Quitinase Protocolo

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FFCLRP-DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS –GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA COMPARADA
Comparação das propriedades bioquímicas das quitinases
produzidas por diferentes isolados de Metarhizium anisopliae
Cynthia Barbosa Rustiguel
Tese apresentada à Faculdade de Filosofia,

Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP,
como parte das exigências para a obtenção do
título de Doutor em Ciências, Área: Biologia
Comparada.
Ribeirão Preto – SP
2014
UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FFCLRP-DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS –GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA COMPARADA
Comparação das propriedades bioquímicas das quitinases
produzidas por diferentes isolados de Metarhizium anisopliae
Cynthia Barbosa Rustiguel

ORIENTADOR: Prof. Dr. Luis Henrique S. Guimarães
Tese apresentada à Faculdade de Filosofia,

Ciências e Letras de Ribeirão Preto da USP,
como parte das exigências para a obtenção
do título de Doutor em Ciências, Área:
Biologia Comparada.
Ribeirão Preto – SP
2014
FICHA CATALOGRÁFICA
Rustiguel, Cynthia Barbosa
Comparação das propriedades bioquímicas das quitinases produzidas

por diferentes isolados de Metarhizium anisopliae.
Ribeirão Preto, 2014

171 p.il.; 30cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e
Letras de Ribeirão Preto/ USP – Área de concentração: Biologia
Comparada.
Orientador: Guimarães, Luis Henrique Souza.
1- Quitinase. 2. Metarhizium anisopliae. 3. Fungo
Entomopatogênico. 4. Purificação de enzimas. 5. Virulência.
Dedico:
Aos meus Pais, Wanderley Rustiguel e Laúren Ap.
Barbosa Rustiguel (in memorian), por estarem sempre
comigo, pelo apoio, amor, carinho, amizade.
A minha avó Therezinha (in memorian) e meu Irmão
Wanderley Sammer pelo amor e carinho.
Ao Luís Fernando. A. de Sousa pelo amor e dedicação.

Agradecimentos:
À Deus e todas as energias positivas do universo por
estar sempre ao meu lado, guiando meus passos.
Ao orientador, Professor Luis Henrique, por acreditar
em mim, pelo apoio, e pelo conhecimento transmitido. Muito
obrigada!
Aos professores João Atílio Jorge, Maria de Lourdes T. M.
Polizeli, Héctor Francisco Terenzi e Arthur Henrique
Cavalcanti de Oliveira por todo o apoio e amizade. Muito
obrigada!
Ao Professor José Cesar Rosa e Helen, pelo auxilio e
conhecimento transmitido. Muito obrigada!
Ao pesquisador e amigo José Eduardo pelo incentivo e
por ajudar nos momentos necessários. Muito obrigada!
Ao orientador, Professor Enrique Quesada Moraga, por
me receber com muito carinho e atenção em seu laboratório,
por me auxiliar e transmitir seus conhecimentos. Muito
obrigada!
Também agradeço muito a todos colegas do laboratório
de entomologia - Espanha pelo carinho, paciência e bons
momentos. ¡Muchas gracias!

Aos amigos do Laboratório os quais foram, por todo o
tempo de desenvolvimento deste trabalho, companheiros,
professores e conselheiros. Em especial Josana e Zé.
Aos técnicos Maurício, Ricardo e Mariana pelo auxílio
técnico e amizade.
A Vera e Renata secretárias da Pós - graduação da Biologia
Comparada pela disponibilidade e atenção.
À Universidad de Córdova Espanha, local onde
desenvolvi parte deste.
À Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão
Preto, local onde foi desenvolvido este trabalho.
Aos professores da FFCL de Ituverava, pelos
ensinamentos e incentivos. Especialmente ao Professor
Hertz Figueiredo dos Santos por me incentivar desde a
graduação.
Ao Luís Fernando A. de Sousa, pela paciência, além de
estar sempre ao meu lado me apoiando.
As minhas amigas de infância, adolescência e todos os
amigos que fiz durante minha caminhada, agradeço pelo
apoio e incentivo.
Ao grupo de pesquisa que faço parte Vanessa, Larissa,
Thaís e Gabriela obrigada pelo apoio.
Aos amigos Doralva, Maria, Luís Miguel, Juliana Zechi,
Luís Andrés, Jonathan, Gloria, Fakhri, Alexis, Luz Marina,
José Maria e Nestor por me acolher e cuidar de mim.
¡Muchas gracias, los quiero mucho!
À Simone por transmitir paixão pela pesquisa e pelos
conselhos. Muito Obrigada!
À Marita por todas as palavras generosas e conselhos!
À Tatiane Beltramine Souto (Amiga!!!) por
compartilhar comigo estes 7 anos de caminhada pessoal,
ciêntifica e muitos momentos inesqueciveis. Muito obrigada
principalmente pel0 companheirismo.
À CAPES, CNPq e Ciências sem Fronteiras pelo apoio
financeiro.
À Todos aqueles que direta e indiretamente colaboram
com a realização deste trabalho e o tornaram realidade.
Muito Obrigada !!!!!!!

“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos é apenas uma gota
de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma
gota.”
Madre Teresa de Calcuta
Lição
“Ninguém faz nada sozinho, sempre existe uma pessoa ao seu
lado.”
Rustiguel, C.B.
Sumário
SUMÁRIO
ÍNDICE DE FIGURAS..................................................................................................xii
ÍNDICE DE TABELAS.................................................................................................xvi
ABREVITURAS............................................................................................................xix
RESUMO.........................................................................................................................xx
ABSTRACT..................................................................................................................xxii
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................1
1.1. FUNGOS ENTOMOPATOGÊNICOS.......................................................................1
1.1.1 Metarhizium anisopliae..........................................................................................3
1.2 QUITINA...................................................................................................................7
1.3 QUITINASES............................................................................................................9
1.3.1 FAMÍLIAS 18 E 19 DAS QUITINASES.............................................................11
1.3.2 QUITINASES EM MICRORGANISMOS..........................................................15
1.3.3 ÁREAS DE UTILIZAÇÃO DE QUITINASES...................................................18
2. OBJETIVOS...............................................................................................................20
2.1. OBJETIVO GERAL .................................................................................................20
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................20
3. MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................21
3.1 MICRORGANISMOS DE ESTUDO.........................................................................21
3.2 MANUTENÇÃO DOS ISOLADOS NO LABORATÓRIO E OBTENÇÃO DAS
CULTURAS.....................................................................................................................21
3.3 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS..............................................22
vi
Sumário
3.3.1 EXTRAÇÃO DE DNA TOTAL.............................................................................22
3.3.2 PCR E PURIFICAÇÃO DO DNA..........................................................................23
3.4 OBSERVAÇÃO MORFOLÓGICA DOS ISOLADOS DE Metarhizium anisopliae
POR MICROSCOPLIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
(MEV).........……..............................................................................................................24
3.5 OBETENÇÃO DAS CULTURAS EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA
(FSbm)..............................................................................................................................25
3.6 OBETENÇÃO DAS CULTURAS EM FERMENTAÇÃO SÓLIDA
(FSS).................................................................................................................................26
3.6.1 COMPOSIÇÃO DAS SOLUÇÕES........................................................................26
3.6.1.1 SOLUÇÃO DE SAIS DE KHANNA...................................................................26
3.6.1.2 ÁGUA DE TORNEIRA ...…………………………………………....…...........27
3.7 OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE QUITINASE EM FSS..................................27
3.8 OBTENÇÃO DOS EXTROS ENZIMÁTICOS.........................................................28
3.9 DOSAGEM DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA.........................................................29
3.9.1 QUITINASES..........................................................................................................29
3.9.2 PROTEASE.............................................................................................................30
3.9.3 LIPASE....................................................................................................................30
3.10 QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS....................................................................31
3.11 ELETROFORESE EM CONDIÇÕES DESNATURANTES SDS- PAGE
(10%)................................................................................................................................31
3.12 ANÁLISE DO SECRETOMA DOS DIFERENTES ISOLADOS DE Metarhizium
anisopliae EM FSbm POR ELETROFORESE
BIDIMENSIONAL...........................................................................................................32
3.13 SPECTROMETRIA DE MASSA E IDENTIFICAÇÃO DAS
vii
Sumário
PROTEÍNAS....................................................................................................................33
3.14 PURIFICAÇÃO PARCIAL DAS QUITINASES EXTRACELULAR
PRODUZIDAS PELOS ISOLADOS IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 E IBCB 425 EM
FSS....................................................................................................................................34
3.15 DETERNIMAÇÃO DA TEMPERATURA E DO pH ÓTIMOS DE
ATIVIDADE....................................................................................................................35
3.16 DETERNIMAÇÃO DA TERMOESTABILIDADES E ESTABILIDADES AO
pH.....................................................................................................................................35
3.17 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS NA ATIVIDADE
QUITINÁSICA.................................................................................................................35
3.18 DERTERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS (Km e Vmáx).................36
3.19 EXPERIMENTOS IN VIVO.....................................................................................36
3.19.1 OBTENÇÃO DAS CULTURAS PARA APLICAÇÃO IN VIVO........................36
3.19.2 PATOGENICIDADE DOS ISOLADOS IBCB 384 E IBCB 425 DE M.
anisopliae SOBRE LARVAS DE G. mellonella POR APLICAÇÃO
TÓPICA............................................................................................................................37
3.19.2.1 APLICAÇÃO TÓPICA UTILIZANDO IMERSÃO..........................................37
3.19.3 OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO, FRAÇÕES E ENSAIO DE

TOXIDADE......................................................................................................................38
3.19.4 COLETA DE HEMOLINFA, PRODUÇÃO DE SORO E INJEÇÃO EM
LARVAS..........................................................................................................................39
3.19.5 ANÁLISES ESTATÍSTICAS...............................................................................40
4. RESULTADOS...........................................................................................................41
RESULTADOS PARTE I: Morfologia e Identificação.................................................41
4.1 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS DE M.
viii
Sumário
anisopliae..........................................................................................................................42
4.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV) DOS
MICROCULTIVOS DOS ISOLADOS DE M.
anisopliae..........................................................................................................................45
RESULTADOS PARTE II: Produção enzimática em FSbm e FSS.............................49
4.3 PRODUÇÃO DE QUITINASES EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA
(FSbm)..............................................................................................................................50
4.3.1 PRODUÇÃO QUITINÁSICA EM FUNÇÃO DO TEMPO DE
CULTIVO.........................................................................................................................55
4.4 PRODUÇÃO DE QUITINASES EM FSS.................................................................58
4.4.1 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES SOLUÇÕES NA PRODUÇÃO DE
QUITINASES...................................................................................................................58
4.4.2 OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DAS QUITINASES EXTRACELULARES
PELOS ISOLADOS DE M. anisoplia EM FSS UTILIZANDO PLANEJAMENTO
FATORIAL.......................................................................................................................60
RESULTADOS PARTE III: ANÁLISE DO SECRETOMA, PURIFICAÇÃO E
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DAS QUITINASES...........................................69
4.5 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA EM CONDIÇÃO
DESNATURANTE..........................................................................................................70
4.5.1 ANÁLISE DO SECRETOMA DOS DIFERENTES ISOLADOS M. anisopliae
CRESCIDOS EM FSbm...................................................................................................73
4.5.1.1 IDENTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS DO SECRETOMA DOS ISOLADOS
IBCB 167 E IBCB 384 DE M. anisopliae CRESCIDOS EM
FSbm.................................................................................................................................78
4.6 PURIFICAÇÃO DA QUITINASE EXTRACELULAR PRODUZIDA EM
ix
Sumário
FSS....................................................................................................................................87
4.7 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA E IDENTIFICAÇÃO DAS
PROTEÍNAS DA FRAÇÃO SPI DO ISOLADO IBCB 384...........................................91
4.8 DETERMINAÇÃO DA TEMPERATURA E pH ÓTIMO APARENTE DE
ATIVIDADE PARA AS QUITINASES PRODUZIDAS PELOS DIFERENTES
ISOLADOS DE M. anisopliae........................................................................................94
4.9 DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE TÉRMICA E ESTABILIDADE AO
pH.....................................................................................................................................97
4.10 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS SOBRE A ATIVIDADE
QUITINÁSICA...............................................................................................................100
4.11 DETERMINAÇÃO DAS CONSTANTES CINÉTICAS Km E Vmáx PARA AS
QUITINASES DOS ISOLADOS IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 E IBCB 425 DE M.
anisopliae........................................................................................................................102
RESULTADOS PARTE IV: EXPERIMENTOS IN VIVO.........................................104
4.12 ENSAIO DE VIRULÊNCIA..................................................................................105
4.12.1 ENSAIO DE VIRULÊNCIA DOS ISOLADOS IBCB 384 E IBCB 425 DE M.
anisopliae SOBRE G. mellonella UTILIZANDO APLICAÇÃO
TÓPICA..........................................................................................................................105
4.12.2 ENSAIO DE VIRULÊNCIA DOS ISOLADOS IBCB 384, IBCB 425 SOBRE A
LARVA DE G. mellonella UTILIZANDO CONÍDIOS
INJETADOS...................................................................................................................106
4.12.3 ENSAIO DE TOXICIDADE DOS ISOLADOS IBCB 384 E IBCB 425
CULTIVADOS EM FSbm SOBRE G. mellonella UTILIZANDO
MICROINJEÇÃO...........................................................................................................108
4.12.4 EFEITO DA TOXICIDADE DO SORO OBTIDO DE LARVAS DE G.
x
Sumário
mellonella INFECTADAS PELOS ISOLADOS IBCB 384 E IBCB 425 UTILIZANDO
MICROINJEÇÃO...........................................................................................................110
5. DISCUSSÃO..............................................................................................................114
6. CONCLUSÃO............................................................................................................144
7. REFERÊNCIAS………………….............................................................................146
8. ANEXO.......................................................................................................................171
ARTIGO: Optimization of the Chitinase Production by Different Metarhizium
anisopliae Strains under Solid-State Fermentation with Silkworm Chrysalis as
Substrate Using CCRD.
xi
Índice de figuras
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Morfologia de M. anisopliae, Aspecto da colônia em meio de cultivo (A),
Conidióforo (B), Conídio (C).........................................................................................4
Figura 2. MEV do ciclo de infecção do fungo M. anisopliae sobre carrapato. conídio
aderido na cutícula, germinação do conídio, diferenciação do tubo germinativo em
apressório, penetração na cutícula, colonização do hospedeiro e extrusão do fungo
para a superfície do hospedeiro, com produção de
conídios..........................................................................................................................6
Figura 3. Hidrólise da quitina pela quitinase (A) e a estrutura da cadeia polimérica da
quitina (B).....................................................................................................................10
Figura 4. Esquema das fendas da família GH 18, onde onde o substrato se liga. (A)
As quitinases possuem múltiplos sítios de ligação a carboidratos, ao longo da
estrutura da fenda. A clivagem ocorre entre os carboidratos -1 e +1. Os açúcares
entram em contado com os aminoácidos D e E, eles são importantes para o
reconhecimento catalítico do motif DXXDXDE e clivagem pelas quitinases. (B)
Subgrupo A (classe V) e C apresenta um sítio catalítico em forma de túnel e profundo
e o subgrupo B um sítio catatítico aberto e amplo, para interação com os
açúcares........................................................................................................................14
Figura 5. Esquema da preparação do microcultivo.....................................................25
Figura 6. Alinhamento de múltiplas sequências dos isolados IBCB 167, IBCB 360,
IBCB 384, IBCB 425 de M. anisopliae e do LRC 189 M. anisopliae var. anisopliae,
utilizando CLUSTALW...............................................................................................44
Figura 7. Fotomicrografia eletrônica de varredura com as medidas de comprimento e
largura dos conídios, para os isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425
do fungo M. anisopliae em microcultivo.....................................................................46
xii
Índice de figuras
Figura 8. Fotomicrografia eletrônica de varredura das hifas dos isolados IBCB 167,
IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 do fungo M. anisopliae em microcultivo..............47
Figura 9. Análise estatística das medidas de comprimento, largura de conídios e
largura das hifas dos isolados de M. anisopliae...........................................................48
Figura 10. Produção de quitinase intracelular pelos isolados IBCB 167, IBCB 360,
IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae sob agitação em função do tempo de
cultivo...........................................................................................................................56
Figura 11. Produção de quitinase extracelular pelos isolados IBCB 167, IBCB 360,
IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae sob agitação em função do tempo de
cultivo...........................................................................................................................57
Figura 12. Gráfico de Pareto em resposta ao planejamento fatorial para FSS
delineado para as variáveis tempo de crescimento e umidade dos isolados IBCB 167,
IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 do fungo M. anisopliae.........................................66
Figura 13. Superfície de resposta para o planejamento fatorial considerando as
variáveis independentes tempo de crescimento e umidade para os isolados IBCB 167,
IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 do fungo M. anisopliae em FSS...........................67
Figura 14. Perfil eletroforético em condição desnaturante (SDS-PAGE 10%) para as
quitinases extracelulares produzidas em FSbm tendo glicose como fonte de carbono e
meio constituído de crisálida + extrato de levedura, corada por Coomassie Blue R-
250................................................................................................................................72
Figura 15. Perfil eletroforético bidimensional para as proteínas secretadas pelos
isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae cultivados em
FSbm contendo glicose como fonte de carbono. pI 3 – 10 e Marcadores de massa
molecular em kDa (M)................................................................................................75
xiii
Índice de figuras
Figura 16. Perfil eletroforético bidimensional para as proteínas secretadas pelos
isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae cultivados em
FSbm contento crisálida como fonte de carbono.........................................................76
Figura 17. Comparação entre as bandas proteicas secretadas do isolado IBCB 167
versus as bandas proteicas secretadas pelos isolados IBCB 360, IBCB 384 e IBCB
425 de M. anisopliae cultivado em FSbm contendo crisálida como fonte de
carbono.........................................................................................................................77
Figura 18. Perfil eletroforético bidimensional para as proteínas secretadas pelo
isolado IBCB 167 de M. anisopliae cultivado em FSbm contento crisálida como fonte
de carbono....................................................................................................................79
Figura 19. Perfil eletroforético bidimensional para as proteínas secretadas pelo
isolado IBCB 384 de M. anisopliae cultivado em FSbm contendo crisálida como fonte
de carbono....................................................................................................................80
Figura 20.Número de bandas proteicas identificadas no secretoma dos isolados IBCB
167 e IBCB 384 de M. anisopliae cultivado em FSbm contendo crisálida como fonte
de carbono....................................................................................................................81
Figura 21. Endo-N-acetyl-β-D-glucosaminidase de M. anisopliae identificada. MS
dos peptídeos tripíticos e MS/MS do peptídeo tripítico..............................................87
Figura 22. Perfil cromatográfico coluna de troca iônica DEAE-Celulose para as
quitinases extracelulares produzidas em FSS pelos isolados IBCB 167, IBCB 360,
IBCB 384 e IBCB 425 do fungo M. anisopliae...........................................................89
Figura 23. Perfil cromatográfico da coluna de exclusão molecular Sephadex G – 100
para as quitinases extracelulares produzidas em FSS pelo isolado IBCB 384 do fungo
M. anisopliae................................................................................................................90
xiv
Índice de figuras
Figura 24. Perfil eletroforético em condição desnaturante (SDS-PAGE 4-15%) para a
quitinase extracelular do isolado IBCB 384 em FSS tendo crisálida como fonte de
carbono, ápos Sephadex G-100....................................................................................92
Figura 25. Determinação da temperatura ótima aparente de atividade para as
quitinases extracelulares produzidas em FSS pelos isolados IBCB 167, IBCB 360,
IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae......................................................................96
Figura 26. Determinação do pH ótimo aparente de atividade em tampão ácido cítrico
para as quitinases extracelulares produzidas em FSS pelos isolados IBCB 167, IBCB
360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae............................................................97
Figura 27. Estabilidade térmica das quitinase extracelulares isolados IBCB 167,
IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae..................................................99
Figura 28. Estabilidade ao pH das quitinases extracelulares dos isolados IBCB 167,
IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 do fungo M. anisopliae.......................................100
Figura 29. Representação gráfica de Lineweaver–Burk para as quitinases
extracelulares dos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 do fungo M.
anisopliae...................................................................................................................104
Figura 30. Confirmação da mortalidade por crescimento micótico dos isolados IBCB
384 e IBCB 425 de M. anisopliae sobre larvas de G. mellonella após injeção de 800
conídios e incubação por 7 dias a 26°C......................................................................108
Figura 31. Efeito da toxicidade do soro obtido de larvas de G. mellonella
contaminada com os isolados IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae após injeção de
800 conídios por larva e incubado por 72h................................................................113
xv
Índice de Tabelas
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Insetos vulneráveis à infecção pelo fungo M. anisopliae................................5
Tabela 2. Áreas onde se utiliza os polímeros de quitina e quitosana...............................9
Tabela 3. Isolados procedente da Coleção de Microrganismos Entomopatogênicos
“Oldemar Cardim Abreu”...............................................................................................21
Tabela 4. Delineamento de Composto Central Rotacional (DCCR), para a otimização
da produção de quitinases em FSS..................................................................................28
Tabela 5. Identificação molecular dos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e
IBCB 425 de M. anisopliae............................................................................................42
Tabela 6. Produção das quitinases intracelular e extracelular pelos isolados IBCB 167,
IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 do fungo M. anisopliae em fermentação submersa
com diferentes meios de cultivo.....................................................................................52
Tabela 7. Produção de quitinases intracelulares e extracelulares pelos isolados IBCB
167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 do fungo M. anisopliae em fermentação
submersa em condição estacionária e sob agitação........................................................54
Tabela 8. Influência de diferentes soluções salinas, água de torneira e solução de
extrato de levedura na produção de quitinases por diferentes isolados do fungo M.
anisopliae em FSS..........................................................................................................59
Tabela 9. Atividade quitinásica extracelular total produzida pelos isolados IBCB 167,
IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae cultivados em FSS através do
DCCR..............................................................................................................................61
Tabela 10. Análise de variância (ANOVA) para a produção de quitinase isolado IBCB
167 de M. anisopliae cultivado em FSS.........................................................................61
Tabela 11. Análise de variância (ANOVA) para a produção de quitinase pelo isolado
IBCB 360 de M. anisopliae cultivado em FSS...............................................................62
xvi
Índice de Tabela
Tabela 14. Quantificação de enzimas extracelulares totais produzidas pelos isolados
IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae cultivados em
FSS..................................................................................................................................68
Tabela 15. Comparação das bandas proteicas secretadas pelos isolados IBCB 167,
IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae cultivados nos meios EG e
EC...................................................................................................................................77
Tabela 16. Identificação das bandas proteicas secretadas pelos isolados IBCB 167 e
IBCB 384 de M. anisopliae............................................................................................82
Tabela 17. Purificação das quitinases extracelulares produzidas pelos isolados IBCB
167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 do fungo M. anisopliae...................................90
Tabela 18. Identificação das proteínas secretadas pelo isolado IBCB 384 de M.
anisopliae, ápos Sephadex..............................................................................................92
Tabela 19. Influência de diferentes compostos na atividade quitinásica extracelular dos
isolados de M. anisopliae..............................................................................................101
Tabela 20. Parâmetros cinéticos das quitináses produzidas pelos isolados IBCB 167,
IBCB 360, IBCB 384 E IBCB 425 DE M. anisopliae..................................................102
Tabela 21. Ensaio de virulência das linhagens IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae
sobre G. mellonela........................................................................................................105
Tabela 22. Ensaio de virulência dos isolados IBCB 384, IBCB 425 de M. anisopliae
sobre larvas de G. mellonella utilizando conídios injetados.........................................106
xvii
Índice de Tabela
Tabela 23. Ensaio de toxicidade das linhagens IBCB 384, IBCB 425 de M. anisopliae
cultivadas em FSbm sobre larvas de G. mellonela utilizando microinjeção................109
Tabela 24. Ensaio de toxicidade do soro extraído de larvas de G. mellonela após
microinjeção de conídios dos isolados IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae........111
xviii
Abreviaturas e Símbolos
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
Atm.......................................................................Atmosfera
Da...........................................................................Dalton
DEAE.....................................................................Dietilaminoetil
DNS.........................................................................Ácido 3’, 5’dinitrosalicílico

