CROMATOGRAFÍA DE

LÍQUIDOS DE ALTA
EFICACIA (HPLC)
INTEGRANTES :
PERLA JACQUELINE ÁLVAREZ HERNÁNDEZ
ARMANDO OROZCO FIGUEROA
LUIS ALBERTO MARTÍNEZ MARTÍNEZ
JAIME EMMANUEL DOMÍNGUEZ PÉREZ
¿QUÉ ES EL HPLC?
 Es una técnica analítica que permite separar mezclas complejas de sustancias de procedencia
diversa, con el propósito de identificarlas, cuantificarlas y purificarlas.

Mediante el HPLC es posible analizar compuestos orgánicos para la sección agricultora o ganadera, como los
pesticidas (organofosforados, carbamatos, benzimidazoles, triazinas), fenoles, isocianatos, PACs (Compuestos
aromáticos policíclicos) que resultan tóxicos en cantidades mínimas para un ser humano.

En el medio acuático es también útil, por sus propiedades de detección de fármacos en suelos y aguas
residuales. La HPLC permite detectar por medio ultravioleta o directa, la determinación cuantificada de sales
tóxicas rurales e industriales.

Los múltiples usos de la HPLC, confirman su alta conveniencia para su laboratorio, garantiza eficacia y
productividad en cada uno de sus proyectos. Las ventajas de la técnica, son principalmente la seguridad y
calidad que manejan en cada análisis brindado, y que actualmente es ya estandarizado en la industria química
y biológica.
 PRINCIPIO :
 La HPLC es uno de los tantos métodos de cromatografía para la separación y análisis de los componentes químicos de
una mezcla. Básicamente, en este método participan las fases móvil y estacionaría (inmiscibles entre sí) y la muestra de
interés. La fase móvil es líquida y su función es llevar la muestra a través de la fase estacionaría, que puede ser sólida o
una película líquida soportada en un sólido inerte. Las distintas fuerzas químicas y físicas que actúan entre la mezcla a
analizar y las dos fases determinan la retención y separación de cada uno de los componentes de la mezcla (Fallon,
Booth y Bell, 1987).
 Los componentes con mayor afinidad con la fase estacionaria se desplazarán con menor velocidad que aquellos que
presentan menor afinidad. Estas diferencias de velocidades dan origen a la separación de los componentes. Las
principales fuerzas que actúan en las moléculas son:
 • Las fuerzas de dispersión de London

 • Las interacciones dipolo

 • Las interacciones por puente de hidrógeno

 • Interacciones dieléctricas

 • Interacciones electroestáticas
La historia de la Cromatografía Líquida comenzó a principios del siglo XX. En 1906, un botánico ruso Mikhail
Tswett inventó LC para separar varios pigmentos vegetales. Inyectó el extracto de la planta y el éter de petróleo a
través de una columna de vidrio llena de carbonato de calcio.

 Puesto que esto se hizo en una columna de vidrio, fue capaz de observar los cambios dentro de la columna. Al
principio, sólo hay una capa de pigmento en la parte superior de la columna (Figura 1.a). Pero a medida que pasa
el tiempo, el pigmento se separa en cuatro capas de colores diferentes (Figura 1.b). La investigación posterior
descubrió que esas cuatro capas eran (i) verde azulado; Clorofila a, (ii) verde amarillento; Clorofila b, (iii)
amarillo; Xantina, y (iv) naranja; caroteno. Todo el proceso de separación tardó varias horas y por lo tanto no era
un método muy práctico. Este largo tiempo de análisis fue parte de la razón por la que LC no se convirtió en una
herramienta analítica popular hasta 1970, medio siglo después de la invención de Mikhail Tswett. A continuación
se presentan algunos términos comúnmente utilizados en el análisis de cromatografía.
HPLC significa Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento. Antes de que la HPLC estuviera disponible,
el análisis LC se llevó a cabo mediante flujo gravitatorio del eluyente (el disolvente utilizado para el
análisis LC) requirió así varias horas para que el análisis se completara. Incluso las mejoras añadidas en el
tiempo posterior fueron capaces de acortar ligeramente el tiempo de análisis. Aquellos sistemas clásicos /
LC iniciales se denominan “cromatografía de baja presión” o “cromatografía en columna”.

 En los años 70 en los Estados Unidos, Jim Waters fundó Waters Corporation y comenzó a vender
instrumentos de HPLC. Esto promovió el uso de la HPLC en áreas de análisis práctico. Los sistemas de
LC que Waters Corporation desarrolló utilizaron una bomba de alta presión que genera un flujo rápido de
eluyente y, por lo tanto, dio lugar a una mejora espectacular en el tiempo de análisis. En comparación
con la “cromatografía de baja presión”, los nuevos tipos se denominaron “cromatografía líquida de alta
presión”. Por lo tanto, se utilizó para pensar que la HPLC significa Cromatografía Líquida de Alta
Presión, sin embargo hoy en día es un acuerdo común que la HPLC significa Cromatografía Líquida de
Alto Rendimiento.
  Otro gran cambio de la fecha de Tswett fueron los métodos de adquisición de datos. En lugar
de observar los cambios de las capas por los ojos, el sistema detector se acopló a la LC y la
salida se registró en la carta de papel. Si tuviéramos que demostrar el resultado del análisis de
Tswett en un gráfico (chromatogramm)

Técnicamente hablando, la palabra LC representa toda la

cromatografía líquida, incluyendo LC de baja presión, sin embargo la
mayoría de los sistemas de LC usados en estos días son HPLC, por lo
tanto, la palabra LC se utiliza como comparable a HPLC.

