Colinesterasa Del Suero

SEMINARIO PRCTICAS
Colinesterasa del suero

un ejemplo de determinacin de actividad
enzimtica y clculos cinticos
Javier Sez Valero
1. Colinesterasas: acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa

1.1. El Sistema colinrgico y el papel de acetilcolinesterasa (AChE)
1.2. Butirilcolinesterasa (BuChE), potencial papel fisiolgico
2. Determinacin de la actividad colinesterasa por el mtodo de Ellman
2.1 El uso de inhibidores y sustratos especficos
3. La prctica
3.1. Los Objetivos
3.2. El Protocolo
3.3. Los clculos enzimticos
4. La seguridad en el laboratorio de investigacin
Colinesterasas
Enzimas que hidrolizan preferentemente los steres de colina. Serin-esterasas
(y por ser inhibidos pro fisostigmina, eserina, 10-5M) Inh irreversible por organosfosforados
Acetilcolinesterasa: AChE
EC 3.1.1.7
(gen cromosoma 7)
Butirilcolinesterasa: BuChE
EC 3.1.1.8
(gen cromosoma 3)
Segn la (IUBMB) Unin

internacional de Bioqumica
y Biologa Molecular, los
estractos enzimticos
pueden nombrarse por
un nmero de
identificacin
consistente en las letras
EC seguidas de 4
digitos (separados por
puntos), que
corresponderan por
orden: el primero a la
clase (de las 6
existentes), el segundo
a la subclase, el tercero
a la sub-subclase y el
cuarto nmero
identificara al enzima
concreto.
Clasificacin y nomenclatura de enzimas

Normalmente se aade el sufijo -asa al nombre del sustrato o bien
a una palabra que describe la reaccin
Glucosa-6-P
Isomerasa
Hexosa-P
Isomerasa
Todas las enzima

nombres del E.C. y
adems nombres
sencillos
Cada una de las 6 clases se subdivide en varias subclases y cada subclase en sub-subclase:
1. xido-reductasas
Reacciones de oxido-reduccin
-Deshidrogenasas.
-Oxidasas.
-Reductasas.
-Peroxidasas
-Catalasas.
-Oxigenasas.
-Hidroxilasas.
2. Transferasas
Transferencia de grupos
funcionales
Transaldolasas, Transcetolasa.
Acil-, metil-, glucosil-, fosforiltransferasas.
Quinasas.
Fosfomutasas.
3. Hidrolasas
Reacciones de hidrlisis
(rotura de enlaces por
adicin de H2O)
Esterasas.
Glucosidasas.
Peptidasas.
Fosfatasas.
Tiolasas.
Fosfolipasas.
Amidasas.
Desaminasas.
Ribonucleasas
4. Liasas
Adicin de grupos a los dobles
enlaces o eliminacin grupos para
formar dobles enlaces
5. Isomerasas
Reacciones de isomerizacin
(reordenamientos moleculares)
6. Ligasas
Formacin de enlaces entre 2
sustratos, con aporte de ATP
Descarboxilasas.
Aldolasas.
Hidratasas.
Deshidratasas.
Sintasas.
Liasas.
Si una molcula se
reduce, tiene que haber
otra que se oxide
grupos aldehidos gupos
acilos grupos glucosilos
grupos fosfatos (kinasas)
Transforman polmeros en
monmeros.
Actuan sobre: enlace ster
enlace glucosdico enlace
peptdico enlace C-N
Entre C y C Entre C y O
Entre C y N
Racemasas.
Epimerasas.
Isomerasas.
Mutasas (no todas).
Sintetasas.
Carboxilasas
Entre C y O Entre C y S
Entre C y N Entre C y C
Ej: Acetilcolinesterasa (AChE)

