Conceitos de Imunidade e Introdução A Sorologia

FISIOPATOLOGIA E FARMACOTERAPIA I
SOROLOGIA-IMPORTÂNCIA E
PARÂMETROS
PROF. ME. ALESSANDRO VIEIRA FERREIRA

IMPORTÂNCIA DOS TESTES SOROLOGICOS
 Diagnóstico
 Demonstração do patógeno
 Auxiliares no diagnóstico individualizado ou em

inquéritos soroepidemiológicos.
PARÂMETROS SOROLÓGICOS
SENSIBILIDADE
ESPECIFICIDADE
VALOR PREDITIVO
LIMIAR DE REATIVIDADE
EXATIDÃO, PRECISÃO, REPRODUTIBILIDADE

TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS
 Técnicas sem uso de marcadores

 Reações de Precipitação
 Reações de Aglutinação
 Técnicas com uso de marcadores

 ELISA
 Citometria de fluxo
 Imunofluorescência
 Radioimunoensaio
TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS
• PRECIPITAÇÃO
- Imunodifusão dupla
- Imunodifusão radial
- Imunoeletroforese PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
• AGLUTINAÇÃO Verificar quanto a
- Aglutinação direta e indireta especificidade e
- Inibição da aglutinação sensibilidade
- Teste de Coombs
• IMUNOENSAIOS
- Radioimunoensaio
- ELISA
- Imunofluorescência
- Citometria de Fluxo
PESQUISA DE ANTICORPOS NO DIAGNÓSTICO
INDIVIDUAL
1.Elucidação de processos patológicos com sintomas e

sinais clínicos e confundíveis: toxoplasmose, rubéola,
sífilis, processos alérgicos....
2. Diferenciação da fase da doença:
IgM – Processos agudos

IgG- imunoglobulina de memória
Avidez ou afinidade funcional dos anticorpos IgG –

utilizados em diferentes fases da patologia.
3. Diagnóstico de doença congênita:
Anticorpos IgM anti- T. Pallidum no sangue do cordão umbilical – sífilis
congênita.
Anticorpos IgG anti-T.pallidum – pode indicar processo infeccioso
congênito ou transmissão da imunoglobulina.
4. Seleção de doadores de sangue:

Triagem clínica
Epidemiológica
Sorológica: doença de chagas, sífilis, hepatite B e C, síndrome da
imunodeficiência adquirida (AIDS) e HTLV-1 e II.
5. Seleção de doadores e receptores de órgãos
para transplantes:
Anticorpos altamente específicos.
Antígenos do complexo de histocompatibilidade (sistema HLA) –
utilizados em testes de linfocitoxicidade.
6.Avaliação do prognóstico da doença
Ex:hepatite B – componentes estruturais do vírus induzem a

formação de Ac- marcadores.
7. Avaliação da eficácia da terapêutica e da suspensão da terapêutica :
Sífilis – AC anticardiolipina detectados no teste do VDRL tem queda

gradual quando a terapêutica é bem sucedida
8. Avaliação da imunidade específica naturalmente adquirida ou artificialmente

induzida:
Ac IgG específicos para componentes antigênicos de um determinado micro-organismo podem ser

utilizados como marcadores de imunidade específica de um individuo a esse microrganismo.
9.Agravamento da patologia
IMPORTÂNCIA DA PESQUISA DE ANTICORPOS EM INQUÉRITOS
SOROEPIDEMIOLÓGICOS
Prevalência
da doença
Erradicação
da doença
Reintrodução de
novos casos em
áreas consolidadas.
IMPORTÂNCIA DA PESQUISA DE ANTÍGENOS
CRITÉRIOS DE CURA
DEFINIÇÃO DA ETIOLGIA DA DOENÇA
SELEÇÃO DE DOADORES DE SANGUE
INQUERITOS EPIDEMIOLÓGICOS
PRÂMETROS PARA VALIDAÇÃO DE UM TESTE
DIAGNÓSTICO
Parâmetro intrínsecos
Selecionar populações doentes e não doentes
Sensibilidade Especificidade Eficiência