1. Naranja 2. Amarillo
3. Amarillo Verde 4. Azulado Verde
 INSTRUMENTACIÓN
 La instrumentación de HPLC consiste en un reservorio que contiene la primera fase, una bomba para impulsar el
sistema de elución, un inyector para introducir la muestra dentro del sistema, un  detector y registrador de la
actividad química para detectar el paso de los componentes de una muestra en el orden en el que se eluyen, un
colector de fracciones para recibir por separado los componentes que ya fueron diluidos en caso de necesitar un
análisis posterior de alguno de ellos, y finalmente, un computador para almacenar e interpretar la información.
 SISTEMA DE SUMINISTRO Y
ALMACENAMIENTO DE FASE
MÓVIL
Garantiza la disponibilidad de fase móvil al sistema en condiciones apropiadas, de modo que se evite la contaminación y la
degradación de la misma.
La fase móvil en HPLC está formada por un disolvente o por una mezcla de ellos, cada uno de los cuales está contenido en
un recipiente, generalmente de vidrio, aunque en ocasiones se emplean otros materiales, como el politetrafluoroetileno. Los
recipientes deben disponer de tapones que impidan la contaminación por gases o partículas en suspensión presentes en el
aire del laboratorio.
Para evitar flujos inestables, la formación de burbujas o la interferencia de partículas extrañas los disolventes deben
estar filtrados y desgasificados. Esto puede realizarse mediante un tratamiento previo que elimine los gases y la materia en
suspensión (filtros milipore) o bien integrando sistemas de filtrado y desgasificación en el equipo de HPLC.
(ELUCIÓN)
 La elución se puede realizar de dos maneras:

 Elución isocrática: cuando se emplea un único disolvente o una mezcla de disolventes de composición
constante.
 Elución en gradiente: cuando se emplea una mezcla de disolventes cuya concentración se hace variar a
largo del proceso, con el fin de modificar la polaridad de la fase móvil y disminuir el tiempo de
separación (es un efecto semejante al que se produce cuando modificamos la temperatura en
cromatografía de gases).
 Los instrumentos modernos están equipados con válvulas de alimentación que permiten controlar de
manera programada la velocidad de flujo de cada disolvente en cada instante.
SISTEMA DE BOMBEO
 Todos los sistemas HPLC incorporan un sistema de bombeo, con las siguientes características:

 Debe ser capaz de gestionar altas presiones, de hasta 400 atm.

 Mantener un flujo libre de pulsos

 Proporcionar caudales constantes y reproducibles

 Permitir cambios de disolvente de modo simple y rápido

 Ser químicamente inerte y resistente a la corrosión

 Las más empleadas son las bombas recíprocas, que consisten en una pequeña cámara en la que el
disolvente es impulsado por el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor. Las entrada y
salida del disolvente se regula mediante dos válvulas antiretorno que se abren y cierran
alternativamente, permitendo el paso de fluido en un solo sentido.
SISTEMA DE INYECCIÓN DE
MUESTRA
 La inyección de un volumen de muestra preciso, y muy pequeño (5-500 μL), debe hacerse a la entrada de
la columna en un breve periodo de tiempo para perturbar lo menos posible el régimen de circulación de
la fase móvil y evitar el ensanchamiento de banda. La reproducibilidad de la inyección va a condicionar
la precisión de las medidas.
 El sistema de inyección está formado por válvulas rotatorias de alta presión de varias vías manuales o
automatizadas. Constan de un doble circuito, uno de los cuales está conectado al exterior y el otro al
propio sistema, pudiendo intercambiarse de forma rápida y simple entre las dos posiciones:

