PROTEINOGRAMA: METODOS DE

FRACCIONAMIENTO PROTEICO
PROTEINAS PLASMATICAS
Suero: Fraccin de protenas solubles que
aparecen tras la retraccin del cogulo
sanguneo. Carece de fibringeno
Funciones:
Transporte de compuestos endgenos/exgenos
poco solubles en agua (medicamentos, hormonas,
calcio, )
Regulacin de la presin onctica y el balance
intra/extravasal de agua.
Respuesta inflamatoria y control de la infeccin
(PCR, Fibringeno, Ferritina, ...)

PROTEINAS PLASMATICAS
Sntesis proteica
Sntesis: la mayor parte de las protenas
plasmticas se sintetizan en el hgado
Los linfocitos B son los responsables de la sntesis
de las inmunoglobulinas
Degradacin/Prdidas.
El catabolismo tiene lugar en muchas y distintas clulas
(endoteliales, fagocitos mononucleares, fibroblastos
cutneos)
Prdidas por filtracin glomerular
Prdidas a travs de la pared intestinal

PROTEINAS PLASMATICAS
Estructura: Los aminocidos -> Unidad
estructural de las protenas (secuencia de aa)
La disposicin espacial de esta secuencia de aa
condiciona su carcter intrnseco y las diferencia de
otras
Los aa, debido su composicin (grupos cidos y
bsicos), al disociarse en agua confieren a la molcula
cargas + y => La molcula proteica presenta una
carga neta suma de las cargas positiva y negativa
La carga elctrica de la protena depende del grado de
disociacin de sus grupos funcionales cidos y bsicos,
lo cual depende del pH.


PROTEINAS PLASMATICAS
PROTEINOGRAMA
Metodologa (electroforesis)
Las protenas son capaces de moverse en funcin de su
carga y tamao cuando son sometidas a un campo
elctrico
La movilidad electrofortica es proporcional al cociente:
Carga/Masa

PROTEINOGRAMA
PROTEINOGRAMA
PROTEINOGRAMA
Fracciones proteicas
Albmina srica
Banda mayoritaria (53-66%) del total del proteinograma
Valores normales:
Recin nacidos: 2.9-5.5 g/100ml
Nios: 3.8-5.5
Adultos (V): 3.3-6.1; (H): 2.7-5.6
Pre-albmina (retinol binding protein)
Mayor movilidad electrofortica.
Rpido recambio (18-45 mg/100ml)
Indicador de estado nutricional

PROTEINOGRAMA
Fracciones proteicas
Fraccin 1 globulinas
Aumenta durante los procesos inflamatorios agudos,
neoplasias, infartos y necrosis (1.9-4.1% del total del
proteinograma)

1- glicoprotena cida
1- antitripsina
1- antiquimiotripsina
1- fetoprotena (<2 mg/100 ml)

PROTEINOGRAMA
Fracciones proteicas
Fraccin 2 globulinas
Aumenta en el sndrome nefrtico, ictericia obstructiva,
tuberculosis, inflamacin crnica (7.7-12.3%)

2 macroglobulina (150-420 mg/100ml; Sndrome nefrtico)
Ceruloplasmina (20-40 mg/100ml; transporte Cu2+; enf.
Wilson)
Haptoglobina (60-270 mg/100ml), transporte Hb; aumenta
en inflamacin, neoplasias; disminuye hemlisis intravascular,
anemia perniciosa
Protena C reactiva (<0.5 mg/100 ml). Inflamaciones e
infecciones


PROTEINOGRAMA
Fracciones proteicas
Fraccin globulinas
Aumento moderado en sndrome nefrtico, ictericia
obstructiva, cirrosis, tuberculosis, inflamacin crnica
(7.6-13.0%)
-Lipoproteina (colesterol)
Fibronectina (25-40 mg/100ml; aumenta en sndrome
nefrtico, colestasis, neoplasias. Disminuye en
politraumatismos, quemaduras extensas, sepsis)
Transferrina (200-400 mg/100ml; transporte Fe; aumenta en
anemias)
Transcobalamina (900 pmol/L; transporte de B12).
Complemento (C3, C4) (85-190; 12-36 mg/100 ml).
Aumentan en procesos inflamatorios agudos. Disminuyen en
reacciones autoinmunes.