EC 3 - Hidrolasa
EC 3.1 Acta sobre enlace ester
EC 3.1.1 Hidrolasa de ester carboxlico
EC 3.1.1.7 Acetilcholinesterasa
(Esterasa de acetilcolina)
Reaccin:
acetilcolina + H2O = colina + acetato
Sistema colinrgico
EC 3.1.1.7
La funcin de la acetilcolinesterasa (AChE)

es la inactivacin rpida del
neurotransmisor acetilcolina despus de su
liberacin en las sinpsis colinrgicas
Adems se localiza en tejidos desprovistos de colina, por lo
que se le atribuyen otras funciones
La enzima
colinacetiltransferasa (ChAT)
acetila la colina (Ch)
utilizando acetil-coenzimaA
(Acetil-CoA) para formar el
neurotransmisor acetilcolina
(ACh).
La ACh, que se libera
mediante vesculas sinpticas
y la participacin del
transportador vesicular de
ACh (VAChT).
La Sinpsis Colinrgica
ChAT
La ACh liberada al espacio

sinptico puede interactuar
con receptores colinrgicos
muscarnicos o nicotnicos.
Finalmente, ACh es
hidrolizada por
acetilcolinesterasa (AChE)
para producir acetato (A) y
Ch.
La Ch es recaptada por la
neurona presinptica por un
transportador de Ch de alta
afinidad (ChT).
AChE
AChE en PATOLOGA
La miastenia gravis (debilidad muscular)
Enfermedad neuromuscular autoinmune
(se generan anticuerpos contra receptores de ACh) y
Crnica: debilidad de los msculos esquelticos

causada por un defecto en la transmisin de los impulsos nerviosos a los
msculos (tratamiento con Inhib AChE)
No confundir con miastenia congnita sinptica,

EAD (Endplate acetylcholinesterase deficiency)
o sndrome miastnico congnito de Engel: dficit de Col Q
(NUNCA administrar Inhib AChE!!!)
La Enfermedad de Alzheimer es una

enfermedad neurodegenerativa:
deterioro cognitivo y trastornos conductuales.
El sistema colinrgico es el ms afectado por la
patologa (papel de ACh en memoria)
EC 3.1.1.8
BuChE o colinesterasa del suero
La funcin fisiolgica de la
Butirilcolinesterasa (BuChE) se
desconoce
Puede hidrolizar acetilcolina, aunque sin potencial
papel en la sinpsis colinrgica (condiciones normales)
Presente en casi todos los tejidos
Especialmente abundante en suero
BuChE en PATOLOGA
BuChE puede hidrolizar algunos steres de colina,
los cuales pueden ser drogas como
Procana*, tetracana*, aspirina, herona y cocana
Tambin se ha propuesto que puede servir de barrera ante el
envenenamiento por organosfosforados
La actividad BuChE puede estar completamente ausente
en individuos con mutaciones genticas: fenotipo silente
Individuos SIN patologa pero NO pueden hidrolizar algunos
compuestos de uso en medicina (*):
anestsico suxametonium
BuChE es especialmente abundante en el suero siendo sintetizada
en el hgado por lo que la disfuncin heptica cursa
con niveles bajos de actividad BuChE
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD COLINESTERASA POR EL MTODO DE ELLMAN
AChE
(CH 3) 3N-CH 2-CH 2-S -CO-CH 3

acetiltiocolina
Iso-OMPA
BuChE
X
(CH 3) 3N-CH 2-CH 2-S -
(CH 3) 3N-CH 2-CH 2-S -CO -CH 2-CH 2-CH 3

butiriltiocolina
tiocolina
CH 3-CH 2-CH 2-C O O- + 2H +
butirato
BW
AChE
X
+ 2H +
BuChE
CH 3-CO O acetato
(CH 3) 3N-CH 2-CH 2-S tiocolina
Basado en la oxidacin de grupos tioles libres por un compuesto cromognico

un tioanlogo del sustrato preferente (ATCh/BuTCh)
La tiocolina reacciona rpidamente con el DTNB (5-tio-2-nitrobenzoato)

muestra un color amarillo intenso y un mximo de absorbancia a 412 nm
COO -
(CH 3) 3N-CH 2-CH 2-S tiocolina

+ COO S
NO2
COOS
NO2
DTNB
NO2
(CH3)3N-CH2-CH2-S-S
conjugado
-S
-S
COO -COO
NO2
NO2
5-tio-2-nitrobenzoato
Cromforo
412 nm
Anlisis de actividad enzimtica: espectrofotmetros