EDTA.....................................................................Ácido etileno diamino tetra acético
FSbm......................................................................Fermentação submersa
FSS.........................................................................Fermantação em extrato sólido
HPLC...................................................Hight Performance Liquid Chromatography
kDa…......................................................................Kilo Dalton
Km...........................................................................Constante de Michaelis-Menten
min...........................................................................Minutos
mM...........................................................................Milimolar
N...............................................................................Normal
nm.............................................................................Nanômetros
PAGE...................................................................Eletroforese em gel de poliacrilamida
pI...............................................................................Ponto isoelétrico
p/v.............................................................................peso por volume
qsp.............................................................................Quantidade suficiente para
s.................................................................................Segundos
SDS...........................................................................Dodecil sulfato de sódio
U...............................................................................Unidade enzimática
L.............................................................................Microlitro
mols........................................................................Micromols
Vmáx .......................................................................Velocidade máxima
V/V...........................................................................Volume por volume
xix
Resumo
RESUMO
Os fungos entomopatogênicos, como Metarhizium anisopliae, têm despertado
grande interesse como agentes no controle de insetos-pragas. Estas espécies de fungos
são especializadas na secreção de um complexo enzimático constituído de proteases,
lipases e quitinases, entre outras, estando relacionadas com patogenicidade e
virulência. Neste contexto a foi analisada a secreção de quitinases pelos isolados
IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae var. anisopliae, como
identificado molecularmente. Contudo, alguns aspectos morfológicos analisados
mostram pequenas diferenças entre estes isolados. Para produção de quitinases, os
isolados foram cultivados em fermentação submersa na presença e ausência de
indutores e em fermentação em estado sólido, tendo crisálida como substrato. A maior
síntese de quitinase intracelular foi obtida para IBCB 425 no meio contendo extrato
de levedura mais glicose (EG). Visando a produção da enzima extracelular e
disponibilidade de fonte de carbono, o meio extrato de levedura mais crisálida (EC),
sob agitação foi padronizado para fermentação submersa (FSbm). Os maiores níveis
enzimáticos intracelulares para os isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB
425 foram obtidos entre 72 h e 216 h e para a forma extracelular entre 96h e 144h. A
produção quitinásica em fermentação sólida (FSS) utilizando crisálida como fonte de
carbono foi otimizada por delineamento composto central rotacional (DCCR, tendo
como variáveis o tempo de crescimento e umidade. O melhor produtor de quitinase
em FSS foi o isolado IBCB 360. A análise do secretoma mostrou um maior número
de proteínas quando os isolados foram cultivados na presença do indutor, com
destaque para o isolado IBCB 425. A maioria das proteínas secretadas pelos isolados
IBCB 167 e IBCB 384, foram identificadas, estando entre elas a endo-N-acetyl-β-D-
glucosaminidase, enzima do complexo quitinolítico. As quitinases produzidas pelos
quatro isolados foram parcialmente purificadas em DEAE – Celulose, obtendo-se dois
picos de atividade quitinásica. O processo de purificação foi continuado para o IBCB
384 em coluna de exclusão molecular, obtendo – se um único pico de atividade
quitinásica, analisado por electrospray. A temperatura ótima de atividade para as
quitinases produzida em FSS pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB
425 variou de 50ºC a 60ºC e pH ótimo de atividade ficou na faixa de 5,0 - 5,5. As
quitinases dos isolados mantiveram-se estáveis nas temperaturas de 30ºC e 40ºC e em
uma ampla faixa de pH. Os sais BaCl2 e MnCl2 ativaram as quitinases dos isolados
IBCB 167 e IBCB 425. Além disso, todas as quitinases foram tolerantes ao β-
xx
Resumo
mercaptoetanol. O comportamento cinético de todas as quitinases foi Michaeliano e a
maior afinidade pelo substrato foi para a quitinase do isolado IBCB 360. Já os
experimentos in vivo e in vitro mostraram que o isolado IBCB 425 foi melhor na fase
pré-infecção e isolado IBCB 384 foi melhor na fase pós – infecção, sendo o mais
virulento. Portanto, os isolados M. anisopliae têm se mostrado como bons produtores
de quitinases, com boa estabilidade a temperatura e pH além de outras características
distintas que provavelmente estão relacionadas com o potencial de patogenicidade e
virulência de cada isolado.
xxi
Abstract
ABSTRACT
Entomopathogenic fungi such as Metarhizium anisopliae, have been attracting
great interest as agents to control insect pests. These species of fungi are specialized
in the secretion of an enzymatic complex consisting of proteases, lipases and
chitinases, among others which are related to pathogenicity and virulence. In this
context the secretion of chitinase by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425
isolated from M. anisopliae var. anisopliae molecularly identified, were analyzed.
However, some structural features analyzed showed small differences among these
isolates. For chitinase production, the isolates were grown in submerged culture in the
presence and absence of inducers and under solid state fermentation with chrysalis as
substrate. The enhanced synthesis of intracellular chitinase was obtained with IBCB
425 using yeast extract plus glucose (EG). Aiming to produce the extracellular
enzyme and the carbon source available, the medium yeast extract and chrysalis (EC),
was standardized to SbmF. The high intracellular enzymes levels produced by IBCB
167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates were obtained between 72 h and
216 h and for the extracellular form between 96h and 144h. The chitinase production
in SSF using chrysalis as carbon source was optimized by CCRD, having the time of
growth and moisture as variables. The best producer of chitinase in SSF was the
isolated IBCB 360. The analysis of the secretome showed a great number of proteins
when the isolates were grown in the presence of the inducer, especially for the
isolated IBCB 425. Most of the proteins secreted by IBCB 167 and IBCB 384 isolates
were identified. Among these proteins the endo-N-acetyl-β-D-glucosaminidase was
identified, enzyme that participates in the chitinulitic complex. Chitinases produced
by the isolates were partially purified on DEAE - cellulose, yielding two peaks of
chitinase activity. The purification process was continued for IBCB 384 isolated using
molecular exclusion chromatographic column, yielding only one peak of chitinase
activity, analyzed by electrospray. The optimal temperature for the chitinase activity
from IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates obtained in SSF, ranged
from 50 ºC to 60 ºC and the optimum pH of activity was 5.0 to 5.5. All chitinases
were stable at 30 ºC and 40 ºC, and wide pH range. The BaCl2 and MnCl2 salts
activated the chitinases of IBCB 167 and IBCB 425 isolates. In addition, all chitinases
were β – mercaptoethanol tolerant. The kinetic behavior of all chitinases was
Michaelian with the highest affinity to the substrate observed for the chitinase of
xxii
Abstract
isolated IBCB 360. The in vivo and in vitro experiments showed that isolated IBCB
425 was better in pre -infection phase and the isolated IBCB 384 was better in the
post – infection phase. Therefore, the M. anisopliae isolates were good producers of
chitinases with interesting temperature and pH stability, and other different
characteristics that are probably related to the potential pathogenicity and virulence of
each isolate.
xxiii
Introdução
1. INTRODUÇÃO
1.1 Fungos Entomopatogênicos
Os fungos são organismos com tamanho e formas variadas podendo ser
unicelulares, como as leveduras, ou multicelulares constituídos por um conjunto de
filamentos (micélio). Entre tais organismos, existe uma grande diversidade de fungos
entomopatogênicos, os quais são patógenos com capacidade de provocar doenças nos
insetos. Gaumann (1950) define doença, como um processo dinâmico entre patógeno
e hospedeiro, intimamente relacionados entre si e com o meio. Ambos são
influenciados, resultando em alterações morfológicas e fisiológicas. Esta capacidade
de causar doença é definida como patogenicidade e tem relação direta com as
características genéticas e fenotípicas do fungo. Desta forma o fungo pode ser
patogênico ou não a um inseto. A doença que estes fungos provocam, pode apresentar
níveis diferentes. Estes níveis ou graus são definidos como virulência, uma
característica biológica mutável que reflete a intensidade da moléstia causada pelo
patógeno (ALVES, 1998). Baseado nestas capacidades, os fungos entomopatogênicos,
tendo sido os primeiros patógenos a serem utilizados no controle microbiano de
pragas, e em diferentes estudos por mais de 100 anos. Vem crescendo o interesse
nestes microrganismos principalmente porque os insetos-pragas têm se tornado cada
vez mais resistentes aos pesticidas químicos (WRAIGHT & BRADLEY,1996 ;
SHAH & PELL, 2003).
Os fungos entomopatogênicos são patógenos de largo espectro capazes de
parasitar insetos que habitam diversos nichos ecológicos em diferentes estágios do
desenvolvimento. Grande parte é especializada na penetração via tegumento, sendo
esta característica uma vantagem contra outros patógenos que infectam o inseto por
via oral ou mesentério (ALVES, 1998). Os principais propágulos produzidos pelos
1
Introdução
fungos são os esporos, os quais podem ser de diferentes tipos. A interação entre o
patógeno (fungo) e seu respectivo hospedeiro é influenciada por diferentes fatores tais
como a temperatura, a umidade, a luz e a radiação ultravioleta, bem como pelas
condições nutricionais e suscetibilidade do hospedeiro. Desta forma, o ciclo completo
de infecção dos fungos entomopatogênicos apresenta as seguintes fases: adesão,
germinação, formação do apressório, formação de grampo de penetração, penetração,
colonização e reprodução do patógeno no inseto (ALVES, 1998; SCHRANK &
VAINSTEIN, 2010).
As enzimas desempenham papel importante durante o processo de penetração
do fungo no hospedeiro, especialmente nas fases de adesão e germinação, onde ocorre
a formação do tubo germinativo e a liberação das enzimas que degradam a cutícula do
inseto, tais como proteases e quitinases, entre outras (St LEGER et al., 1988b). Vários
trabalhos relacionam a produção de enzimas com patogenicidade e virulência, como o
trabalho de Paris & Segretain (1978). A incapacidade de Beauveria brongniartii em
produzir quitinase, por exemplo, o tornou não patogênico para Melolontha melolontha
(PARIS & FERRON, 1979). Segundo Giménez-Pecci et al. (2002), diferentes
isolados de uma mesma espécie produzem níveis diferentes de enzimas extracelulares.
Os entomopatógenos possuem ampla variabilidade genética, o que lhes confere
diferenças importantes quanto à virulência e patogenicidade à grupos específicos de
insetos. Assim sendo, para a diferenciação dos isolados, alguns parâmetros devem ser
analisados, tais como crescimento vegetativo, meio de cultura, sensibilidade a
produtos químicos e tolerância a luz ultravioleta, bem como a produção de enzimas
específicas relacionadas ao processo de infecção (PACCOLA-MEIRELES &
AZEVEDO, 1990; SÓSA-GOMEZ, 1994). Existem cerca de 750 espécies
2
Introdução
entomopatogênicas descritas distribuídas em 85 gêneros (PUTZKE & PUTZE, 2003),
sendo que entre estas Metarhizium anisopliae tem sido alvo de diferentes estudos.
1.1.1 Metarhizium anisopliae
O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é um deuteromiceto da
família Monoliaceae amplamente distribuído na natureza, podendo ser encontrado
facilmente no solo. Possui micélio hialino, septado e conidióforos característicos com
conídios ovais, apresentando uma coloração que vai do verde ao verde oliva (Figura
1). Este fungo necessita de poucos nutrientes para se desenvolver e pode utilizar como
fonte de carbono amido, glicose, glicerol, maltose, sacarose e quitina (ALVES, 1998).
M. anisopliae pode se desenvolver naturalmente entre as temperaturas de 15 ºC a 32
ºC. Porém, a temperatura ótima de crescimento pode estar ente 24 ºC e 30 ºC. Já o pH
ótimo de crescimento é de 6 a 9 (DRIVER et al., 2000 ; ARRUDA et al., 2005). É
interessante ressaltar que o gênero Metarhizium possui várias espécies e variedades.
No trabalho de Bischoff et al., (2009), eles reorganizaram e esclareceram a taxonomia
das espécies deste gênero. Sendo elas M. anisopliae, M. guizhouense, M. pingshaense,
M. acridum, M. lepidiotae e M. majus. Também descreveram as novas espécies M.
globosum e M. robertsii.
O primeiro trabalho utilizando este fungo entomopatogênico, foi realizado pelo
zoologista e patologista russo Ilya Metchnikoff em 1878, onde aplicou M. anisopliae
para controlar as larvas do besouro Anisoplia austriaca (ALVES, 1998). M.
anisopliae tem sido estudado devido a sua capacidade de atacar um grande número de
insetos (Tabela 1), de modo especial Diatrea saccharalis (Lepdoptera: Crambridae),
conhecida como cigarrinha da cana-de-açúcar, sendo que cerca de 10% das lagartas
são encontradas infectadas com este fungo naturalmente (ALVES, 1998;
3
Introdução
COUTINHO, 2009). O ciclo completo de infecção do fungo M. anisopliae sobre o
carrapato pode ser observado na Figura 2.
B
C
Figura 1. Morfologia de M. anisopliae (A) Aspecto da colônia em meio de cultivo,
(B) Conidióforo, (C) Conídio. Figura modificada (ARRUDA et al., 2005).
4
Introdução
Tabela 1. Insetos vulneráveis à infecção pelo fungo M. anisopliae.
Espécie hospedeira Ordem: Família Descrição Referências

