Métodos de Análisis IBQ.

Ago – Dic 2021

PROBLEMARIO TERCER EXAMEN PARCIAL

1) Defina qué es electroforesis y mencione qué factores asociados al sistema electroforético
tienden a afectar la movilidad electroforética de las sustancias.
Electroforesis: Migración de analitos cargados en presencia de un campo eléctrico.
Factores que afectan la movilidad:
• Porosidad del soporte del gel: A mayor concentración de monómeros del gel mayor fricción.
• Carga, Forma y Tamaño.
2) ¿La electroforesis es un tipo de separación cromatográfica?
NO
3) Explique de qué forma afectan la movilidad electroforética: la carga, el tamaño y la forma
delanalito
• Carga: A mayor carga mayor migración.
• Forma: A una forma lineal mayor migración y una forma fibrosa menor migración.
• Tamaño: A mayor tamaño menor movilidad y a menor tamaño mayor movilidad.
4) ¿Por qué el pH y la fuerza iónica del regulador de corrimiento afectan la movilidad
electroforética de los analitos?
El pH modificara la carga de nuestro analito y no presentara la misma movilidad cuando el pH sea
igual al punto isoeléctrico.
Entonces, al presentarse una mayor fuerza iónica habrá una mayor cantidad disponible de cargas
por lo que la velocidad de migración será mayor.
5) Realice un esquema de una cámara de electroforesis, indicando los electrodos, la dirección
del flujo de electrones, la zona de aplicación de muestra. Finalmente, dibuje dos
electroferogramas: en uno de ellos represente los resultados de separación electroforética
con baja resolución, y en el otro, los resultados obtenidos de una separación con alta
resolución.

Bandas muy anchas y juntas presentara una baja

resolución.
Bandas delgadas y separadas presenta mayores
resoluciones

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6) Si estuviera interesado en separar una muestra biológica cuyos componentes más

abundantes tienen un punto isoeléctrico (pI) de 6.5, mencione ¿qué pH debe tener el
regulador de corrimiento para garantizar la migración de los analitos hacia el cátodo?
Menor a 6.5 para que se dirija hacia el cátodo.
7) ¿Qué %T recomendaría a un grupo de analistas que pretende separar una mezcla de
proteínas cuya masa molar oscila entre 40 - 50 kDa? Justifique brevemente el porqué de su
decisión, considerando la relación que existe entre el porcentaje del polímero y el efecto de
este en la porosidad y por tanto en la movilidad electroforética de los analitos.
Se recomienda un %T igual al 15% de acrilamida ya que presenta un mayor grado de
entrecruzamiento para aumentar la fricción del analito y aumentar la resolución de moléculas
pequeñas.
8) Explique de manera clara y precisa, por qué para la separación de moléculas de DNA con
un tamaño de 0.04 – 0.4 kpb se recomiendan geles con un 8 – 12% de agarosa, mientras que
para moléculas de DNA con un tamaño de 0.8 – 20 kpb se recomienda un menor porcentaje
de agarosa (aproximadamente de 0.7 – 0.6%)
Cuanto mayor es el porciento de T el grado de entrecruzamiento es mayor= numerosos poros pequeños.
Útil para mejorar la resolución en la separación de moléculas pequeñas.
Por el contrario si él %T es bajo, el grado de entrecruzamiento es menor=pocos poros de gran tamaño. Se
emplea para moléculas de mayor tamaño, porque trabajar geles con elevado %T dificulta la migración de
las moléculas al aumentar la fricción entre estas y el gel.
9) En un laboratorio de Biología Molecular están interesados en caracterizar una mezcla
compleja compuesta por fragmentos de ácidos nucleicos de distinta forma y tamaño. Con
base en su conocimiento, describa detalladamente el protocolo que sugeriría al equipo de
trabajo para separar dicha mezcla, mediante electroforesis.
Desnaturalizamos el DNA con ayuda de SDS para trabajar con una forma igual, utilizando un Gel de
agarosa por desplazamiento horizontal.
10) Describa de manera breve el protocolo experimental que seguiría para llevar a cabo la
separación de una mezcla mediante electroforesis bidimensional. Al final de su descripción,
mencione de manera concisa qué ventaja ofrece esta modalidad, respecto a la electroforesis
unidimensional.
Ventaja de la electroforesis Bidimensional es que si se pueden separar las moléculas con respecto a
su carga y al peso molecular.
11) ¿Qué diferencia existe entre electroforesis continua y electroforesis discontinua?
La electroforesis discontinua el gel presenta concentracion de monómeros, pH y fuerza iónica
diferente de los dos geles separadores.
Mientras que la continúa presentan todas sus características iguales.