Un espectrofotmetro tiene la capacidad de
proyectar un haz de luz monocromtica a
travs de una muestra y medir la cantidad de
luz que es absorbida por dicha muestra.
Permite al operador realizar dos funciones:
1. Da informacin sobre la naturaleza de la
sustancia en la muestra (ej AN Abs 260 nm)
2. Indica indirectamente que cantidad de la
sustancia que nos interesa est presente en la
muestra
Lector de placa permite adaptar los mtodos

y evaluar simultneamente gran nmero de
muestras (placas de 96 pocillos)
La prctica
Objetivos (El alumno habr de ser capaz de):

Medir actividades enzimticas por tcnicas colorimtricas.
Representar grficamente el curso temporal de la reaccin y valorar la linealidad del
proceso.
Calcular actividades enzimticas, expresando el resultado en unidades de actividad
enzimtica.
Observar una cintica michaeliana y representar la curva de velocidad frente a
concentracin de sustrato.
Determinar las constantes cinticas por la representacin de Lineweaver-Burk.
La prctica
Ensayo de actividad enzimtica
1) La formacin de producto con el tiempo.
2) El efecto de la concentracin de sustrato.
Procedimiento:
Preparar la tanda de 6 tubos (ms un tubo para al autocero) segn el protocolo
1 disolucin de DTNB (breve incubacin)
2 el volumen de sustrato (butiril-tiocolina) + el volumen de agua para completar.
Antes de la primera medida de actividad, preparar una cubeta slo con 2 ml de agua y 1 ml de DTNB
(volumen total 3 ml), y usarla para hacer el autocero del colormetro
3 Disparar la reaccin con la enzima.
La prctica
3 Disparar la reaccin con la enzima.
(tubo a tubo NO todos de golpe)
Anotar cada 20 sg (durante 3 min)
el valor de absorbancia (a 410 nm)
* Es preferible iniciar la reaccin aadiendo el sustrato, pero en esta prctica conviene dispararla con la enzima.
Ello nos lleva a despreciar el valor de hidrlisis espontnea: los grupo tioles libres presentes en protenas de la
muestra, los cuales al reaccionar tambin con el DTNB pueden alterar la medida enzimtica. Se evita, en parte,
incubando las muestras con el DTNB, antes de aadir el sustrato.
*La adicin de inhibidores es necesaria si la muestra puede contener AChE y BuChE; si slo una de ellas est
presente, como es el caso, se pueden omitir.
Cintica Enzimtica: Velocidad de transformacin de reactivos en productos

Mtodo de estudio del mecanismo de una reaccin: estudio de la velocidad de la reaccin
(y su variacin en respuesta a cambios en los parmetros experimentales)
Las enzimas modifican las velocidades de las reacciones
La velocidad se expresa como cambio en [S] (o aparicin de P, cambio en [P]) por unidad de t
Reaccin: S
d S d P
Velocidad v
dt
dt
Perfil de Velocidad o Curva de Progreso
vo
P
Curva de progreso:
Determina vo experimentalmente (para cada [S])
[S] ajustable por el investigador
vo
Tiempo
Representacin de la Ecuacin de Michaelis-Menten
Clculos
Para conocer la concentracin de sustrato final en cada uno de los tubos, aplicar:
Vi Si = Vf Sf
Por ejemplo, para el tubo 1:
0.05ml 6mM = 3ml S1
(S1 = 0.1 mM)
CLCULOS DE ACTIVIDAD ENZIMTICA

Unidad Internacional (U): Cantidad de enzima que transforma 1 micromol de sustrato por min.
1 UNIDAD = 1 U = 1 mol / min
La relacin absorbancia - concentracin sigue la Ley de Lambert-Beer:
Absorbancia = C L
C = Abs / L(espesor)
siendo
= coeficiente de extincin molar del cromforo (1,36104 litro/ mol cm).