Anopheles gambiae Diptera: Culicidae Vetor da malária Scholte et al., 2004
Culex quinquefasciatas Diptera: Culicidae Transmissor da filariose

Lacey et al., 1988
Musca domestica Diptera:Muscidae Mosca Barson et al., 1994
Glossina spp. Diptera:Glossinidae Mosca tse-tsé

Kaaya & Munyinyi, 1995
Ceratitis capitata Diptera:Tephritidae Mosca da fruta Mochi et al., 2006
Zaprionus indianas Diptera:Drosophilidae Mosca-do-figo

Svedese et al., 2005
Anastrepha ludens Diptera:Tephritidae Mosca das frutas mexicana

Lezana-Gutiérrez et al., 2000
Dysdercas peravianus Hemiptera:Pyrrhocoridae Percevejo manchador do algodão

Lubëck et al., 2008
Mahanarva fimbriolata Hemiptera:Cercopidae Cigarrinha da raiz da cana-de-açúcar

Almeida et al., 2003
Mahanarva posticata Hemiptera:Cercopidae Cigarrinha da folha da cana-de-açúcar

Filho et al., 2003
Bemisia tabaci Hemiptera:Aleyrodidae Mosca branca do tabaco

Batta, 2003
Triatoma infestans Hemiptera:Reduviidae Transmissor da doença de Chagas

Luz et al., 1998
Vatiga illudens Hemiptera:Tingidae Percevejo -da-renda

Oliveira et al., 2001
Deois flavopieta Homoptera:Cercopidae Cigarrinha das pastagens

Teixeira et al., 2007
Tetranychus evansi Acarina:Tetranychidea Ácaro vermelho

Wekesa et al., 2005
Hypothenemus hampei Coleoptera:Scolytidae Broca do café Bustillo et al., 1999
Chalcodermus
Coleoptera:Curculionidae "Manhoso"
bimaculatus
Quintela et al., 1992
Capnodis tenebrionis Coleoptera:Buprestidae "Flatheaded peachborer"

Marannino et al., 2006
Diploschema rotundicolle Coleoptera:Cerambycidae Broca dos citros

Machado & Filho, 2006
Blatella germanica Dyctioptera:Blattellidae Barata

Quesada-Moraga, 2004
Schistocerca gregaria Orthoptera:Acrididae Gafanhoto do deserto

Mowierski et al., 1996
Manduca sexta
Lepidoptera:Sphingidae Lagarta da folha do tabaco
St. Leger et al., 1996
Tabela modificada: Junges, (2010).

5
Introdução
Enzimas:
Lipase
Protease
Quitinase
Figura 2. MEV do ciclo de infecção do fungo M. anisopliae sobre carrapato. (a)
conídio aderido na cutícula, (B) germinação do conídio, (C) diferenciação do tubo
germinativo em apressório, (D) penetração na cutícula, (E) colonização do hospedeiro
e (F) extrusão do fungo para a superfície do hospedeiro, com produção de conídios.
CO - conídio, GT – tubo germinativo, AP – apressório, H – hifa. Escalas utilizadas 2
µm a 1 mm. Figura modificada (SCHRANK & VAINSTEIN, 2010).
6
Introdução
Loureiro et al. (2005) e Zappelini (2009) selecioaram diferentes isolados dos
fungos entomopatogênicos para controle de pragas. Entretando Zappelini (2009)
investigou os fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana e M. anisopliae, sendo
que deste último, foram testados 27 isolados quanto à infecção e a mortalidade de D.
saccharalis. Analisando os resultados obtidos no trabalho de Zappelini (2009) e
outras informações descritas na literatura sobre a relação entre enzimas e virulência de
fungos (BOLDO et al., 2009), optamos por investigar os isolados IBCB 167, IBCB
360, IBCB 384 e IBCB 425 da espécie M. anisopliae, cujas porcentagens de
mortalidade confirmada para a praga D. saccharalis foram de 55%, 68%, 96% e 82%,
respectivamente.
Este fungo apresenta um bom desenvolvimento em meio sólido tendo arroz pré-
cozido como substrato, chegando a uma produção de 1012 conídios/Kg de arroz
(ALMEIDA & BATISTA FILHO, 2001; ALVES & LOPES, 2008). Segundo o
trabalho de Boldo et al. (2009), M. anisopliae produz diferentes quitinases, enzimas
relacionadas ao processo infecção do fungo sobre o hospedeiro, justificando assim a
realização deste trabalho.
1.2 QUITINA
Quitina vem da palavra grega χιτώνας que significa túnica. Este polissacarídeo
foi descrito pela primeira vez, como substâncias presente em cogumelos pelo
pesquisador Henri Braconnot em 1811 (HARTL et al., 2012). Este polissacarídeo é
facilmente encontrado na natureza, ocupando o segundo lugar, perdendo apenas para
a celulose (FRANCO, 2005). Este polissacarídeo está presente em algas, fungos e
exoesqueleto de artrópodes. A quitina é um polímero de cadeia linear, constituídos
por moléculas simples de β-(1-4) 2-acetamido-2-deoxi-D-glicose (N-
7
Introdução
acetilglicosamina), sendo insolúvel em água e solventes orgânicos (Figura 3). A
quitina desempenha diversas funções biológicas, sendo um polímero atóxico,
biodegradável, biocompatível e obtido de fontes naturais (DIAS et al., 2013). Ela
apresenta polimorfismo e está dividida em α, β e γ (Figura 3). A quitina α é a mais
rígida porque a cadeia polimérica está disposta em sentido paralelo e antiparalelo e
possivelmente encontrada em artrópodes. Na quitina β a cadeia polimérica é paralela,
possibilitando maior flexibilidade aos organismos que a possui, como as lulas. Já na
quitina γ a cadeia polimérica apresenta uma mistura das posições, porém não em
proporções iguais (MATSUI, 2007). A partir da quitina hidrolisada obtem-se a
quitosana, que é produto de valor econômico e características biológicas interessantes
como atividade antimicrobiana, antioxidante, anti-colesterolémica e analgésica
(MARICATO, 2010). Sendo assim, a quitina e os seus produtos apresentam
características únicas e de extremo valor para a humanidade. Estes polímeros podem
ser aplicados no tratamento de efluentes industriais ou em outras áreas como descrito
na tabela 2. O processo para extrair a quitina, divide-se em três etapas:
desproteinização, desmineralização e despigmentação (ANTONINO, 2007). Já a
obtenção da quitosana pelo processo natural necessita da desacetilação da quitina
(OLIVEIRA, 2006). Em todos os processos citados anteriormente são utilizados ácido
fortes, bases fortes e solventes orgânicos, gerando resíduos industriais que podem
causar problemas ambientais. A melhor opção para reduzir os problemas ambientais,
do processo de extração de quitina, é o aumento de pesquisas voltadas para enzimas
que hidrolisam o polímero de quitina. De forma geral a substituição de produtos
químicos por enzimas, reduz os resíduos industriais nocivos ao meio ambiente.
8
Introdução
Tabela 2. Áreas onde se utiliza os polímeros de quitina e quitosana.
Área Utilização
Aditivos alimentares
Indústria de Alimentos Nutrição Animal
Embalagens
Agente Cicatrizante
Farmacêutica Aditivo
Liberação controlada de drogas
Controle de Colesterol
Lente de contato
Biomédica Biomembranas artificiais

Sutura cirúrgica
Umectante
Cosmética Fungicida
Bactericida
Indústria Têxtil Tratamento de Superfície
Imobilização de enzimas células

Biotecnologia Separação de proteínas
Cromatografia
Antibacteriana
1.3 QUITINASES (EC 3.2.1.14)
Quitinases são enzimas amplamente encontradas na natureza, existindo uma
grande diversidade de organismos que as produzem, tanto procariotos como
eucariotos, estando entre estes últimos os fungos. A quitinase catalisa a hidrólise de
ligações de β-1,4(GlcNac) da quitina (Figura 3 A) (FLEURI & SATO, 2005).
9
Introdução
A
Figura 3. Hidrólise da quitina pela quitinase (A) e a estrutura da cadeia polimérica da
quitina (B) Figura modificada (FLEURI & SATO, 2005; SPIN - NETO, 2008 e
ANTONINO, 2007).
10
Introdução
A hidrólise completa da quitina ocorre através de um sistema quitinolíco o
qual atua de maneira sinérgica e consecutiva (PATIL et al., 2000). As quitinases são
divididas em duas classes principais, as endoquitinases e as exoquitinases. As
endoquitinases clivam a quitina em sítios aleatórios no interior do polímero, liberando
quito-oligossacarídeos (quitotetraose, quitotriose). As exoquitinases clivam a quitina a
partir da sua extremidade não redutora, liberando dímeros de (GlcNAc)2 (DUO-
CHUAN, 2006; VAN AALTEN et al., 2001). Também foram descritas as endo-
exoquitinases, que apresentam as duas atividades (DA SILVA et al., 2006). As duas
classes de quitinases são distintas das N-acetilglicosaminidases, que atuam sobre os
produtos da ação das quitinases, convertendo - os em N-acetilglicosaminas.
Entretanto, as N-acetilglicosaminidases também são capazes de liberar resíduos de N-
acetilglicosamina a partir da extremidade não redutora da quitina (DUO-CHUAN,
2006). As N-acetilglicosaminidases estão incluídas na família 20 das glicosil
hidrolases (GH) com base na conservação da sequência de aminoácidos, na presença
de vários motivos conservados e na estrutura das proteínas (HENRISSAT, 1991).
1.3.1 FAMÍLIAS 18 E 19 DAS QUITINASES
Dentro da família das glicosil-hidrolases (GH) as quitinases estão divididas em
duas famílias, as famílias GH 18 e GH 19. Sendo assim, as famílias GH 18 e GH 19
não compartilham similaridade de sequências e apresentam algumas características
peculiares (BATTACHARYA et al., 2007; KASPRZEWSKA, 2003).
Na família GH 19 encontramos as quitinases produzidas por plantas
(PERRAKIS et al., 1994). Esta família apresenta um domínio catalítico em forma de
estrutura bilobada e predominância de α-hélices. Seu mecanismo enzimático é de
inversão e seus produtos são α –anômeros (SEIDL et al., 2005).
11
Introdução
Em plantas, estas quitinases parecem estar envolvidas na defesa contra
patógenos e contra estresses abióticos. Evidências que comprovam o papel das
quitinases em plantas se confirmam pelo fato de que elas são induzidas durante a
infecção por patógenos e sob o efeito de várias formas de estresses do meio ambiente.
Como conseqüência de sua ação, uma série de eventos degenerativos ocorre na célula
do patógeno, incluindo desorganização das células do fungo fitopatogênico e da sua
cutícula, levando ao desequilíbrio osmótico, a agregação e o recolhimento do
citoplasma e da membrana plasmática (CASTORIA et al., 2001).
Tais quitinases estão incluídas em um complexo conhecido como proteínas
relacionadas à patogenicidade (PR-patogenesis-related), sendo observadas em plantas,
quando estas são atacadas por microrganismos patogênicos (HEIL & BOSTOCK et
al., 2002). Atualmente cinco classes de quitinases vegetais são reconhecidas com base
nas similaridades entre as sequências de aminoácidos (EL-KATANY et al., 2001 e
OHNO et al., 1996):
- Classe I: contém um domínio rico em cisteína na região N-terminal, o qual está
envolvido na ligação com quitina, e um peptídeo C-terminal altamente conservado.
Este tipo de quitinase é conhecida por existir em grande quantidade nas
monocotiledôneas e dicotiledôneas.
- Classe II: têm alta similariedade de sequências com as da classe I e são secretadas no
apoplasto.
- Classe III: não mostra identidade de sequência com outras classes, mas parece estar
mais próxima de enzimas de fungos envolvidas na morfogênese. Tipicamente, elas
são proteínas extracelulares e têm atividade de lisoenzimas.
- Classe IV: têm significativa similaridade com as da classe I, pois contêm um
domínio rico em cisteína e mostram o principal domínio catalítico da classe I, embora
12
Introdução
com duas deleções características. Quitinases desta classe são extracelulares e têm
sido identificadas principalmente em dicotiledôneas.
- Classe V: compreende um grupo de exoquitinases não relacionadas às outras
quitinases de plantas. Estas possuem uma estrutura de sequência primária que parece
ser derivada daquela observada em bactérias.
As quitinases das classes I, II e IV têm sequências homólogas e constituem a
família GH 19, enquanto que as representantes das classes III e V não são homólogas
com as anteriores e pertencem à família GH 18 (SUBROTO et al., 1999).
Todas as quitinases de fungos relatadas até o momento pertencem à família
GH 18, porém encontramos uma ampla gama de indivíduos que as produzem,
incluindo bactérias, plantas, insetos, mamíferos e vírus (PERRAKIS et al., 1994).
Esta família possui um domínio catalítico em forma de barril (α/β)8, e seu mecanismo
enzimático é de retenção, o qual resulta em quito-oligossacarídeos com configuração
β- anomérica (ARAKANE & MUTHUKRISHNAN, 2010). Todas as quitinases da
família GH 18 são sensíveis a alosamidina e estão divididas nos subgrupos A, B e C.
Estes subgrupos diferem na arquitetura, no formato da fenda do sítio catalítico, na
atividade enzimática endo e extra, na presença de diferentes carboidratos ligados
(SEIDL et al., 2005 e 2008; GRUBER & SEIDL – SEIBOTH, 2011). As quitinases
do subgrupo A e C pertencem a classe V (fungos e bacterias), o subgrupo B pertence
à classe III (fungos e plantas). As quitinases da classe III possuem um sítio ativo
aberto e raso, apresentado pelas endoquitinases (TERWISSCHA VAN
SCHELTINGA et al.,1996). Diferentemente as quitinases da classe V, possuem um
sítio catalítico em forma de túnel e profundo, são característicos de exoquitinases
como os encontrados nas quitinases bacterianas ChiA e ChiB de Serratia marcescens
e a quitinase CiX1 do fungo Coccidioides immitis (BORTONE et al., 2002).
13
Introdução
Geralmente o sítio catalítico das quitinases da família GH 18 é longo e adapta – se no
mínimo 5 unidades de açúcar. A clivagem dos substratos sempre ocorre entre o açúcar
-1 e +1, como pode ser observado na Figura 4.
* Estabilizador
# Geramente ácido / básico
B
Subgrupo A/C Subgrupo B
Figura 4. Esquema das fendas da família GH 18, onde onde o substrato se liga. (A)
As quitinases possuem múltiplos sítios de ligação a carboidratos, ao longo da
estrutura da fenda. A clivagem ocorre entre os carboidratos -1 e +1. Os açúcares
entram em contado com os aminoácidos D e E, eles são importantes para o
reconhecimento catalítico do motivo DXXDXDE e clivagem pelas quitinases. (B)
Subgrupos A (classe V) e C apresentam um sítio catalítico em forma de túnel
profundo e o subgrupo B, um sítio catatítico aberto e amplo, para interação com os
açúcares. Figura modificada de Hartl et al., 2012.
14
Introdução
Dentro dos domínios já identificados, as quitinases da família 18 apresentam
domínios característicos como aquele com uma região rica em resíduos de serina /
treonina; domínio de união à quitina (ChBD); domínio de união à celulose (CBD),
domínios LysM e região N-terminal contendo peptídeo sinal. Sendo assim o subgrupo
A possui o domínio S-globulina e o B domínio de união à celulose (CBD). Ambos
abrangem quitinases de fungos. Já a subgrupo C contém as quitinases de alta massa
molecular, domínios LysM e domínio EGF1 – like (SEIDL et al ., 2005).
As quitinases da família GH 18 são capazes de realizar reações de
transglicosilação. Esta capacidade foi observada para as quitinases Chit42, Chit33 e
de Trichoderma harzianum e ChitB1 A. fumigatus (ANDRES et al.,2012; BOER et
al., 2004 e LU et al., 2009). Mutações nos resíduos de aminoácidos da ChitB1
envolvidos na ligação do substrato, alteraram a atividade hidrolítica desta enzima
para reação de transglicosilação. Já a reação de transglicosilação de Chit42 e Chit33
foi observada com modificações sintéticas dos quito-ologosacarideos (COSs). Estes
quito-oligosacaridios são importantes e utilizados em inúmeros setores (AAM et al.,
2010).
1.3.2 QUITINASE EM MICRORGANISMOS
Em fungos, as quitinases estão envolvidas em várias funções como: i) na
morfogênese da parede celular, ii) nos processos nutricionais, iii) na degradação da
quitina exógena, iv) remodelamento da parede celular durante o ciclo de vida do
fungo e v) na competição e defesa contra outros fungos e artrópodes (SEIDL, 2008;
BOLDO et al., 2009). A quitinase é produzida por diversos microrganismos como T.
harzianum CECT 2413 (REY et al., 2001), Glomus mosseae e Glomus intraradices
(POZO et al., 2002), Tilletiopsis pallescens (URQUHART et al., 2002),
15
Introdução
Cellulomonas flavigena (CHEN et al.,1997), Paecilomyces lilacinus (KHAN et al.,
2003) e B. bassiana (SASSÁ et al., 2008), entre outros. Muitos microrganismos
necessitam da presença de indutores específicos para síntese de enzimas de interesse,
os quais podem ser adicionados ao meio de cultivo em estudos conduzidos em
laboratório, como foi feito para a obtenção de quitinase em fermentação sólida com T.
harzanium TUBF 781. O extrato enzimático extracelular obtido do fungo T.
harzanium TUBF 781 mostrou atividade antifúngica contra uma série de linhagens,
tais como Aspergillus sp., Rhizopus sp., Mucor sp. e principalmente Aspergillus niger
(NAMPOOTHIRI et al., 2004). Foi observado que a quitinase produzida por T.
harzanium, apresentou pH e temperatura ótimos de atividade igual a 3,5 e 50°C,
respectivamente, e pI de 7,4. Neste caso, a massa molecular obtida foi de 27,5 kDa
(DEANE et al., 1998). Segundo Chang et al. (2010), a quitinase produzida por
Bacillus subtilis também apresentou atividade antifúngica contra Fusarium
oxysporum.
Quando analisada a produção de endoquitinases por Bacillus
stearothermophilus CH-4 em meio de cultivo contendo quitina como única fonte de
carbono, três formas enzimáticas diferentes foram encontradas, ou seja, quitinase A
(endo-ação), quitinase B (exo-ação) e N-acetilglicosaminidase (KENJI et al., 1998).
Entretanto, vários fungos como Trichoderma sp. e M. anisopliae secretam diferentes
enzimas, entre elas as quitinases que são essenciais para a ação micoparasitária (EL-
KATANY et al., 2001).
Muitas pesquisas têm focado na produção de quitinases pelos agentes de
biocontrole, os quais supostamente agem como depolimerases da parede celular de
fungos fitopatogênicos e na cutícula dos insetos-pragas (CASTORIA et al., 2001). O
fungo B. bassiana também é utilizado como um biocontrolador que produz isoformas
16
Introdução
de quitinases que foram ativas nos pH 5,5, 6,0 e 8,5 (SASSÁ et al., 2008). No
trabalho desenvolvido por Adrangi et al. (2010) também foram identificadas e
caracterizadas duas isoformas de endoquitinases extracelulares produzidas por
Massilia timonae, sendo elas Chi 56 e Chi 64. Ambas apresentaram pH ótimo de
atividade de 5,0, pI de 8,5, ativação por Mn2+ e inibição por Hg2+. Comparando–se
ambas as formas, Chi 56 possui massa molecular de 56 kDa e a sequência N-terminal
Q-T-P-T-Y-T-A-T-L. Já para Chi 64 a massa molecular foi de 64 kDa e a sequência
N-terminal Q-A-D-F-P-A-P-A-E (ADRANGI et al., 2010).
A quitinase purificada (30 kDa) de M. anisopliae teve seu ótimo de atuação
no pH 4,5 e 5,0, e na temperatura entre 40°C e 45°C (PINTO et al., 1997). Nos
trabalhos de St. Leger et al. (1991), Pinto et al. (1997) e Kang et al. (1999) foram
relatadas quitinases diferentes de M. anisopliae, com massas moleculares variando
de 30 kDa a 110 kDa.
Vários experimentos com a expressão ou superexpressão de genes de
quitinases de fungos vêm sendo desenvolvidos, existindo duas abordagens distintas: i)
Sistema biológico in vivo; ii) Alta produção da enzima para testes in vitro. Como
exemplo em sistemas biológicos, o gene de quitinase do fungo Trichoderma ssp. foi
introduzido em plantas (limão, algodão, maçã e cenoura) conferindo uma maior
resistência frente a fungos fitopatogênicos. Estas plantas também apresentaram
resistência a outros tipos de estresses biótico (bactérias) e abióticos (salinidade e
metais pesados), segundo os trabalhos De Las Mercedes et al. (2006) e Kumar et al.
(2009). A expressão de genes da quitinase tem sido estudada em fungos
entomopatógenos, como B. bassiana (FANG et al., 2004), Nomuraea rileyi
(WATTANALAI et al., 2004) e Paecilomyces javanicus (CHEN et al., 2007). O gene
Bbchit1 de B. bassiana foi superexpresso e as linhagens resultantes foram bastante
17
Introdução
virulentas em bioensaios contra afídeos adultos (Myzus persicae) (FANG et al.,
2004). Utilizando o mesmo gene, Fang et al. (2007), superexpressaram em B.
bassiana uma quitinase recombinante contendo um domínio de reconhecimento da
quitina pertencente ao inseto Bombix mori. A quitinase recombinante apresentou
propriedades cinéticas de hidrólise aumentada e uma maior virulência quando
comparada com a quitinase nativa.
Os fungos, de forma geral, podem apresentar entre 10 e 25 quitinases
diferentes e a maioria destas quitinases ainda não foram estudadas. Existem várias
quitinases preditas nos genomas de fungos como, por exemplo, em Chaetomium
globosum (LIU et al., 2008) e Hypocrea jecorina (SEIDL et al., 2005). Segundo Seidl
et al. (2005) o fungo Trichoderma reesei possui 18 genes que codificam quitinases e o
mesmo número de genes que codificam quitinases, foi observado para o fungo A.
fumigatus (ALCAZAR – FUOLI et al., 2011). Observa - se um número maior de
genes codificadores de quitinases em M. anisopliae, chegando a aproximadamente 30
genes, já para M. acridum são 21 genes (GAO et al., 2011) e 20 genes para B.
bassiana (XIAO et al., 2012). Ou seja, há muito que estudar e entender sobre as
quitinases.
1.3.3ÁREAS DE UTILIZAÇÃO DAS QUITINASES
As quitinases são enzimas com grande potencial biotecnológico podendo ser
utilizadas em diversos setores industriais como o alimentício, farmacêutico,
biomédico, cosmético, têxtil e agrícola. São empregadas também no controle fungos
fitopatogênicos e pragas agrícolas. Adicionalmente, as quitinases são capazes de
realiazar transglicosilação, produzindo quito-oligosacarídeos biologicamente ativos.
Eles agem como indutores de defesa da planta e estão envolvidos na sinalização para
18
Introdução
desenvolvimento do nódulo radicular. Podem ainda ser empregados na área médica
como, por exemplo, a quitohexaose e a quitoheptaose, ambos com atividade
antitumoral. Estes quito-oligosacaridios são utilizados ainda no setor de cosméticos e
de tratamento de águas (AAM et al., 2010). Para obter os COS é necessária a
realização da hidrólise química da quitina utilizando ácidos ou enzimas. No entanto, a
hidrólise química gera efluentes contaminados, que causam danos ao meio ambiente.
Sendo assim, a capacidade de transglicosilação apresentada pelas quitinases é
interessante, evitando a contaminação ambiental, ampliando as áreas de aplicação
destas enzimas e ainda destacando o grande potencial biotecnológico das mesmas.
19
Objetivo
2. OBJETIVO
2.1 OBJETIVO GERAL

