UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE GUERRERO

Facultad de Ciencias Químico Biológicas (Licenciatura en Químico Biólogo

Parasitólogo)

INVESTIGACIÓN DE MÉTODOS Y TÉCNICAS DE ÁCIDOS

NUCLEICOS

Integrantes:

 Chacón Ramírez Ayeitza

 Felipe Díaz Yessica
 Gatica de la Cruz Oscar
 Hernández López Gabriela
 Nicolás Hernández Christopher
 Olguín González Mildred Andrea
 Silverio Hernández Alejandra
 Villamar Maciel Aurora Cristina

Grupo 203° T.M.

Unidad de Aprendizaje: Bioquímica, Profesor: Dr. Julio Ortiz Ortiz

ÍNDICE
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 4
CAPÍTULO 1.- ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS ............................................. 5
Ácido desoxirribonucleico (ADN) .......................................................................................... 8
Estructura primaria ................................................................................................................ 8
Estructura secundaria........................................................................................................... 9
Estructura terciaria .............................................................................................................. 11
Ácido ribonucleico (ARN) ...................................................................................................... 11
Estructura primaria .............................................................................................................. 11
Tipos de ARN ......................................................................................................................... 12
Estructura secundaria......................................................................................................... 13
Estructura terciaria .............................................................................................................. 14
CAPÍTULO 2.- DETERMINACIÓN DE ESTRUCTURA DE ÁCIDOS NUCLEICOS ........... 15
Biosíntesis de nucleótidos purina ....................................................................................... 17
Biosíntesis de nucleótidos pirimidina ................................................................................ 17
Métodos de solución ............................................................................................................... 18
Cromatografía ....................................................................................................................... 19
Electroforesis ........................................................................................................................ 20
Ultracentrifugación .............................................................................................................. 21
CAPÍTULO 3.- MÉTODOS GENERALES DE CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS
NUCLEICOS ................................................................................................................................... 22
Determinación por espectrofotometría. ............................................................................. 22
Método de tinción con bromuro de etidio ......................................................................... 23
Método del ácido diamino benzoico (daba) para la determinación de ADN. ........... 23
CAPÍTULO 4.- DETERMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS INDIVIDUALES ....... 24
Estudio del ADN ....................................................................................................................... 25
Uso de enzimas de restricción y Fingerprinting .......................................................... 25
Southern blot ......................................................................................................................... 26
Análisis de RFLPs ................................................................................................................ 27
DOT BLOT Y SLOT BLOT ................................................................................................... 27
RT-PCR .................................................................................................................................... 29
CAPÍTULO 5.- REPLICACIÓN, REPARACIÓN Y RECOMBINACIÓN DEL ADN ............. 30
La replicación de ADN en cromosomas es bidireccional ............................................. 32
 ADN polimerasa ........................................................................................................................ 34
Elongación de la cadena; reacción de transferencia de grupo nucleotidilo ............ 35
Permanencia de la ADN polimerasa lll unida a la horquilla de replicación .............. 38
Lectura de prueba para corregir errores............................................................................ 39
Síntesis simultánea de dos hebras por la ADN polimerasa...................................... 39
Síntesis discontinua de la hebra retrasada ................................................................... 40
CAPÍTULO 6.- MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS ........................ 46
Método de aislamiento y purificación de ADN ................................................................. 46
Métodos de aislamiento y purificación de ARN ............................................................... 48
Formación y separación de la doble hebra de ADN ....................................................... 50
CAPÍTULO 7.- MÉTODOS DE ELECTROFORESIS ............................................................... 51
Geles de electroforesis en gel de poliacrilamida............................................................. 53
Preparación de geles............................................................................................................... 54
Electroforesis en gel de losa................................................................................................. 55
Electroforesis en gel discontinua ........................................................................................ 56
CAPÍTULO 8.-SINTESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS............................................................... 58
La Gota ........................................................................................................................................ 59
CAPÍTULO 9.- EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.................... 60
Cromatografía de penetrabilidad ......................................................................................... 61
Cromatografía de intercambio iónico. ................................................................................ 62
Cromatografía de adsorción.................................................................................................. 63
CAPÍTULO 10.-ANALISIS Y CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR
ESPECTROSCOPIA. .................................................................................................................... 64
Espectroscopia por rayos ultravioleta ............................................................................... 64
Fluorometría .............................................................................................................................. 65
REFERENCIAS .............................................................................................................................. 66
INTRODUCCIÓN
En el presente trabajo se dará a conocer las técnicas que se usan para identificar,
cuantificar, purificar, etc., los ácidos nucleicos, esto con el fin de mostrar la variedad
de métodos para conocer más acerca de los mismos. Los ácidos nucleicos son
grandes polímeros formados por la repetición de monómeros denominados
nucleótidos, unidos mediante enlaces fosfodiéster. Se forman, así, largas cadenas;
algunas moléculas de ácidos nucleicos llegan a alcanzar tamaños gigantescos, con
millones de nucleótidos encadenados.

El descubrimiento de los ácidos nucleicos se debe a Friedrich Miescher, quien en el

año 1869 aisló de los núcleos de las células una sustancia ácida a la que llamó
nucleína, nombre que posteriormente se cambió a ácido nucleico. Posteriormente,
en 1953, James Watson y Francis Crick descubrieron la estructura del ADN,
empleando la técnica de difracción de rayos X.

Como es lógico la rapidez con que se suceden las innovaciones de toda índole tanto
científicas como humanísticas resulta difícil adaptarse a los avances alcanzados, en
los momentos actuales, que se dan a nivel mundial, que coloca esta ciencia entre
las primeras con más descubrimientos y logros. Por lo tanto se espera que las
técnicas empleadas actualmente tengan mejores resultados que sus antecesoras.

Al hacer esta investigación, se ha tenido en cuenta los progresos de la Biología y

de la Genética con un tema tan interesante como lo es la estructura del ADN y ARN.
CAPÍTULO 1.- ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS
La información genética es almacenada y transmitida por los ácidos nucleicos DNA
(ácido desoxirribonucleico) y RNA (ácido ribonucleico), que son macromoléculas
resultantes de la polimerización de un número elevado de nucleótidos.

Los nucleótidos están formados por tres unidades fundamentales: bases

nitrogenadas, una osa y ácido fosfórico. La unión de una osa (ribosa o 2-
desoxirribosa) y una base nitrogenada (púrica o pirimidínica) por un enlace N-
glucosídico se denomina nucleósido. El compuesto formado por la esterificación de
un nucleósido por ácido fosfórico es un nucleótido.

Bases púricas

La purina es un heterociclo del que derivan numerosos

compuestos por sustitución de los átomos de hidrógeno de
los grupos CH por diversos radicales; todos se caracterizan
por su carácter aromático y por absorber intensamente la luz
ultravioleta (figura 4.1) (José, et al., 2009).

Las bases púricas presentes en los ácidos nucleicos, tanto en el DNA como en el
RNA, son:
• Adenina (A) ó 6-amino-purina.

• Guanina (G) ó 2 amino-6-hidroxi-purina (figura 4.2).

Otras bases púricas, derivadas de las anteriores son la hipoxantina (6-oxipurina) y

la xantina (2,6-dioxi-purina) (figura 4.3).

Una modificación común de estas bases en los ácidos nucleicos es la metilación,

así tenemos la 6-metil-adenina, la 2-metil-guanina y la 7-metil-guanina.

Bases pirimidínicas

Derivan del núcleo de pirimidina por sustitución de los hidrógenos de los grupos CH
por diversos radicales. Absorben intensamente en el ultravioleta (figura 4.4) (José,
et al., 2009)..
Hay tres bases pirimidínicas en los ácidos nucleicos:

• Citosina (C) ó 2-hidroxi-4-amino-pirimidina, presente en todos los ácidos nucleicos.

Algunos derivados suyos, presentes en pequeña cantidad de algunos DNA son la
5-metil-citosina y la 5-hidroximetil-citosina.

• Uracilo (U) ó 2,4-dihidroxi-pirimidina, está presente en todos los RNAs, pero no en

el DNA.

• Timina (T) ó 2,4-dihidroxi-5-metil-pirimidina, se encuentra en el DNA, pero no en

los RNAs (figura 4.5).

Tanto las bases púricas como las pirimidínicas pueden tener varias configuraciones
tautoméricas. La tautomería puede ser:

a) Ceto-enólica (figura 4.6)

b) Amino-imino (figura 4.7)

 Osas
Las osas que forman parte de los ácidos nucleicos son pentosas, estables en su
forma furanósica (figura 4.8):
• D-ribosa presente en los RNAs.
• D-2-desoxirribosa, en el DNA.

Ácido desoxirribonucleico (ADN)

Estructura primaria
El ácido desoxirribonucleico es un polímero de desoxirribonucleótidos, unidos por
enlaces 3′-5′-fosfodiéster. Las cadenas de DNA tienen polaridad; el azúcar del
nucleótido de uno de los extremos de la cadena tiene un grupo 3´-OH libre y el
azúcar del nucleótido del otro extremo de la cadena tiene un grupo 5′-P. Por
convención, el extremo 5′-P de la cadena de polinucleótidos se escribe a la
izquierda, es decir, la secuencia de bases está escrita en la dirección 5´ → 3´. El
polidesoxirribonucleico puede representarse de la siguiente forma:
Estructura secundaria Erwin Chargaff, en 1950, encontró en el
DNA de todas las especies que estudió la

La estructura secundaria del DNA fue siguiente proporción de bases

nitrogenadas:
establecida en 1953 por James Watson y
 A/T= 1.
 C/G= 1.

Es decir, que A + C = g + T. Esta

equivalencia tomó significado cuando
Watson y Crick propusieron su modelo de
DNA (Gutierrez y Pertierra, 2009).

Francis Crick basándose en patrones

de difracción de rayos X de fibras de
DNA. Su modelo presenta las
siguientes características:

 La molécula de DNA está constituida por dos cadenas de polinucleótidos

formando una doble hélice dextrógira.
 Las dos cadenas de la doble hélice están orientadas con polaridad opuesta,
es decir, son antiparalela.
 Los anillos de desoxirribosa con el grupo fosfato unido están en el
exterior de la hélice, con lo cual las cargas negativas de los grupos fosfato
pueden interaccionar con los cationes de la solución, lo que estabilizaría la
molécula.
 Las bases nitrogenadas están en el interior de la hélice. Las dos cadenas
permanecen unidas mediante puentes de hidrógeno; solamente los pares A-
T y g-C pueden acomodarse en la estructura de doble hélice. El enlace A-T
es mediante dos puentes de hidrógeno y el g-C mediante tres, por lo cual es
más estable. Por lo tanto, la secuencia de nucleótidos de una cadena de la
 doble hélice determina la secuencia de la otra cadena, y se dice que las dos
cadenas de una molécula de DNA son complementarias.
 Los planos que contienen las bases son perpendiculares al eje de la
hélice. Los planos que contienen los azúcares están formando ángulos casi
rectos con los de las bases.
 El diámetro de la hélice es de 20 Å, la separación entre nucleótidos
adyacentes a lo largo del eje de la hélice es de 3,4 Å.
 Puede haber cualquier secuencia de bases en la cadena polinucleotídica.
Una secuencia concreta de bases transporta una información genética
precisa.

La estructura de doble hélice del DNA se puede presentar bajo distintas formas:

 Forma B del DNA: Es la de mayor interés biológico ya que es la que suele

encontrarse en condiciones fisiológicas. Corresponde básicamente al modelo
propuesto por Watson y Crick, con 10 pares de bases por vuelta de hélice y
una separación de, aproximadamente, 3,4 Å entre nucleótidos contiguos.
 Forma A del DNA: Aparece cuando la humedad relativa es inferior al 75%.
 La forma Z es una hélice doble, con las cadenas antiparalelas y con el
apareamiento de Watson y Crick entre guanina y citosina.