C = concentracin molar de producto formado (moles / litro).
L = longitud del paso ptico de la cubeta (1 cm).
En la prctica (para nuestra reaccin colorimtrica): C = Abs /1,36104 (moles / litro)
Clculos
Promediar Incremento absorbancia (Abs) frente a tiempo (min), Abs /min,
comprobando linealidad grficamente,
Dividiendo este valor por y por L nos dar el valor de C/min (C es el incremento de producto).
A continuacin, calculad la actividad enzimtica, sabiendo el coeficiente de extincin del cromforo,
empleando la expresin:
Actividad en U/ml (mol.min-1.ml-1) = [(Abs/min)103Vt] / [1.36104 Vm]
Donde Vt es el volumen total en la cubeta, y Vm el volumen de muestra (enzima).
103 es una factor de conversin.
Para simplificar los clculos, conviene calcular un factor f tal que:

Actividad en U/ml (mol.min-1.ml-1) = (Abs/min)f
Calcular dicho factor f para nuestros ensayos
Resultados
Representar grficamente la absorbancia frente al tiempo para cada uno de

los tubos y obtener la recta que mejor se ajusta a los puntos:
calcular el Abs/min
Calcular la actividad enzimtica en U/ml suero (mol/min /ml suero)
- Valores Abs/min, v, 1/v, [S], 1/ [S]
- Grfica de v frente a S y 1/v frente a 1/S.
- Valor obtenido de KM y Vmx .
Representacin de la Ecuacin de Michaelis-Menten
En la prctica no suelen calcularse la Vmax ni la KM a partir de la curva de saturacin, es poco preciso
A partir de 6-8 puntos experimentales, puede considerarse fiable la

determinacin grfica de KM y Vmax por este mtodo
La KM y la Vmax son nicas para cada actividad enzimtica en unas condiciones de pH y T determinadas
-Es un proceso bifsico:

KM: da informacin sobre la fase de fijacin del sustrato E+SES.
Vmax: da informacin sobre la fase cataltica (cintica de paso de SP).
Velocidad inicial v0
Grfica Michaelis-Menten
V max
Vmax
2
Km
-Significado de KM :
su valor es prximo a la [S] que suelen darse en
condiciones fisiolgicas. Esto permite la regulacin de la
actividad del enzima en respuesta a pequeas variaciones
de pH, T, fuerza inica, .
-Sera la [S] a la cual el enzima trabaja a la mitad de su
velocidad mxima. Tiene unidades de concentracin (M)
k 1 k 2
KM
k1
Si k2<<k-1:
k 1
1
KM
k1 K a
La KM puede ser un indicador de la afinidad de unin del enzima por el sustrato
-Significado de vmax :
La vmax revela el nmero de recambio de la enzima

-(La Constante cataltica ) El Nmero de recambio (turnover):
Nmero de molculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo y por
cada molcula de enzima, en condiciones de saturacin
(U/mol de enzima mol de Sustrato X min.-1 X mol de enzima-1)
Si hay S >>>> E, todo E est como ES y la kcat ~ k2
Cuestionario - Informe
1.- Por qu es mejor usar butiriltiocolina que acetiltiocolina para medir la
actividad de butirilcolinesterasa?
Y por qu butiriltiocolina y no butirilcolina?
Por qu prescindimos de inhibidores de colinesterasas?
2.- La enzima ensayada da una respuesta lineal de formacin de producto
con el tiempo?
La enzima ensayada, cumple la ecuacin de Michaelis - Menten?
3.- En hojas aparte deber presentar un informe, que contenga los clculos
ya comentados:
- La tabla de Resultados.
- Grfica de absorbancia frente a tiempo.
- Tabla con valores de Abs/min, v, 1/v, [S], 1/ [S]
- Grfica de v frente a S y 1/v frente a 1/S.
- Valor obtenido de KM y Vmx .
Directrices para laboratorios bsicos niveles de bioseguridad 1 y 2
Proteccin personal
En el laboratorio SIEMPRE ATENTOS!!

Procedimientos
1. Estar estrictamente prohibido pipetear con la boca.
2. No se colocar ningn material en la boca ni se pasar la lengua por las etiquetas.
3. Todos los procedimientos tcnicos se practicarn de manera que se reduzca al mnimo la
formacin de aerosoles y gotculas.
4. Se limitar el uso de jeringuillas y agujas hipodrmicas, que no se utilizarn en lugar de dispositivos
de pipeteo ni con ningn fin distinto de las inyecciones por va parenteral o la aspiracin de lquidos de
los animales de laboratorio.
5. Todos los derrames, accidentes y exposiciones reales o potenciales a materiales infecciosos
se comunicarn al supervisor del laboratorio. Se mantendr un registro escrito de esos accidentes
e incidentes.
6. Se elaborar y seguir un procedimiento escrito para la limpieza de todos los derrames.
7. Los lquidos contaminados debern descontaminarse (por medios qumicos o fsicos) antes de
eliminarlos por el colector de saneamiento. Puede ser necesario un sistema de tratamiento de
efluentes, segn lo que indique la evaluacin de riesgos del agente con el que se est trabajando.
8. Los documentos escritos que hayan de salir del laboratorio se protegern de la contaminacin
mientras se encuentren en ste.