PROTEINOGRAMA
Fracciones proteicas
Fraccin globulinas
La fraccin de las gammaglobulinas supone entre 10.3 y
20.8% del total de protenas del suero. Se pueden
detectar IgG, IgM, IgA, IgD e IgE
IgM aparece aumentada tras procesos agudos virales
IgA aumenta en enfermedades intestinales autoinmunes
(Crohn)
IgG aumenta en enfermedades autoinmunes (lupus
eritematoso, hepatitis crnica activa, infecciones bacterianas
crnicas)
IgE est aumentada en enfermedades con un componente
alrgico (eczema, asma, infeccin parasitaria)


PROTEINOGRAMA
Cuantificacin de protenas totales (Siempre
deben acompaar al proteinograma)
Mtodo colorimtrico (R-Biuret y Sulfato de cobre
alcalino)-> 545 nm
Valores normales: 6-8 mg/dL

Cuantificacin de Igs
Nefelometria (tb. Ferritina)
IDR (tb. Haptoglobina, ceruloplasmina)


PROTEINOGRAMA
Principales alteraciones

Hipoproteinemia: hipoalbuminemia

Deficiencias: 1 antitripsina, inmunoglobulinas,
complemento

Paraproteinemia: presencia de protenas
anormales o en cantidad excesiva (reaccin de
fase aguda, mielomas, macroglobulinemia,
linfomas B, etc.).

PROTEINOGRAMA
Principales alteraciones (Albmina)

PROTEINOGRAMA
Principales alteraciones (Albmina)
Hipoalbuminemia
Artefactual (por dilucin):
Error en la toma (miembro infundido)
Excesiva administracin parenteral de lquidos
Redistribucin:
Posicional (de pie, vs.decbito)
Aumento de la permeabilidad capilar (postoperatorio, shock)
Retencin de lquido (edema)
Balance negativo:
Menor sntesis (enfermedad crnica heptica, malnutricin,
sndromes de malaabsorcin)
Mayor catabolismo (muchos procesos patolgicos con balance
negativo de N2)
Prdidas (enfermedad renal, quemaduras extensas,
epidermolisis, enteropatas)

PROTEINOGRAMA
Principales alteraciones (Albmina)
Consecuencias de la hipoalbuminemia:
Edema:
Extravasacin de lquido, edema
Transporte:
Muchos compuestos endgenos van unidos a albmina
(Ca2+, cidos grasos)
Muchos frmacos se unen a albmina. Puede aumentar
la fraccin libre de frmaco, y con ello un exceso de
efecto farmacolgico.
Desplazamiento de un frmaco por otro, y aumento de
la concentracin libre plasmtica

PROTEINOGRAMA
Principales alteraciones (Deficiencias)

PROTEINOGRAMA
Principales alteraciones

PROTEINOGRAMA
Principales alteraciones (R. de fase aguda)
Cambios en la sntesis heptica de protenas plasmticas,
como consecuencia de la regulacin de genes inducida por
citoquinas inflamatorias (IL-6, IL-1, TNF-)

Aumento muy importante (>5x): PCR
Aumento moderado (1-5x): 1 antitripsina, 1
glicoprotena cida, ferritina, IgG, complemento C3/C4,
ceruloplasmina, 1 antiquimiotripsina
Pocos cambios (1-2x): Fibringeno, Haptoglobina
Disminucin: Albmina, Transferrina


PROTEINOGRAMA
Principales alteraciones


PROTEINOGRAMA
Principales alteraciones (Fraccin -globulinas)

Las hipergamaglobulinemias policlonales se manifiestan en
inflamaciones crnicas (hepatitis crnica, cirrosis) e
infecciosas (brucelosis, lepra, endocarditis), y ciertas
enfermedades autoinmunes (lupus).

Las hipogamaglobulinemias se presentan en el sndrome
nefrtico, mieloma con proteinuria Bence-Jones, gran
parte de las leucemias crnicas, sndrome de Cushing.
Existen tambin agamaglobulinemias

Gamapatas de clulas B (Plasmacitomas, mieloma
mltiple)
- Macroglobulinemia de Waldestrm



PROTEINOGRAMA
Principales alteraciones (Fraccin -globulinas)

PROTEINOGRAMA
Inmunofijacin
Permite el estudio de protenas en sangre y orina,
especficamente la identificacin de componentes
monoclonales u oligoclonales
Se investigan bandas anormales que aparecen en
el perfil electrofortico de protenas de sueros u
orinas, principalmente situadas en las fracciones -
globulinas y -globulinas que son siempre
sospechosas de ser protenas monoclonales, y por
lo tanto son un indicio de gammapatas
monoclonales.