Este trabalho teve por objetivo investigar a produção de quitinases pelos
isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 do fungo entomopatogênico M.
anisopliae, caracterizando - as bioquimicamente e utilizando estas características para
um melhor entendimento da interação patógeno-hospedeiro e, consequentemente, da
virulência.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Foram objetivos específicos deste trabalho:
a) Identificar molecularmente os isolados;
b) Análisar a morfologia dos isolados por microscopia eletrônica de varredura;
c) Determinar e padronizar as melhores condições físico-químicas para a
produção de quitinases pelos isolados;
d) Estabelecer as melhores condições de ensaio para atividade enzimática;
e) Purificar e caracterizar as quitinases produzidas pelos isolados;
f) Analisar o secretoma dos isolados e identificar as proteínas secretadas;
g) Realizar ensaios de virulência in vivo utilizando os isolados IBCB 384, IBCB
425 de M. anisopliae sobre Galleria mellonella.
20
Material e Métodos
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 MICRORGANISMOS DE ESTUDO
Para a realização deste trabalho foram utilizados os isolados IBCB 167, IBCB
360, IBCB 384 e IBCB 425 (Tabela 3) da espécie M. anisopliae procedente da
Coleção de Microrganismos Entomopatogênicos “Oldemar Cardim Abreu” do
Laboratório de Controle Biológico do Instituto Biológico de Campinas, gentilmente
cedido pelo Dr. José Eduardo Marcondes de Almeida.
Tabela 3. Isolados procedente da Coleção de Microrganismos Entomopatogênicos
“Oldemar Cardim Abreu” do laboratório de Controle Biológico, Instituto Biológico,
Campinas – SP.
Isolados IBCB Mortalidade Origem Local
167 55% Solo Cascavel-PR
360 68% Solo da área de cultivo da banana Piedade-SP
384 96% Inseto: Mahanarva fimbriolata Sertãozinho-SP
425 82% Solo Mata Atlântica Iporanga-SP
Mortalidade: Quantidade de insetos (Diatraea saccharalis) infectados e mortos pelo fungo M.

anisopliae.
3.2 MANUTENÇÃO DOS ISOLADOS NO LABORATÓRIO E OBTENÇÃO
DAS CULTURAS
Os isolados foram mantidos em laboratório em tubos de ensaio contendo 10
mL de meio sólido BDA (batata-dextrose-ágar), previamente esterilizados em
autoclave a 120°C e 1,5 atm, por 20 minutos e solidificado de forma inclinada. Os
repiques foram feitos utilizando alça de platina. As culturas foram mantidas a 26oC
21
Material e Métodos
por 10 dias em estufa e posteriormente conservadas em geladeira a 4oC e utilizadas
em até 30 dias.
3.3. IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS
Esta parte do trabalho foi desenvolvido na Universidade de Córdoba /
Espanha, no Departamento de Ciencias y Recursos Agrícolas y Forestales na Unidad
Entomología Agrícola, Campus de Rabanales sob a orientação do Professor Doutor
Enrique Quesada Moraga.
3.3.1 EXTRAÇÃO DE DNA TOTAL
Para a extração de DNA foram utilizados 50 mg de micélio, esferas de vidro
estéreis e 500 µL de tampão de lise (24,28 g de Tris, EDTA 0,01 mol/L, NaCl 0,5
mol/L, SDS1% para 1L, pH 7,5), submetidos a agitação em Vórtex por 10 minutos.
Em seguida adicionou-se 500 µL da solução fenol-clorofórmio - álcool isoamílico nas
proporções ( 25:24:1 ) e submetidos a agitação em Vórtex por 5 minutos. O material
lisado foi centrifugado por 8 minutos à 8.000 x g. O sobrenadante foi transferido para
outro tubo tipo Eppendorf e adicionado de 500 µL de clorofórmio - álcool isoamílico
(24:1), homogenizado e centrifugado por 8 minutos à 8.000 x g. O novo sobrenadante
foi transferido para outro tudo tipo Eppendorf, adicionado 10 µL de RNase, misturado
e incubado a 37 ° C durante 1h. Passado o período, adicionou-se 500 µL da solução
fenol - clorofórmio – álcool isoamílico na proporção (25:24:1), misturando bem e o
material foi centrifugado a 8.000 x g por 8 minutos. O sobrenadante foi transfertido
para um novo tubo tipo Eppendorf, adicionado de 500 µL da solução clorofórmio -
álcool isoamílico (24:1), homogenizado e centrifugado a 8.000 x g por 8 minutos. O
sobrenadante foi transferido para um novo tudo tipo Eppendorf, adicionado de 2,5
22
Material e Métodos
volumes de etanol 100% e misturado delicadamente, para a preciptação do DNA. O
material foi mantido em temperatura ambiente durante 2 minutos e posteriormente
centrifugado 9.600 x g durante 10 minutos. O etanol foi removido vertendo- se o tubo.
Posteriormente 200 µL de etanol a 70 % gelado foi adicionado. Em seguida procedeu-
se a centrifugação 9.600 x g durante 2 minutos. O tubo foi vertido para secar o
preciptado formado. Finalmente a amostra foi solubilizada em 60 µL de água para
PCR (RAEDER & BRODA, 1985).
3.3.2. PCR E PURIFICAÇÃO DO DNA
A reação de PCR foi preparada utilizando o kit MyTaq Red DNA Polymerase,
como segue: 10µL de 5x MyTaq Red Reaction Buffer, 1µL do Primer R (ITS4) a 20
µM, 1µL do Primer F (ITS1F) a 20 µM, 36µL de água (ddH2O), 1,5µL de DNA e
0,5µL de MyTaq Red DNA Polymerase.
As sequências dos primers utilizados são as seguintes: Primer forward -
ITS1F: 5´-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA – 3´ (GARDES & BRUNS, 1993) e
Primer reverse - ITS4: 5´- TCCTCCGCTTATTGATATGC -3´ (WHITE et al.,
1900). Uma vez preparada as amostras, foi realizada a PCR utilizando o aparelho
PCR Applied Biosystems® Veriti® 96-Well Thermal Cycler, como descrito nos
passos abaixo:
Passos Temperatura Tempo Ciclos

Desnaturação inicial 95ºC 3 min 1
Desnaturação 95ºC 15 s 35 ciclos
Anelamento 50ºC 15 s 35 ciclos
Extensão 72ºC 10 s 35 ciclos
Final 4ºC ∞ (infinito) ∞ (infinito)
23
Material e Métodos
Após o termino do PCR, utilizou-se um gel de agarose 0,8% para recortar as
bandas de interesse. A purificação foi realizada utilizando o Kit Gene Clean con
Favor Prep GEL/PCR Purification, seguindo as intruções do fabricante. As amostras
obtidas deste processo foram enviadas a empresa StabVida, que foi responsável pelo
sequeciamento. As sequências obtidas foram tratadas com o programa DNAStar.
Posteriormente os programas Blast e ClustalW foram utilizados para identificar os
isolados e alinhar.
3.4 OBSERVAÇÃO DA MORFOLÓGIA DOS ISOLADOS DE M. anisopliae
POR MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV)
Os microcultivos para cada isolado foram preparados sobre lamínulas de
vidro, sobre as quais foram colocados pequenos cubos de BDA. Com auxílio de uma
alça de platina os isolados foram inoculados nos quatro lados do pedaço de BDA e
posteriormente, cobertos com lamínula estéril (Figura 5). Após o inóculo, a lâmina
foi acondicionada dentro de uma câmara úmida à 25oC, por 4 dias. Depois do período
de crescimento as lamínulas foram retiradas e imersas em banhos sucessivos de
concentrações crescentes de álcool etílico (10 – 100%). Sendo analisadas
posteriormente em MEV. O microscópio eletrônico de varredura utilizado foi Zeiss
EVO 50 e as lamínulas foram pulverizadas com ouro coloidal no pulverizador Bal-
Tec SCD 050 sputter coater. Todos os isolados foram submetidos a esta técnica.
Através das micrografias eletrônicas foram medidos os conídios e as hifas dos
isolados. Foram escolhidas 5 áreas aleatórias e em cada área foram realizadas 10
medidas das dimensões dos conídios. Para as medidas das hifas foram escolhidas 6
áreas aleatórias. Neste caso, para cada área foram realizadas 8 medidas. Para a análise
24
Material e Métodos
dos dados obtidos foi utilizado o teste One-Way Anova seguido pelo pós-teste de
Tukey com nível de significância α = 0,05, utilizando o programa GraphPad Prism 5.
Figura 5: Esquema da preparação do microcultivo (ALMEIDA, 2012).
3.5 OBTENÇÃO DAS CULTURAS EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA (FSbm)
Os cultivos em FSbm foram realizados em frascos Erlenmeyer de 125 mL
contendo 25 mL de diferentes meios de cultivo descritos a seguir, previamente
esterilizados em autoclave a 120oC e 1,5 atm por 20 minutos. Após esterilização, os
meios foram inoculados com 1 mL de uma suspensão de esporos (105 esporos/mL)
em água destilada, adicionada de 20 µL de tween 80, dos diferentes isolados
separadamente, e incubados 168 horas a 26°C, sob agitação (100 rpm) ou em
condição estacionária.
Meios utilizados:
a) Extrato de levedura (1%) (E).
25
Material e Métodos
b) Extrato de levedura (1%) + crisálida de Bombyx mori (1%) previamente
macerada (EC).
c) Extrato de levedura (1%) + glicose (1%) (EG).
d) Extrato de levedura (1%) + glicose (1%) + crisálida (1%) previamente
macerada (EGC).
e) Extrato de levedura (1%) + Diatraea saccharalis (Ds) (1%) previamente
macerada (EDs).
Posteriormente, a influência do tempo de cultivo sobre o crescimento e a produção
enzimática para os quatro isolados foi determinada utilizando-se 50 mL do meio de
cultivo constituído por 1% de extrato de levedura adicionado de 1% de crisálida por
diferentes períodos (24 a 240 horas).
3.6 OBTENÇÃO DAS CULTURAS EM FERMENTAÇÃO EM SUBSTRATO
SÓLIDO (FSS)
As culturas em FSS foram obtidas mediante inóculo de 1mL de uma suspensão
de esporos (105 esporos/mL) sobre 4 g de crisálida seca triturada como substrato,
fornecida pela empresa Fiação de Seda Bratac S/A. O substrato foi umedecido com
água de torneira, solução de extrato de levedura (1% m/v), solução de sais SR ou
solução de sais de Khanna, na proporção 1,3 : 1 (m/v). As culturas foram incubadas a
26ºC durante 168 horas, em estufa com umidade relativa ao redor de 76% monitorada
com o auxílio de um termohigrometro (CAAL, modelo 303C). Ressaltamos que
utilizamos Delineamento de Composto Central Rotacional (DCCR), para padronizar a
produção de quitinase em FSS, como apresentado no item 3.7.
26
Material e Métodos
3.6.1 COMPOSIÇÃO DAS SOLUÇÕES
3.6.1.1 Solução de sais de Khanna [20x]
NH4NO3.....................................................................................................................2,0g
KH2PO4 ...................................................................................................................1,3g
MgSO4.7 H2O .......................................................................................................0,362g
KCl .......................................................................................................................0,098g
ZnSO4.H2O............................................................................................................0,007g
MnSO4. H2O........................................................................................................0,0138g
FeCl3 .6H2O.........................................................................................................0,0066g
CuSO4. 5H2O ......................................................................................................0,0062g
Água destilada qsp................................................................................................100mL
3.6.1.2 Água de torneira
Alumínio........................................................................................................0,009 mg/L
Ferro................................................................................................................0,008mg/L
Nitrogênio.......................................................................................................0,193mg/L
Oxigênio...........................................................................................................1,2 mg/L
Fluoreto............................................................................................................0,20 mg/L
3.7. OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DE QUITINASE EM FSS
A otimização da produção enzimática em FSS foi realizada utilizando um
planejamento fatorial (22) tendo como variáveis independentes o tempo de
crescimento (X1) e a umidade (X2). Foram realizadas três repetições nos pontos
centrais (0) e dois pontos externos (-α e +α), totalizando 11 experimentos (Tabela 4).
O valor calculado para os pontos externos foi ±1,41. Os resultados obtidos foram
27
Material e Métodos
submetidos à análise de variância (ANOVA) com p fixado em 0,05 e 0,1 utilizando-se
o software Statistica 8.0 (Stat Soft), o qual foi também empregado para obtenção das
superfícies de resposta e dos gráficos de pareto.
Tabela 4. Delineamento de Composto Central Rotacional (DCCR), para a otimização
da produção de quitinases em FSS.
Valores codificados Valores reais
Crescimento Umidade Tempo de Umidade