 Estructura secundaria.
Estructura terciaria
El DNA lineal en disolución se comporta como un ovillo estadístico de gran rigidez,
debido al impedimento estérico que originan las interacciones intramoleculares que
estabilizan la doble hélice. Este hecho se produce a partir de un peso molecular de
uno o dos millones; por debajo de este peso molecular se comporta como una varilla
ligeramente flexible. La flexibilidad del DNA parece
deberse a pequeñas distorsiones en la molécula
que le permiten curvarse ligeramente.
Los DNAs circulares virales, de pequeño tamaño,
cuando se aíslan aparecen superenrollados
negativamente. El DNA superenrollado es la forma
común de la mayor parte del DNA de las células
vivas; así el DNA cromosómico bacteriano está
organizado en bucles aislados, que se comportan
como anillos que pueden superenrollarse
independientemente. El superenrollamiento es un
mecanismo para regular la transcripción (Gutierrez
y Pertierra, 2009).

Ácido ribonucleico (ARN)

Estructura primaria
Los ácidos ribonucleicos son polímeros de ribonucleótidos, con un elevado número
de unidades. Los ribonucleótidos adyacentes están unidos por enlaces 3´,5´-
fosfodiéster. Las cadenas de RNA, al igual que las de DNA, tienen polaridad, con
un 3´-OH libre en un extremo y un 5´-P en otro; elextremo 5´se escribe a la izquierda
(Gutierrez y Pertierra, 2009).

El polirribonucleótido puede representarse de la siguiente forma:

También como pApgpCpUpC o como AgCUC.

Las moléculas de RNA son hebras simples; las proporciones de los diferentes
ribonucleóticos varían según las clases de RNA, su origen biológico y el estado de
nutrición del organismo del que procede.

Tipos de ARN
 RNA mensajero (mRNA): Es el molde para la síntesis de proteínas, es
decir, traslada la información genética desde el DNA a los ribosomas, donde
se produce la síntesis de cadenas polipeptídicas. Son moléculas grandes,
con más de 5.000 nucleótidos.
 RNA de transferencia (tRNA): Es el adaptador en la síntesis de proteínas,
contiene un centro de unión de aminoácido y un centro de reconocimiento
del molde o anticodón. Cada molécula de tRNA transporta un aminoácido
específico activado hasta el lugar de la síntesis proteica. Son moléculas
 pequeñas de unos 75-85 nucleótidos. Tienen entre 10 y 15% de sus bases
modificadas, presentan: inosina, inosina metilada en posición 1, guanina
metilada en posición 1, guanina dimetilada en el N hexocíclico, seudo-uridina,
ribotimidina (T) y dihidrouridina (UH2)
 RNA ribosómico (rRNA): Forma parte de los ribosomas asociado con
proteína. En células procarióticas se distinguen tres tipos de rRNA: 23S, 16S
y 5S; en las células eucarióticas se distinguen: 28S, 18S, 5,8S y 5S. Son
ricos en guanina y citosina y tienen muy poca seudo-uridina.

Estructura secundaria
La molécula de RNA está formada por una única cadena polinucleotídica, sin
embargo no es lineal, sino que forma estructuras irregulares parcialmente
helicoidales mediante puentes de hidrógeno entre secuencias complementarias
antiparalelas; las bases que se unen siguen la complementariedad de Watson y
Crick (A:U y g:C), aunque no de forma estricta, ya que las hélices pueden incluir
bases no apareadas y apareamientos no-Watson-Crick (g:U). La estructura
secundaria del RNA depende de su estructura primaria, es decir, de la secuencia
de nucleótidos y, en muchos casos, es importante para la propia función de las
moléculas de RNA. El elemento estructural más importante en el RNA es la forma
A de doble hélice que se forma en las regiones apareadas. Las estructuras
secundarias más frecuentes en el RNA son: bucles en horquilla, bucles internos y
salientes. Los rRNA presentan numerosos bucles de apareamiento,
aproximadamente el 70% de la molécula (Gutierrez y Pertierra, 2009).
Los tRNA presentan numerosas bases modificadas, son modificaciones
postranscripcionales que influyen decisivamente en la estructura secundaria de los
tRNAs, puesto que generan zonas monocatenarias, que no pueden formar puentes
de hidrógeno, en la cadena. Su estructura secundaria tiene forma de hoja de trébol
y presenta las siguientes características:
 En el extremo 5′ tienen ácido
guanílico.
 El brazo UH2 se llama así por
presentar dihidrouridina; reconoce
la aminoacil-tRNA-sintetasa.
 El brazo del anticodón, que
reconoce el codón del mensajero,
tiene 7 bases desapareadas: 5′pyr-
pyr-X-y-Z-pur-base3′.
 El brazo TΨC, contienen la
secuencia ribotimidina (T), seudo-
uridina (Ψ), citosina (C), es la zona
de interacción con el ribosoma

Estructura terciaria
Las bases no apareadas que forman los bucles de las horquillas de RNA pueden
interaccionar con secuencias distantes de la molécula de RNA, frecuentemente
mediante apareamientos tipo Watson-Crick, aunque también se producen
apareamientos no-Watson-Crick, así como otros tipos de puentes de hidrógeno,
como aquellos en los que participa el OH en 2′ de la ribosa. Todos los enlaces
contribuyen a formar la estructura terciaria de la molécula. De los RNAs, la
estructura terciaria mejor establecida es la de los tRNAs, determinada por difracción
de rayos X, que tiene forma de L, donde un extremo de la L corresponde al extremo
3′-OH de la molécula y el otro extremo de la L corresponde al anticodón, quedando
los bucles UH2 y TΨC juntos en el vértice. Esta estructura está estabilizada por
puentes de hidrógeno entre las bases de las zonas con estructura primaria; estos
puentes de hidrógeno no siguen en todos los casos, el patrón de Watson y
Crick(Gutierrez y Pertierra, 2009).

CAPÍTULO 2.- DETERMINACIÓN DE ESTRUCTURA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Los ácidos nucleicos son grandes macromoléculas compuestas por monómeros
llamados nucleótidos. El término polinucleótido se refiere a una sola molécula de
ácido nucleico. Mientras que el término ácido nucleico se refiere al hecho de que
estos polinucleótidos se detectaron por primera vez como moléculas ácidas en el
núcleo de las células eucariotas. Ahora se sabe que los ácidos nucleicos no están
confinados a los núcleos eucarióticos y que son abundantes en
el citoplasma y en los procariotas, que no tienen núcleo (Pratt y
Cornely, 2011).

A diferencia de los polipéptidos, con 20 diferentes aminoácidos

disponibles para polimerización, cada ácido nucleico está
formado por sólo cuatro nucleótidos distintos. Por ejemplo, los
residuos en el RNA contienen las bases adenina, citosina, guanina y uracilo,
mientras que en el DNA los residuos contienen adenina, citosina, guanina y timina.
En la polimerización participan los grupos fosfato y azúcar de los nucleótidos, que
se unen mediante enlaces fosfodiéster (Horton, et al., 2008).

Debido en parte a que los nucleótidos son menos variables en estructura y

comportamiento químico que los aminoácidos, los ácidos nucleicos tienden a
presentar estructuras más regulares que las proteínas. Esto concuerda con su
función principal de portadores de información genética, la cual está contenida en
su secuencia de residuos nucleótidos más que en su forma tridimensional. Algunos
ácidos nucleicos se doblan y pliegan en formas globulares compactas, al igual que
las proteínas (Horton, et al., 2008).

Los nucleótidos están compuestos por un azúcar de cinco carbonos, una base
nitrogenada heterocíclica y al menos un grupo fosfato. En los ribonucleótidos, el
azúcar es la ribosa; en los desoxirribonucleótidos, es la derivada desoxirribosa. Los
ribonucleósidos contienen tres grupos hidroxilo que se pueden fosforilar (2, 3 y 5),
y los desoxirribonucleósidos contienen dos de esos grupos hidroxilo (3 y 5). En los
nucleótidos naturales, los grupos fosforilo suelen estar unidos al átomo de oxígeno
del grupo 5-hidroxilo. Los nucleótidos 3′ y 5′ son nucleósidos con un grupo fosforilo
en el grupo 3′- o 5′-hidroxilo del azúcar, respectivamente. Dado que casi todos los
nucleótidos son 5′-, el prefijo “5′-” por lo general se omite cuando se les cita. Los
grupos fosforilo adicionales, ligados por enlaces anhídridos de ácido al grupo
fosforilo de un mononucleótido, forman nucleósido difosfatos y trifosfatos (Pratt y
Cornely, 2011).

Las bases nitrogenadas de los nucleótidos corresponden a dos familias conocidas

como purinas y pirimidinas. Son bases débiles relativamente insolubles en agua al
pH fisiológico. Sin embargo, dentro de las células la mayor parte de bases pirimidina
y purina se encuentran
como constituyentes de
nucleótidos y
polinucleótidos,
compuestos que son muy
hidrosolubles. Las bases adenina (A) y guanina (G) se conocen como purinas
porque se parecen al compuesto orgánico purina. Las bases citosina (C) y timina
(T) se conocen como pirimidinas porque se parecen al compuesto orgánico
pirimidina. Las purinas y pirimidinas son heterociclos que contienen nitrógeno,
estructuras cíclicas que contienen, además de carbono, otros (hetero) átomos,
como nitrógeno. De modo que el DNA contiene las bases A, C, G y T, mientras que
el RNA contiene A, C, G y U. El ácido ribonucleico (RNA) contiene la pirimidina
uracilo (U) en vez de timina (Murray, et al., 2010).

Los nucleósidos están formados por ribosa y desoxirribosa y una base heterocíclica.
En cada nucleósido, un enlace b-N-glicosídico conecta el C-1 del azúcar al N-1 de
la pirimidina o al N-9 de la purina. Por consiguiente, los nucleósidos son derivados
N-ribosilo o N-desoxirribosilo de las pirimidinas o las
purinas. La convención de numeración para los
átomos de carbono y nitrógeno de los nucleósidos
refleja que están formados por una base y un azúcar
de cinco carbonos, y cada uno de ellos tiene su propio esquema de numeración. La
designación de los átomos en las partes de purina y pirimidina tiene preferencia.

Los desoxinucleótidos se nombran de manera similar, y sus abreviaturas van

precedidas de la letra “d”. La contraparte desoxi sería monofosfato de
desoxiadenosina (dAMP), difosfato de desoxiguanosina (dGDP) y trifosfato de
desoxicitidina (dCTP).

Biosíntesis de nucleótidos purina

Con la excepción de protozoarios parásitos, todas las formas de vida sintetizan
nucleótidos purina y pirimidina. La síntesis a partir de intermediarios anfibólicos
procede a índices controlados apropiados para todas las funciones celulares. Con
el fin de lograr homeostasis, mecanismos intracelulares detectan y regulan el
tamaño del fondo común de nucleótido trifosfatos (NTP), que aumenta durante el
crecimiento, o la regeneración de tejido, cuando las células se están dividiendo con
rapidez. Los nucleótidos purina y pirimidina se sintetizan in vivo a índices
congruentes con la necesidad fisiológica. En las investigaciones tempranas de
biosíntesis de nucleótido se emplearon primero aves, y más tarde Escherichia coli
(Pratt y Cornely, 2011).

Precursores isotópicos de ácido úrico suministrados como alimento a palomas

establecieron la fuente de cada átomo de una purina. Tejidos de aves sirvieron como
una fuente de genes clonados que codifican para enzimas de la biosíntesis de
purina y las proteínas reguladoras que controlan el índice de biosíntesis de purina.
Los tres procesos que contribuyen a la biosíntesis de nucleótido purina son, en
orden de importancia decreciente:

 Síntesis a partir de intermediarios anfibólicos (síntesis de novo).

 Fosforribosilación de purinas.
 Fosforilación de nucleósidos purina.

