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    Diagrama de Bloques PROYECTO

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    1. Se extraen nódulos de raíces de trébol y se desinfectan mediante lavados y exposición a hipoclorito de sodio. 2. Los nódulos desinfectados se siembran en placas de agar y se incuban a 28°C por 7 días. 3. Luego de la incubación, se realiza tinción de Gram a las colonias obtenidas para observar la presencia de bacterias Gram negativas, correspondientes a la bacteria Rhizobium.

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    1. Se extraen nódulos de raíces de trébol y se desinfectan mediante lavados y exposición a hipoclorito de sodio. 2. Los nódulos desinfectados se siembran en placas de agar y se incuban a 28°C por 7 días. 3. Luego de la incubación, se realiza tinción de Gram a las colonias obtenidas para observar la presencia de bacterias Gram negativas, correspondientes a la bacteria Rhizobium.

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    Diagrama de bloques PROYECTO

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    1. Se extraen nódulos de raíces de trébol y se desinfectan mediante lavados y exposición a hipoclorito de sodio. 2. Los nódulos desinfectados se siembran en placas de agar y se incuban a 28°C por 7 días. 3. Luego de la incubación, se realiza tinción de Gram a las colonias obtenidas para observar la presencia de bacterias Gram negativas, correspondientes a la bacteria Rhizobium.

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    Diagrama de Bloques PROYECTO

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    1. Se extraen nódulos de raíces de trébol y se desinfectan mediante lavados y exposición a hipoclorito de sodio. 2. Los nódulos desinfectados se siembran en placas de agar y se incuban a 28°C por 7 días. 3. Luego de la incubación, se realiza tinción de Gram a las colonias obtenidas para observar la presencia de bacterias Gram negativas, correspondientes a la bacteria Rhizobium.

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    SIEMBRA DE LA BACTERIA Rhizobium

    Dejar raíz con


    tierra Raíces sin tierra

    Trébol con Extracción de Transportar al Lavar las


    nódulos raíces laboratorio raíces

    Colocar los nódulos Separar los


    Repetir el Lavar los nódulos en un tubo de
    lavado 6 veces desinfectados nódulos
    ensaye

    Con agua Añadirle 4 ml Con bisturí


    Transportar los estéril de NaClO y/o navaja
    nódulos a cajas Petri
    Agregar 5 Tomarlo con Con la flama del
    gotas de agua un asa mechero Fisher

    Colocar la mezcla en un
    Mezclar Dejar secar Sellar el frotis
    portaobjetos (frotis)

    TINCION DE GRAM
    Realizar tinción de
    Gram al frotis

    Puente de vidrio Colocar en una tarja


    y el frotis

    Añadir cristal Cubrir completamente


    violeta portaobjetos

    Añadir Lugol

    Eliminar exceso del Cubrir completamente Eliminar exceso


    Agua destilada colorante portaobjetos del colorante
    Safranina de 30 a Acetona de 5
    Agua destilada
    60 segundos a 10 gotas

    Eliminar exceso Enjuagar


    Colocar colorante Colocar alcohol
    de colorante inmediatamente

    Secado Observar al
    microscopio a 100x

    Aceite de
    inmersión

    SIEMBRA DE LA BACTERIA Rhizobium


    Preparación de los nódulos para la obtención de la bacteria Rhizobium
    1. Extraer una pequeña parte del trébol cuidando que las raíces contengan bastante
    tierra.
    2. Lavar cuidadosamente las raíces del trébol con abundante agua hasta que no queden
    residuos de tierra.
    3. Separar cuidadosamente con un bisturí y/o navaja, los nódulos de las raíces y
    colocarlos en el tubo de ensayo de 13 X 100.
    4. Cubrir los nódulos con 4 ml de hipoclorito de sodio (5%), dejar actuar de 1-3
    minutos.
    5. Lavar los nódulos desinfectados con agua estéril, repetir el lavado mínimo de 6
    veces.
    6. Transferir los nódulos, en condiciones de sepsis a una caja de Petri estéril y agregar
    5 gotas de agua.
    7. Mezclar el nódulo con el agua, tomar un asa y colocar esta mezcla en un
    portaobjetos (frotis).
    8. Dejar secar el frotis, sellar el frotis con la flama del mechero Fisher pasándolo
    rápidamente por la flama.
    9. Realizar tinción de Gram al frotis.
    TINCION DE GRAM
    a) Colocar en la tarja un puente de vidrio y colocar el frotis.
    b) Colocar cristal violeta hasta cubrir completamente el portaobjetos y dejar actuar 1
    minuto.
    c) Eliminar el exceso del colorante con agua destilada.
    d) Colocar Lugol hasta cubrir completamente el portaobjetos y dejar actuar durante 1
    minuto.
    e) Eliminar el exceso del colorante con agua destilada.
    f) Colocar Alcohol – acetona de 5 – 10 gotas y enjuagar inmediatamente.
    g) Colocar colorante Safranina de 30-60 segundos.
    h) Eliminar el exceso del colorante con agua destilada
    i) Dejar secar cerca del mechero Fisher.
    j) Observar al microscopio a 100x con aceite de inmersión.
    PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