Tratamentos X1 X2 crescimento %
1 -1 -1 5 30
2 1 -1 12 30
3 -1 1 5 65
4 1 1 12 65
5 0 0 9 48
6 0 0 9 48
7 0 0 9 48
8 -1,41 0 4 48
9 1,41 0 13 48
10 0 -1,41 9 23
11 0 1,41 9 72
Os cultivos foram feitos conforme as condições estipuladas no DCCR. As
amostras do extrato bruto extracelular da FSS foram utilizadas para determinar a
atividade quitinásica conforme descrito no item 3.9.1.
3.8 OBTENÇÃO DOS EXTRATOS ENZIMÁTICOS
Após incubação, as culturas em FSbm foram filtradas a vácuo, utilizando
papel filtro Watman nº 1, obtendo–se um filtrado livre de células chamado extrato
bruto extracelular e a massa micelial retida, a qual foi lavada com dois volumes de
água destilada, prensada entre folhas de papel filtro, macerada e ressuspensa em
10mL de solução tampão acetato de sódio 100mM, pH 5,0. Essa suspensão foi
28
Material e Métodos
centrifugada a 12.000g por 10 minutos, a 4C. O sobrenadante contendo as enzimas
intracelulares foi chamado de extrato bruto intracelular. Os extratos brutos contendo
as enzimas intracelulares e extracelulares foram dialisados em água destilada, durante
24 horas, a 4 C e posteriormente, utilizado para a determinação da atividade
quitinásica.
As culturas obtidas em FSS foram adicionadas de 50 mL de água destilada a 4
ºC, sendo esta mistura mantida sob agitação com uma barra magnética por 30
minutos, a 4 ºC. Posteriormente, foram filtradas a vácuo em funil de Buchner,
obtendo-se um filtrado livre de células. O micélio com os resíduos de substrato foram
descartados. O filtrado foi dialisado em água destilada por 24h, a 4 ºC e
posteriormente, utilizado para a determinação da atividade enzimática.
3.9 DOSAGEM DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA
3.9.1 QUITINASE
A determinação da atividade enzimática foi realizada utilizando-se 1mM do
substrato sintético 4-nitrofenil-N-Acetil-β-D glucosaminideo (NP-GlcNAc) em
tampão acetato de sódio 100 mM, pH 5,0.
A mistura de reação foi constituída de 200µL de uma solução de substrato e
200µL de amostra enzimática. Após incubação da mistura de reação na temperatura
de 40 oC esta foi interrompida, em diferentes intervalos de tempo, adicionando – se
1mL de NaOH 1M. O branco consistiu de 200µL da solução de substrato + 1mL de
NaOH e posteriormente a adição de 200µL de enzima. Todos os experimentos foram
realizados em triplicata. O paranitrofenolato liberado foi quantificado em λ = 405nm
em espectrofotômetro. Uma unidade de atividade enzimática (U) foi definida como
sendo a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 1 µmol de substrato, por
29
Material e Métodos
minuto, nas condições de ensaio. Para FSbm tem-se U/mL e para a FSS, U/g de
substrato. A atividade específica foi expressa em U / mg de proteína.
3.9.2 PROTEASE
O substrato utilizado para quantificar a atividade proteoásica foi o leite em pó
solúvel Molico a 1%, dissolvido em tampão fosfato de sódio 100 mM pH 7,0. A
mistura da reação foi constituída de 2,5 mL do substrato leite e 500 µL do extrato
enzimático. Sendo mantida em banho Maria a 50 oC. A reação foi interrompida,
retiranto alíquotas de 1mL em diferentes tempos e adicionado 1 mL de TCA. 20%.
Em seguida, a mistura foi mantida em gelo por 1 h. Ápos este período ocorreu a
formação do precipitado e este foi removido através de centrifugação por 10 minutos
em centrífuga Eppendorf (14000x g). Todos os experimentos foram realizados em
triplicata. A absorbância do sobrenadante foi quantificada em λ = 280 nm em
espectrofotômetro. Uma unidade de atividade proteásica (U) foi definida como sendo
a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 1 µg de tirosina por minuto. A
metodologia utilizada foi realizada conforme recomendação de Hull (1974).
3.9.3 LIPASE
A determinação da atividade lipásica foi realizada utilizando-se o substrato
sintético p-nitrofenilpalmitato (pNPP), acompanhando a liberação do íon p-
nitrofenilpalmitato. A reação foi padronizada utilizando McIlvaine 50 mM, pH5,
contendo pNPP 0,8 mM, isopropanol 10%, goma arábica 0,5 mg/mL e Triton X-100
0, 25%, num volume final de 1mL. Inicialmente foram dissolvidos em isopropanol
sob agitação, o substrato, Triton X-100 e a goma arábica e adicionados ao tampão. A
30
Material e Métodos
reação foi constituída de 50 µL do extrato enzimático adicionado ao meio reacional e
interrompida, em diferentes intervalos de tempo, por aquecimento a 90ºC por 1
minuto e adição de 1mL de tetraborato de sódio saturado. A absorbância foi
quantificada em λ = 410 nm em espectrofotômetro. Uma unidade da atividade (U) foi
definida como sendo a quantidade de enzima necessária para hidrolisar 1 µmol de
substrato por minuto.
3.10 QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
As proteínas foram estimadas pelos métodos descritos por Lowry et al. (1951)
e Bradford et al. (1976) utilizando-se albumina de soro bovino (BSA) como padrão.
3.11 ELETROFORESE EM CONDIÇÃO DESNATURANTE SDS – PAGE
(10%)
Para acompanhar a secreção de proteínas produzidas pelos isolados foram
utilizadas amostras extracelulares liofilizadas do extrato bruto aplicadas em
eletroforese em gel de poliacrilamida em condição desnaturante (SDS-PAGE 10%) de
acordo com Laemmli (1970). A corrida eletroforética foi realizada em tampão Tris-
HCl 25 mM, pH 8,9 + glicina 192 mM + 0,1% SDS, sendo a fonte ajustada para 120V
e 40 mA, por um período de 2 horas. Foram utilizados os seguintes padrões de massa
molecular: α 2-Macroglobulina (168 kDa), β-Galactosidase (112 kDa), Lactoferrina
(91 kDa), Piruvato quinase (67 kDa), Dehidrogenase lática (36 kDa) e Triose fosfato
isomerase (31 kDa). Para calcular a massa molecular de cada banda proteica foi
utilizando o Log da massa molecular de cada marcador em função da mobilidade
relativa (Rf). Após a corrida eletroforética o gel foi retirado das placas e corado
utilizando-se Comassie Brilliant Blue R- 250 para visualização das bandas proteicas.
31
Material e Métodos
3.12 ANÁLISE DO SECRETOMA DOS DIFERENTES ISOLADOS DE M.
anisopliae EM FSbm POR ELETROFORES BIDIMENSIONAL
Os isolados foram cultivados em dois meios diferentes. O primeiro meio de
cultivo, não indutor de quitinase, foi constituído de extrato de levedura 1% (m/v) +
glicose 1% (m/v) e água destilada. O segundo meio de cultivo, indutor de quitinase,
foi constituído de extrato de levedura 1% (m/v) + crisálida 1% (m/v) e água destilada.
Ambos foram mantidos a 26ºC, sob agitação orbital (100 rpm) por 7 dias. Após o
cultivo foi obtido o extrato bruto extracelular para cada isolado em ambas as
condições de cultivo como descrito no item 3.8. Os extratos enzimáticos obtidos
foram então precipitados com TCA 15% a 4ºC, centrifugados a 5.000 g, 4ºC por 20
minutos, lavados com acetona 100% e novamente centrifugados a 5.000 g, 4ºC por 20
minutos. Os precipitados foram ressuspensos em 300 µL de tampão de re-hidratação
contendo uréia 8M, 1 mg de DTT, CHAPS 2%, azul de bromofenol (traço) e 2% IPG
Buffer (pH 3 – 11 GE Health Care) e aplicados em strips de 13 cm com variação de
pH 3 – 10, para corrida eletroforética da 1º dimensão. A focalização isoelétrica das
proteínas foi realizada no IPGPhor System (Amersham Bioscience) nas seguintes
condições: gradiente 100 volts/ 1 hora, step 500 volts/ 1 hora, step 1000 volts/ 1 hora,
step 2.000 volts/ 1 hora, step 4.000 volts/ 1 hora e step 8.000 volts até 60.00 volts/
hora, gradiente 200 volts/ 5 minutos e step final de 50 volts/ 24 horas. Em seguida as
strips foram imersas em solução de equilíbrio, constituída de Tris - HCl 50 mm,
glicerol 30%, uréia 6 M, DTT 10mg/mL, SDS 2% e azul de bromofenol 1% por 15
minutos e novamente foram imersas em solução de equilíbrio, constituída de Tris -
HCl 50 mm, glicerol 30%, uréia 6 M, 25 mg /mL de iodo acetamida, SDS 2% e azul
de bromofenol 1% por 15 minutos. Em seguida a 2a dimensão foi realizada em SDS-
PAGE 12% (LAEMMLI, 1970), em placas de 18,0 x 16,0 x 0,1 cm. A corrida foi
32
Material e Métodos
conduzida a 100 volts, 25 mA por 5 horas. O gel foi corado utilizando Comassie
coloidal (NEUHOFF et al., 1988) e as bandas proteicas dos isolados cultivados em
meio indutor e não indutor, foram observadas após descoloração do gel com solução
contendo 30% de etanol e 10% de ácido acético. Optamos identificar as proteínas dos
isolados IBCB 167 e IBCB 384, considerando que ambos apresentam potenciais de
controle opostos, frente a D. saccharalis.
3.13 SPECTROMETRIA DE MASSAS E IDENTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS
Os géis bidimensionais obtidos foram analisados pelo software Image Master
7 GE para detecção das bandas proteicas (spots). Os spots recortados e posteriormente
analisados foram selecionados seguindo uma avaliação visual de intensidade. As
bandas proteicas obtidas dos géis 2D para os isolados IBCB 167 e IBCB 384
crescidos em presença de crisálida foram recortados e digeridos com adição de 0,5 µg
de tripsina (Promega) + 17 µL de tampão bicarbonato de amônio 0,1M pH 8,0.
Depois da digestão os peptídeos foram aplicados em coluna de fase reversa poros 50
R2 (PerSeptive Biosystems). Os peptídeos purificados foram hidratados em 6 µL de
solução matriz (5mg mL-1 α-ciano-4-hidroxycinnaminic acid em 50% de acetronitrila
e 0,1% de ácido trifluoracetico (v/v). Desta hidratação 2 µL de cada amostra foram
aplicados na placa de MALDI-TOF/TOF (Axima Performace, Kratos-Shimadzu,
Manchester, UK). Os MS/MS obtidos de cada spot digerido foram analisados
utilizando o software MASCOT (Matrix Science, London, UK) e os bancos de dados
SwissProt e NCBInr.
33
Material e Métodos
3.14 PURIFICAÇÃO PARCIAL DA QUITINASE EXTRACELULAR
PRODUZIDA PELOS ISOLADOS IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 E IBCB 425
EM FSS
O extrato bruto extracelular obtido da FSS para os isolados IBCB167, IBCB
360, IBCB 384 e IBCB 425 contendo quitinase foi aplicado em coluna cromatográfica
de troca iônica DEAE-Celulose (9,0 x 2,0 cm) previamente equilibrada em tampão
Tris-HCl 10mM, pH 7,5, sendo eluída pela aplicação de um gradiente linear de NaCl
(0-1M) no mesmo tampão. A coluna foi mantida a 28ºC e frações de 3mL foram
coletadas, sendo a vazão mantida em 1,9 mL/min. As frações que apresentaram
atividade quitinásica foram reunidas em um único pool o qual foi dialisado contra
água destilada por 24h, a 4ºC e posteriormente liofilizado.
O segundo pico com atividade quitinolítica, observado para o isolado IBCB
384, foi liofilizado, ressuspenso em solução tampão Tris-HCl 10mM pH 7,0 e
aplicado em coluna cromatográfica de exclusão molecular Sephadex G-100 (89,5 x
2,0 cm) previamente equilibrada com tampão tampão Tris-HCl 10mM pH 7,0, sendo
eluída neste mesmo tampão. A coluna foi mantida a 4ºC e frações de 1mL foram
coletadas, sendo a vazão mantida em 0,38 mL/min. As frações que apresentaram
atividade foram reunidas em único pool, o qual foi dialisado contra água destilada por
24h, a 4ºC e posteriormente aplicado em eletroforese em condições não desnaturantes
(PAGE) e desnaturantes (SDS-PAGE). O Pico I com atividade quitinásica obtido da
coluna Sephadex G-100 foi identificado por Eletrospray ESI Q-TOF ULTIMA (da
Waters - Manchester-UK).
34
Material e Métodos
3.15 DETERNIMAÇÃO DA TEMPERATURA E DO pH ÓTIMO DE
ATIVIDADE
Foram realizados ensaios com as quitinases parcialmente purificadas, obtidas
da FSS em diferentes temperaturas (30 ºC a 80ºC) para definir a temperatura ótima
aparente de atividade. Já para o melhor pH aparente de atividade quitinásica foi
utilizado o tampão ácido cítrico 50mM com valores de pH variando de 2,5 a 7,5, e
posteriormente foi realizada a dosagem enzimática.
3.16 DETERNIMAÇÃO DA TERMOESTABILIDADE E ESTABILIDADE AO
pH
Foram realizados ensaios com as quitinases obtidas da FSS. Para os quatro
isolados estas amostras enzimáticas foram previamente incubadas em diferentes
temperaturas (30ºC, 40ºC, 50ºC, 60ºC e 70ºC) e diferentes valores de pH (2,5, 3,0,
4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0) em tampão ácido cítrico 50 mM por 1 hora. Em ambos os
experimentos foram retiradas alicotas e armazenadas em gelo, sendo posteriormente
utilizadas na reação enzimática para se avaliar a estabilidade térmica e ao pH,
respectivamente.
3.17 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS NA ATIVIDADE
QUITINÁSICA
A mistura de reação foi adicionada de diferentes compostos (HgCl2, NH4Cl,
CaCl2, BaCl2, CoCl2, FeSO4, FeCl3, Cisteína, KCl, KH2PO4, ZnSO4, Zn(NO3)2,
EDTA, CuSO4, CuCl2, NaCl, NaH2PO4, NaBr, MgSO4, MnCl2, MgCl2, Pb (C2H3O2) e
β - Mercaptoetanol) na concentração de 1 mM.
35
Material e Métodos
3.18 DERTERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS CINÉTICOS (Km e Vmáx)
A determinação dos parâmetros cinéticos Km e Vmáx para as enzimas
parcialmente purificadas foi realizada utilizando-se concentrações crescentes de 0,02
a 5mM do substrato sintético 4-nitrofenil-N-Acetil-β-D glucosaminideo em tampão
acetato de sódio 100 mM, pH 5,0. Os valores de Km e Vmáx foram calculados com o
auxílio do programa Origin 8.0, utilizando as seguintes equações (y=a+b.x); Vmáx =
(1/y) e Km = (-1/x).
3.19 EXPERIMENTOS IN VIVO
Esta parte do trabalho foi desenvolvido na Universidade de Córdoba / Espanha, no
Departamento de Ciencias y Recursos Agrícolas y Forestales na Unidad Entomología
Agrícola, Campus de Rabanales sob a orientação do Professor Doutor Enrique
Quesada Moraga.
3.19.1 OBTENÇÃO DAS CULTURAS PARA APLICAÇÃO IN VIVO
Os cultivos em FSbm foram realizados em duas etapas: 1) Cultivo em frasco
Erlenmeyer de 125 mL contendo 25 mL de meio líquido Adamek (40 g de glicose, 40
g de extrato de levedura, 30 g licor de milho e 1000 mL de água destilada)
(ADAMEK, 1963), previamente esterilizados em autoclave a 120oC e 1,5 atm por 20
minutos. Este meio foi inoculado com 1 mL de uma suspensão de esporos (107
esporos/mL) para os isolados IBCB 384 e IBCB 425 e depois incubado por 96 horas a
25°C, sob agitação (110 rpm); 2) Após este período foram transferidos 2 mL de
cultivo para um novo meio de cultivo, onde utilizou–se frascos Erlenmeyer de 1000
36
Material e Métodos
mL contendo 250 mL de meio Adamek esterilizado, como descrito anteriormente. O
cultivo foi mantido por 168 horas a 25°C, sob agitação (110 rpm).
3.19.2 PATOGENICIDADE DOS ISOLADOS IBCB 384 E IBCB 425 DE M.
anisopliae SOBRE LARVAS DE G. mellonella POR APLICAÇÃO TÓPICA
Para a aplicação tópica foi utilizada a técnica de imersão. Inicialmente os
diferentes isolados foram crescidos em placa de Petri 90 mm com meio MA (12,75 g
de extrato de malte, 2,75 g de dextrina, 2,35 g de glicerol, 0,78 g de peptona e 15 g de
agar, para um litro de água) previamente esterilizado. As placas foram incubadas a
25°C por 15 dias até ocorrer à esporulação. As suspensões dos conídios foram
preparadas por raspagem do micélio crescido na placa e coletado utilizando uma
lâmina esterilizada. Em seguida, o micélio foi colocado em tubos estéreis contendo 15
mL de água esterilizada com 0,10% de Tween 80 e sucessivas diluições foram
realizadas até a padronização de 1 x 108conídios mL-1. A contagem destes conídios foi
em câmara de Malassez (Blau Brand, Germany)
3.19.2.1 APLICAÇÃO TÓPICA UTILIZANDO IMERSÃO
Dez larvas de G. mellonella no 4° instar foram imersas em 5 mL de suspenção
de 1 x 108 conídios mL-1 por 30 segundos. Este processo foi realizado 3 vezes
totalizando 30 larvas para cada isolado testado. No controle deste experimento 10
larvas foram imersas em água destilada com 0,10% de Tween 80. Depois da imersão,
cada larva foi colocada individualmente em placas de Petri plásticas (28 mm de
diâmetro e 13 mm de altura), com um algodão úmido e alimentada com dieta artificial
(30,8 g de farinha de milho, 30,8 g de germe de trigo, 30,8 g trigo fino, 21,1 g de leite
em pó, 10,8 g de levedura de cerveja, 27 g de glicerina, 48,6 g de mel e 1,5 g de
nipagina). A mortalidade das larvas foi avaliada a cada 24h por 15 dias. As larvas
37
Material e Métodos
mortas foram lavadas em solução de 5% de hipoclorito de sódio por 1 minuto e 3
vezes em água destilada estéril por 3 minutos. Após as lavagens cada larva foi
colocada em câmara úmida, mantida a 25°C e umidade de 65%. Depois de 5 dias foi
avaliada a presença de micélio na superfície da cutícula da larva.
3.19.3 OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO, FRAÇÕES E ENSAIO DE
TOXIDADE
Os extratos brutos obtidos a partir do cultivo dos isolados IBCB 384 e IBCB
425 em FSbm foram filtrados utilizando o filtro Dynagard de 0,2 µm (Spectrum,
Brenda, The Netherlands) e injetados em larvas de G. mellonella no 5° instar, na
região entre o segundo e o terceiro seguimento abdominal. Já a massa micelial retida
no filtro foi descartada. O dispositivo micro injetor (Burkard manufacturin,
Rckmansworth, UK) foi utilizado para injetar 8 µL do filtrado com 1 mg proteína/mL,
em cada larva. No inseto controle foram injetados 8 µL do meio Adamek bem como
0,16 µL/larva de inibidor de protease. Os ensaios foram em triplicata com 10 larvas
cada, totalizando 30 larvas para cada extrato testado. O bioensaio foi monitorado
diariamente durante 7 dias.
Em um segundo momento, o extrato bruto com volume de 50 mL foi dialisado
utilizando uma membrana de cut off de 3,5 kDa, contra 2 L de água destilada por 24
horas a 4°C. Sendo assim, a fração que ficou retida na membrana recebeu o nome de
não dialisado. Já a fração referente aos 2 L de água recebeu o nome de dialisado.
Ambas as frações foram concentradas por liofilização até o volume de 50 mL e
injetadas nas larvas como descrito acima. Os insetos mortos foram dissecados sob um
microscópio binocular para identificar sinais de toxicidade sobre os tecidos, causados
38
Material e Métodos
pelas moléculas tóxicas presentes nas frações injetadas (ORTIZ – URQUIZA et al.,
2010a).
3.19.4 COLETA DE HEMOLINFA, PRODUÇÃO DE SORO E INJEÇÃO EM
LARVAS
Cada larva de G. mellonella foi injetada com 8 µL da suspensão de conídios,
obtidas dos isolados IBCB 384 e IBCB 425, contendo 800 conídios. As larvas tratadas
foram alimentadas com dieta artificial, mantidas a 25 ºC até que a pré - fase letal da
infecção fosse observada. Esta fase é caracterizada pela presença de hifas na
hemolinfa. A hemolinfa foi coletada através de um corte na falsa pata da larva. Esta
hemolinfa infectada foi coletada em tubos contendo 300 µL de tampão anticoagulante
(WANG et al., 2007), sendo centrifugada a 800 g a 4 ºC durante 10 minutos para
remover as estruturas fúngicas e hemócitos, obtendo-se o soro. Foram quantificadas
as proteínas presentes no soro obtido do inseto segundo Bradford (1976). Este soro foi
esterilizado por filtração através de um filtro com 0,22-µm Dynagard (Spectrum,
Breda, The Netherlands). Após a esterilização foi injetado em cada larva 8 µL de
soro. Foram utilizadas 15 larvas distribuídas entre três triplicatas. As larvas tratadas
foram mantidas a 25 °C e alimentadas com dieta artificial. A mortalidade foi
observada continuamente a cada 24 horas por 9 dias. Também foram observados os
sintomas externos e internos tais como melanização da cutícula e traquéia, causados
pelo soro injetado e estes sintomas foram comparados com os sintomas causados pela
infecção fúngica.
39
Material e Métodos
3.19.5 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os dados de mortalidade foram submetidos a análise de variância (ANOVA).
Para a diferença mínima significativa (LSD) foi realizado o teste de comparação das
médias. Também foram calculados os valores do tempo médio de sobrevivência. As
análises estatísticas foram realizadas utilizando Statistix 9.0 (Analytical software,
2003) e SPSS 12.0 (SPSS Inc., 1989-2003) para Windows 3.
Observação
Para melhor compreensão dos resultados, os mesmos foram divididos em
quatro partes, sendo elas:
I. Morfologia e Identificação;
II. Produção enzimática em FSbm e FSS;
III. Análise do secretoma, purificação e caracterização bioquímica das quitinases;
IV. Experimentos in vivo.
40
Resultados
RESULTADOS
Parte I
Morfologia e Identificação
41
Resultados
4. RESULTADOS
4.1 IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS DE M. anisopliae
Utilizando os iniciadores descritos no item 3.3.2, obteve - se as sequências
constituídas de 567 nucleotídeos para o isolado IBCB 167 e 351 nucleotídeos para o
isolado IBCB 360. Já para os isolados IBCB 384 e IBCB 425 foi obtido 540 e 563
nucleotídeos, respectivamente. Estas sequências foram analisadas no programa Blast,
obetendo-se uma alta porcentagem de identidade e cobertura para as sequências
obtidas, quando comparadas com outras sequências de M. anisopliae depositadas no
GenBank. Baseado nas análises feitas com o programa Blast, foi possível confirmar a
identificação dos isolados utilizados neste trabalho, no nível de variedade, sendo M.
anisopliae variedade anisopliae (Tabela 5). As sequências de nucleotídeos dos
isolados deste trabalho e a sequência do LRC 189 M. anisopliae var. anisopliae foram
alinhadas utilizando-se o programa ClustalW (THOMPSON et al., 1994), por meio do
qual foi possível indentificar os nucleotídeos conservados entre as sequências (Figura
6).
Tabela 5. Identificação molecular dos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de
M. anisopliae.
Isolado Score Query cover Erro Identidade Espécie Acesso