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12) ¿Qué diferencia existe entre la electroforesis en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE)

y la electroforesis por isoelectroenfoque (IEF)?
En condiciones desnaturalizantes se debe de realizar un tratamiento para homogeneizar
la carga y forma de las moléculas y que solo se lleve a cabo la separación de acuerdo a las
diferencias por tamaño. Y por otra parte el isoenfoque solo separa en función de la carga.
13) Una muestra es separada, de manera independiente, tanto en condiciones NO reductoras
como condiciones reductoras, obteniendo el siguiente resultado (figura 1):

Figura 1. Separación de mezclas por electroforesis en condiciones reductoras

empleando DTT (izquierda) y no reductoras (derecha)
Con base en su conocimiento y considerando el fundamento de separación de mezclas por
electroforesis, explique claramente por qué se obtienen resultados diferentes al procesar la
muestra empleando o no un agente reductor
Por qué el agente reductor desestabiliza los enlaces que dan las subunidades proteicas confiriendo
una carga aniconica y asu vez quitando las subunidades de las proteínas.
14) ¿En qué se basa la migración de sustancias durante la separación de mezclas empleando
electroforesis capilar? Indique qué ventaja(s) presenta este tipo de electroforesis respecto a
la electroforesis convencional (electroforesis en gel).
La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación basada en la diferente velocidad de migración
de las distintas especies cargadas bajo la acción de un campo eléctrico. La separación se lleva a cabo en
un capilar de sílice fundida de diámetro muy pequeño (50-100 μm).
Ventajas
Requiere de un menor voltaje, por lo tanto, genera menores cantidades de calor lo que favorece la
separación mejorando su resolución.
Con la cromatografía electrocinética micelar (MEEKC), se puede dar la separación de moléculas neutras.
15) Defina ¿qué es la movilidad electroforética? Y ¿qué es el flujo electroosmótico?
Movilidad electroforética: Es un caso particular de la velocidad de migración de un ión cuando se
aplica un campo eléctrico.
Flujo electroosmótico: Movimiento de fluido a través de un conducto de un muy pequeño diámetro
como un capilar o un microcanal cuando se aplica un campo eléctrico.

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16) Describa brevemente en qué consiste la electroforesis capilar de tipo cromatografía

electrocinética micelar (MEEKC)
En esta modalidad las moléculas se distribuyen con base en su hidrofobicidad en una fase micelar
con carga. Útil para separar moléculas con carga y moléculas neutras, éstas últimas se distribuyen
entre la fase micelar y la fase acuosa (BGE). Al distribuirse en las micelas las moléculas neutras
quedan cargadas y por tanto pueden migrar al aplicarse el campo eléctrico. Esta técnica es un
híbrido entre la electroforesis capilar y la cromatografía de líquidos, en la cual los analitos se van a
distribuir en función de su coeficiente de partición entre la micela y el BGE y migrarán desde un
electrodo al otro al aplicarse corriente eléctrica (la micela se comporta como una fase
“pseudoestacionaria” y el BGE hace las veces de fase móvil). Los analitos más afines a la fase micelar
presentan menor movilidad electroforética respecto a los analitos más afines al BGE.

17) Cite dos aplicaciones de la electroforesis como método de separación (electroforesis

preparativa) y dos como método para caracterización de mezclas (electroforesis analítica).
Preparativa:
Western blot (WB) y separación de carbohidratos.
Analítica:
Separaciones quilares y secuenciación de DNA.
18) Investigue y describa una aplicación de la electroforesis capilar en el área biológica
• Análisis de péptidos
• Proteínas
• Ácidos nucleicos
• Fármacos
• Moléculas orgánicas

