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    Diagrama de Flujo Práctica 5

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    Cristian Huerta
    Diagrama de flujo de Toxicología QFB UASLP

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    Diagrama de flujo de Toxicología QFB UASLP

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    Diagrama de flujo práctica 5

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    Preparación de soluciones

    Agarosa

    Regular al 1% Regular LMPA


    5%

    Pesar 0.25g Pesar 0.125g

    Agua Agua
    Disolver 25mL y desionizada Disolver 25mL y
    desionizada
    agitar 30°C agitar
    30°C

    Verter en frasco Verter en frasco

    Colocar en baño Colocar en baño


    a 50°C a 37°C
    Solución de lisis
    146.1 g de NaCl (2.5 M),
    1.2 g de trizma base (10 mM), Pesar
    8 g de NaOH (0.2 M) y
    37.2 g EDTA (100 mM)

    Ajustar pH a 10

    100 mL de dimetilsulfóxido
    Agregar (DMSO, 10 %) y
    10 mL de Tritón 100 X (1 %).

    Aforar en matraz de 1 L

    Filtrar con papel


    Whatman

    Almacenar en frasco
    A 4°C por 1 h ámbar
    Solución amortiguadora para electroforesis

    200 g de Pesar
    NaOH (10 N)

    Disolver 500 mL de agua


    desionizada

    3.72 g de EDTA Pesar


    (200 mM)

    Ajustar pH a 10

    Disolver 50 mL de agua
    desionizada

    48 mL de NaOH (10 N),


    8 mL de EDTA (200 mM) y Mezclar
    agua

    Medir pH ≥13

    Aforar en matraz de 2 L

    Filtrar con papel


    Whatman

    Almacenar en frasco
    A 4°C por 1 h ámbar
    Solución de trizma base

    12.12 g de trizma Pesar


    base (0.4 M)

    Ajustar pH a 7.5

    Aforar en matraz de 250


    mL

    Filtrar con papel


    Whatman

    Almacenar en frasco
    A 4°C por 1 h ámbar
    Preparación de camas de agarosa
    Esmerilado hacia arriba
    Colocar portaobjetos
    en un vaso de precipitado
    con alcohol anhidro

    Tapar con parafilm

    Reposar 15 minutos

    Tomar portaobjetos con


    pinzas

    Limpiar con una gasa

    Colocar en charola y
    rotular

    Colocar sobre el 150 µL de agarosa


    portaobjetos regular

    Distribuir la agarosa

    Colocar en charolas y secas y frías las laminillas


    secar en el horno a una pueden ser almacenadas
    temperatura de 65-70°C en cajas porta-laminillas
    Preparación de las muestras para el ensayo

    Colocar en el fondo de 15 µL de células en


    tubos Eppendorf suspensión

    Añadir 225 µL de agarosa


    LMPA

    Homogeneizar en vortex

    Tomar de la mezcla 75 225 µL de agarosa


    µL LMPA

    Colocar sobre la cama de


    agarosa en la laminilla

    Colocar cubreobjetos

    Llevar a refrigeración por 5


    minutos Transcurrido el tiempo,
    retirar de forma cuidadosa el
    cubreobjeto y desecharlo.
    En el coplin, agregar 50 mL
    de la solución de lisis y
    Retirar de forma delicada el colocar dentro las laminillas
    cubreobjeto de la laminilla por 1 hora.

    Colocar de nuevo el
    Agregar 75 µL u 80 µL de cubreobjeto y llevar a
    agarosa LMPA refrigeración por 5 minutos
    Electroforesis

    Colocar la solución de
    electroforesis en la cámara

    Colocar las laminillas


    en la cámara

    Verter la solución de
    electroforesis hasta cubrir las
    laminillas

    Se configuran los
    parámetros de la fuente de
    poder a 25 V, 300 A y 20
    minutos.

    Apagar la fuente y sacar las


    laminillas con las pinzas y
    secar por debajo

    Aplicar trizma 0.4 M y dejar


    reposar 5 minutos

    Escurrir las laminillas,


    aplicar alcohol anhidro y
    dejar reposar 5 minutos

    Retirar de forma delicada el


    cubreobjeto de la laminilla

    Escurrir las laminillas y


    colocarlas en un coplin
    con alcohol anhidro por 5
    minutos
    Tinción de las muestras para su lectura y observación en microscopio de
    fluorescencia

    Preparar 10 mL una
    solución de bromuro de
    etidio a 0.05 mM

    Tomar una laminilla y


    colocar 25 µL de bromuro
    de etidio (0.05 mM)

    Colocar cubreobjetos

    Enfocar en el microscopio
    de fluorscencia con el
    objetivo de 20 X

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