IBCB 167 1048 100 % 0 100% LRC 189 M. anisopliae var. anisopliae EU307902,1
IBCB 360 586 92% 5x10-164 99% LRC 189 M. anisopliae var. anisopliae EU307902,1
IBCB 384 990 99% 0 100% LRC 189 M. anisopliae var. anisopliae EU307902,1
IBCB 425 1040 100% 0 100% LRC 189 M. anisopliae var. anisopliae EU307902,1
Foi utilizado o programa BLAST para comparar as sequências de interesse com as sequências depositadas no banco
de dados.
42
Resultados
167 ------------------------------------------------------------
425 ------------------------------------------------------------
189lr CCTAAGATGTTTGGCCCAACGGGCGTAACATGACGGGNCAGGAGTAATTCCTTGGCCGGA
384 ------------------------------------------------------------
360 ------------------------------------------------------------
167 ------------------------------------------------------------
425 ------------------------------------------------------------
189lr AGGCCCGGTAATCTTGTTAACTCCTCGTGCTGGGGATAGAGCATGCAATTATTGTTTTCA
384 ------------------------------------------------------------
360 ------------------------------------------------------------
167 ------------------------------------------------------------
425 ------------------------------------------------------------
189lr ACGAGGATCCCTAGTAAGCGCAAGTCACAGCTTGCGTTGATACGTCCCTGCCCTTGTACA
384 ------------------------------------------------------------
360 ------------------------------------------------------------
167 ------------------------------------------------------------
425 ------------------------------------------------------------
189lr CACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGTCAGTGAGGCGTCCGGACTGGCCCAGGGCA
384 ------------------------------------------------------------
360 ------------------------------------------------------------
167 ----------------------------------------------------------TA
425 ------------------------------------------------------------
189lr GGTGGGCAACTACCACCCAGGGCCGGAAAGCTCTCCAAACTCGGTCATTTAGAGGAAGTA
384 --------------------------------------TCTTGGTCATTTAGAGGAAGTA
360 ------------------------------------------------------------
167 AAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATCCAA
425 ----TCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATCCAA
189lr AAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATCCAA
384 AAAGTCGTAACAAGGTCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTATCCAA
360 ---------------------------GGGGGATGAAAGCCCTTCTTATGTGGTGCCCAA
* * * * * * * ****
167 CTCCCAACCC-CTGTGAATCATACCTTTA-ATTGTTGCTTCGGCGGGACTTCGCGCCCGC
189lr CTCCCAACCC-CTGTGAATCATACCTTTA-ATTGTTGCTTCGGCGGGACTTCGCGCCCGC
360 CACCAAGTCCACAGGGGACAAGAGGGGCGTAATGACGCTCGAACAGG----CATGCCCGC
* ** * ** * * * * * * * ** *** * ** * ******
167 CGGGGACCCGAACCTTCTGAATTTTTTAATAAGTATCTTCTGAGTGGTTAAAAAAATGAA
189lr CGGGGACCCGAACCTTCTGAATTTTTTAATAAGTATCTTCTGAGTGGTTAAAAAAATGAA
360 CAGA-ATACTGACGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAA
* * * * ** * *** * ** ** *** * * ** **
167 TCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGA-AGAACGCAGCGAAATG
189lr TCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGA-AGAACGCAGCGAAATG
360 TTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTT-CATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCG
* * * * * * ** ** ***** ******** ***** ** ** *
167 CGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCG
189lr CGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCG
360 TTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTTTTAACCACTCAGAAGATACTTATTAAAAAATTCAG
* * * * *** ** * * *** ** ** * *** *
167 CCCGTCAGTATTCT-GGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGCCCCTCAAGTCCCCT
189lr CCCGTCAGTATTCT-GGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACGCCCCTCAAGTCCCCT
360 AAGGTTCGGGTCCCCGGCGGGCGCGAA-GTCC---CGCCGAAGCAACAATTAAAGGTATG
** * * * ******* * ** * ** * * * * **
43
Resultados
167 GTGGACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTTTCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTA
189lr GTGGACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTTTCCAGCACAGCCGTCCCTTAAATTA
360 ATTCACA-GGGGTTGGGAGTTGGATAACT-------------------------------
* ** ** ****** * ** *
167 ATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCCTCTGCGCAGTAGTAAAACACTCGCAACAGGAGCCC
189lr ATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCCTCTGCGCAGTAGTAAAACACTCGCAACAGGAGCCC
360 ------------------------------------------------------------
167 GGCGCGGTCCACTGCCGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAGTTGACCTCGAATCAGGTAGG
425 GGCGCGGTCCACTGCCGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAGTTGACCTCGAATCAGGTAGG
189lr GGCGCGGTCCACTGCCGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAGTTGACCTCGAATCAGGTAGG
384 GGCGCGGTCCACTGCCGTAAAACCCCCCAACTTTTTATAGTT------------------
360 ------------------------------------------------------------
167 ACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATA-------------------------------
425 ACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAG-----------------------------
189lr ACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACCAACAGGGATTGCC
384 ------------------------------------------------------------
360 ------------------------------------------------------------
167 ------------------------------------------------------------
425 ------------------------------------------------------------
189lr CCAGTAACGGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATTCTGGGTCCCCAGGGCCC
384 ------------------------------------------------------------
360 ------------------------------------------------------------
167 ------------------------------------------------------------
425 ------------------------------------------------------------
189lr GAGTTGTAATTTGCAGAAGGATGGCTTTTGGTGAGGTGCCTTCCGAGTTCCCTGGAAACG
384 ------------------------------------------------------------
360 ------------------------------------------------------------
167 ------------------------------------------------------------
425 ------------------------------------------------------------
189lr GGACGCCATAAAGGGTTGAGAAGCCCCGTTCTGGGTTGGAATTACCGAGCCTTCTGTAAA
384 ------------------------------------------------------------
360 ------------------------------------------------------------
167 ------------------------------------------------------------
425 ------------------------------------------------------------
189lr GCTCCTTCGAACAATTCCAAGTAATTTGGGAATTGCTGCTCCTAAATTGGAAGGTATATG
384 ------------------------------------------------------------
360 ------------------------------------------------------------
167 --------------------------------------
425 --------------------------------------
189lr TTTTTCTTAAAGCTAAATATTGGGCCAGAAAACCCATT
384 --------------------------------------
360 --------------------------------------
FIGURA 6. Alinhamento de múltiplas sequências dos isolados IBCB 167, IBCB 360,
IBCB 384 e IBCB 425 do M. anisopliae e var. anisopliae LRC 189, utilizando
CLUSTALW. Simbolos: Nucleotídeos conservados (*) e ausência de nucleotídeos (-).
44
Resultados
4.2 MEV DOS MICROCULTIVOS DOS ISOLADOS DE M. anisopliae
Microcultivos dos diferentes isolados de M. anisopliae foram analisados por
MEV. Nas micrografias eletrônicas pode - se observar os conídios, os quais são
ovalados para todos os isolados (Figura 7). Na figura 8 observa – se as dimenções das
hifas dos isolados. Após a análise das medidas de comprimento e largura dos conídios
para os isolados estudados, não foi observada diferença estatística relevante entre as
larguras dos conídios (Figura 9 B). Contudo, existe diferença estatisticamente
relevante, quando analisado o comprimento do conídio do isolado IBCB 384 e IBCB
425 (Figura 9 A). Ao analisar as medidas de largura das hifas dos isolados estudados,
foram observadas apenas diferenças estatisticamente relevantes entre os isolados
IBCB167 e IBCB 425 como mostrado na figura 9 C.
45
Resultados
Figura 7. Fotomicrografia eletrônica de varredura com as medidas de comprimento e
largura dos conídios, para os isolados IBCB 167 (A), IBCB 360 (B), IBCB 384 (C) e
IBCB 425 (D) do fungo M. anisopliae em microcultivo.
46
Resultados
Figura 8. Fotomicrografia eletrônica de varredura das hifas dos isolados IBCB 167 (A),
IBCB 360 (B), IBCB 384 (C) e IBCB 425 (D) do fungo M. anisopliae em microcultivo.
47
Resultados
Figura 9. Análise estatística das medidas de comprimento (A) e largura (B) de conídios,
e largura das hifas (C) dos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M.
anisopliae.
48
Resultados
Parte II
Produção enzimática em FSbm e FSS
49
Resultados
4.3 PRODUÇÃO DE QUITINASES EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA
(FSbm)
Na tabela 6 podem ser observados os dados para produção de quitinases pelos
isolados do fungo M. anisopliae em fermentação submersa em função do meio de
cultivo utilizado e mantido sob agitação (100 rpm) a 26ºC, por 168 horas. A
temperatura e o tempo de cultivo foram definidos inicialmente, baseados na literatura.
Em todos os meios e condições analisados os fungos cresceram, sendo que a
maior produção quitinásica total (intra + extracelular) foi obtida no meio de cultivo
EG para todos os isolados deste estudo (Tabela 6). Ainda analisando a produção
quitinásica total, o isolado IBCB 425 apresentou produção quitinásica 20% maior se
comparado ao isolado IBCB 360 quando cultivado no meio EG.
O maior nível de atividade enzimática intracelular foi obtido no meio de
cultivo EG para todos os isolados, sendo o isolado IBCB 425 o melhor produtor (3,10
U totais). O isolado IBCB 425 crescido em EG apresentou uma produção quitinásica
intracelular 4,4 vezes superior quando comparado com o isolado IBCB 384 crescido
na mesma condição (Tabela 6). Quanto à atividade quitinásica extracelular, esta foi
maior quando os isolados IBCB 360 e IBCB 425 foram crescidos em meio de cultivo
EGC. Para os isolados IBCB 167 e IBCB 384 a maior atividade foi obtida em meio de
cultivo EC (1,60 U totais) e EG (2,47 U totais), respectivamente. De modo geral, a
maior produção quitinásica extracelular foi obtida com o isolado IBCB 384 (2,47 U
totais) cultivado em EG.
É claro que a presença de indutores no meio de cultivo favoreceu a secreção da
quitinase extracelular para todos os isolados. Ao analisar a produção das quitinases
extracelulares produzidas pelos quatro isolados, na presença de indutores, verificou –
se que o isolado IBCB 425 foi o que mais secretou a enzima no meio EGC, sendo
50
Resultados
seguido pelo isolado IBCB 360. Cada isolado apresentou um comportamento e um
potencial de produção de quitinase extracelular diferente quando expostos em meios
de cultivo diversos. Perante estes resultados e considerando o nível de atividade
extracelular e a disponibilidade de indutores, o meio extrato de levedura mais
crisálida (EC) foi selecionado para continuidade dos estudos.
51
Resultados
Tabela 6. Produção das quitinases intracelulares e extracelulares pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 do
fungo M. anisopliae em fermentação submersa com diferentes meios de cultivo.
Atividade enzimática (U Totais)
Intracelular Extracelular
Meio de cultivo IBCB 167 IBCB 360 IBCB 384 IBCB 425 IBCB 167 IBCB 360 IBCB 384 IBCB 425
E 0,06 ± 0 0,15 ± 0 0,11 ± 0 0,19 ± 0 0,22± 0 0,07 ± 0 0,14 ± 0 0,16 ± 0
EG 2,73 ± 0,03 2,41 ± 0,01 0,70 ± 0 3,10 ± 0,02 0,72 ± 0 0,55 ± 0,01 2,47 ± 0 0,45 ± 0
EC 0,60 ± 0 0,19 ± 0 0,60 ± 0 0,22 ± 0 1,60 ± 0 1,2 ± 0 1,72 ± 0 0,80 ± 0
EGC 0,26 ± 0,01 0,46 ± 0,01 0,11 ± 0 0,31 ± 0,01 1,35 ± 0 1,80 ± 0 1,15 ± 0 2,05 ± 0
EQ 0,06 ± 0 0,04 ± 0 0,06 ± 0 0,08 ± 0 0,17 ± 0 0,1 ± 0 0,15 ± 0 0,10 ± 0
Eds 0,13 ± 0,01 0,03 ± 0 0,32 ± 0,03 0,05 ± 0,00 1,27 ± 0,01 0,85 ± 0,01 0,80 ± 0,01 0,60 ± 0
Foram utilizados 25mL de meio de cultivo, mantidos sob agitação à 26ºC por um período de 168 horas. Meios de cultivo: Extrato de levedura (E), Extrato +
glicose (EG), Extrato + crisálida (EC), Extrato + glicose + crisálida (EGC), Extrato + quitina (EQ) e Extrato + Diatrea saccharalis (EDs).
52
Resultados
Uma vez selecionado o meio de cultivo para a produção enzimática em FSbm,
a influência da agitação ou não do cultivo sobre a produção de quitinases foi avaliada
(Tabela 7). Em todas as condições analisadas os fungos cresceram satisfatoriamente.
Analisando a produção total de quitinases (intracelular + extracelular), verificou – se
que a condição de agitação favoreceu a produção enzimática pelos isolados IBCB 167
e IBCB 384. Para os isolados IBCB 360 e IBCB 425 a condição estacionária foi
melhor, obtendo-se 5,32 U totais e 3,94 U totais, respectivamente. O isolado IBCB
360 cultivado em condição estacionária produziu 2,5 vezes mais quitinases que o
isolado IBCB 384 submetido a mesma condição. A maior produção de quitinase
intracelular foi obtida em condição estacionária para todos os isolados, sendo que o
isolado IBCB 425 foi o que se destacou (1,73 U totais), representando uma produção
40% maior se comparada a obtida para o isolado IBCB 167 na mesma condição
(Tabela 7).
Quanto à produção quitinásica extracelular observamos que ambas as
condições favoreceram a produção da enzima. Porém, a melhor produção quitinásica
extracelular foi sob agitação para os isolados IBCB 167, IBCB 384 e IBCB 425,
sendo o isolado IBCB 384 o melhor produtor nesta condição (2,76 U totais), cerca de
24% superior se comparado ao isolado IBCB 425. O segundo melhor produtor de
quitinase extracelular sob agitação foi o isolado IBCB 167 (Tabela 7). Por outro lado,
a melhor produção de quitinase extracelular para o isolado IBCB 360 foi em condição
estacionária, sendo que a condição de agitação também proporcionou uma boa
produção da enzima (2,58 U totais). Considerando-se a produção da forma
extracelular por todos os isolados, a condição de agitação foi selecionada para
continuidade dos estudos.
53
Resultados
Tabela 7. Produção de quitinases intracelulares e extracelulares pelos isolados
IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 do fungo M. anisopliae em
fermentação submersa em condição estacionária e sob agitação.
Atividade enzimática (U totais)
Intracelular Extracelular
Isolados Estacionária Agitação Estacionária Agitação
IBCB 167 1,23 ± 0 0,74 ± 0,01 1,63 ± 0,01 2,62 ± 0,02
IBCB 360 1,61 ± 0,01 0,30 ± 0,001 3,71 ± 0,01 2,58 ± 0,01
IBCB 384 1,25 ± 0 0,78 ± 0,01 0,84 ± 0 2,76 ± 0,02
IBCB 425 1,73 ± 0 0,25 ± 0,01 2,21 ± 0,02 2,22 ± 0,01
Foram utilizados 50 mL de meio de cultivo EC, mantidos à 26ºC por um período de 168 horas.
54
Resultados
4.3.1 PRODUÇÃO QUITINÁSICA EM FUNÇÃO DO TEMPO DE CULTIVO
Considerando o cultivo dos diferentes isolados de M. anisopliae em meio
contendo extrato de levedura + crisálida (1%) (EC) e mantidos sob agitação orbital
(100 rpm) a 26 ºC, a influência do tempo de cultivo sobre a produção enzimática foi
analisada (Figuras 10 e 11). Os maiores níveis enzimáticos intracelulares para os
isolados estudados foram obtidos em períodos que variaram de 72 h a 216 h, não
sendo coincidentes com os crescimentos máximos observados para os isolados IBCB
360, IBCB 384 e IBCB 425 (Figura 10). Já para a produção da forma extracelular,
verificou-se que os níveis máximos foram alcançados em periodos variando de 96 h a
144 h (Figura 11), com destaque para o isolado IBCB 384, o qual mostrou maior
produção quitinásica em 120 h. Analisando a produção da quitinase intracelular e
extracelular verificou – se que cada isolado apresentou comportamento de produção e
secreção diferentes e peculiares, ficando claro que as produções de quitinases
extracelulares foram maiores quando comparadas com as produções de quitinases
intracelulares. Assim sendo, visando a produção das quitinases extracelulares, foram
escolhidos os períodos de cultivo de 144 h para os isolados IBCB 167 e IBCB 425, 96
h para o IBCB 360 e 120 h para o IBCB 384.
55
Resultados
18 0,5
3,0 A 16 B 20
0,4
14
Atividade quitinásica (U totais)

