le séchage primaire est terminé lorsque toute la glace a été retirée du produit congelé, et le
processus passe à la troisième et dernière étape du processus, le séchage secondaire.

3.3. Désorption : Dessication secondaire :

Le séchage secondaire élimine l’eau résiduelle 3 en augmentant la température de
l’échantillon. Il est conseillé d'utiliser une température d'étagère élevée pendant une courte
durée plutôt qu’une température basse pendant une longue période [10]. Normalement, le
temps optimal de séchage secondaire est de 3 à 6h à une température comprise entre 40 et
50°C. À L’issue de cette étape, les flacons de lyophilisat sont scellés et stockés.
4. Le lyophilisateur
Indépendamment de l’échelle, un lyophilisateur est composé de plusieurs éléments : la
chambre de séchage, le condenseur, la pompe à vide, le système de chauffage et de
réfrigération, et le système de supervision et de contrôle4 (figure 6). La chambre de séchage
contient généralement une ou plusieurs étagères, sur lesquelles les flacons sont placés
directement pendant les trois étapes du processus. Ces étagères fournissent aux échantillons
la chaleur nécessaire au séchage. La température des étagères est contrôlée au moyen d’un
fluide caloporteur pompé dans des canaux intégrés, qui est refroidi ou chauffé par le système
de chauffage-réfrigération. Les étagères servent d’échangeur de chaleur, enlevant l’énergie
du produit pendant la congélation et fournissant de la chaleur pendant les étapes de séchage
primaire et secondaire. La chambre de séchage est généralement reliée au condenseur par
une vanne champignon ou papillon, refroidie par un système de réfrigération.

Le condenseur sert à piéger la vapeur d’eau qui maintient le niveau de vide pendant le
séchage en condensant et en congelant la vapeur d’eau qui se forme pendant le séchage. Le
condenseur peut être placé dans la chambre de séchage (système à chambre unique) ou dans
une chambre de condenseur séparée (système à deux chambres) comme indiqué sur la Fig. 6
En outre, une pompe à vide est connectée au condenseur et utilisée pour créer le vide dans
le système habituellement au début de l’étape de séchage primaire (figure 6). Enfin, un ou
plusieurs capteurs de température et de pression aident le système de contrôle à maintenir
les valeurs de consigne sélectionnées des variables de fonctionnement pendant les
différentes étapes du cycle. [11]

3
L’eau résiduelle est l’eau liée et non congelée adsorbée à la surface des pores de la matière sèche ou incluse
dans la masse du lyophilisat
4
Un ensemble de capteurs différents qui permettent de surveiller la progression du séchage.

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Lyophilisation des souches probiotiques

Figure 7 : Après le séchage secondaire, les flacons et les ampoules doivent être scellés.

5. Lyophilisation : appliquées aux probiotiques

La lyophilisation de microorganismes tels que les probiotiques ne nécessite pas la même
approche qu’une lyophilisation classique. En effet, cette technique de séchage doit préserver
les microorganismes, en les maintenant en vie sur une longue période à la fois pour des
applications alimentaires ainsi que pour des applications médicales. La lyophilisation, si elle
est convenablement réalisée, reste l’une des méthodes qui permet d’obtenir les taux les plus
élevés de probiotiques viables (taux de viabilité)

5.1. Utilisation des excipients

Les excipients sont des substances protectrices tels que des agents tampon, agents
stabilisants, agents tensio-actifs ou encore les agents antioxydants.
Ces substances permettent aux cellules de mieux supporter une congélation ou une
décongélation lente et un stockage à température supérieure à - 50 °C. [12], [13].
5.2. Étapes du procédé de lyophilisation probiotique

5.2.1. Culture bactérienne : échelle laboratoire

La pré-culture consiste à adapter le microorganisme à son nouveau milieu afin de lancer la
culture des microorganismes. La pré-culture s’effectue tout d’abord par prélèvement d’une
colonie dans la boite de Pétri.

Figure 8 : Culture de la souche probiotique

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Lyophilisation des souches probiotiques

La colonie est ensuite ensemencée dans 100mL de milieu MRS5 liquide dans un Erlenmeyer
bouché. Le tout est maintenu sous agitation constante à 150 rpm à la température de 37°C
pendant 24h. Une fois la pré-culture réalisée, celle-ci est prélevée pour être introduite dans
du milieu de culture frais à 1%(v/v)6 et le tout est maintenu à 37°C sous agitation constante
(150 rpm) [8].

La suspension obtenue, est repartie dans des flacons de centrifugation de 50 mL puis

centrifugée à température ambiante pendant 10 minutes avec une accélération de 7000 g,
afin de pouvoir séparer et laver les bactéries du milieu de culture. À l’issue de la séparation,
le culot bactérien est récupéré́ pour l’étape de formulation [8].