Con la válvula en la posición de llenado de la izquierda la

fase móvil pasa de la bomba a la columna mientras que la
muestra se inyecta en el otro circuito con forma de bucle.
Cuando la válvula gira hacia la posición de inyección de
la derecha, la fase móvil arrastra la muestra hacia la
columna. El objetivo de utilizar este tipo de válvulas es de
no interrumpir el flujo de fase móvil a través de la columna
e introducir en el flujo de la misma un volumen de muestra
que estará contenida en un tramo de tubería de volumen
fijo.
COLUMNAS
CROMATOGRAFICAS
 Columnas Analíticas en HPLC
 Son columnas rectas, fabricadas habitualmente de acero, aunque también se emplean columnas
construidas de vidrio y materiales poliméricos. La mayoría de ellas tienen una longitud entre 5 y 30 cm,
y su diámetro interno varía entre 3 y 10 mm. Los rellenos más comunes son de 5 a 10 μm y se mantienen
en el interior del tubo mediante cierres porosos de metal o de vidrio. Actualmente existen columnas de
mayor eficacia y dimensiones más reducidas, que superan los 100.000 platos/metro con un consumo
mínimo de disolvente (lo cual abarata considerablemente el proceso).
 Precolumnas
 Las columnas son delicadas y caras, por lo que se emplean precolumnas, de composición similar a la de
la columna (aunque con un diámetro de partícula de mayor tamaño para minimizar la caída de
presión). Las precolumnas eliminan los contaminantes, la materia en suspensión y aquellos componentes
que se unen de manera irreversible a la fase estacionaria, de manera que cuando está muy contaminada,
se vacía y se rellena de nuevo o se reemplaza por otra nueva.
 Columnas termostatizadas
 En algunas ocasiones se obtienen mejores resultados calentando la columna, ya que la viscosidad del
disolvente disminuye (se consigue un mayor caudal o se reduce la presión requerida) y se acortan los
tiempos de retención. Sin embargo, un aumento de la temperatura también puede degradar la fase
estacionaria y reducir el tiempo de vida de la columna, por lo que se deben emplear hornos que controlen
la temperatura de una manera muy precisa (de décimas de grado).
 RELLENO DE LA COLUMNA
 El relleno empleado en las columnas de HPLC debe ser químicamente inerte, mecánicamente resistente y
poseer un tamaño de partícula bien definido. Habitualmente está formado por partículas esféricas
microporosas de sílice muy puro, que son permeables al disolvente y presentan una elevada área
superficial (no puede emplearse con fases móviles cuyo pH sea mayor que 8). También se emplean
rellenos de alúmina (u otros óxidos metálicos), grafito poroso o materiales poliméricos (como estireno-
divinilbenceno).
 El relleno puede actuar como mero soporte de una fase estacionaria líquida o, convenientemente
tratado, puede intervenir directamente en el proceso de separación.
DETECTORES EN HPLC
 A diferencia de la cromatografía de gases, en la cromatografía de líquidos no hay detectores
universales tan fiables como lo son el detector FID o el TCD. Sus características (sensibilidad,
estabilidad, reproducibilidad, respuesta lineal, tiempo de respuesta corto, fácil manejo) son similares a
éstos, aunque no es necesario que sean sensibles en un intervalo de temperaturas tan elevado y deben
tener un volumen interno mínimo para reducir el ensanchamiento de banda extracolumna.
 Detector de absorción UV-visible
 El flujo de líquido que sale de la columna pasa a través de una pequeña celda, de pequeño volumen
(entre 1 a 10 μL), para minimizar el ensanchamiento de banda. La medida de la absorbancia del líquido
que la atraviesa en función del tiempo constituye el cromatograma. Su límite de detección oscila entre
0’1 y 1 ng y puede emplearse en cromatografía de elución en gradiente.

•Fotómetro de filtro: es el detector de absorción UV más sencillo.

Emplea una lámpara de mercurio como fuente y una serie de filtros
para aislar la intensa línea a 254 nm, con la que se mide la
absorbancia (variando los filtros se pueden seleccionar otras líneas).
•Espectrómetro de barrido: permite realizar el análisis
seleccionando una o varias longitudes de onda en la región de
interés.
•Espectrómetro de arreglos de diodos: debido a su rapidez, son
capaces de registrar la totalidad del espectro proporcionando un
cromatograma tridimensional que muestra la absorbancia en
función de la longitud de onda cada pequeños intervalos de tiempo.
 Detector de dispersión de luz
 La dispersión se produce por la interacción de la radiación electromagnética con la materia. El eluato que
abandona la columna se nebuliza mediante un flujo de nitrógeno o de aire y se vaporiza la fase móvil,
quedando únicamente unas finas gotitas de soluto sin evaporar. La nube de partículas de analito pasa a
través de un haz de láser y la dispersión producida es detectada por un fotodiodo de silicio.
 Este detector responde a todos los solutos menos volátiles que la fase móvil y su límite de detección se
encuentra entre 0’1 y 1 ng.

Otros detectores:
Detector de absorción infrarroja
Detector de fluorescencia
Detector de índice de refracción
Detector electroquimico
Detector de conductividad
APLICACIÓN DE LA
CROMATOGRAFÍA HPLC
 La cromatografía líquida de alto rendimiento tiene una amplia gama de aplicaciones en los campos de la
bioquímica, química analítica, productos farmacéuticos, ciencia forense, investigación alimentaria y otras áreas.
Por ejemplo, la HPLC también se utiliza en las pruebas de sustancias prohibidas en atletas.
 Campos de Aplicación de HPLC

 Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos

 Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos

 Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos

 Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes

 Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB

 Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos

 Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos.

 Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa

 Separación y purificación de metabolitos

 Separación y purificación de los metabolitos de las drogas procedentes de muestras de orina

 Purificación y separación de enantiómeros

 Purificación de compuestos naturales

 Purificación y caracterización de enzimas y proteínas