    gr de Agar sal manitol 500 ml de gr de ASM


    con rojo Congo agua

    Pesar en balanza Verter en


    Añadir al Homogenizar
    granataria matraz
    matraz hasta disolver
    graduado

    Esperar Esterilizar Agregar 500


    Taparlo ml
    enfriamiento autoclave

    15 min a 120 °C Gorro de papel de Agua


    estraza y cinta
    Sacar y dejar enfriar
    Por cada
    vaciado Medio de siembra

    Esperar a que
    Encender Flamear boca del matraz Vaciar a cajas
    solidifique
    mechero Petri

    Poner en
    refrigeración

    PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO


    1. En una balanza granataria pesar gr de Agar sal manitol con rojo Congo.
    2. En un matraz graduado agregar 500 ml de agua, añadir el gr de Agar y homogenizar
    hasta que se disuelva perfectamente.
    3. Agregar los otros 500 ml de agua, taparlo con un tapón de gasa.
    4. Tapar con un gorro hecho de papel estraza con cinta indicadora.
    5. Esterilizar en el autoclave 15 min a 120°C
    6. Posterior al tiempo de esterilizado sacar y dejar enfriar solo un poco.
    7. Prender el mechero, para poder vaciar en las cajas Petri. Para el vaciado es
    importante flamear la boa del matraz cada vez que se vaya a vaciar en las cajas
    Petri.
    8. Dejar enfriar hasta que se hagan sólidas.
    SEMBRADO EN LOS MEDIOS DE CULTIVO
    Con bisturí y/o
    9. Almacenar para posteriormente sembrar en ellas. navaja
    Raiz con tierra del Abundante
    trébol agua

    Transportar a Separar
    Extracción Lavar Raíz
    laboratorio nódulos

    Agua esteril

    Lavar nódulos Colocar en tubo


    Dejar actuar Cubrir nódulos de ensaye
    desinfectados

    6 veces

    4 ml de hipoclorito de Tubo de 13
    1 a 3 minutos
    sodio al 5% x 100
    Repetir lavado
    Agregar 5 Por estriado en
    gotas de agua Asa disolución
    bacteriológica

    Sembrar en caja
    Transferir Caja Petri esteril Tomar muestra Petri
    nódulos

    En condiciones de A 28 °C Incubar
    sepsis por 7 dias

    Aplicar nuevamente Seleccionar Observar


    Prepara frotis
    tinción gram colonias desarrollo

    Blancas y mucosas

    Observar en Presencia de Gram


    microoscopio Negativos bacilos cortos
    SEMBRADO EN LOS MEDIOS DE CULTIVO
    1. Extraer una pequeña parte del trébol cuidando que las raíces contengan bastante
    tierra.
    2. Lavar cuidadosamente las raíces del trébol con abundante agua hasta que no queden
    residuos de tierra.
    3. Separar cuidadosamente con un bisturí y/o navaja, los nódulos de las raíces y
    colocarlos en el tubo de ensayo de 13 X 100.
    4. Cubrir los nódulos con 4 ml de hipoclorito de sodio (5%), dejar actuar de 1-3
    minutos.
    5. Lavar los nódulos desinfectados con agua estéril, repetir el lavado mínimo de 6
    veces
    6. Transferir los nódulos, en condiciones de sepsis a una caja de Petri estéril y agregar
    5 gotas de agua.
    7. Con un asa bacteriológica tomar un poco de esta mezcla y sembrar en la caja Petri
    por estriado en dilución.
    8. Incubar a 28 °C de 3 a 7 días.
    9. Observar el desarrollo de la bacteria en el medio de cultivo, seleccionar colonias
    aisladas blancas y mucosas (Ver Anexo…)
    10. A partir de una de las colonias típicas seleccionadas, preparar un frotis, y aplicar
    nuevamente una tinción de Gram y observar al microscopio, al observar deben
    existir la presencia de Gram Negativos bacilos cortos (ver anexo…)

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