Figure 9 : Séparation du culot bactérien du milieu de culture par centrifugation

5.2.2. Formulation
Après lavage et séparation de leur milieu de culture, les culots bactériens sont mis en
formulation avec des excipients, puis reparties dans des flacons de lyophilisation en verre de
6 mL [15].
5.2.3. Congélation
Le protocole optimal de congélation consiste tout d’abord à refroidir les formulations à -5°C
puis de la laisser reposer pendant 15 à 30 minutes, avant de la soumettre à l’étape de
congélation. Les échantillons sont ensuite maintenus à -45°C pendant 2h afin de s’assurer que
l’étape de congélation soit bien terminée [8].
5.2.4. Sublimation : dessication primaire
Cette étape est réalisée à très basse température (-40°C) dans une gamme de pression totale
comprise entre 10 Pa et 15 Pa [8].

5
Le milieu de culture MRS est un milieu développé par De Man, Rogosa and Sharpe [14]. Il contient tous les
éléments nutritifs nécessaires à la croissance des lactobacilles. Il se présente sous forme d’une poudre qu’il
faut dissoudre dans de l’eau distillée (55,3g/L). Le milieu peut être utilisé sous forme liquide après stérilisation,
mais il peut aussi être utilisé sous forme gélifiée en y ajoutant 15g/L d’agar bactériologique et en coulant le
milieu à chaud dans des boites de Pétri. Le pH initial du milieu indiqué par le fournisseur est de 6,4 [8]. La
composition de l’MRS en annexe 2.
6
Composition milieu de culture frais [8] : 2,5mL de solution mère introduits dans 250mL de MRS dans un
Erlenmeyer.

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Lyophilisation des souches probiotiques

5.2.5. Désorption : dessication secondaire

Une fois la sublimation terminée, l’étape de séchage secondaire (désorption/diffusion) est
lancée à la température constante de 20°C, sous la même pression totale que lors de l’étape
de séchage primaire (sublimation) dans une période comprise entre 6h à 24h, selon le produit.
Les flacons sont ensuite bouchés et scellés sous vide à l’intérieur du lyophilisateur, puis
conservés, d’une part, à 4°C pour un premier lot et, d’autre part, à température ambiante.[8]

Figure 10 : Lyophilisat après la dessication secondaire, stocke à température de 4°C

6. Conclusion et perspective

Parmi les nombreuses techniques de séchage couramment utilisées en industrie pour

stabiliser les probiotiques7, la lyophilisation est le procédé́ le plus efficace. Elle est l’unique
méthode permettant de conserver des principes actifs thermosensibles à l’état sec sur le long
terme, et elle est de plus en plus utilisée dans l’industrie alimentaire pour la conservation des
probiotiques [16]. Si elle apparait comme une solution pratique pour stabiliser des
populations microbiennes et faciliter leur manipulation et stockage, elle reste néanmoins
onéreuse et gourmande en énergie. D’autres alternatives comme l’atomisation et la
fluidisation existent, mais font appel à la chaleur, avec pour conséquences, des taux de survie
inférieurs et des pertes de fonctionnalité des souches.

L'utilisation de cryoprotecteurs au cours de la lyophilisation et d'antioxydants pendant le

stockage augmente significativement le taux de viabilité des cellules [8].

In fine, malgré tout, au cours des trois étapes de séchage du procédé, les probiotiques sont
soumis à de sévères conditions physiques (température ; pression), associées à de nombreux
stress qui ont un impact direct sur leur viabilité. Il est donc important d’analyser et de
comprendre les mécanismes qui entrainent des dommages, voire la destruction des cellules,
afin de produire un lyophilisat de bonne qualité. Cependant, malheureusement peu d’études
focalisent sur la lyophilisation des souches probiotiques.

6.1. Bilan personnelle

Ce travail bibliographique sur la lyophilisation m’a permis de poser les bases sur le procédé
et de son application aux probiotiques et d’une manière générale d’approfondir mes
connaissances sur les techniques de séchages. De plus ce projet m’a permis de comprendre
l’amplitude de la rigueur de la recherche scientifique.

7
La lyophilisation, l’atomisation, le séchage sous vide, le séchage par lit fluidisé, et une technique plus récente,
l’atomisation à froid

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Lyophilisation des souches probiotiques

7. Annexes

Annexe 1 : Exemples de souches probiotiques

Figure 11 : Exemples de souches considérées comme probiotiques ([17],[18])

Annexe 2 : Composition du milieu de culture MRS

Figure 12 : composition du milieu de culture MRS [8]

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Lyophilisation des souches probiotiques

8. Références bibliographiques
1. Pierre Schuck, Romain Jeantet, Gwénaël Jan, Anne Perraut. Séchage des probiotiques:
Un procédé innovant simple et efficace. 2015.

2. Saarela, M., Mogensen, G., Fondén, R., Mättö, J., Mattila-Sandholm, T., 2000.
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8. Pierre VERLHAC. Étude et optimisation des cycles de lyophilisation d’une souche

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Lyophilisation des souches probiotiques

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