Procedimientos

Zonas de trabajo del laboratorio
1. El laboratorio se mantendr ordenado, limpio y libre de materiales no relacionados
con el trabajo.
2. Las superficies de trabajo se descontaminarn despus de todo derrame de material
potencialmente peligroso y al final de cada jornada de trabajo.
3. Todos los materiales, muestras y cultivos contaminados debern ser descontaminados
antes de eliminarlos o de limpiarlos para volverlos a utilizar.
4. El embalaje y el transporte de material debern seguir la reglamentacin nacional o
internacional aplicable.
5. Las ventanas que puedan abrirse estarn equipadas con rejillas que impidan el paso de
artrpodos.
Seamos
Profesionales!!
(=responsables)
Los cuadernillos de practicas deben entregarse al profesor

responsable de la prctica al concluir la misma, con
el nombre del alumnos,
as del compaero

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SEMINARIO PRCTICAS

Colinesterasa del suero

1. Colinesterasas: acetilcolinesterasa y butirilcolinesterasa

Segn la (IUBMB) Unin

Clasificacin y nomenclatura de enzimas

Todas las enzima

Ej: Acetilcolinesterasa (AChE)

La funcin de la acetilcolinesterasa (AChE)

La ACh liberada al espacio

(se generan anticuerpos contra receptores de ACh) y

Crnica: debilidad de los msculos esquelticos

No confundir con miastenia congnita sinptica,

La Enfermedad de Alzheimer es una

BuChE o colinesterasa del suero

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD COLINESTERASA POR EL MTODO DE ELLMAN

(CH 3) 3N-CH 2-CH 2-S -CO-CH 3

(CH 3) 3N-CH 2-CH 2-S -

(CH 3) 3N-CH 2-CH 2-S -CO -CH 2-CH 2-CH 3

(CH 3) 3N-CH 2-CH 2-S tiocolina

Basado en la oxidacin de grupos tioles libres por un compuesto cromognico

La tiocolina reacciona rpidamente con el DTNB (5-tio-2-nitrobenzoato)

(CH 3) 3N-CH 2-CH 2-S tiocolina

Anlisis de actividad enzimtica: espectrofotmetros

Lector de placa permite adaptar los mtodos

Objetivos (El alumno habr de ser capaz de):

3 Disparar la reaccin con la enzima.

Cintica Enzimtica: Velocidad de transformacin de reactivos en productos

Perfil de Velocidad o Curva de Progreso

Representacin de la Ecuacin de Michaelis-Menten

0.05ml 6mM = 3ml S1

(S1 = 0.1 mM)

CLCULOS DE ACTIVIDAD ENZIMTICA

= coeficiente de extincin molar del cromforo (1,36104 litro/ mol cm).

En la prctica (para nuestra reaccin colorimtrica): C = Abs /1,36104 (moles / litro)

Para simplificar los clculos, conviene calcular un factor f tal que:

Representar grficamente la absorbancia frente al tiempo para cada uno de

Representacin de la Ecuacin de Michaelis-Menten

En la prctica no suelen calcularse la Vmax ni la KM a partir de la curva de saturacin, es poco preciso

A partir de 6-8 puntos experimentales, puede considerarse fiable la

-Es un proceso bifsico:

La KM puede ser un indicador de la afinidad de unin del enzima por el sustrato

La vmax revela el nmero de recambio de la enzima

Directrices para laboratorios bsicos niveles de bioseguridad 1 y 2

Directrices para laboratorios bsicos niveles de bioseguridad 1 y 2

Directrices para laboratorios bsicos niveles de bioseguridad 1 y 2

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Los cuadernillos de practicas deben entregarse al profesor

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