2,5
15
Proteínas (mg totais)

12
Proteína (mg totais)

2,0 0,3
10
1,5 8 10
0,2
6
1,0
4 5
0,1
0,5
2
0,0 0 0,0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264
Horas Horas
1,8 0,5 35
16
1,6
C D
30
14
1,4 0,4
12 25
1,2

10 0,3
1,0 20
8
0,8 15
0,2
0,6 6
10
0,4 4
0,1
5
0,2 2
0,0 0 0,0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264
Horas Horas
FIGURA 10. Produção de quitinase intracelular pelos isolados IBCB 167 (A), IBCB 360
(B), IBCB 384 (C) e IBCB 425 (D) de M. anisopliae sob agitação em função do tempo de
cultivo. Desvio padrão para todos os pontos: 0,002 a 0,015. Proteína (□).
56
Resultados
6
A 5 B
5
Atividade quitinásica ( U totais)

4
4
3
3
2
2
1 1
0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Horas Horas
7
4,0
C D
6
3,5
5 3,0
4 2,5
2,0
3
1,5
2
1,0
1
0,5
0 0,0
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Horas Horas
FIGURA 11. Produção de quitinase extracelular pelos isolados IBCB 167 (A), IBCB 360
(B), IBCB IBCB 384 (C) e IBCB 425 (D) de M. anisopliae sob agitação em função do
tempo de cultivo. Desvio padrão para todos os pontos: 0,002 a 0,012.
57
Resultados
4.4 PRODUÇÃO DE QUITINASES EM FSS
4.4.1 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES SOLUÇÕES NA PRODUÇÃO DE
QUITINASES
Na tabela 8 pode ser verificada a influência das diferentes soluções (água de
torneira, solução de extrato de levedura, solução de sais SR e solução de sais de
Khanna), utilizadas para umedecer o substrato crisálida, sobre a produção enzimática.
Todos os isolados se desenvolveram quando o meio foi umedecido com as quatro
soluções. Porém, a maior produção quitinásica extracelular foi observada na presença
de solução de extrato de levedura para a maioria dos isolados, exceto para o isolado
IBCB 384, sendo a produção enzimática favorecida pela utilização de solução de sais
de Khanna. A produção enzimática pelo isolado IBCB 167, quando umedecido com
solução de extrato de levedura, foi de 2,42 U/g de substrato, 4 vezes maior quando
comparada a utilização da solução de sais de Khanna. Para os isolados IBCB 360 e
IBCB 425 foram obtidas produções de 1,76 U/g de substrato e 1,33 U/g de substrato,
respectivamente, quando umedecidos com a solução de extrato de levedura. Já o
isolado IBCB 384 foi o que menos produziu a enzima de interesse em todas as
situações analisadas. Confrontando as melhores condições para a produção da enzima
pelos isolados, a produção pelo isolado IBCB 384 foi 5 vezes menor que a obtida para
o isolado IBCB 167. Padronizou-se, portanto a utilização da solução de extrato de
levedura 1% (m/v) para os isolados IBCB 167, IBCB 360 e IBCB 425, e a solução de
sais de Khanna para o isolado IBCB 384.
58
Resultados
Tabela 8. Influência de diferentes soluções salinas, água de torneira e solução de extrato de
levedura na produção de quitinases pelos diferentes isolados do fungo M. anisopliae em FSS.
Atividade Quitinásica Extracelular (U/g de substrato)
IBCB 167 IBCB 360 IBCB 384 IBCB 425
Água de torneira 0,73 ± 0,01 0,87 ± 0,01 0,35 ± 0,01 1,09 ± 0,01
Solução extrato de levedura 2,42 ± 0,05 1,76 ± 0,03 0,30 ± 0,01 1,33 ± 0,01
Solução de sais SR 0,63 ± 0,01 0,71 ± 0,01 0,20 ± 0,01 0,84 ± 0,01
Solução de sais Khanna 0,62 ± 0,01 0,72 ± 0,01 0,46 ± 0,01 0,85 ± 0,00
As culturas foram mantidas em estufa à 26ºC com umidade relativa ao redor de 76% por um período de 168 horas.
59
Resultados
4.4.2 OTIMIZAÇÃO DA PRODUÇÃO DAS QUITINASES
EXTRACELULARES PELOS ISOLADOS DE M. anisopliae EM FSS
UTILIZANDO PLANEJAMENTO FATORIAL
Para testar a influência das variáveis crescimento e umidade na produção de
quitinases extracelulares pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425
do fungo M. anisopliae, em FSS, optou-se por um planejamento fatorial de dois
níveis, composto por três pontos centrais (0) e dois pontos externos (-α e α), em um
total de 11 experimentos (Tabela 9). Os isolados foram inoculados nos meios, cuja as
variações foram descritas no item 3.7. Os resultados foram submetidos à análise de
variância (ANOVA), como apresentado nas tabelas 10 - 13 para os isolados IBCB
167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425, respectivamente. Entre os 11 experimentos
realizados, observou – se que a maior produção enzimática foi encontrada no
tratamento 5 para os isolados IBCB 384 e IBCB 425, já para o isolado IBCB 360 foi o
tratamento 2 e no tratamento 9 para o isolado IBCB 167.
O planejamento desenvolvido para o isolado IBCB 167 apresentou R2 de 0,87
(Tabela 10), sendo que a influência de ambas as variáveis foi significante tanto no
nível linear quanto quadrático (Figura 12 A). Ao analisar o gráfico de Pareto fica
claro que a variável tempo de crescimento, no nível linear tem um efeito positivo
sobre a produção da quitinase. Entretanto um período muito longo já apresenta um
efeito negativo. Já a variável umidade (linear) nos mostra que a adição de água é
favorável para a produção da quitinase, porém quando se adiciona muita água a
produção é prejudicada. Apenas a interação entre as variáveis no nível linear, não foi
significante, (p > 0,10) (Tabela 10). O valor do F-calculado foi de 15,15, ou seja, 4,93
vezes maior que o valor de F-tabelado (3,07), sendo possível gerar o gráfico de
superfície de resposta (Figura 13 A). Neste caso, a equação que descreve o modelo é
60
Resultados
z=5,36+1,63.x-1,34.x2+1,09.y-1,88.y2; onde z = Atividade quitinásica (U/g substrato),
x = crescimento (Dias) e y = Umidade (%) para todas as equações apresentadas a
partir daqui.
Tabela 9. Atividade quitinásica extracelular total produzida pelos isolados IBCB 167,
IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae cultivados em FSS através do
DCCR.
Atividade quitinásica
Valores codificados Valores reais
(U/g substrato)
Tratamentos X Y X (Dias) Y (%) 167 360 384 425
1 -1 -1 5 30 0 0 0 0,04
2 1 -1 12 30 1,27 7,36 1,63 1,45
3 -1 1 5 65 1,14 3,9 0,72 4,26
4 1 1 12 65 3,49 4,68 2,81 6,27
5 0 0 9 48 5,38 6,18 4,6 6,38
6 0 0 9 48 5,10 7,23 3,63 6,02
7 0 0 9 48 5,59 6,96 4,51 5,84
8 -1,41 0 4 48 0,05 0,66 0,43 1,5
9 1,41 0 13 48 6,70 6,12 2,18 4,5
10 0 -1,41 9 23 0,4 0,33 0,44 0,55
11 0 1,41 9 72 4,17 6,98 1,29 3,29
X= Tempo de crescimento
Y= Umidade
Tabela 10. Análise de variância (ANOVA) para a produção de quitinase isolado

IBCB 167 de M. anisopliae cultivado em FSS.
.
Factor SS DF MS F p
(1)crescimento(L) 21,17663 1 21,17663 12,61577 0,016355 *
crescimento(Q) 10,00454 1 10,00454 5,96010 0,058558 *
(2)umidade (L) 9,43655 1 9,43655 5,62173 0,063872 *
umidade (Q) 19,89718 1 19,89718 11,85355 0,018378 *
1L by 2L 0,29160 1 0,29160 0,17372 0,694118
Error 8,39292 5 1,67858
Total SS 62,98885 10
.
R2 = 0,87; R2 ajustado= 0,73. Intervalo de confiança de 90%;
* Variável significante (p < 0,10).
61
Resultados
Para a produção enzimática pelo isolado IBCB 360, o valor de R2 foi de 0,89
(Tabela 11). A influência das duas variáveis estudadas foi significante em ambos os
níveis, linear e quadrático, bem como a interação entre elas. O F-calculado foi de 12,1
sendo 4 vezes maior que o valor de F-tabelado (3,18). Na figura 12 B fica claro que a
variável tempo de crescimento (linear) tem um efeito positivo sobre a produção da
quitinase. Entretanto um período muito longo já apresenta um efeito negativo. A
variável umidade no nível linear, mostra que a adição de água favorece a produção
quitinásica, porém o excesso de água prejudica. O gráfico de superfície de resposta
pode ser observado na figura 13 B e a equação que descreve o modelo é
z=6,79+1,98.x-1,59.x2+1,33.y-1,45.y2-1,64.x.y.
Tabela 11. Análise de variância (ANOVA) para a produção de quitinase pelo
isolado IBCB 360 de M. anisopliae cultivado em FSS.
Factor SS DF MS F p
(1)crescimento(L) 31,45 1 31,45 16,59 0,01 *
crescimento(Q) 14,13 1 14,13 7,45 0,04 *
(2)umidade (L) 14,08 1 14,08 7,42 0,04 *
umidade (Q) 11,85 1 11,85 6,25 0,05 *
1L by 2L 10,82 1 10,82 5,71 0,06 *
Error 9,48 5 1,9
Total SS 85,98 10

62
Resultados
No planejamento desenvolvido para o isolado IBCB 384, o R2 foi 0,97 (Tabela
12). Somente a interação entre as variáveis não foi significante (p> 0,10) sendo o F-
calculado de 47,55, ou seja, 13,13 vezes maior que F-tabelado (3,62), possibilitando a
obtenção do gráfico de superfície de resposta (Figura 13 C), cuja equação que
descreve o modelo é z=4,25+0,78.x-1,42.x2+0,39.y-1,65.y2+0,12.x.y. A variável
tempo de crescimento causa um efeito positivo sobre a produção da quitinase,
entretanto um período muito longo gera um efeito negativo. A variável umidade, no
nível linear, mostra que a adição de água favorece a produção da quitinase, porém
quando a umidade é excessiva a produção enzimática passa a ser prejudicada (Figura
12 C).
Factor SS DF MS F p
(1)crescimento(L) 4,84 1 4,84 25,78 0*
crescimento(Q) 11,35 1 11,35 60,52 0*
(2)umidade (L) 1,21 1 1,21 6,46 0,05 *
umidade (Q) 15,21 1 15,21 81,05 0*
1L by 2L 0,06 1 0,06 0,29 0,61
Error 0,94 5 0,19
Total SS 27,7 10

63
Resultados
O planejamento desenvolvido para o isolado IBCB 425 apresentou R2 de 0,93
(Tabela 13), sendo que a influência das variáveis analisadas foi significantes, pois o
valor de p foi < 0,05. A variável tempo de crescimento, no nível linear, exerceu um
efeito positivo sobre a produção da quitinase, entretanto um período longo apresenta
um efeito negativo. Já a variável umidade, no nível linear, mostra que a adição de
água favorece a produção enzimática, porém alta umidade no meio é desfavorável
(Figura 12 D). O F-calculado foi de 29,34, ou seja, 9 vezes maior que F-tabelado
(3,07). Na figura 13 D pode ser observado o gráfico de superfície de resposta. A
equação que descreve o modelo para este planejamento é z=6,08+0,96.x-
1,40.x2+1,62.y-1,95.y2.
Factor SS DF MS F p
(1)crescimento (L) 7,33 1 7,33 10,29 0,02 *
crescimento (Q) 11,07 1 11,07 15,53 0,01 *
(2)umidade (L) 20,87 1 20,87 29,28 0*
umidade (Q) 21,27 1 21,27 29,85 0*
1L by 2L 0,09 1 0,09 0,11 0,76
Error 4,28 6 0,71
Total SS 58,06 10
.R2 = 0,93; R2 ajustado= 0,88. Intervalo de confiança de 95%;
Interessantemente, para os isolados IBCB 167, IBCB 384 e IBCB 425 a
interação entre as variáveis não foi significante diferindo do observado para o isolado
IBCB 360 onde a interação entre as variáveis foi significante (Figura 12 B).
Considerando que o valor de F-calculado para todos os planejamentos realizados foi
64
Resultados
maior que o valor de F-tabelado, os modelos são preditivos e estatisticamente válidos.
Adicionalmente, é possível verificar que a maior produção enzimática se dá com
quantidades iguais ou superiores a 48% de umidade e em períodos superiores a 5 dias.
Este comportamento foi observado para todos os isolados estudados. Através destes
resultados foi padronizado o meio de cultivo com umidade inicial de 48% e tempo de
crescimento de 9 dias, para continuidade dos experimentos.
Ápos a padronização da produção das quitinases extracelulares pelos isolados
de M. anisopliae em FSS, as enzimas protease e lipase secretadas nas condições
padronizadas foram quantificadas. Verificou – se que os isolados IBCB 360 e IBCB
425 são os melhores produtores de lipases com 1,4 U totais/g e 1,3 U totais/g,
respectivamente. Para a protease o isolado IBCB 425 foi o melhor produtor,
produzindo 3,7 vezes mais que o isolado IBCB 384 (Tabela 14).
65
Resultados
Figura 12. Gráfico de Pareto em resposta ao planejamento fatorial para FSS delineado
para as variáveis tempo de crescimento e umidade dos isolados IBCB 167 (A) IBCB 360,
(B) IBCB 384 (C) e IBCB 425 (D) do fungo M. anisopliae.
66
Resultados
Figura 13. Superfície de resposta para o planejamento fatorial considerando as variáveis
independentes tempo de crescimento e umidade para os isolados IBCB 167 (A) IBCB 360,
(B) IBCB 384 (C) e IBCB 425 (D) do fungo M. anisopliae em FSS.
67
Resultados
Tabela 14. Quantificação de enzimas extracelulares totais produzidas pelos isolados
IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae cultivados em FSS.
U /g de substrato
Enzimas IBCB 167 IBCB 360 IBCB 384 IBCB 425
Quitinase 5,2±0,02 7,07±0,02 4,30±0,02 6,14±0,02
Lipase 1,03±0,01 1,37±0,01 0,2±0,01 1,3±0,01
Protease 141,22±0,56 2366±1,61 80,70±0,68 301,16±0,28
As culturas foram mantidas em estufa à 26ºC com umidade relativa ao redor de 76% por um período de
9 dias.
68
Resultados
Parte III
Análise do secretoma, Purificação e