Biosíntesis de nucleótidos pirimidina

El catalítico para la reacción inicial es la carbamoil fosfato sintasa II citosólica, una
enzima diferente de la carbamoil fosfato sintasa I mitocondrial de la síntesis de la
urea. De esta manera, la comparta mentalización proporciona un fondo común
independiente de carbamoil fosfato para cada proceso. El PRPP, un participante
temprano de la síntesis de nucleótido purina es un participante mucho más tardío
en la biosíntesis de pirimidina. La inspección de los componentes de la reacción en
revelará que, al igual que la biosíntesis de pirimidinas, la biosíntesis de los
nucleósidos purina es costosa desde el punto de vista energético (Pratt y Cornely,
2011).

Métodos de solución
Los ácidos nucleicos en las células se asocian invariablemente con proteínas. Una
vez que las células se han abierto, sus ácidos nucleicos deben ser desproteinizados.
Esto se puede lograr agitando la solución acuosa que contiene el complejo de ácido
proteína-nucleico con una mezcla de 25:24:1 de fenol, cloroformo y alcohol isoamilo.
La proteína se desnaturaliza y se extrae en la fase orgánica inmiscible con agua,
que se separa de la fase acuosa que contiene ácido nucleico por
centrifugación. También puede ser disociada por agentes desnaturalizantes como
detergentes, guanidinio. cloruro, o altas concentraciones de sal, y / o puede ser
degradado enzimáticamente por proteasas. En todos los casos, los ácidos
nucleicos, una mezcla de ARN y ADN, pueden aislarse por precipitación con etanol.

El ARN puede recuperarse de dicho precipitado tratándolo

con DNasa pancreática para eliminar el ADN. Por el contrario, el ADN puede
liberarse del ARN mediante el tratamiento con RNasa . Alternativamente, el ARN y
el ADN pueden separarse por ultracentrifugación. En todas estas y posteriores
manipulaciones, los ácidos nucleicos deben protegerse de la degradación por las
nucleasas tanto en los materiales experimentales como en las manos. Las
nucleasas pueden inhibirse por la presencia de agentes quelantes
como el ácido etilendiaminotetraacético , que secuestra los iones metálicos
divalentes que requieren las nucleasas para su actividad. En los casos en que no
se puede tolerar la actividad de nucleasas, todos los artículos de vidrio deben
esterilizarse en autoclave para desnaturalizar las nucleasas por calor y el
experimentador debe usar guantes de plástico. Sin embargo, los ácidos nucleicos
son generalmente más fáciles de manejar que las proteínas porque su falta, en la
mayoría de los casos, de una estructura terciaria compleja los hace relativamente
tolerantes a condiciones extremas (Murray, et al., 2010).

Cromatografía
Muchas de estas técnicas que se utilizan para separar proteínas y ácidos
nucleicos. Los oligonucleótidos pueden separarse fácilmente por HPLC,
particularmente cromatografía de fase inversa. Los ácidos nucleicos más grandes a
menudo se separan mediante procedimientos que incluyen cromatografía de
intercambio iónico y cromatografía de filtración en gel.

 La hidroxiapatita para aislar y fraccionar el ADN : el ADN bicatenario se une

a la hidroxiapatita (forma de fosfato de calcio) con más fuerza que la mayoría
de las otras moléculas. En consecuencia, el ADN puede aislarse
rápidamente haciendo pasar un lisado celular a través de una columna de
hidroxiapatita, lavando la columna con un tampón de fosfato de
concentración lo suficientemente baja como para liberar solo el ARN y las
proteínas, y luego eluyendo el ADN con una solución de fosfato más
concentrada. Además, el ADN monocatenario se eluye a partir de
hidroxiapatita en una concentración de fosfato más baja que el ADN
bicatenario

 Los ARNm pueden aislarse mediante cromatografía de afinidad:

una cromatografía de afinidad es útil para aislar ácidos nucleicos
específicos. Por ejemplo, la mayoría de los ARN mensajeros eucariotas
(ARNm) tienen una secuencia de poli (A) en sus 3 extremos. Se pueden
aislar en una matriz de agarosa o celulosa a la que se ha unido poli (U)
covalentemente. Las secuencias de poli ( A) se unen específicamente al poli
(U) complementario en alta sal y a bajas temperaturas y luego se pueden
liberar al alterar estas condiciones. Además, si se conoce la secuencia
(parcial) de un ARNm, la cadena de ADN complementaria puede sintetizarse
y usarse para aislar ese ARNm particular (Voet, et al,. 2010).
Electroforesis
Los ácidos nucleicos de un tipo determinado pueden separarse por electroforesis
de gel de poliacrilamida porque sus movilidades electroforéticas en estos geles
varían inversamente con sus masas moleculares. Sin embargo, los ADN de más de
unos pocos miles de pares de bases son demasiado grandes para penetrar incluso
un gel de poliacrilamida débilmente reticulado. Esta dificultad se supera
parcialmente mediante el uso de geles de agarosa. Al usar geles con un contenido
de agarosa apropiadamente bajo, se pueden fraccionar los ADN relativamente
grandes en varios rangos de tamaño. De esta manera, los plásmidos, por ejemplo,
pueden separarse del ADN cromosómico más grande de las bacterias.

 El ADN dúplex se detecta mediante tinción selectiva con agentes de

intercalación: las diversas bandas de ADN en un gel deben detectarse si se
van a aislar. El ADN bicatenario se tiñe fácilmente con cationes aromáticos
planos como el ion etidio y naranja de acridina. Estos tintes se unen al ADN
dúplex por intercalación (deslizándose entre los pares de bases apiladas),
donde exhiben una fluorescencia bajo luz UV que es mucho más intensa que
la del tinte libre. Tan solo 50 ng de ADN se pueden detectar en un gel tiñendo
con bromuro de etidio. El ADN y el ARN monocatenario también estimulan la
fluorescencia del ion etidio, pero en menor medida que el ADN dúplex. Las
desventajas de usar estos colorantes son que son mutágenos y deben
manipularse y eliminarse con precaución y que la exposición a la luz UV daña
el ADN. SYBR Safe, un colorante no mutagénico igualmente sensible
que emite fluorescencia cuando está unido al ADN bicatenario y es excitado
por la luz azul, evita estas dificultades.

 Los ADN muy grandes se separan mediante electroforesis de campo

pulsado: los tamaños de los ADN que se pueden separar mediante
electroforesis en gel convencional limitados a 100.000 pb incluso cuando los
geles contienen tan poco como 0.1% de agarosa (gel extremadamente frágil)
son usados. Sin embargo, el desarrollo de la electroforesis en gel de campo
pulsado (PFGE) por Charles Cantor y Cassandra Smith extendió este límite
 a los ADN con hasta 10 millones de pb (6.6 millones de kD). El aparato de
electroforesis utilizado en PFGE tiene dos o más pares de electrodos
dispuestos alrededor de la periferia de un gel de losa de agarosa. Los
diferentes pares de electrodos se pulsan secuencialmente durante tiempos
que varían de 0.1 a 1000 s dependiendo de los tamaños de los ADN que se
separan.

La electroforesis en gel del ADN requiere que estas moléculas alargadas se

abran paso a través de los canales laberínticos del gel más o menos en la
dirección del cátodo al ánodo. Si la dirección del campo eléctrico cambia
abruptamente, estos ADN deben reorientar sus ejes largos a lo largo de la
nueva dirección del campo antes de que puedan continuar su paso a través
del gel. El tiempo requerido para reorientar moléculas de ADN embebidas en
gel muy largas evidentemente aumenta con su tamaño. En consecuencia,
una elección juiciosa de distribución de electrodos y longitudes de pulso hace
que los ADN más cortos migren a través del gel más rápido que los ADN más
largos, lo que afecta su separación (Voet, et al,. 2010).

Ultracentrifugación
La ultracentrifugación en gradiente de densidad de equilibrio E en CsCl constituye
uno de los procedimientos de separación de ADN más utilizados. Por ejemplo, los
ADN eucariotas a menudo tienen fracciones menores que se separan de las
especies principales. Algunas de estas bandas satelitales consisten en ADN
mitocondrial y cloroplasto. Otra clase importante de ADN satélite está compuesta
por secuencias repetitivas que son segmentos cortos de ADN que se repiten
en tándem cientos, miles y, en algunos casos, millones de veces en un genoma. Del
mismo modo, los plásmidos pueden separarse del ADN cromosómico bacteriano
mediante ultracentrifugación en gradiente de densidad de equilibrio. El ARN es
demasiado denso para unirse en CsCl pero lo hace en soluciones de Cs2SO4. Los
híbridos de ARN-ADN se unirán en CsCl pero a una densidad mayor que el ADN
dúplex correspondiente. El ARN puede fraccionarse por ultracentrifugación zonal a
través de un gradiente de sacarosa. Los ARN se separan por esta técnica en gran
medida en función de su tamaño. De hecho, el ARN ribosómico, que constituye la
mayor parte del ARN celular, se clasifica según su velocidad de sedimentación; por
ejemplo, el ARN de la subunidad ribosómica pequeña de E. coli se conoce como
ARN 16S (Voet, et al,. 2010).

CAPÍTULO 3.- MÉTODOS GENERALES DE CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS

NUCLEICOS
Los métodos generales para el estudio de los ácidos nucleicos se basan en la
separación de estas moléculas del resto de las biomoleculas, es necesario recurrir
a las propiedades diferenciales del ADN y del ARN respecto del resto de
biomoleculas. Su cuantificación general se fundamenta en que presentan la
capacidad importante de absorción de ratificación electromagnética a 2260 nm,
debido a la presencia de las bases nitrogenadas.

Como la mayoría de técnicas, los métodos para el estudio de los ácidos nucleicos
se fundamentan en la estructura de estos compuestos.

Como métodos generales para una cuantificación de ácidos nucleicos se

contribuyen a las siguientes técnicas:

Determinación por espectrofotometría.

El ADN o el ARN se pueden cuantificar midiendo su absorción de luz ultravioleta a
260 nm en un espectrofotómetro. Deben usarse cubetas de cuarzo, ya que las
cubetas convencionales plásticas pueden absorber la luz en la región UV del
espectro a la que se realiza la medición de absorbancia de ácidos nucleicos.

Para realizar este tipo de medidas se toma en cuenta una alícuota de unos 5 oL de
disolución purificada de ADN o de ARN, y se diluye con agua hasta completar la
capacidad del volumen de la cubeta de cuarzo (entre 0,5 y 1 mL) a continuación se
procede a leer la absorbancia a 260 nm. Para comprobar la posible cuantificación
con proteínas, se lee también la absorbancia (A) a 280 nm y se mide la relación de
A260/A280. Si esta relación es próxima a 1,8 es probable que la absorción se deba
mayoritariamente a la presencia de ácidos nucleicos; si la relación es inferior a 1,6,
es probable que exista una importante cantidad de contaminantes, como proteínas
(debido a los aminoácidos aromáticos), fenol residual u otros compuestos orgánicos;
y si la relación es superior a 2,0 indica una probable degradación de los ácidos
nucleicos purificados o una posible contaminación con determinadas sustancias,
según la procedencia de la muestra. Para calcular la concentración de multiplica la
absorbancia medida a 260 nm por diferentes factores según trate de ADN, de ARN
o de un oligonucleótido:

Método de tinción con bromuro de etidio

El bromuro de etidio es un compuesto fluorescente que se
intercala entre las fases del ADN (figura 20.10) al producirse
dicha unión, cambian las propiedades de fluorescencia del
bromuro de etidio, incrementándose de forma muy
importante se emisión fluorescente en presencia de ADN
(figura 20.11). La fluorescencia obtenida es proporcional a
la cantidad de ADN presente. No obstante, es un método poco sensible y, además,
no es especifico del ADN, ya que el ARN también interacciona con el bromuro de
etidio; la interferencia del ARN puede eliminarse tratando las muestras con ARNasa
(Roca et al., 2003).