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19) ¿Qué tipo de transiciones energéticas son responsables de las señales instrumentales
detectadas en la espectrofotometría de absorción en la región del infrarrojo (IR)?
Transiciones vibracionales y rotacionales.
20) Mencione cuáles son las regiones en las que se divide el IR medio para el análisis
cualitativo de moléculas, indicando ¿cuál de ellas permite caracterizar de manera inequívoca
a unasustancia?
La región del IR medio es de 2.5- 50μ y a 4000 a 200(V),𝑐𝑚 −1 la que permite caracterizar de manera
inequívoca es de 2.5-15𝜇 (región de la huella dactilar de 1400-600𝑐𝑚 −1 .
21) ¿A qué se refiere el término momento dipolar de una molécula?
• Muchas moléculas eléctricamente neutras, esto es, sin carga neta, poseen una distribución de cargas
no homogénea. La magnitud de ese dipolo viene definida por lo que se conoce como momento
dipolar, y es el producto de la carga fraccional presente sobre cada átomo por la distancia que las
separa
• En una molécula los átomos no se encuentran fijos unos respecto a otros, sino que vibran alrededor
de sus posiciones de equilibrio. La energía necesaria para generar una vibración depende de la
energía de enlace y de la masa de los átomos involucrados.
¿Qué efecto tiene sobre el análisis de moléculas por espectroscopia IR?
Una condición necesaria para que se produzca una vibración en una molécula al incidir
sobre ella un haz de energía infrarroja es la presencia de momentos dipolares. Sí el
momento dipolar es nulo no hay absorción de energía infrarroja, caso contrario, habrá
absorción de energía infrarroja.
• Momento dipolar nulo • Momento dipolar no nulo

22) En los siguientes pares de enlaces subraye cuál de ellos se presentará a mayor
frecuencia, Justifique en cada caso el porqué de su decisión:
a) Estiramiento C – H o flexión C – H. Estiramiento C – H, porque …
El estiramiento se presenta a mayor frecuencia que la flexión.
b) Estiramiento C = O o flexión C – O Estiramiento C = O, porque …
El carbonilo presenta un doble enlace que tiene mayor energía de enlace comparado con un
enlace simple por lo tanto aumenta su frecuencia y como en el inciso anterior el estiramiento
presenta mayor que la frecuencia que la flexión.
c) Estiramiento C – N o estiramiento C = N. Estiramiento C = N, porque …
Y a que el doble enlace presenta una mayor energía de enlace comparado con el enlace simple, por
lo tanto aumenta su frecuencia.
d) Estiramiento O – H o estiramiento N – H Estiramiento N - H, porque …
Manteniendo constante un átomo en un enlace químico, la disminución en la masa del segundo
átomo unido al primero provoca un aumento en las frecuencias de vibración del enlace como
respuesta estiramiento N-H.

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e) Estiramiento C – Cl o estiramiento C – O Estiramiento C- O, porque …

Manteniendo constante un átomo en un enlace químico, la disminución en la masa del segundo
átomo unido al primero provoca un aumento en las frecuencias de vibración del enlace como
respuesta estiramiento C-O.

23) Se pretende caracterizar una muestra compleja de hidrocarburos extraída en el campo

petrolero de Chicontepec, Veracruz. Considerando las características de este grupo de
compuestos y las virtudes de las técnicas espectroscópicas en las regiones UV-visible e IR,
resuelva:
a) ¿Cuál de las dos regiones (UV-visible o IR) emplearía para la caracterización estructural de la
mezcla?
IR porque los hidrocarburos no absorben luz en el rango de UV-visible del espectro electromagnético.
b) Una vez seleccionada la región del espectro a utilizar y establecido el método de análisis,
decide que es pertinente clasificar a los compuestos de la mezcla, en principio, en dos grandes
grupos: alifáticos saturados y aromáticos. Con base en ello, ¿en qué zona de frecuencias (altas
o bajas) pretende encontrar a los compuestos del primer grupo y en cuál a los del segundo
grupo?
Aromáticos a bajas frecuencias.
Alifáticos a altas frecuencias.
24) ¿Cuál es el fundamento de análisis de sustancias utilizando la espectroscopia de
Resonancia Magnética Nuclear (RMN)?
• Interacción entre energía y materia (específicamente los núcleos de los átomos)
• Fundamento del spin nuclear que es el número de spin distinto a 0.
25) ¿Por qué la RMN es considerada una espectroscopia o un método espectrofotométrico?
Por qué para su representación gráfica se toman en cuenta la intensidad de señal instrumental y el
desplazamiento químico.
26) ¿Qué efecto produce la nube de electrones sobre el análisis de núcleos atómicos en la
espectroscopia de RMN?
La nube de electrones produce un apantallamiento magnético ya que provoca una protección
generando bajas frecuencias y campos altos.

27) Defina ¿qué es el desplazamiento químico (δ)?

Hace alusión al comportamiento de los núcleos en función de núcleos de referencia, es la posición
de una señal en el espectro.