 Validade de um teste quantitativos ou
qualitativos
 Teste diagnosticar um evento (validade

simultânea ou concorrente) ou para predizê-lo
(validade preditiva).
 Para determinar a validade, compara-se os

resultados do teste com os de um padrão (padrão
ouro)
Parâmetros para validação de um teste
sorológico
(DOENÇA) Diagnóstico verdadeiro
TESTE
Presente ausente
Verdadeiros positivos Falsos positivos
POSITIVO
(VP) (FP)
falsos negativos Verdadeiros negativos
NEGATIVO
(FN) (VN)
TOTAL VP+FN FP+VN
 Sensibilidade: porcentagem de resultados positivos pelo
teste na população de doentes.
 Sensibilidade técnica: mede o limiar de detecção-

visualização direta ou indireta da reação antígeno e
anticorpo.
Sensibilidade = VP
VP+ FN
 Especificidade: capacidade que o teste
diagnóstico/triagem tem de detectar os verdadeiros
negativos, isto é, de diagnosticar corretamente os
indivíduos sadios.
Especificidade = VN
VN+ FP
 Eficiência: relação entre o somatório dos resultados
verdadeiro-positivos e verdadeiro-negativos com a
população estudada. Quanto mais próximo de 1, melhor
será o teste em estudo.
Eficiência = VP + VN
VP+ VN +FP + FN
PARÂMETROS QUE DEPENDEM DA PREVALÊNCIA DA
DOENÇA
 Valores preditivos positivos ou negativos dependem da

especificidade e da sensibilidade do teste.
Valor Preditivo Positivo: Se o teste é positivo,
qual a probabilidade da doença estar presente?
Valor Preditivo Negativo: Se o teste é negativo,

qual a probabilidade da doença estar ausente ?
 Dependem da prevalência da doença diagnosticada na população

em estudo.
 Prevalência: porcentagem de indivíduos doentes em uma população

t ado
esul ste Doente Sadio
R te
do
Possui a doença e o
Não possuem a doença mas
teste foi positivo o teste foi positivo
Positivo = VERDADEIROS
=FALSOS POSITIVOS
POSITIVOS
Possui a doença mas o Não possuem a doença e o

Negativo teste foi negativo
teste foi negativo = VERDADEIROS
= FALSOS NEGATIVOS NEGATIVOS
Sensibilidade = VP / VP + FN Especificidade= VN/VN + FP
AUTORIA: professor Eliseu Alves Waldman.Disciplina de Epidemiologia I -

2007 .Faculdade de Saúde Pública da USP
Parâmetros extrínsecos
Precisão Acurácia ou exatidão Reprodutibilidade

Existência de Determina a Habilidade do teste em
concordância dos capacidade do teste produzir resultados
resultados obtidos em fornecer resultados consistentes (quase os
quando um mesmo muito próximos ao mesmos resultados)
teste é feito várias verdadeiro valor do quando realizados
vezes. Mede o erro que se está medindo. independentemente e
acidental do método – sob as mesmas
erro experimental condições.
acumulado.
Mycobacterium tuberculosis por PCR -RT
CRITÉRIOS PARA A ESCOLHA DOS TESTES
SOROLÓGICOS
 Testes de Alta Sensibilidade:

 Testes de triagem
 Falso-negativo é mais grave
 Testes de Alta Especificidade

 Doenças graves sem tratamento eficaz
 Teste confirmatório
 Teste admissional
 Falso-positivo é mais grave