Método del ácido diamino benzoico (daba) para la determinación de ADN.

En este método se provoca la hidrolisis de los desoxirribonucleicos, y las
desoxirribosas libres reaccionan con el DABA dando un compuesto fluorescente
(figura 20.12), de manera que la fluorescencia producida es proporcional a la
concentración de ADN presente en la muestra.

CAPÍTULO 4.- DETERMINACIÓN DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS INDIVIDUALES

Una vez aislados los ácidos nucleicos del resto de las biomoleculas que a estas
acompañan en las muestras biológicas, debe determinarse cada uno en particular.
Al ser moléculas cargadas y con tamaños significativos pueden separarse por
electroforesis. En el caso de largas moléculas de ADN se deben realizar
previamente una ruptura en fragmentos y, como estos
fragmentos de ADN y delos ARNs son grandes,
normalmente se utilizan como soporte de electroforesis
de ácidos nucleicos la agarosa, que permite la
separación de estas moléculas por cribado molecular
ya que mantiene una relación carga/masa constante.
Se consigue buena separación por geles de agarosa
debido a que estos geles presentan un rango de
tamaños de poros que permiten la discriminación de ácidos nucleicos por tamaño
molecular, en cambio, al tener poros más pequeños
no permiten una buena separación de los
fragmentos grandes. En la figura 22.1 se muestra
la concentración adecuada de agarosa a emplear
según el rango de tamaños de los ácidos nucleicos
a separar (Roca et al., 2003).
Los ácidos nucleicos pueden visualizarse tiñendo los geles con diferentes
colorantes: bromuro de etidio, Sybr Green, Sybr Gold, etc. (figura 22.2).

Estudio del ADN

Estos métodos generalmente están encaminados a determinar diferencias entre las
secuencias del ADN, centrándose en analizar las mutaciones en un gen
determinado.

Uso de enzimas de restricción y Fingerprinting

Puede fragmentarse por acción de productos químicos o por l acción de las enzimas
de restricción. Estas enzimas se encuentran en gran variedad de las especies
bacterianas y se caracterizan por reconocer secuencias específicas de nucleótidos
y producir cortes característicos en ellas. (Figura 22.3).

Si las muestras de ADN de distintos individuos, en

los geles de agarosa se podrán observar bandas
correspondientes a fragmentos de tamaño
característico. El análisis de estas bandas
exclusivas para cada individuo, por este tipo de
técnica se conoce como Fingerpriting y tiene una
importante aplicación en pruebas de paternidad y
en medicina forense, asi como el estudio de la
presencia de polimorfismos, etc. (Roca et al.,
2003).
Southern blot
Permite detectar la presencia de una secuencia o región específica y, en algunos
casos, la detección de mutaciones. Esta técnica se basa en transferir a una
membrana el ADN separado por electroforesis, para su posterior análisis.

Este tipo de ensayos requieren una purificación y fragmentación previa del ADN,
una vez fragmentado el ADN, los diferentes segmentos son separados por
electroforesis en geles de agarosa. (Figura 22.3). Los fragmentos de ADN son
transferidos a membranas de nitrocelulosa o de nilón cargadas positivamente para
inmovilizarlos, de manera que pueda procederse después a la hibridación de las
membranas con sondas específicas (figura 22.5). De esa manera una mayor
sensibilidad en la técnica y también se puede estudiar la presencia de secuencias
características de los individuos estudiados (figura 22.6)
Análisis de RFLPs
La presencia de una determinada mutación en un gen o en el promotor del mismo
puede determinarse mediante este análisis. La formación de fragmentos de ADN de
distinto tamaño cuando son tratados con una endonucleasa especifica. La
endonucleasa se elige según la mutación a estudiar. Una vez tratadas las muestras
con las enzimas, se crean nuevas dianas para la endonucleasa debido a la
mutación, las muestras que presentan la mutación dará lugar a fragmentos más
pequeños. Así una separación electroforética de los fragmentos producidos
permitirá identificar la presencia de la mutación o no en los individuos estudiados.
(Figura 22.7)

DOT BLOT Y SLOT BLOT

Esta técnica permite estudiar la cantidad de ARNm que hay en un momento
determinado inmovilizando las muestras sobre una membrana de nitrato de celulosa
o de nilón cargada positivamente. Los ácidos nucleicos se unen por interacciones
electrostáticas, pudiendo formar enlaces covalentes con la membrana por
exposición al calor o a la radiación ultravioleta.

La matriz solida sobre la que se transfieren las especies de ARN permite que se
procesen al mismo tiempo múltiples muestras y minimizar la variabilidad en el
tratamiento de estas. El hecho de que estas muestras a estudiar y las muestras
control estén expuestas a los mismos reactivos y condiciones en todo momento,
incrementa la consistencia interna del ensayo y permite la comparación de los
resultados entre las diferentes muestras (Roca et al., 2003).

Las muestras de ARN desnaturalizado se depositan en los pocillos y son

succionados por un sistema de generación de vacío que de forma que el ARN
queda depositado sobre la membrana (cargada positivamente). A continuación se
fija covalentemente a las muestras de ARN a la membrana por calor o por
exposición a radiaciones ultravioleta (Roca et al., 2003).

NORTHERN BLOT

Permite realizar estudios de la expresión de genes. Los ensayos aportan

información del peso molecular y determinan la cantidad de estos, de forma
semicuantitativa. Las moléculas de ARN pueden hibridarse con fragmentos de la
misma molécula o con otras moléculas del ARN, pero al mismo tiempo interfieren
en la secuencia de ARN en los geles de agarosa.
 El ARN una vez separados por electroforesis deben
ser inmovilizados por hibridación y posterior a
detectar las especies de interés. Las muestras de
ARN desnaturalizado se depositan en los pocillos y
son succionados por un sistema de generación de
vacío que de forma que el ARN queda depositado
sobre la membrana (cargada positivamente). A
continuación se fija covalentemente a las muestras
de ARN a la membrana por calor o por exposición a
radiaciones ultravioleta (Roca et al., 2003).

RT-PCR
Este método permite la semicuantificacion de los niveles de ARNm, una
retrotranscripcion del ARN aislado de la muestra o muestras de interés por acción
de una enzima con actividad retrotranscriptasa (RT). Se obtiene asi del ADN
complementario (ADNc) y puede controlar las diferencias en el proceso de
amplificación dado entre los distintivos tubos de análisis, se coamplifica en cada
tubo otro ADNc correspondiente a un gel constitutivo que se utiliza como patrón
interno del proceso, para el segundo gen se utiliza primers que provoca la
amplificación de un fragmento de este gen de una longitud diferente a la longitud
del fragmento del gen que quiere estudiarse. Los productos de amplificación son
separados por electroforesis en geles de agarosa y visualizados con bromuro de
etidio, observándose dos bandas por tubo de amplificación (figura 22.19) los geles
son utilizados por una captura de imagen y la intensidad de cada banda se
determina con ayuda de un programa informático de cuantificación (Roca et al.,
2003).
La determinacion cuantitativa de los niveles de ARNm se fundamenta en la
retrotranscripcion del ARNm salvalvaje y en la amplificacion de un fragmento de
este gen, junto con la coamplificacion de un patron interno que se añade a la
muestra. Esto permite inferenciar el producto del ARNm mutante del ARNm salvaje,
tras incubar los productos de la RT-PCR con la enzima de restriccion.

Al igual que en otras tecnicas cuantitativas, se utilizan patrones externos qu

eproprocionan una curva patron para poder determinar los niveles de mensajero
presentes ne la muestra. Los productos amplificados son separados por
electroferisis y se realiza posteriormente un SOUTHEM BLOT y una hibridacion con
un asonda especifica, seguida de un relevado inmunologico (Roca et al., 2003).

CAPÍTULO 5.- REPLICACIÓN, REPARACIÓN Y RECOMBINACIÓN DEL ADN

La transferencia de la información genética de una generación a la siguiente ha
confundido a los biólogos desde los tiempos de Aristóteles. Hoy, 2 500 años
después, puede explicarse por qué “lo semejante engendra lo semejante”. Ya que
la información genética está contenida en el ADN, la consecuencia es que la
transferencia de la información de una célula parental (o precursora) a dos células
hijas requiere una duplicación exacta del ADN, y ese proceso se llama replicación
del ADN.
La estructura que propusieron Watson y Crick en 1953 de inmediato sugirió un
método de replicación. Como las dos hebras del ADN doble helicoidal son
complementarias, la secuencia de nucleótidos de una especifica automáticamente
la secuencia de la otra. Watson y Crick propusieron que las dos hebras de la hélice
se desenrollan durante la replicación del ADN, y que cada hebra del ADN actúa
como plantilla para sintetizar una hebra complementaria. De esta forma, la
replicación del ADN produce dos moléculas
hijas de doble hebra, y cada una contiene
una hebra parental y una hebra recién
sintetizada. A este modo de replicación se
le llama semiconservativa, porque una
hebra del ADN parental se conserva en
cada molécula hija (horton, 2008).

En una serie de experimentos, Matthew

Meselson y Franklin W. Stahl demostraron,
en 1958, que en realidad el ADN se replica
en forma semiconservativa, como habían
indicado Watson y Crick. Más o menos al
mismo tiempo comenzaron a aparecer
informes de la purificación y las propiedades
de algunas de las enzimas que intervienen en
la replicación. La primera ADN polimerasa
fue purificada en 1958 por Arthur Kornberg, a
quien se le otorgó el Premio Nobel por este
logro. El mecanismo de la replicación actual
es mucho más complejo, y más interesante,
que el sencillo esquema de la figura 20.1.
Para establecer los pasos del mecanismo de replicación se necesitó una
combinación de análisis bioquímicos y genéticos. Gran parte de lo que se conoce
acerca de la replicación del ADN proviene de estudios de las enzimas en
Escherichia coli, y de sus bacteriófagos. Los resultados de esos estudios han
demostrado cómo se ensamblan grandes cantidades de polipéptidos en complejos
que efectúan una serie complicada de reacciones. El complejo de replicación de
ADN es como una máquina, o una fábrica, cuyas partes son de proteína. Algunos
de los polipéptidos componentes tienen actividad parcial en el aislamiento, pero
otros sólo son activos en asociación con la máquina completa de proteínas. Hay
tres etapas distintas en la replicación del ADN:

1) La iniciación comienza con el ensamble correcto de las proteínas de

replicación en el sitio donde debe comenzar la replicación de ADN.
2) Durante la etapa de elongación, el ADN se replica en forma semiconservativa
cuando el complejo cataliza la incorporación de nucleótidos en las hebras
crecientes de ADN.
3) Por último, cuando termina la replicación, se desarma la máquina de
proteínas y las moléculas hijas se separan para poderse segregar en sus
nuevas células.

La replicación de ADN en cromosomas es bidireccional

El cromosoma de E.coli es una molécula de ADN grande, circular y de doble hebra
de 4.6X103 kilopares de bases (kb). La replicación de este cromosoma comienza en
un sitio único llamado origen de replicación, y sigue en forma bidireccional hasta
que se encuentran los dos complejos de replicación en el sitio de terminación, que
es donde se detiene la replicación (Figura20.2) .
La máquina de proteínas que efectúa la reacción de polimerización se llama
replisoma. Contiene varias proteínas diferentes que se requieren para una
replicación rápida y fiel del ADN. Un replisoma está en cada una de las dos
horquillas de replicación, los puntos donde se destuerce el ADN parental.