PROTEINOGRAMA
Inmunofijacin
Es una electroforesis de protenas seguida de una
inmovilizacin de las mismas al enfrentarse a un antisuero
especfico (Anti-IgG, IgA, IgM, IgD, , ) formando un
complejo insoluble que luego se revela por coloracin.
Se realiza en cuatro etapas:
1. Separacin de protenas mediante electroforesis en gel de agarosa
2. Inmunofijacin (inmunoprecipitacin) de las protenas separadas :
los carriles de migracin electrofortica apropiados son recubiertos
con los antisueros individuales, los cuales difunden dentro del gel
y precipitan los antgenos correspondientes cuando estn
presentes. Las protenas del carril de referencia son fijadas con
una solucin fijadora.
3. Las protenas solubles no precipitadas se eliminan del gel
mediante un blotting y un lavado. La precipitacin del complejo
antgeno-anticuerpo queda fijada en la matriz del gel
4. Los precipitados y las protenas fijadas son visualizadas mediante
tincin

PROTEINOGRAMA
Inmunofijacin (Suero / Orina)

PROTEINOGRAMA
Inmunofijacion (Utilidades)
Identificacin de protenas monoclonales en
enfermedades hematolgicas (Mieloma Mltiple,
Gammapatas Monoclonales de significado incierto,
Macroglobulinemia de Waldenstrom, Amiloidosis
primaria, Crioglobulinemia)
Polineuropatia crnica (identificacin de protenas
oligoclonales o monoclonales)
Investigacin y caracterizacin de la Proteina de
Bence Jones (Cadenas ligeras en orina) <-> MM



PROTEINOGRAMA
Electroforesis de alta resolucin (HRE)
La HRE usa como medio un gel de agarosa
acoplada a alto voltaje y un soporte de
enfriamiento.
Para obtener los patrones de HRE, las muestras
son aplicadas en el gel, que a la vez es sometido a
un campo elctrico para permitir la migracin de
las protenas, luego los geles son teidos, secados
y analizados.


PROTEINOGRAMA
Electroforesis de alta resolucin (HRE)


PROTEINOGRAMA
Electroforesis de alta resolucin (HRE)
Aplicaciones
La orina normal contiene muy poca cantidad de protenas
(slo la albumina es visible) y requiere ser concentrada
para su anlisis



Las protenas en orina se pueden aumentar en disfuncin
glomerular o tubular y en enfermedad de las cadenas
ligeras, inflamacin, etc.



PROTEINOGRAMA
Electroforesis de alta resolucin (HRE)
Aplicaciones
La HRE en orina es frecuentemente usada para la bsqueda de
bandas monoclonales o cadenas ligeras.
En la enfermedad de Cadenas ligeras las cantidades anormales
de protenas monoclonales son filtradas a travs de los glomerulos.
Estas protenas son usualmente encontradas en la regin Gama ,
pero tambin se pueden hallar en las zonas alfa o beta.
En la proteinuria glomerular selectiva el patrn urinario refleja la
prdida de selectividad encontrada en el glomrulo con excrecin de
albumina, alfa 1- antitripsina, alfa 1-glicoprotena cida y
transferrina.
En proteinuria tubular la capacidad de reabsorcin de los tbulos
de protenas de bajo peso molecular esta comprometida. El patrn
urinario generalmente muestra la presencia de pequeas cantidades
de albmina, 2 bandas en la regin alfa 2 (alfa 2- microglobulinas) y
una banda en el medio de la regin beta.
En proteinurias no selectivas el patrn urinario puede ser similar
al srico.




PROTEINOGRAMA
Electroforesis de alta resolucin (HRE)
Aplicaciones
Enfermedad de las cadenas ligeras (Proteinuria BJ)




Proteinuria glomerular (Se filtran molculas de alto Pm:
alfa 2 macroglobulina y beta lipoproteina








PROTEINOGRAMA
Electroforesis capilar
La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las
tcnicas electroforeticas convencionales, pero utiliza condiciones y
tecnologa distinta (sopote: capilar de silica fundida a potenciales
elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por
aire.

La corriente electroendosmtica (FEO) generada por los grupos silanol
de la superficie interna del capilar da como resultado una corriente
plana del frente del lquido que contrasta con el frente parablico de la
cromatografa lquida de alta resolucin .

