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    Electroforesis Capilar

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    Este documento describe la técnica de electroforesis capilar, incluyendo su historia, ventajas sobre otras técnicas como la electroforesis convencional y cromatografía líquida de alta eficacia, principios de funcionamiento, instrumentación, tipos como electroforesis capilar de zona y cromatografía electrocinética micelar, y ejemplos de aplicaciones.

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    Electroforesis Capilar

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    ELECTROFORESIS CAPILAR

    Electroforesis:
    “Técnica de separación basada en la migración diferenciada de
    compuestos iónicos o ionizables en un campo eléctrico”

    Electroforesis Electroforesis
    Convencional Capilar
    • Metodologia clásica • Metodologia totalmente
    • Arne Tiselius (1937)  Nobel 1948 instrumental
    • Separación de compuestos de • Mikkers (1979 – tubos de
    elevado peso molecular Teflon 200 µm) – Jorgenson
    (1981 – tubos Pyrex 75 µm)
    • Analisar várias muestras
    simultaneamente
    Electroforesis:
    “Técnica de separación basada en la migración diferenciada de
    compuestos iónicos o ionizables en un campo eléctrico”

    Electroforesis Electroforesis Capilar


    Convencional
    Ventajas del EC
    • Automatización completa
    Cuando comparado a la
    • Análisis cualitativas y cuantitativas
    electroforesis convencional
    • Acoplamiento a diversos detectores
    • Consumo mínimo de reactivos y solventes:
    • Volúmenes de muestra pequeños  EC: 0,1 nL – 1000 nL (1 µL) / HPLC (1 – 20 µL)
    • Buffer  EC: Sln stock 50 mL TBS 100 mM en água = ~2 g TBS (almacenar por 1 año) / HPLC (~30 mL de fase
    móvil por análisis)
    • EC: Análisis de muestras de diversos tipos y naturaleza con un mismo capilar / HPLC (diferentes columnas)
    • Análisis más rápidas:
    • Ej.: EC: 10 min / HPLC: 45 min
    • EC: Análisis ‘sub-minute’
    Desventajas:
    • Mejor resolución que HPLC
    Menor sensibilidad que HPLC
    Más parámetros requeridos en la optimización
    del método que en HPLC
    Equipos

    Beckman-Coulter P/ACE

    Agilent CE 7100
    Beckman-Coulter PA800 Plus

    Advanced Analytical
    Instrumentación

    Componentes
    Instrumentación

    Automuestreador
    Instrumentación

    Cassete y capilar

    Capilar hueco
    30 – 100 cm
    25 – 100 µm i.d.
    Instrumentación

    Detección:
    Instrumentación

    Detección
    Capilar con ventana de
    detección con bulbo expandido

    UV-Vis (DAD)

    Menor sensibilidad que el HPLC

    Celda de detección en Z
    Instrumentación

    Detección Flujo HPLC Flujo EC

    UV-Vis (DAD)

    Mejores resoluciones que HPLC


    Instrumentación

    Detección

    CE-MS
    Tipos de Electroforesis Capilar

    CZE: Electroforesis Capilar de Zona


    Tipos de Electroforesis Capilar

    CZE: Electroforesis Capilar de Zona


    Tipos de Electroforesis Capilar

    MEKC: Cromatografia electrocinética


    micelar
    Tipos de Electroforesis Capilar
    CGE: Electroforesis Capilar en Gel
    - Separación de compuestos iónicos de alto peso molecular
    (p.ej. Fragmentos de DNA, proteínas)
    - Estructuras poliméricas internas en el capilar – gel
    (p.ej. poliacrilamida)

    CIEF: Focalización isoeléctrica capilar


    - Separación de compuestos anfóteros en un gradiente de
    pH
    - Buffer contiene mezcla de compuestos con distintas cargas
    (p.ej. NaOH y H3PO4), con soluciones de distintos pH en los viales
    ánodo y cátodo.
    ¿Como funciona?

    NaOH 1M
    ¿Como funciona?

    EOF
    Buffer*
    (BGE)

    Doble capa Capa fija


    eléctrica Capa difusa
    Campo eléctrico: 0 hasta ~35 kV

    *Ej.: Tetraborato de sódio (TBS) pH = 9,3

    FLUJO ELETROOSMÓTICO - EOF


    ¿Como funciona? Velocidad de migración
    v = µeE
    EOF
    µe = movilidad electroforética
    E = intensidad del campo eléctrico

    Mobilidad electroforética
    µe = q/f

    q = carga eléctrica del analito


    f = fuerza de retardo por rozamiento
    ¿Como funciona?

    DETECTOR
    - NN ++
    N-- +
    N
    - N +

    CORRIENTE DEL RIO


    CÁTODO (-)
    ¿Como funciona?
    EOF Factores que afectan el EOF

    • pH del buffer
    • Campo eléctrico
    • Temperatura
    • Surfactante aniónico

    • Surfactante catiónico
    • Modificador orgánico
    en el buffer
    ¿Como funciona?
    INYECCIÓN
    Presión Vacio

    Sifón Electrocinético
    Versatilidad…
    Versatilidad…
    Inversión de flujo:
    EOF
    Buffer con CTAB
    (Bromuro de cetiltrimetil amonio)
    Inversión de la polaridad - N +
    Voltaje (-)

    Separación de elementos
    neutros
    Formación de miscelas
    (MEKC)

    Detección de compuestos
    sin grupos cromóforos
    Detección invertida
    (Buffer con co-ión absorvente)
    CE-MS
    Ejemplos de Aplicaciones
    Ejemplos de Aplicaciones
    Ejemplos de Aplicaciones
    Ejemplos de Aplicaciones

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