Al desenrollarse el ADN parental en una horquilla de replicación, cada hebra se usa

como plantilla de síntesis para una nueva hebra. En E. coli, la velocidad de
movimiento de una horquilla de replicación es de unos 1 000 pares de bases por
segundo. En otras palabras, cada una de las dos nuevas hebras se extiende a la
velocidad de 1 000 nucleótidos por segundo. Como hay dos horquillas de replicación
que se mueven con esa velocidad, todo el cromosoma de E. coli se puede duplicar
aproximadamente en 38 minutos. Los cromosomas eucarióticos son moléculas de
ADN lineales y de doble hebra que suelen ser mucho mayores que los cromosomas
de las bacterias. Por ejemplo, los grandes cromosomas de la mosca de la fruta,
Drosophila melanogaster, tienen unos 5x104 kb, 10 veces más que el cromosoma
de E. coli. En los eucariotas, como en E. coli, la replicación es bidireccional. Pero,
aunque el cromosoma de E. coli tiene un solo origen de replicación, los cromosomas
de los eucariotas tienen varios sitios donde se inicia la síntesis del ADN. Aunque la
velocidad de movimiento de la horquilla en los eucariotas es menor que en las
bacterias, la presencia de muchos orígenes independientes de replicación permite
copiar a los mayores genomas eucarióticos aproximadamente en el mismo tiempo
que los genomas procarióticos (horton, 2008)

ADN polimerasa
La síntesis de una nueva hebra de ADN se alcanza por la adición sucesiva de
nucleótidos al extremo de una cadena creciente. Esa polimerización es catalizada
por enzimas llamadas ADN polimerasas dirigidas por ADN, o simplemente ADN
polimerasas. E. coli contiene tres ADN polimerasas diferentes; cada proteína se
identifica con un número romano de acuerdo con el orden de su descubrimiento. La
ADN polimerasa I repara ADN y participa en la síntesis de una de las hebras de
ADN durante la replicación. La ADN polimerasa II tiene un papel en la reparación
de ADN. La ADN polimerasa III es la principal enzima de replicación de ADN: es
responsable del alargamiento de la cadena durante la replicación del ADN, y es la
parte esencial del replisoma (horton, 2008).
La ADN polimerasa III contiene 10 subunidades distintas de polipéptido, y es, con
mucho, la mayor de las tres ADN polimerasas (tabla 20.1). La holoenzima purificada
es un dímero asimétrico formado por dos copias de cada polipéptido, dentro de esta
estructura, los polipéptidos α, ε y θ se combinan para formar dos complejos
centrales, responsables de las reacciones de polimerización. Las subunidades β
forman una abrazadera deslizante que rodea a cada una de las dos hebras de ADN
en la horquilla de replicación. La mayor parte de las subunidades restantes forman
el complejo y o “tensor de la abrazadera”, que ayuda en el ensamble del replisoma
y también para mantener a la enzima unida al ADN parental durante las reacciones
sucesivas de polimerización (horton, 2008).

Elongación de la cadena; reacción de transferencia de grupo nucleotidilo

Virtualmente todas las ADN polimerasas, incluyendo la polimerasa III, sintetizan
ADN agregando nucleótidos uno por uno al extremo 3´ de la cadena creciente. El
sustrato de nucleótido es un desoxirribonucleósido 5´-trifosfato (dNTP). El
nucleótido específico se determina por apareamiento de bases Watson-Crick a la
hebra de la plantilla; la adenina (A) se aparea con la timina (T) y la guanina (G) se
aparea con la citosina (C). Como la reserva de cada dNTP en una célula es
aproximadamente igual, eso quiere decir que, en promedio, la enzima pasa tres
cuartos de su tiempo discriminando contra dNTP incorrectos que se hayan difundido
al sitio catalítico donde tratan de aparear bases con la hebra de la plantilla. La ADN
polimerasa III cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el dNTP entrante
y la cadena en crecimiento. El dNTP entrante forma un par de bases con un residuo
de la hebra de plantilla. Una vez formado el par de bases correcto, el grupo 3´-
hidroxilo libre de la cadena naciente de ADN hace un ataque nucleofílico al átomo
de fósforo α del dNTP entrante. Esta reacción causa la adición de un nucleósido
monofosfato y el desplazamiento de pirofosfato. La hidrólisis siguiente del
pirofosfato, por abundante enzima pirofosfatasa, hace que la reacción de
polimerización sea irreversible en esencia. La dirección de la polimerización
(crecimiento de la cadena) se define como 5´ → 3´, y se lee por los átomos de
carbono en el anillo de azúcar del residuo recién agregado (horton, 2008).

Después de cada reacción de adición, la ADN polimerasa III avanza un residuo, se

une un nuevo nucleótido, y se efectúa otra reacción de transferencia de grupo
nucleotidilo. Este mecanismo asegura que la cadena nueva se extienda por la
adición escalonada de nucleótidos sencillos que estén bien alineados por
apareamientos de bases, con la hebra de plantilla. Como es de esperar, la ADN
polimerasa III no puede sintetizar ADN en ausencia de una plantilla, ni puede
adicionar moléculas en ausencia de un extremo 3´ de una cadena ya existente. En
otras palabras, la ADN polimerasa III requiere tanto una plantilla como un cebador
para que suceda la síntesis, como se ve en la Figura 20.6. Como se indicó antes, la
replicación de ADN en el interior de la célula se efectúa a una velocidad aproximada
de 1 000 nucleótidos por segundo. Es la velocidad más rápida que se conoce de
todas las de polimerización in vivo. Pero, la velocidad de polimerización catalizada
por ADN polimerasa III in vitro es mucho menor, lo que indica que la enzima aislada
carece de algunos componentes necesarios para su actividad total. Sólo cuando se
arma el replisoma completo la polimerización in vitro avanza aproximadamente con
la misma velocidad que en el interior de la célula (Horton, 2008).
Permanencia de la ADN polimerasa lll unida a la horquilla de replicación
Cuando se inicia la síntesis de ADN, la polimerasa permanece unida a la horquilla
de replicación hasta que se completa la replicación. El extremo 3´ de la cadena
creciente queda asociado al sitio activo de la enzima, en tanto que se adicionan
muchos nucleótidos uno tras otro. Las enzimas que permanecen unidas a sus
cadenas nacientes durante muchos pasos de polimerización se llaman procesivas.
Como parte de la replisoma, la holoenzima ADN polimerasa III es muy procesiva.
Eso quiere decir que sólo se necesita una pequeña cantidad de moléculas de ADN
polimerasa III para replicar todo el cromosoma. La procesividad también explica la
gran velocidad de replicación del ADN (Horton, 2008).

La procesividad de la holoenzima ADN polimerasa III se debe, en parte, a las

subunidades β de la enzima. Esas subunidades no tienen actividad propia, pero
cuando están ensambladas en la holoenzima forman un anillo que puede rodear por
completo a la molécula de ADN. El anillo se forma con dos subunidades β que
forman un dímero cabeza con cola. Cada una de las subunidades contiene tres
dominios similares, formados por un pliegue β de emparedado con dos hélices a en
la orilla interior, que interactúan con ADN.

Las subunidades β funcionan así como una abrazadera deslizante, asegurando la

polimerasa al sustrato de ADN. Como se verá después, al incorporarse la ADN
polimerasa III a una máquina de proteínas aún mayor en la horquilla de replicación,
se asegura más que la enzima permanezca asociada a las cadenas nacientes de
ADN durante la polimerización (Horton, 2008).
Lectura de prueba para corregir errores
La holoenzima ADN polimerasa III también posee una actividad de 3´→
5´exonucleasa. Esta exonucleasa, cuyos sitios activos están principalmente dentro
de la subunidad ε, puede catalizar la hidrólisis del enlace fosfodiéster que une al
residuo terminal 3´ con el resto de la cadena de polinucleótido en crecimiento. Así,
la holoenzima ADN polimerasa III puede catalizar tanto la elongación como la
degradación de la cadena. La actividad de exonucleasa permite que la holoenzima
“corrija” o “edite” el ADN recién sintetizado, para corregir pares de bases mal
apareados. Cuando la ADN polimerasa III reconoce una distorsión en el ADN
producido por una base mal apareada, la actividad exonucleasa de la enzima
cataliza la eliminación del nucleótido mal apareado antes de que continúe la
polimerización (Horton, 2008).

Síntesis simultánea de dos hebras por la ADN polimerasa

La ADN polimerasa cataliza la elongación de la cadena sólo en la dirección 5´→3´,
ya que las dos hebras de ADN son antiparalelas la síntesis 5´→3´ usando una hebra
de plantilla avanza en la misma dirección que el movimiento de la horquilla, pero la
síntesis 5´→3´ usando la otra hebra de plantilla sucede en la dirección contraria al
movimiento de la horquilla.
 La nueva cadena formada por
polimerización en la misma dirección
que la del movimiento de la horquilla se
llama hebra líder. La nueva hebra
formada por polimerización en la
dirección contraria se llama hebra
retrasada. Recuérdese que el dímero
de la holoenzima ADN polimerasa lll
contiene dos complejos centrales que
pueden catalizar la polimerización. Uno
de ellos es responsable de la síntesis
de la hebra líder y el otro de la síntesis
de la hebra retrasada (Horton, 2008).

Síntesis discontinua de la hebra retrasada

La hebra líder se sintetiza en forma de un polinucleótido continuo, comenzando en
el origen y terminando en el sitio de terminación. En contraste, la hebra retrasada
se sintetiza en forma discontinua, en tramos cortos, y en dirección contraria al
movimiento de la horquilla. Estos tramos de hebra retrasada se unen entonces por
una reacción separada. Un experimento que ilustra la síntesis discontinua del ADN:
 El ADN de E. coli se marca con un El
experimento detecta dos tipos de
moléculas marcadas con ADN:
moléculas muy grandes de ADN que en
conjunto contienen más o menos la
mitad de la radiactividad del ADN
parcialmente replicado, y fragmentos
más cortos de ADN, de unos 1 000
residuos, que en conjunto contienen la
otra mitad de la radiactividad. Las
moléculas grandes de ADN proceden de
la síntesis continua de la hebra líder; los
fragmentos más cortos proceden de la
síntesis discontinua de la hebra
retrasada. Los tramos cortos de hebra
retrasada de ADN se llaman
fragmentos de Okazaki en honor de su
descubridor, Reiji Okazaki. El
mecanismo general de replicación de
ADN se llama semidiscontinuo, para
subrayar los distintos mecanismos para
replicar cada hebra (Horton, 2008).

Cada fragmento de Okasaki inicia con un ARN cebador

Claramente la síntesis de la hebra retrasada es discontinua, pero no es obvio cómo
se inicia la síntesis de cada fragmento de Okazaki. El problema es que ninguna ADN
polimerasa puede iniciar la polimerización; sólo puede agregar nucleótidos a
polímeros existentes. Esta limitación no presenta dificultades para la síntesis de la
hebra líder, porque una vez que esa síntesis de ADN se está efectuando, se
agregan nucleótidos en forma continua a una cadena creciente. Sin embargo, en la
hebra retrasada la síntesis de cada fragmento de Okazaki requiere un nuevo evento
de iniciación. Eso se hace formando trozos cortos de ARN en la horquilla de
replicación. Estos cebadores de ARN son complementarios a la plantilla de la hebra
retrasada. La ADN polimerasa extiende cada cebador desde su extremo 3´. La
síntesis de la hebra líder también se inicia con un cebador de ARN, pero sólo se
requiere ese único cebador para toda la hebra:

El uso de cebadores cortos de ARN evita la limitación impuesta por el mecanismo

de la ADN polimerasa, es decir, que no puede iniciar desde la nada la síntesis de
ADN. Los cebadores son sintetizados por una enzima ARN polimerasa dependiente
de ADN, llamada primasa, que es producto del gen dnaG en E.coli. La estructura
cristalina tridimensional del dominio catalítico de dnaG revela que su plegamiento y
su sitio activo son distintos a los de las muy estudiadas polimerasas, lo que parece
indicar que puede emplear un mecanismo enzimático novedoso. La primasa es
parte de un complejo mayor llamado primosoma, que contiene muchos otros
polipéptidos además de la primasa. El primosoma, junto con la ADN polimerasa III,
es parte del replisoma. Al avanzar la horquilla de replicación, se desenrolla el ADN
parental y quedan expuestos más ADN de una hebra. Más o menos una vez por
segundo, la primasa cataliza la síntesis de un ARN cebador corto usando este ADN
de una hebra como plantilla. Los cebadores sólo tienen pocos nucleótidos de
longitud. Ya que la horquilla de replicación avanza a una velocidad de 1000
nucleótidos por segundo, se sintetiza un cebador más o menos cada 1 000
nucleótidos que se incorporan. La ADN polimerasa III cataliza la síntesis de ADN en
dirección 5´→ 3´ al prolongar cada ARN cebador corto (Horton, 2008).