TESTES SOROLÓGICOS
 REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO:
Antígeno solúvel + anticorpo solúvel = complexos

insolúveis que são visíveis.
 Quantidades de antígeno e anticorpo são equivalentes (zona de

equivalência) formação máxima de precipitado, decrescendo à
medida em que um dos dois reagentes está em excesso: pró-
zona ou zona de excesso de anticorpo e pós-zona ou zona de
excesso de antígeno.
 Aplicação: diagnóstico de infecções causadas por fungos e

para a detecção de alguns auto-anticorpos.
Curva de formação de imunocomplexo em função da quantidade de antígeno adicionada.
(Fonte:http://www.uoguelph.ca/mbnet/323IMMUN/C2_AGAB.)
BUSCAR
BUSCAR
SOBRE
SOBRE SOBRE
SOBRE
O
O EFEITO
EFEITO PRÓ-
PRÓ-
ZONA
ZONA
TÉCNICAS ENVOLVENDO SEPARAÇÃO ELETROFORÉTICA
 IMUNOELETROFORESE: Combina a eletroforese em gel, seguida da
imunodifusão e precipitação das proteínas.
 Procedimento em duas etapas que primeiro envolve a separação
eletroforética das proteínas, seguida de imunodifusão de cada componente, a
partir do seu centro de difusão, contra o anti-soro específico, formando uma
linha ou arco de precipitação na região de equivalência.

 TESTE DE AGLUTINAÇÃO
DO LÁTEX: partículas de
látex são esferas de
poliestireno utilizadas como
suportes na adsorção de
proteína solúvel e antígenos
polissacarídicos,
funcionando como sistema
indicador da reação
antígeno-anticorpo.
 Aplicação: fator reumatóide

IgM, dirigido contra isótopos
de IgG, IgA1, IgM ou IgE.
ENSAIOS COM MARCADORES FLUORESCENTES
 Fluorocromo (ou fluoróforo) é uma substância que absorve

luz de comprimento de onda menor e emite luz de
comprimento de onda maior quando excitado, fenômeno
conhecido como fluorescência.
 Testes fluorescentes homogêneos de modulação direta

(São baseados na capacidade da molécula de fluoresceína
em emitir luz polarizada em um plano após excitação).
 Aplicação: detecção de moléculas pequenas e para
monitorização terapêutica ou dosagem de drogas de abuso,
sendo rápido e reprodutível
 Testes Fluorescentes Heterogêneos:
 Reação de Imunofluorescência Direta
 A reação Ag-Ac é detectada pela emissão de fluorescência.
 Pesquisa de antígeno
 Amostra + Ac específico conjugado a substância
fluorescente (conjugado)
 microscópio de fluorescência
 Reação de Imunofluorescência indireta
A - pesquisa de antígeno
Amostra (Ag?) + Ac específico → Ag-Ac
 Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina
microscópio de fluorescência
B- pesquisa de anticorpos

Ag (lâmina) + soro do paciente (Ac?) → Ag-Ac
Ag-Ac + conjugado anti-imunoglobulina
microscópio
determinação do título e classe do Ac
Leishmania sp
Tripanosoma cruzi
Giardia lamblia
Schistosoma mansoni
As reações imunológicas baseiam-se na interação molecular entre antígeno e anticorpo
nos testes de detecção de patologias em ensaios imunes usando substâncias não
marcadas, capazes de detectar e quantificar os efeitos dessa interação molecular
(reação antígeno-anticorpo).
E quais são esses efeitos que podem ser observados?

Precipitação,
Aglutinação,
Atividade hemolítica.
Por outro lado, os testes que utilizam substâncias marcadas são capazes de detectar e
quantificar diretamente a interação antígeno-anticorpo usando marcadores específicos,
na maioria das vezes fluorescentes.
• ELISA (Enzyme Lynked Immunosorbent Assay),

• Imunohistoquímica,
• Imunofluorescênica,
• Western blotting
• Citometria de fluxo.
TÉCNICAS IMUNOENZIMÁTICAS
 ELISA:
 o antígeno é preso a uma superfície (geralmente de poliestireno)
através de um anticorpo. Uma vez o antígeno ligado ao anticorpo
imobilizado, este complexo pode ser reconhecido por um outro
anticorpo, desta vez ligado a uma enzima que possa produzir um
composto facilmente detectável.
 Vantagem: detecção de quantidades muito reduzidas de

antígeno pois permitindo que a reação ocorra por um tempo
elevado consegue-se produzir uma quantidade considerável de
alguma molécula detectável (fluoróforo). Um exemplo é a
detecção do hormônio placental ganadotrofina coriônica, um
teste de gravidez bastante confiável
 Ensaio para
anticorpos –
 Método indireto
Método de captura para anticorpos