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28) ¿Qué diferencia(s) existen entre los espectros de RMN de protón ( 1H-RMN) y los de
carbono-13 (13C-RMN)?
La brecha energética que genera la diferencia de energía al someter un analito a un
campo magnético es menor en la del carbono-13(13C-RMN) por lo que su frecuencia de
resonancia será menor esto es debido a que la constante giro magnética del carbono es ¼ con el
valor comparado del hidrogeno.
29) En espectroscopia de RMN, ¿en qué se basa el análisis de señales por desdoblamiento
espín – espín?
Se basa en el origen de multiplicidad de las señales bajo la regla de N+1.
30) ¿Qué efecto tiene la electronegatividad de los átomos adyacentes sobre la posición de la
señal de un protón en los espectros de RMN?
Al estar adyacente a la electronegatividad provoca que el núcleo este des-apantallado
por lo que no estará protegido y presentara campos bajos o frecuencias altas.
31) En la espectroscopia de RMN del protón (1H-RMN), ¿por qué el grupo metileno contiguo al
grupo funcional nitro (NO2), del nitropropano, tiene un desplazamiento químico mayor
respecto al grupo metileno del mismo compuesto?
Considere que la fórmula química del compuesto se representa como: NO2 – CH2 – CH2 – CH3
El grupo metileno que esta contiguo al grupo Nitro (NO2-) es menos parecido al TMS lo
que genera una menor protección y ocurrirá un mayor desplazamiento químico con
respecto al grupo metileno que está más protegido y tendrá un mayor parecido al TMS.
32) En la espectroscopia de RMN del carbono-13 (13C-RMN), ¿qué utilidad tiene el análisis por
“desacoplamiento fuera de la frecuencia de resonancia”, y cómo se generan las señales
en este tipo de espectros? Sugerencia: para dar respuesta a la última interrogante, considere
cuál es la regla que se aplica para identificar el número de señales asociadas a cada carbono
(análogo al desdoblamiento espín – espín).
Ofrece información sobre la interacción C-H, este análisis genera señales múltiples
respetando la regla N+1.
Nos indica a cada señal de carbono identificado si hay alguna señal y si las hay cuantos
protones estan unidos a ese carbono.
33) Analice los compuestos representados en la figura 2 y para cada uno:
a) Dibuje el espectro de resonancia magnética nuclear del protón (1H-RMN).
b) Dibuje el espectro 1H-RMN identificando, cuando corresponda, las señales múltiples
asociadas al desdoblamiento espín - espín.
c) Represente el espectro de resonancia magnética del carbono-13 (13C-RMN) de los
diferentescompuestos.
d) Aplicando la regla de multiplicidad, represente el 13C-RMN que obtendría como resultado
del desacoplamiento fuera de la frecuencia de resonancia.

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 B) De acuerdo al hidrogeno C) De acuerdo al 𝐶 13
TMS
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A) 200 0
20 1 4
3
3 2
1

10 0 D) 𝑁2 = 3 + 1 = 4 10 𝑁1 = 3 + 2 + 1 = 6 0
𝑁3 = 2 + 1 = 3 𝑁2 = 1 + 3 + 1 = 5
𝑁3 = 1 + 1 = 2
𝑁4 = 2 + 1 = 3

2
2 1
4 3 𝑁1 = 1 + 1 = 4
5 v 1
3
5
10 0 10 𝑁1 = 2 + 1 = 3 0
𝑁2 = 3 + 2 + 1 = 6
𝑁3 = 2 + 1 = 3
𝑁3 = 0 + 0 + 1 = 1
𝑁4 = 0 + 1 = 1
𝑁1 = 1 + 1 = 4
𝑁5 = 0 + 1 = 1 𝑁1 = 2 + 1 = 3
𝑁2 = 2 + 1 = 3
𝑁3 = 1 + 2 + 1 = 4
𝑁1 = 1 + 1 = 4 1 5 𝑁4 = 1 + 2 + 1 = 4
2
𝑁5 = 2 + 2 + 1 = 5

3 4

10
𝑁 =1+1=4 0
Figura 2. Fundamento del análisis de compuestos químicos orgánicos1por
espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN)