Unión de fragmentos de Okazaki por acción de ADN polimerasa l y ADN ligasa

Los fragmenos de Okazaki al final se unen para producir una cadena continua de
ADN. Esta reacción se efectúa en tres pasos: eliminación del ARN cebador, síntesis
del ADN de repuesto y sellado de los fragmentos adyacentes de ADN. Los pasos
se efectúan por la acción combinada de ADN polimerasa I y ADN ligasa. La ADN
polimerasa I de E. coli fue la primera enzima en encontrarse que puede catalizar la
síntesis de ADN usando una hebra de plantilla. En un solo polipéptido, la ADN
polimerasa I contiene las actividades de la holoenzima ADN polimerasa III: actividad
de polimerasa 5´ → 3´ y actividad exonucleasa de corrección 3´ → 5´.

La ADN polimerasa I se puede dividir con ciertas enzimas proteolíticas para generar
un fragmento pequeño que contiene la actividad exonucleasa 5´ → 3´ y un
fragmento mayor que retiene las actividades de polimerización y corrección. El
fragmento mayor consiste en los 605 residuos de aminoácido C-terminales, y el
fragmento menor contiene los restantes 323 residuos N-terminales. El fragmento
mayor se llama fragmento Klenow, y se usa mucho para secuenciar ADN y en
muchas otras técnicas que necesitan síntesis de ADN sin degradación 5´ → 3´.

La estructura del fragmento de Klenow

acomplejado con un fragmento de ADN que
contiene un par terminal de bases mal apareado.
El extremo 3´ de la hebra naciente está colocado
en el sitio de la exonucleasa 3´ → 5´en la enzima.
Durante la polimerización, la hebra de plantilla
ocupa la ranura en la parte superior de la
estructura, y la enzima enlaza al menos 10 pares
de bases de ADN de doble hebra.
Muchos de los residuos de aminoácido que intervienen en el enlazamiento de ADN
son parecidos en todas las ADN polimerasas, aunque, por lo demás, puede ser que
las enzimas sean muy distintas en estructura tridimensional y en secuencia de
aminoácidos (Horton, 2008).

La actividad exonucleasa 5´ → 3´ única de la ADN polimerasa I elimina el ARN

cebador al principio de cada fragmento de Okazaki. (Como no es parte del
fragmento de Klenow, no se muestra la exonucleasa 5´ → 3´ pero estaría ubicado
en la parte superior de la estructura, junto a la ranura donde entra la hebra de
plantilla). Al eliminarse el cebador, la polimerasa sintetiza ADN para rellenar la
región entre los fragmentos de Okazaki, y a ese proceso se le llama traslación de
muesca.

Traslación de muesca:
1) La ADN polimerasa I reconoce y se une a la muesca entre unión de
fragmentos Okazaki por la acción combinada de ADN polimerasa I y ADN
ligasa.

2) La ADN polimerasa I prolonga el fragmento de Okazaki, en tanto que su

actividad de exonucleasa 5´ → 3´ elimina al ARN cebador. Este proceso se
llama traslación de muesca y da como resultado el movimiento de la muesca
a lo largo de la hebra retrasada.
 3) La ADN polimerasa I se disocia después de prolongar 10 a 12 nucleótidos el
fragmento de Okazaki. La ADN ligasa se une a la muesca.

4) La ADN ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster, que sella la

muesca y crea una hebra retrasada continua. A continuación, la hebra se
disocia del ADN.

El extremo 3´ de un fragmento de Okazaki y el extremo 5´ del siguiente cebador.

Entonces la exonucleasa 5´ → 3´ cataliza la eliminación hidrolítica del primer
nucleótido de ARN, en tanto que la polimerasa 5´ → 3´ adiciona un desoxinucleótido
al extremo 3´, de la cadena de ADN. De esta forma, la enzima recorre la muesca a
lo largo de la hebra. Después de completar 10 a 12 ciclos de hidrólisis y
polimerización, la ADN polimerasa I se disocia del ADN dejando atrás dos
fragmentos de Okazaki separados por una muesca en el esqueleto de fosfodiéster.
La eliminación de ARN cebadores por la ADN polimerasa I es parte esencial de la
replicación del ADN, porque el producto final debe estar formado totalmente por
ADN de doble hebra (Horton, 2008).

El último paso en la síntesis de la hebra retrasada de ADN es la formación de una

unión fosfodiéster, entre el grupo 3´-hidroxilo en el extremo de un fragmento de
Okazaki, y el grupo 5´-fosfato de un fragmento de Okazaki adyacente. Este paso
es catalizado por la ADN ligasa. Las ADN ligasas en las células eucarióticas y en
células infectadas por bacteriófagos requieren ATP como cosustrato. En contraste,
la ADN ligasa de E. coli usa NAD+ como cosustrato (Horton, 2008).
CAPÍTULO 6.- MÉTODOS DE AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS
La aplicación de las técnicas de biología molecular al análisis de genomas
complejos depende de la capacidad de aislar fragmentos puros de ADN y ARN y,
en el caso de los primeros, también de poder aislar moléculas de un elevado peso
molecular.

Para purificar ácidos nucleicos hay que partir de una disolución acuosa

Método de aislamiento y purificación de ADN

Las muestras de tejido se recogen y se congelan en nitrógeno líquido. A
continuación, se procede a la digestión y lisis del tejido con reactivos adecuados
(por ejemplo, empleando proteinasa K).

La purificación de ADN de muestras de sangre es difícil porque la sangre es una

mezcla compleja que contiene células, proteínas, metabolitos, etc. Más del 99% de
las células de la sangre son eritrocitos, que no tienen núcleo y, por lo tanto, carecen
de ADN. El ADN de la sangre debe aislarse de los leucocitos y debe estar libre de
contaminantes que interfieran en métodos posteriores; así, por ejemplo, la
presencia del grupo hemo provoca una fuente inhibición de la Taq ADN polimerasa
durante el proceso de PCR. Las muestras de sangre se recogen en tubos con EDTA
como anticoagulante y, generalmente, deben procesarse inmediatamente. La
separación de los eritrocitos respecto de los leucocitos se realiza vía lisis
preferencial de los eritrocitos. Después se lisan los glóbulos blancos con un
detergente aniónico fuerte, para proseguir con un proceso general de aislamiento
de ADN (Smit y Wood, 1997).

El gran tamaño del ADN procedente de células de mamíferos dificulta su aislamiento

y purificación. La elección del método de extracción de ADN debe estar determinada
por el uso que se hará de la muestra, ya que el tamaño final del material purificado
diferirá según el método.

Los métodos generales de purificación de ADN pueden dividirse en dos fases:

- Un procedimiento suave de lisis de las células y de solubilidad del ADN.

- Una segunda fase con uno o varios métodos enzimáticos o químicos de
eliminación de contaminantes (proteínas, ARN y otras macromoléculas).

El proceso de extracción con fenol: cloroformo se basa en la capacidad que

tienen los disolventes orgánicos de neutralizar y precipitar las proteínas en
disolución, mientras que no afectan en este sentido a los ácidos nucleicos. Se
ha desarrollado un gran número de procesos basados en la utilización de fenol,
así como varios aditivos que aumentan la inhibición de la actividad nucleasas o
sirven para reforzar una desproteinizacion más eficaz por parte del fenol (por
ejemplo, el cloroformo). La mayoría de los métodos lleva acoplado un proceso
de lisis celular utilizando un detergente, que además permite la disociación de
los complejos proteína-nucleótidos (Smit y Wood, 1997).
El aislamiento y la concentración de ADN y ARN en disoluciones acuosas se realiza
primero eliminando los lípidos de la muestra mediante una extracción con fenol:
cloroformo, seguida de la precipitación con etanol de los ácidos nucleicos, que se
encuentran en la fase acuosa. En el proceso de extracción con disolventes
orgánicos, las proteínas son desnaturalizantes y se reparten en la fase orgánica o
entre la interfase orgánica/acuosa. Durante la precipitación con etanol, en presencia
de sales, el fenol y el cloroformo residual se mantienen en disolución, mientras que
los ácidos nucleicos, en forma de sal, forman un precipitado blanco que puede
recogerse fácilmente por centrifugación (Smit y Wood, 1997).

Métodos de aislamiento y purificación de ARN

El aislamiento de ARN no difiere en gran medida del aislamiento del ADN, aun que
presenta un problema importante: la posible contaminación de las muestras con
ribonucleasas, que son enzimas muy estables, y que por tanto pueden degradar el
ARN de la muestra. Las disoluciones acuosas que se utilizan en el proceso deben
estar tratadas con DEPC (dietilpirocarbonato), que inactiva a las ARNasas. Los
protocolos de purificación y aislamiento de ARN suelen involucrar la lisis celular en
un entorno químico que provoque la desnaturalización de las ARNasas; para ello se
utilizan normalmente detergentes fuertes, soluciones caotropicas y otros agentes
desnaturalizantes de proteínas. El ARN es entonces separado del resto de
componentes celulares. El tipo de célula y el uso posterior que se pretenda dar al
ARN determinan el proceso de aislamiento apropiado.

La lisis de las células se puede realizar por diferentes métodos, entre los que se
pueden mencionar:

- La utilización de detergentes,
- La lisis celular utilizando tiocianato de guanidinio, que es el método más
utilizado para la extracción de ARN de tejidos.

Normalmente, pueden utilizarse determinados sistemas para favorecer la lisis de las

células, manuales o mecánicos, como el sistema Potter-Elvejhem o como el
homogeneizador mecánico de palas. Además, los procesos de extracción pueden
ser de ARN total o ARN específicos (citoplasmático, nuclear u organular). La
extracción de ARN total no requiere una separación de un orgánulo celular
especifico antes de la lisis u homogeneización, pudiéndose realizar el proceso de
extracción sin un fraccionamiento previo de las células (Smit y Wood, 1997).

Los métodos de aislamiento de ARN explotan sus diferencias químicas con el ADN.
Controlando el pH se puede forzar a que el ADN tenga afinidad por una fase fenólica
y el ARN por una fase acuosa, ya que el ARN es más soluble en disoluciones
acuosas al poseer un grupo hidroxilo más, en posición 2< y al estar constituido
únicamente por una hebra.

Las extracciones clásicas con fenol: cloroformo han sido reemplazados por los
métodos en que, además de fenol y cloroformo, se incluye tiocianato de guanidinio.
Este es un agente cao trópico en el que tanto en catión como el anión que forma
son fuertes agentes cao trópicos, los que permite una rápida inactivación celular de
las ARNasas durante la lisis celular.

Formación y separación de la doble hebra de ADN

Tanto la formación de la doble hélice de ADN, como la separación de las dos hebras
(su desnaturalización), se encuentran influenciadas por la temperatura. Esta
absorbancia es un indicador del estado de desnaturalización del ADN, puesto que
tiene mayor capacidad de absorbancia si este desnaturalizado que si está en estado
bicatenario. El proceso de formación de la doble hebra de ADN por el
establecimiento de los enlaces de hidrogeno es cooperativo. La forma sigmoidea de
la curva indica que las interacciones entre los pares de bases unidas mediante
puentes de hidrogeno y apiladas son interacciones cooperativas. Estas
interacciones cooperativas se distorsionan progresivamente durante la
desnaturalización (fusión) hasta que las dos hebras se separan completamente y, a
partir de ese momento, no se observa ningún cambio posterior en la absorción, la
temperatura a la cual el ADN se encuentra semidesarrollado (es decir, la mitad del
ADN total de la muestra se encuentra en forma de doble hélice y la otra mitad en
forma de cadenas) se conoce con el nombre de temperatura de fusión o Tm (T
melting) del ADN (Jones, et al,. 1994).