IgM
Diferentes tipos de ELISA
 Western Blotting
 Proteínas são separadas pelo
tamanho por eletroforese e, após
separação, transferidas para uma
membrana de nitrocelulose onde
ficam imobilizadas.
 Essa membrana é utilizada como
suporte sólido para um ensaio
imunoenzimático.
 Aplicação: pesquisa de antígenos

ou de anticorpos, diagnóstico de
doenças infecciosas e auto-imunes.
Teste teste confirmatório na
investigação de doenças infecciosas
e auto-imunes

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FISIOPATOLOGIA E FARMACOTERAPIA I

PROF. ME. ALESSANDRO VIEIRA FERREIRA

 Auxiliares no diagnóstico individualizado ou em

EXATIDÃO, PRECISÃO, REPRODUTIBILIDADE

 Técnicas sem uso de marcadores

 Técnicas com uso de marcadores

1.Elucidação de processos patológicos com sintomas e

2. Diferenciação da fase da doença:

IgM – Processos agudos

Avidez ou afinidade funcional dos anticorpos IgG –

4. Seleção de doadores de sangue:

6.Avaliação do prognóstico da doença

Ex:hepatite B – componentes estruturais do vírus induzem a

Sífilis – AC anticardiolipina detectados no teste do VDRL tem queda

8. Avaliação da imunidade específica naturalmente adquirida ou artificialmente

Ac IgG específicos para componentes antigênicos de um determinado micro-organismo podem ser

DEFINIÇÃO DA ETIOLGIA DA DOENÇA

SELEÇÃO DE DOADORES DE SANGUE

Selecionar populações doentes e não doentes

Sensibilidade Especificidade Eficiência

 Teste diagnosticar um evento (validade

 Para determinar a validade, compara-se os

 Sensibilidade técnica: mede o limiar de detecção-

 Valores preditivos positivos ou negativos dependem da

Valor Preditivo Negativo: Se o teste é negativo,

 Dependem da prevalência da doença diagnosticada na população

 Prevalência: porcentagem de indivíduos doentes em uma população

Possui a doença mas o Não possuem a doença e o

Sensibilidade = VP / VP + FN Especificidade= VN/VN + FP

AUTORIA: professor Eliseu Alves Waldman.Disciplina de Epidemiologia I -

Precisão Acurácia ou exatidão Reprodutibilidade

 Testes de Alta Sensibilidade:

 Testes de Alta Especificidade

 Falso-positivo é mais grave

Antígeno solúvel + anticorpo solúvel = complexos

 Quantidades de antígeno e anticorpo são equivalentes (zona de

 Aplicação: diagnóstico de infecções causadas por fungos e

 IMUNOELETROFORESE: Combina a eletroforese em gel, seguida da

imunodifusão e precipitação das proteínas.

 Procedimento em duas etapas que primeiro envolve a separação

eletroforética das proteínas, seguida de imunodifusão de cada componente, a

partir do seu centro de difusão, contra o anti-soro específico, formando uma

linha ou arco de precipitação na região de equivalência.

 Aplicação: fator reumatóide

 Fluorocromo (ou fluoróforo) é uma substância que absorve

 Testes fluorescentes homogêneos de modulação direta

B- pesquisa de anticorpos

E quais são esses efeitos que podem ser observados?

• ELISA (Enzyme Lynked Immunosorbent Assay),

 Vantagem: detecção de quantidades muito reduzidas de

Método de captura para anticorpos

 Aplicação: pesquisa de antígenos

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