34) Mencione el fundamento del análisis por espectrometría de masas y la utilidad analítica de
esta técnica
La espectrometría de masas técnica basada en la separación de iones en función de su masa y
carga, para que finalmente sean detectados en un sistema de alta sensibilidad.
Determinar la masa molar de un compuesto a partir de su patrón de fragmentación.
35) ¿La espectrometría de masas es una técnica espectroscópica? SÍ o NO, ¿POR QUÉ?
No, Porque ene la espectrometría de masas la medida analítica no involucra, o no es el resultado de
la interacción entre la materia y alguna región del espectro electromagnético (Radicación igual a
energía).Por lo tanto, en un espectro de masas no estará representada la emisión o absorción de
energía radiante como variable dependiente.
36) Tomando en cuenta las etapas del proceso de análisis de compuestos mediante
espectrometría de masas, describa de manera clara el fundamento de operación de una
fuente de ionización y un analizador de masas, utilizados en los equipos de espectrometría
de masas.
• Fuente de ionización: Se encarga de ionizar las moléculas para favorecer su
partición y fragmentación adquiérelo una unidad de carga por cada unidad de
masa, además que los fragmentos más estables son los que se encuentran más
abundantes.
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• Analizador de masas: Es un campo magnético que separa los iones generados son
fragmentos de una misma molécula separados en función de su masa.

37) ¿Qué diferencias existen entre los espectros de masas obtenidos mediante una ionización
por impacto electrónico, respecto a los que se obtienen por ionización química?
• Impacto electrónico: Presenta una ionización fuerte ya que la diferencia de
potencial entre capas produce electrones de alta energía que impacta en las
moléculas fragmentándolas e incluso puede romper enlaces covalentes.
• Ionización química: Requiere de un gas reactivo y se obtienen menos fragmentos
con respecto a la IE derivados del analito.
38) Represente, en lo general, un espectro de masas, indicando claramente qué variable se
acota en el eje de las ordenadas y qué variable en el eje de las abscisas; asimismo, acote el
pico base y el pico del ion molecular indicando qué representa cada uno

Relación masa-carga

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39) En un espectro de masas, ¿qué representa cada señal instrumental (o cada pico)?
Un fragmento distinto de ionización.
40) ¿Cuál es el fundamento que rige la separación de mezclas mediante centrifugación? En su
respuesta, mencione las propiedades del analito que influyen en su separación utilizando el
método de centrifugación.
Separación basada en diferencias en la velocidad de sedimentación bajo efecto de Campo centrifugo
e influye la masa, forma y densidad de las partículas que influyen en su velocidad de sedimentación.
41) ¿Cuáles son las unidades en las que deben reportarse las condiciones de centrifugación:
revoluciones por minuto (rpm) o gravedades (g, fuerza centrífuga relativa = RCF)?
Son las g = Fuerzas centrifuga relativa=RFC
42) ¿Qué es el coeficiente de sedimentación (S) y cómo influye en la separación de mezclas por
centrifugación? En su respuesta indique ¿en qué unidades se reporta el coeficiente de
sedimentación?
Es la propiedad que hace alusión a la capacidad de una sustancia de sedimentar y presentara una
mayor capacidad por lo tanto un mayor S, por lo que requeriremos menor fuerza centrífuga para
lograr la sedimentación y sus unidades son 1S=10−13𝑠 .
Un alto S=Centrifugación a menor valor de g.
43) Mencione las diferencias que existen entre la centrifugación zonal y la centrifugación
isopícnica

A) En la centrifugación zonal los componentes migran a diferentes velocidades de

sedimentación, en un gradiente preformado con disoluciones de densidad variable. Además
que el gradiente se prepara por ejemplo, con soluciones de sacarosa, además que se prepara
el gradiente con soluciones de sacarosa.
B) Más en cambio en la centrifugación en equilibrio isopínica la separación se basa en la
diferencia en densidades de las moléculas; así, cada analito detiene su desplazamiento en la
región del gradiente de la cual cuya densidad sea igual a la de él y se prepara el gradiente en
sales pesadas por ejemplo CsCl o 𝐶𝑠2 (𝑆𝑂4 )

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44) Tomando como referencia el fundamento y aplicaciones de la radiactividad, resuelva:

a) ¿Qué es radiactividad?
b) ¿Cuáles son las formas de energía mediante las cuales se pueden estabilizar los núcleos
radiactivos?
c) Mencione el fundamento de operación de los instrumentos empleados para medir la
radiactividad
d) En qué unidades se mide la radiactividad

45) Cite dos efectos sobre los sistemas biológicos, como consecuencia de la exposición a la
radiactividad

46) Describa de manera breve y clara dos aplicaciones de la radiactividad en el área biológica

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