La temperatura de fusión se encuentra determinada por la composición de las bases

del ADN, ya que los apareamientos AT requieren menor cantidad de energía para
su separación que los apareamientos GC, de manera que cuanto mayor sea el
número de bases G y C, mayor será la temperatura de fusión (Jones, et al,. 1994).

Una vez separadas, las dos hebras se pueden Re naturalizar, es decir, volver a
unirse en una doble cadena. Si una muestra de ADN fundido o desnaturalizado (con
las hebras separadas) se enfría lentamente, la absorción de luz ultravioleta por la
disolución en que se encuentra dicho ADN disminuye, indicando que las hebras
complementarias de ADN se han apareado de nuevo, el proceso de re
naturalización; si se enfría rápidamente, las cadenas poli nucleotídicas forman
masas enmarañadas y la renaturalización es mucho más lenta.

La renaturalización será más rápida cuanto mayor sea el número de pares de bases
que persistan unidas entre las dos cadenas. Aun en el caso de una separación total
de las dos hebras, puede producirse la renaturalización, pero de forma mucho más
lenta, ya que las hebras deberán alinearse previamente de forma adecuada;
teniendo en cuenta que solo una de las alineaciones es la correcta, la velocidad
inicial de renaturalización será lenta (Jones, et al,. 1994).

CAPÍTULO 7.- MÉTODOS DE ELECTROFORESIS

Descripción
La electroforesis es una herramienta analítica que permite a los bioquímicos
examinar el movimiento diferencial de las moléculas cargadas en un campo
eléctrico. Las técnicas electroforéticas modernas utilizan una matriz tipo gel
polimerizada, que es más estable como medio de soporte. La muestra a analizar se
aplica al medio como una mancha o banda delgada; por lo tanto, el término
electroforesis zonal se usa a menudo. La migración de las moléculas está
influenciada por: (1) el tamaño, la forma, la carga y la composición química de las
moléculas a separar; (2) la matriz rígida mazelike del soporte de gel; y (3) el campo
eléctrico aplicado. La electroforesis, que es una técnica relativamente rápida,
económica y conveniente, es capaz de analizar y purificar muchos tipos diferentes
de biomoléculas, pero es especialmente efectiva con proteínas y ácidos nucleicos.
La versión más nueva de la técnica analítica, la electroforesis capilar (CE),
proporciona una resolución extremadamente alta y es útil para el análisis de
moléculas grandes y pequeñas. Se ha encontrado que CE es especialmente útil en
el análisis de productos farmacéuticos. (Boyer, R.F., 2012.)
Fundamento.
Todos los modos de electroforesis se basan en los principios que se acaban de
describir. La principal diferencia entre los diversos métodos es el tipo de medio de
soporte. La celulosa y el acetato de celulosa se usan como medio de soporte para
productos bioquímicos de bajo peso molecular como aminoácidos y carbohidratos.
Los geles de poliacrilamida y agarosa se usan ampliamente como medios de
soporte para moléculas más grandes. En la electroforesis capilar, se utilizan varios
tipos diferentes de medios de soporte, incluidas las superficies naturales no tratadas
dentro de un tubo capilar de diámetro estrecho de sílice. Las geometrías (vertical y
horizontal), los amortiguadores y las condiciones electroforéticas proporcionan
muchos arreglos experimentales diferentes para la variedad de métodos descritos
aquí. (Boyer, R.F., 2012.)
Geles de electroforesis en gel de poliacrilamida
Los geles formados por la polimerización de acrilamida tienen varias características
positivas en la electroforesis:
(1) alto poder de resolución para proteínas y ácidos
nucleicos de tamaño pequeño y moderado (hasta
aproximadamente daltons)
(2) aceptación de tamaños de muestra relativamente
grandes
(3) interacciones mínimas de las moléculas que migran
con la matriz
(4) la estabilidad física de la matriz. Recuerde de la
discusión anterior de la filtración en gel, que los geles
se pueden preparar con diferentes tamaños de poro
cambiando la concentración de los agentes de
reticulación. La electroforesis a través de geles de poliacrilamida conduce a una
resolución mejorada de los componentes de la muestra porque la separación se
basa tanto en el tamizado molecular como en la movilidad electroforética. Sin
embargo, el orden de movimiento molecular en la filtración en gel y PAGE es muy
diferente. En la filtración en gel, las moléculas grandes migran a través de la matriz
más rápido que las moléculas pequeñas. Lo opuesto es el caso de la electroforesis
en gel, donde no hay volumen vacío en la matriz, sino solo una red continua de
poros en todo el gel. El gel de electroforesis es comparable a un solo cordón en
filtración de gel. Por lo tanto, las moléculas grandes no se mueven fácilmente a
través del medio, y el orden
de movimiento son moléculas
pequeñas seguidas de
moléculas grandes. (Boyer,
R.F., 2012.)
Preparación de geles
Los geles de poliacrilamida se preparan mediante la polimerización por radicales
libres de acrilamida y el agente de reticulación -metileno-bis-acrilamida (Figura 6.1).
La polimerización química se controla mediante un sistema iniciador-catalizador,
persulfato de amonio - tetrametiletilendiamina (TEMED). La polimerización
fotoquímica puede iniciarse por riboflavina en presencia de radiación ultravioleta
(UV). Un gel estándar para la separación de proteínas es el 7,5% de poliacrilamida.
Se puede usar sobre el rango de tamaño molecular de 10,000 a 1,000,000 de
daltons; sin embargo, la mejor resolución se obtiene en el rango de 30,000 a
300,000 daltons. El poder de resolución y el rango de tamaño molecular de un gel
dependen de las concentraciones de acrilamida y bis-acrilamida. Concentraciones
más bajas dan geles con poros más grandes, lo que permite el análisis de
biomoléculas de mayor peso molecular. En contraste, las concentraciones más altas
de acrilamida dan geles con poros más pequeños, lo que permite el análisis de
biomoléculas de menor peso molecular, para rangos efectivos de separación de
ADN). La electroforesis en gel de poliacrilamida se ha realizado utilizando dos
arreglos instrumentales, columna o losa. Los geles de columna rara vez se usan
hoy en día, pero tienen un significado histórico ya que son importantes precursores
de geles de losa más modernos. La figura 6.2 muestra la disposición típica para un
gel de columna. Los tubos de vidrio se llenan con una mezcla de acrilamida, -
metilen-bis-acrilamida, tampón e iniciador-catalizador de radicales libres. La
polimerización ocurre en 30 a 40 minutos. La columna de gel se inserta entre dos
depósitos de tampón separados. El depósito superior generalmente contiene el
cátodo y el inferior del ánodo. La electroforesis en gel generalmente se realiza a pH
básico, donde la mayoría de los polímeros biológicos son aniónicos; por lo tanto, se
mueven hacia el ánodo. La muestra a analizar se coloca en capas sobre el gel y se
aplica voltaje al sistema. El ADN y muchas proteínas son incoloras, por lo que se
debe agregar un colorante reactivo para controlar la tasa de electroforesis. Se aplica
un "tinte de rastreo", que se mueve más rápidamente a través del gel que los
componentes de la muestra. Cuando la banda de tinte se ha movido al extremo
opuesto de la columna, el voltaje se apaga y el gel se retira de la columna y se tiñe
con un tinte. (Boyer, R.F., 2012.)

Electroforesis en gel de losa

Los geles de losa ahora se usan mucho más que los geles de columna. El gel de
Aslab en el que se pueden analizar varias muestras es más conveniente de hacer y
usar que varios geles de columna individuales. Los geles de losa también ofrecen
la ventaja de que todas las muestras son analizado en un entorno de matriz que es
idéntico en composición en comparación con los tubos de vidrio, que pueden tener
composiciones ligeramente diferentes. La losa de poliacrilamida se prepara entre
dos placas de vidrio que están separadas por separadores .Los espaciadores
permiten un espesor de losa uniforme de 0.5 a 2.0 mm, lo cual es apropiado para
procedimientos analíticos y algunos procedimientos preparativos. Los geles de losa
son generalmente o menos para la secuenciación de nucleótidos, geles de losa tan
grandes como a menudo se requieren. El “peine” plástico insertado en la parte
superior del gel de losa durante la polimerización forma hendiduras en el gel que
sirven como pocillos de muestra. Se pueden formar hasta 20 pozos de muestra.
Después de la polimerización, el peine se retira cuidadosamente y los pocillos se
enjuagan bien con tampón para eliminar las sales y cualquier acrilamida no
polimerizada. La placa de gel se sujeta entre dos depósitos de tampón, se carga
una muestra en cada pocillo y se aplica voltaje. Para la visualización, la losa se retira
y se tiñe con un tinte apropiado, o en algunos casos, el gel se puede teñir con el
tinte antes de la electroforesis. Quizás el aspecto más difícil e inconveniente de la
electroforesis en gel de poliacrilamida es la preparación de geles. El monómero, la
acrilamida, es una neurotoxina y un agente cancerígeno; por lo tanto, se requiere
un manejo especial. (Boyer, R.F., 2012.)
Electroforesis en gel discontinua
La disposición experimental para la electroforesis en gel "disco" hay tres
características significativas de este método son que:
(1) Hay dos capas de gel, un gel inferior o de resolución y un gel superior o de
apilamiento
(2) Los tampones utilizados para preparar las dos capas de gel son de diferentes
fuerzas iónicas y pH.
(3) El gel de apilamiento tiene una concentración de acrilamida más baja, por lo
que sus tamaños de poro son más grandes.
Estos tres cambios en las condiciones experimentales provocan la formación de
bandas de muestra altamente concentradas en el gel de apilamiento y una mayor
resolución de los componentes de la muestra en el gel inferior. La concentración de
la muestra en el gel superior se produce de la siguiente manera. La muestra
generalmente se disuelve en tampón de cloruro de glicina, pH 8 a 9, antes de cargar
en el gel. La glicina existe principalmente en dos formas a este pH, un zwitterión y
un anión.La carga promedio en los aniones de glicina a pH 8.5 es aproximadamente
Cuando se enciende el voltaje, los iones tampón (glicinato y cloruro) y la muestra
de proteína o ácido nucleico pasan al gel de apilamiento, que tiene un pH de 6.9 .
Al entrar en el gel superior, el equilibrio de la Ecuación se desplaza hacia la
izquierda, aumentando la concentración de zwitterión de glicina, que no tiene carga
neta y, por lo tanto, no tiene movilidad electroforética. Para mantener una corriente
constante en el sistema de electroforesis, se debe mantener un flujo de aniones.
Como la mayoría de las proteínas y las muestras de ácido nucleico siguen siendo
aniónicas a pH 6,9, reemplazan al glicinato como iones móviles. Por lo tanto, las
movilidades iónicas relativas en el gel de apilamiento son proteínas de cloruro o
glicinato de muestra de ácido nucleico. La muestra tenderá a acumularse y formará
una banda delgada y concentrada intercalada entre el cloruro y el glicinato a medida
que se mueven a través del gel superior. Dado que la concentración de acrilamida
en el gel de apilamiento es baja (2% a 3%), hay poco impedimento para la movilidad
de las moléculas de muestra grandes. Ahora, cuando el frente iónico alcanza el gel
inferior con un tampón de pH 8 a 9, la concentración de glicinato aumenta y la glicina
y el cloruro aniónicos transportan la mayor parte de la corriente. Las moléculas de
muestra de proteína o ácido nucleico, ahora en una banda estrecha, encuentran
tanto un aumento en el pH como una disminución en el tamaño de los poros. El
aumento en el pH, por supuesto, tenderá a aumentar la movilidad electroforética,
pero los poros más pequeños disminuyen la movilidad. La velocidad relativa de
movimiento de los aniones en el gel inferior es la proteína de cloruro de glicinato o
la muestra de ácido nucleico. La separación de los componentes de la muestra en
el gel de resolución se produce como se describe en una sección anterior sobre la
electroforesis en gel. Cada componente tiene una relación carga / masa única y un
tamaño y forma discretos, que influyen directamente en su movilidad. La
electroforesis en gel de disco
produce una resolución
excelente y es el método de
elección para el análisis de
proteínas y fragmentos de ácido
nucleico. Las bandas de
proteína o ácido nucleico que
contienen tan poco como 1 o
pueden detectarse mediante
tinción de los geles después de
la electroforesis (Boyer, R.F.,
2012.)
CAPÍTULO 8.-SINTESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Los ácidos nucleicos DNA y RNA son polinucleótidos que codifican la información
genética utilizada para construir y mantener a los organismos vivos.
En este presente tema de investigación se darán a conocer ejemplos de las síntesis
de ciertos ácidos nucleicos:
Los ácidos nucleicos son polímeros: Los ácidos nucleicos están formados por largas
cadenas de nucleótidos. Los ácidos nucleicos son polímeros de nucleótidos. Los
nucleótidos a su vez están formados por tres moléculas: un azúcar, un ácido
fosfórico y una base nitrogenada. El azúcar es una pentosa, con 5 átomos de
carbono que puede ser de dos tipos: ribosa o desoxirribosa, la diferencia entre
ambas es que en la desoxirribosa falta un átomo de oxígeno en el carbono 2. El
ácido fosfórico se encuentra normalmente ionizado con cargas negativas por lo que
es más correcto denominarlo fosfato. La base nitrogenada es una molécula muy
compleja de estructura cíclica con átomos de nitrógeno y que es capaz de captar
H+, de ahí su carácter de base (opuesto al de ácido). Hay cinco clases de bases
nitrogenadas diferentes: adenina, guanina citosina, timina y uracilo. En los
organismos hay dos clases de ácidos nucleicos: el ácido desoxirribonucleico, ADN
que como su nombre indica el azúcar que contiene es la desoxirribosa y el ácido
ribonucleico (ARN) que contiene ribosa (Peter, et al,. 2006)..
Ambos se diferencian también por la estructura de sus cadenas y las bases
nitrogenadas presentes en sus nucleótidos.
Ejemplo 1.
Ejemplo 2.