La ventaja de esta tcnica es que el capilar de silica fundida que
generalmente se cubre con una capa de poliamina para darle mayor
rigidez y resistencia, permite el paso de la luz UV de tal manera que la
visualizacin es on-line.

Con esta tcnica descripta es posible separar cationes, aniones,
protenas, macromolculas y sustancias no cargadas en forma
simultnea.
PROTEINOGRAMA
Electroforesis capilar

PROTEINOGRAMA
PROTEINOGRAMA
PROTEINOGRAMA
Inmunoglogulinas (LCR)
IgG < 40 mg/L
Otras Ig muy inferior
[Igs]:
Aumento Ig en suero
Alteracin de la BHE
Aumento de sntesis local
Procendencia :
Razn de IgG y diversos ndices
Permiten conocer si existe un ss.Intratecal de las Ig.
IgG: presencia y actividad de LB locales (E. desmielinizantes).
IgM: aparicin ms precoz en la RI: diagnstico y seguimiento
de procesos infecciosos e inflamatorios del SNC.
IgA: ofrece poco valor clnico en enfermedades neurolgicas.



PROTEINOGRAMA
LCR
La medicin debe realizarse de manera inmediata
despus de la recepcin de la muestra.

Si se emplea electroforesis convencional para el estudio
cualitativo, el LCR debe concentrarse entre 50 y 100
veces (ultrafiltracin) hasta C2540 g/L.

Conservacin: hasta 3 das a 2 8 C

Obtencin de muestras simultneas de suero y LCR :
Investigar la presencia de bandas oligoclonales
Para calcular los distintos ndices

PROTEINOGRAMA
LCR
Deteccin de bandas oligoclonales
Imprescindible para confirmar la sntesis intratecal de Ig
que se producen en la EM (mtodo separacin proteica)
La EEF convencional del LCR concentrado: deteccin de
b. oligoclonales.
Inmunofijacin: confirmacin de bandas oligoclonales e
identificacin de Ig.
Para confirmar la sntesis intratecal de Ig:
Estudio electrofortico
Anlisis cuantitativos de Ig :
especficos
calidad metrolgica

PROTEINOGRAMA
LCR
Mtodos de separacin proteica
Finalidad: deteccin de bandas oligoclonales.




Procedimientos ms utilizados para su fraccionamiento:
Electroforesis en acetato de celulosa o el gel de agarosa
seguida de inmunofijacin en gel de poliacrilamida.
Isoelectroenfoque en gel de agarosa o en gel de poliacrilamida.
Electoctroforesis capilar

PROTEINOGRAMA
LCR (Electroforesis)


PROTEINOGRAMA
LCR (Inmunofijacin)
Gammapatas monoclonales:
Un solo clon de clulas. de plasma produce
elevados niveles de Ig de una sola clase o tipo:
Benignas
Malignas: mieloma mltiple, macroglobulinemia
Waldestrm
Gammapatas policlonales:
Debido a desrdenes clnicos (E. crnica del hgado,
desrdenes de colgenos, artritis reumatoide e
infecciones crnicas).


PROTEINOGRAMA
LCR (Utilidad)
Esclerosis mltiple:
El patrn de B. Oligoclonales en el LCR, es caracterstico de cada
paciente y permanece inalterable en el tiempo.
La concentracin de Ig en el LCR, puede afectarse por efectos del
tratamiento.
Prdida de LCR en rinorreas u otorreas:
Demostrar presencia de transferrina- : m.separacin proteica.
Procesamiento en paralelo del LCR y del suero del paciente.
Electroforesis bidimensional:
Pptidos (LCR) cuadros neuropsiquitricos.
Etiologa
Mejoran diagnstico y seguimiento.



PROTEINOGRAMA
Limitaciones
Visualizacin a ojo
Bandas monoclonales dbiles

Bandas monoclonales enmascaradas dentro de otra
fraccin distinta a la esperada (IgA)-> , 2

Integracin (densitometra): Revisar fracciones y picos
de la curva

Inmunofijacin: Determinar Igs -> Referencia para
ajustar diluciones => Sensibilidad

PROTEINOGRAMA
Criterios de rechazo de muestras

Muestras hemolizada (zona- por la Hb)

Muestras hiperlipmicas (zona- por Lipoprot)