Ejemplo 3.

La Gota
Se caracteriza por un aumento de la concentración sanguínea de ácido úrico y sus
síntomas se pueden aliviar mediante la administración de alopurinol cuyo
mecanismo de acción se muestra a continuación:
Ejemplo

De esta manera se reduce la formación de ácido úrico mientras que aumenta la

excreción de xantina e hipoxantina, más solubles.
Aclaro que La gota es más frecuente en hombres que en mujeres (9 a 1), y en éstas
sólo se presenta después de la menopausia. El ácido úrico, desde el punto de vista
químico, es la 2,6,8, trioxipurina, procede del metabolismo de las purinas, siendo el
metabolismo final en el hombre (Peter, et al,. 2006).

CAPÍTULO 9.- EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

Todos los tipos de macromoléculas biológicas tienen una característica en común
que va a permitir el desarrollo de un método de separación específico para ellas.
Estos métodos deben ser completamente biocompatibles para que puedan ser
posteriormente útiles al investigador y, al mismo tiempo, lo suficientemente potentes
para permitir el aislamiento de la molécula deseada de entre un mezcla compleja de
multi-componentes que hacen las veces de “contaminantes” de nuestra molécula
en cuestión. En este sentido, la cromatografía en columna ha demostrado ser una
herramienta muy útil ya que se dispone de varios mecanismos de separación. La
modificación de las diferentes fases estacionarias ya existentes, así como el
desarrollo de nuevas es la base principal para la obtención de las condiciones
necesarias para la rápida y eficiente separación de biomoléculas
Cromatografía de penetrabilidad
Fundamento
Esta consiste en una columna cromatográfica empacada de tal manera que las
partículas de dicho empacamiento tienen diferentes tamaños de poros o de redes
de poros con el fin de que las moléculas de soluto sean retenidas o excluidas
basándose en su forma y tamaño y no en el peso molecular.

Descripción

El componente básico es una columna empaquetada con una matriz en gel especial,
que son partículas de un polímero orgánico de estructura tridimensional, que
originan una red de poros hidrofílicos equilibrados con un tampón acuoso. La técnica
consiste en que las moléculas de gran tamaño no penetran por los poros del
polímero, por lo que migran mucho más rápidamente que las de menor tamaño que
son capaces de penetrar por los poros de la matriz (Boyer, 2012; Roca et al., 2004)..

Al principio del desarrollo de la técnica, se realizaba a bajas presiones por lo que el

rango de aplicaciones estaba restringido debido a los elevados tiempos de
separación y su poca resolución. En la actualidad se han desarrollado matrices de
sílica estables a elevadas presiones que se utilizan columnas de alta presión, para
la separación de biomoléculas en función de su forma y tamaño (Boyer, 2012; Roca
et al., 2004).

Cromatografía de intercambio iónico.

Fundamento

El fundamento básico de la cromatografía de intercambio iónico es que las

moléculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de
modo que dichas moléculas pueden ser asociadas o disociadas cambiando el
ambiente iónico.

Descripción

Es el método más utilizado para la separación de ácidos nucleicos. El mecanismo

básico es el intercambio reversible de los iones en solución con los grupos
funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina
(Berg et al., 2002). Por ejemplo, un ácido nucleico con carga negativa a pH 7,0 se
unirá a un intercambiador iónico con grupos cargados positivamente, pero eluirá de
la columna al cambiar el pH del tampón (tampón de elución) ya que los iones del
tampón de elución interaccionan con los grupos cargados del ácido nucleico o del
intercambiador iónico,
respectivamente; primero eluirán
de la columna las moléculas
cargadas positivamente que no
se unen a la fase estacionaria y
posteriormente, al añadir el
tampón de elución, eluirán las
moléculas con poca carga
negativa neta y luego las de
mayor carga negativa neta (Berg
et al., 2002).
Cromatografía de adsorción
Fundamento

Se basa en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos en presencia de sales

caotrópicas. Bajo condiciones nativas, los ácidos nucleicos están recubiertos de una
capa hidratante de moléculas de agua que mantienen la solubilidad del DNA en
soluciones acuosas.

Descripción

Con la adición de iones caotrópicos a los ácidos nucleicos, se destruye esta

ordenada estructura de moléculas de agua de la capa hidratante, por lo que las
sales caotrópicas crean un entorno hidrofóbico alrededor del DNA. Bajo estas
condiciones hidrofóbicas, los ácidos nucleicos se unen perfectamente a la
membrana de sílica de las columnas, mientras que las proteínas, los metabolitos y
otros contaminantes no se unen y, por lo tanto, son eliminados de la muestra
durante los pasos de lavado (Berg et al., 2002). Posteriormente, los ácidos nucleicos
se eluyen de la membrana de sílica mediante tampones de elución con baja
concentración de sales (ligeramente alcalinos) o simplemente agua, ya que
permiten recuperar la capa hidratante de los ácidos nucleicos, liberándolos así de
la membrana. Con esta tecnología, no se produce ningún efecto sobre las moléculas
de los ácidos nucleicos ya que la unión intramolecular de los mismos no es de
naturaleza hidrofóbica. Con este rápido proceso de purificación mediante la
tecnología de la adsorción-desorción sobre membranas de sílica, se obtiene ácidos
nucleicos altamente purificados y listos para usar en procesos posteriores como
PCR, RT-PCR, QPCR, secuenciación, blotting, clonaje, etc (Berg et al., 2002).
CAPÍTULO 10.-ANALISIS Y CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR
ESPECTROSCOPIA.
Fundamento

La espectrofotometría UV/Visible nos permite confirmar que contamos con cantidad

suficiente de ácidos nucleícos (DNA/RNA) de calidad adecuada antes de llevar a
cabo ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real (QRTPCR), análisis de SNPS
(Polimorfismos de nucleótido único) o la secuenciación automática de muestras de
DNA de plásmidos, cósmidos, productos de PCR

Espectroscopia por rayos ultravioleta

Fundamento
Los fotones UV tiene la energía suficiente para excitar y remover los electrones de
los átomos y las moléculas, induciendo la formación de radicales e iones. Algunos
de estos productos pueden recombinarse en una reacción química que conduce a
la formación de nuevas moléculas. Un conocimiento fiable de los niveles de
radiación UV sobre la superficie de Marte es importante para los modelos
fotoquímicos de la atmósfera, de la química de los minerales de la superficie y la
formación de radicales oxidantes y, debido a su interacción con las moléculas
orgánicas, es de suma importancia para la estimación de las dosis biológicas. En
particular, las moléculas orgánicas más importantes, los ácidos nucleicos (ADN y
ARN) y proteínas, que son, además, común a todas las formas de vida conocidas,
son muy sensibles a la radiación UV. Los ácidos nucleicos muestran una fuerte
banda de absorción en el rango de 260 nm y las proteínas en el rango de 280 nm.
Por lo tanto un alto nivel de radiación UV puede disociar totalmente estas moléculas
y esterilizar la superficie (Berg et al., 2002).

Descripción

El concepto de sensores REMS-UV de medición se basa en el uso de seis

fotodiodos espectrales de UV diferentes. Los fotodiodos UV tienen la ventaja de ser
pequeño en tamaño, ligeros y robustos para sobrevivir y trabajar en condiciones
duras como las que se espera para MSL. El sensor de REMS-UV se coloca dentro
de la cubierta móvil, mirando hacia el cielo, en un lugar que sea visible por el
NavCam del rover. El conjunto REMS-UV pesa sólo 72 g. Cuenta con 6 tipos
diferentes de sensores de carburo de silicio (SiC) y un sensor de temperatura RTD
de referencia en aluminio anodizado y pintado FR4 caja de 55 mm x 68 mm x 16
mm con un conector D25 para las 7 señales de salida. Cada fotodiodo pesa 1 gr y
consta de una carcasa A-5 (de 5 mm de altura y 5 mm de diámetro) con una
superficie de SiC de detección de 1 mm ^ 2 y un campo nominal de visión (FOV) de
+ / – 30 º. El campo de visión está limitado por la geometría del encapsulado del
fotodiodo. Cuando el Sol está dentro de los 30 º con respecto a la normal, el haz
directo llega a los dados de detección de forma directa o después de atravesar el
filtro (si existe). Cada fotodiodo está incrustado en un anillo magnetico de cobalto
samario para desviar la trayectoria de la caída en el polvo y reducir la deposición de
polvo (Berg et al., 2002).

Un imán adicional se coloca en

el centro de la caja debajo de un
área blanca. Esta zona se utiliza
para volver a calibrar durante la
misión, utilizando imágenes de
la cámara, el sensor de
oscurecimiento (y por lo tanto la
degradación del sensor), debido
a la deposición de polvo (Berg et
al., 2002).

Fluorometría
La determinación de la concentración de AN mediante fluorometría se utiliza cuando
la muestra no está suficientemente purificada y se basa en la existencia de
fluorocromos de unión a ADN. Estos agentes intercalantes producen fluorescencia
cuando se unen al ADN. Uno de ellos es el bromuro de etidio. No se suele utilizar
para cuantificar ADN ya que no muestra especificidad total por el ADN (de hecho se
usa para visualizar ARN en geles de agarosa). El uso se restringe a la visualización
de AN en geles de elecroforesis. El segundo agente intercalante es muy específico
de ADN y permite una cuantificación muy precisa. Se usa también para llevar a cabo
uno de los métodos aplicados en PCR en tiempo real (Berg et al., 2002).

REFERENCIAS
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