Caracterização bioquímica das quitinases
69
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4.5 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA EM CONDIÇÃO
DESNATURANTE
Na figura 14 observa – se o perfil eletroforético das proteínas extracelulares
produzidas em FSbm no meio EC pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384
e IBCB 425 do fungo M. anisopliae, submetidas à condições desnaturantes (SDS -
PAGE 10%). Analisando as bandas referentes as proteínas produzidas pelos
isolados cultivados em glicose (Figura 14 A), ou na presença de crisálida (Figura
14 B), verificou – se a maior secreção proteica comparada ao observado para os
controles negativos, ou seja, somente meio contendo glicose e crisálida, na
ausência de crescimento fúngico.
Na presença de glicose, como fonte de carbono, os isolados secretaram grande
quantidades de proteínas se comparado ao controle negativo (Figura 15 A). Os
isolados IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 167 apresentam três proteínas com a mesma
massa molecular sendo elas de 100 kDa, 47 kDa e 30 kDa. Porém, para o isolado
IBCB 425 é possível observar uma proteína com massa molecular de 60 kDa.
Todos os isolados apresentaram bandas proteicas com massa molecular inferior a
30 kDa, sendo estas secretadas com intensidades diferentes por cada isolado. Na
figura 14 B observa - se o perfil das proteínas secretadas quando os isolados foram
cultivados tendo crisálida como fonte de carbono, sendo esta uma fonte indutora de
quitinases. Nesta condição os isolados secretaram diversas proteínas com massas
moleculares diversificadas quando comparada entre eles e com o controle negativo.
Na raia 167 verificamos 5 bandas com massas moleculares de 91 kDa, 64 kDa, 54
kDa, 36 kDa e 31kDa. Algumas destas bandas também foram encontradas nas raias
384 e 425. Entretanto é interessante observar nas raias 360 e 425 a ausência das
bandas proteicas com massa molecular superior 72 kDa. A menor diversidade de
70
Resultados
bandas proteicas foi observada para o isolado IBCB 360. Proteínas com massas
moleculares inferiores a 31 kDa também foram observadas. As diferenças entre as
bandas proteicas foram determinadas de acordo com a mobilidade relativa de cada
proteína. Em suma, é evidente que cada isolado apresenta um comportamento de
secreção diferente, mesmo quando submetidos às mesmas situações, evidenciando
assim suas diferenças.
71
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A B
M G 360 384 167 425 M 167 360 384 425 Cri
168 kDa 168 kDa

112 kDa 112 kDa
91 kDa 91 kDa
67 kDa 67 kDa
36 kDa
36 kDa
31 kDa
31 kDa
Figura 14. Perfil eletroforético em condição desnaturante (SDS-PAGE 10%) para
as quitinases extracelulares produzidas em FSbm tendo glicose como fonte de
carbono (A) e meio constituído de crisálida + extrato de levedura (B), corada por
Coomassie Blue R- 250. Marcadores de massa molecular (M), meio contendo
glicose e sem crescimento fúngico (G) e crisálida + extrato de levedura sem
crescimento fúngico (Cri). Marcadores: α 2-Macroglobulina (168 kDa), β-
Galactosidase (112 kDa), Lactoferrina (91 kDa), Piruvato quinase (67 kDa) e
Dehidrogenase lática (36 kDa) e Triosefosfato isomerase (31 kDa).
72
Resultados
4.5.1 ANÁLISE DO SECRETOMA DOS DIFERENTES ISOLADOS M.
anisopliae CRESCIDOS EM FSbm
A análise do secretoma dos diferentes isolados foi realizado por eletroforese
bidimensional dos extratos enzimáticos obtidos sob duas condições: glicose (não indutor) (EG)
(Figura 15) e meio contendo crisálida (indução) (EC) (Figura 16), como descrito no item 3.12.
Primeiramente, foi realizado análise comparativa das proteínas secretadas diferentemente pelos
os isolados cultivados no meio EG vesus as proteínas secretadas no meio EC. Neste caso, os
géis foram analisados utilizando o software ImageMaster 2D Platinum v7.0 para localizar as
bandas proteicas e sobrepor os géis analisados. As bandas proteicas significantes apresentam
valor de ANOVA menor que 0,05. Analisando os perfis bidimensionais, verificamos que o
isolado IBCB 167 apresenta 5 bandas proteicas semelhantes em ambas as condições de cultivo,
e 25 bandas proteicas presentes apenas no meio EC. O isolado IBCB 360 apresenta 10 bandas
proteicas semelhantes em ambos os meio de cultivo, sendo que 22 bandas proteicas são
exclusivamente observadas no meio EC. Já o isolado IBCB 425 apresentou 8 bandas proteicas
semelhantes e 34 bandas proteicas presentes apenas no meio EC. O isolado IBCB 384 foi o que
apresentou o menor número de bandas proteicas secretadas no meio EG e entre os meios EC e
EG (Tabela 15).
Realizou – se uma comparação entre o isolado IBCB 167, que é o menos patogênico
frente a D. saccharalis e os isolados IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425, onde todos foram
cultivados no meio EC (Figura 16). Na análise dos perfis bidimensionais, verificamos que
algumas das bandas proteicas reveladas para o isolado IBCB 167 são encontradas nos demais
isolados. Porém o isolado IBCB 167 apresenta 24%, 26% e 12% de bandas proteicas diferentes
quando comparado com os isolados IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425, respectivamente. Já os
isolados IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 apresentam 18%, 22% e 46% de bandas proteicas
73
Resultados
diferentes das encontradas para IBCB 167, respectivamente (Figura 17). O isolado IBCB 425 foi
o que apresentou mais bandas proteicas no perfil eletroforético de forma geral (Figura 16 D).
74
Resultados
kDa kDa
kDa
kDa
Figura 15: Perfil eletroforético bidimensional para as proteínas secretadas pelos isolados
IBCB167 (A), IBCB 360 (B), IBCB 384(C) e IBCB 425 (D) de M. anisopliae cultivados
em FSbm contendo glicose como fonte de carbono. pI 3 – 10 e marcadores de massa
molecular em kDa.
75
Resultados
kDa kDa
kDa kDa
kDa
Figura 16: Perfil eletroforético bidimensional para as proteínas secretadas pelos
isolados IBCB 167 (A), IBCB 360 (B), IBCB 384(C) e IBCB 425 (D) de M.
anisopliae cultivados em FSbm contento crisálida como fonte de carbono. pI 3 – 10 e
marcadores de massa molecular em kDa.
76
Resultados
Tabela 15. Comparação das bandas proteicas secretadas pelos isolados

IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae cultivados
nos meios EG e EC.
Número de bandas proteicas
Isolados glicose comum crisálida
IBCB 167 19 5 25
IBCB 360 19 10 22
IBCB 384 18 3 25
IBCB 425 19 8 34
100% = 68 bp 100% = 70 bp 100% = 111 bp
Figura 17: Comparação entre as bandas proteicas secretadas do isolado IBCB 167
versus as bandas proteicas secretadas pelos isolados IBCB 360, IBCB 384 e IBCB
425 de M. anisopliae cultivado em FSbm contendo crisálida como fonte de carbono.
Abreviatura: Banda proteica (bp).

77
Resultados
4.5.1.1 IDENTIFICAÇÃO DAS PROTEÍNAS DO SECRETOMA DOS
ISOLADOS IBCB 167 E IBCB 384 DE M. anisopliae CRESCIDOS EM FSbm
As análises dos secretomas dos isolados IBCB 167 e IBCB 384 foram
realizadas por eletroforese bidimensional dos extratos enzimáticos obtidos em meio
de cultivo contendo crisálida (EC) (indução), como descrito no item 3.12. De forma
geral estes isolados apresentam perfis de secreção de proteínas diferentes, tanto
qualitativamente como quantitativamente. Considerando que estes isolados, possuem
potenciais de controle opostos frente a D. saccharalis, as proteínas secretadas foram
submetidas à identificação. Na figura 18 observamos spots (bandas proteicas) para o
isolado IBCB 167, enumerados de 1 a 60 e as letras A e B, totalizando 62 bandas
proteicas, as quais foram digeridas e analisadas. Destas, apenas 17 não foram
identificadas. Já na figura 20 foram analisadas 39 bandas proteicas pertencentes ao
secretoma do isolado IBCB 384 e apenas 7 destas não foram identificadas. De forma
geral, foram identificadas 76% das 101 bandas proteicas selecionadas. Entre as
proteínas identificadas foram encontradas enzimas relacionadas a vários processos
metabólicos e virulência (Tabela 16). Analisando ambos os secretomas,
aproximadamente 34% das proteínas são exclusivas do isolado IBCB 167 e
aproximadamente 11% para o isolado IBCB 384, sendo 28% comuns entre os
isolados (Figura 20). Também o isolado IBCB 167 expressou 2,47 vezes mais a
enzima pyridine nucleotide-disulfide da família oxidoreductase que o isolado IBCB
384. Porém o isolado IBCB 384 expressou 4,30 vezes mais endo-N-acetyl-β-D-
glucosaminidase que o isolado IBCB 167 (Tabela 16). Entre as enzimas identificadas
a endo-N-acetyl-β-D-glucosaminidase merece destaque, pois ela é uma das enzimas
que pertencem ao complexo quitinolítico, estando relacionada ao mecanismo de
virulência. A endo-N-acetyl-β-D-glucosaminidase identificada apresentou pI
78
Resultados
observado de 7,71 e 28 kDa. Na figura 21 observamos o MS e MS/MS do spot 46
obtidos para a identificação da endo-N-acetyl-β-D-glucosaminidase.
Figura 18: Perfil eletroforético bidimensional para as proteínas secretadas pelo
isolado IBCB 167 de M. anisopliae cultivado em FSbm contento crisálida como
fonte de carbono. Bandas proteicas não identificadas ( ○).
79
Resultados
Figura 19: Perfil eletroforético bidimensional para as proteínas secretadas pelo
isolado IBCB 384 de M. anisopliae cultivado em FSbm contendo crisálida como
fonte de carbono. Bandas proteicas não identificadas ( ○).
Perfil eletroforético bidimensional para as proteínas secretadas pelos isolados 167
(A), 360 (B), 384(C) e 425 (D) de M. anisopliae cultivados em FSbm contento
80
crisálida como fonte de carbono. Símbolos: Proteínas diferentes entre os isolados
( ) e proteínas diferentes entre os meios EG e EC (∆).

Resultados
167 384
28 Bp
34 Bp = 33,66 % = 27,72 % 11 Bp = 10,89 %
Figura 20: Número de bandas proteicas identificadas no secretoma dos isolados
IBCB 167 e IBCB 384 de M. anisopliae cultivado em FSbm contendo crisálida
como fonte de carbono. Abreviatura: Banda proteica (Bp).
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Resultados
Tabela 16. Identificação das bandas protéicas secretadas pelos isolados IBCB 167 e IBCB 384 de M. anisopliae.
Spot
Match Cover % Mascot Massa (Da) Massa (Da) pI pI Expressão Código Sequência Similariedade Microrganismo Base de
count score teórica observada teórico observado 167 384 Hits identificada dados
2 1 3 89 97.470 99.290 5,26 4,77 0 0 gi|322705683 2 WSC domain containing protein M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
4 2 5 118 110.483 78.167 4,97 4,68 0,13 -0,13 gi|322695977 4 putative glyoxal oxidase precursor M. acridum CQMa 102 NCBInr
8 1 1 67 80.738 74.000 5,74 5,7 0 0 gi|82754305 1 catalase P. citrinum NCBInr
16 2 8 135 68.421 59.196 5,07 4,87 0,42 -0,42 gi|322710982 3 endonuclease/exonuclease/phosphatase family M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
16 2 3 121 97.470 59.196 5,26 4,87 0,42 -0,42 gi|322705683 1 WSC domain containing protein M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
20 2 4 143 57.916 52.862 5,12 4,75 1,54 -1,54 gi|322710850 1 1,2-a-D-mannosidase M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
20 2 3 64 27.112 52.862 9,64 4,75 1,54 -1,54 gi|256762337 1 predicted protein Enterococcus faecalis T3 NCBInr
24 1 8 201 42.743 44.000 5,42 5 0 0 gi|322697834 3 thioredoxin reductase, putative M. acridum CQMa 102 NCBInr
26 1 8 105 42.746 48.738 5,42 5,5 0 0 gi|322697834 2 thioredoxin reductase, putative M. acridum CQMa 103 NCBInr
82
Resultados
Tabela 16. Continuação.
Spot
Match Cover % Mascot Massa (Da) Massa (Da) pI PI Expressão Código Sequência Similariedade Microrganismo Base de
count score teórica Observada teórico observado 167 384 Hits identificada dados
pyridine nucleotide-disulfide oxidoreductase
28 1 7 214 87.434 48.036 6,02 5,99 0 0 gi|322710325 4 family M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
29 1 2 81 87.434 48.245 6,02 6,27 0 0 gi|322710325 2 family M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
30 2 5 240 116.92 45.221 5,93 4,25 0 0 gi|322705888 4 hypothetical protein MAA_07113 M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
30 2 2 139 130.952 45.221 9,07 4,25 0 0 gi|322712318 2 TRI14-like protein M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
31 2 3 77 39.440 45.221 4,78 4,25 0 0 gi/322712318 2 TRI 14-like protein M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
32 2 3 177 87.828 44.164 7,12 4,95 2,47 -2,47 gi|322692828 2 family M. acridum CQMa 102 NCBInr
33 2 2 117 87.828 43.846 7,12 5,15 1,43 -1,43 gi|322692828 1 family M. acridum CQMa 103 NCBInr
34 1 2 114 87.828 44.164 7,12 5,35 0 0 gi|322692828 1 family M. acridum CQMa 104 NCBInr
35 2 25 575 45.126 42.415 6,57 7,33 -3,17 3,17 gi|322712820 7 secreted protein M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
35 2 3 92 87.828 42.415 7,12 7,33 -3,17 3,17 gi|322692828 2 family M. acridum CQMa 102 NCBInr
35 2 10 77 36.156 42.415 7,07 7,33 -3,17 3,17 gi|322705372 2 hypothetical protein MAA_07504 M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
37 2 5 123 36.156 36.294 7,07 6,34 0,2 -0,2 gi|322705372 1 hypothetical protein MAA_07504 M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
83
Resultados
Tabela 16. Continuação

Massa
Spot Match Cover % Mascot (Da) Massa (Da) pI pI Expressão Código Sequência Similariedade Microrganismo Base de
count score teórica observada teórico observado 167 384 Hits identificada dados
46 2 5 115 38.631 28.180 6,6 7,71 -4,3 4,3 gi|322693374 1 endo-N-acetyl-β-D-glucosaminidase precursor M. acridum CQMa 102 NCBInr
47 1 7 86 40.651 29.560 7,14 8,25 0 0 gi|16215662 1 subtilisin-like protease PR1A M. anisopliae NCBInr
48 1 7 142 40.651 29.560 7,14 8,63 0 0 gi|16215662 1 subtilisin-like protease PR1A M. anisopliae NCBInr
49 1 7 131 40,304 28.000 5,15 6,45 0 0 gi|322712350 1 leucine aminopeptidase, putative M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
51 2 6 55 16,241 18.000 7,27 4,8 0 0 gi|322708481 1 proteinase inhibitor I1, Kazal M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
52 2 2 48 57.012 17.778 10,18 5,02 0,84 -0,84 EX7L_RHIME 1 Exodeoxyribonuclease 7 large subunit OS Rhizobium meliloti 1021 SwissProt
55 2 6 55 16.241 17.205 7,27 6,97 0,98 -0,98 gi|322708481 1 proteinase inhibitor I1, Kazal M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
cyclophilin family peptidyl-prolyl cis-trans
58 1 18 250 20.417 16.200 6,89 8,45 0 0 gi|322709763 3 isomerase Cyp2 M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
59 1 62 326 14.491 13.350 4,86 4,14 -1,03 1,03 gi|322710287 5 eliciting plant response-like protein M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
A 1 19 296 29.896 16.480 9,58 9,35 0 0 gi|322706541 5 nucleoside diphosphate kinase 1 M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
A 1 23 231 16.862 16.480 7,77 9,35 0 0 gi|154285406 3 nucleoside-diphosphate kinase Ajellomyces capsulatus NAm1 NCBInr
A 1 17 177 16.762 16.480 7,79 9,35 0 0 gi|396497447 2 similar to nucleoside diphosphate kinase Leptosphaeria maculans JN3 NCBInr
A 1 11 104 17.000 16.480 8,81 9,35 0 0 gi|164662016 1 hypothetical protein MGL_0723 Malassezia globosa CBS 7966 NCBInr
84
Resultados

Massa Massa
Spot Match Cover % Mascot (Da) (Da) pI PI Expressão Código Sequência Similariedade Microrganismo Base de
count score teórica observada teórico Observado 167 384 Hits identificada dados
64 1 6 233 68.421 66.710 5,07 4,62 0 0 gi|322710982 3 endonuclease/exonuclease/phosphatase family M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
64 1 1 57 97.986 66.710 5,38 4,62 0 0 gi|322701536 1 WSC domain containing protein M. acridum CQMa 102 NCBInr
68 1 4 131 57.916 59.269 5,12 4,73 0 0 gi|322710850 2 1,2-a-D-mannosidase M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
69 1 4 138 57916 59.269 5,12 4,73 0 0 gi|322710850 2 1,2-a-D-mannosidase M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
70 1 6 126 47.95 55.000 5,03 4,73 0 0 gi|322706823 2 NHL repeat-containing protein M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
Trichophyton verrucosum HKI
71 1 1 52 79,765 55.000 9,58 5,4 0 0 gi|302666331 1 hypothetical protein TRV_01048 0517 NCBInr
Trichophyton tonsurans CBS
71 1 4 51 46,84 55.000 5,17 5,4 0 0 gi|326472196 1 bZIP transcription factor 112818 NCBInr
72 2 67 77.32 55.000 6,41 5,6 0 0 gi|322692181 1 leupeptin-inactivating enzyme 1 precursor M. acridum CQMa 102 NCBInr
72 53 42.743 55.000 5,6 0 0 gi|322697834 1 thioredoxin reductase, putative M. acridum CQMa 102 NCBInr
75 1 10 198 36.156 40.000 7,07 6 0 0 gi|322705372 2 hypothetical protein MAA_07504 M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
76 1 4 73 35.790 40.000 8,48 6,3 0 0 gi|322693886 1 hypothetical protein MAC_08201 M. acridum CQMa 102 NCBInr
78 1 10 193 36.156 40.000 7,07 7 0 0 gi|322705372 2 hypothetical protein MAA_07504 M. anisopliae ARSEF 23 NCBInr
As culturas foram mantidas à 26ºC por um período de 168 horas em meio adicionado de crisálida. Obs: Match count =1 representa banda proteica exclusiva e
Match count = 2 representa banda proteica comum. O valor positivo na coluna de expressão mostra a localização da banda proteica.
85
Resultados
Spot Match Cover % Mascot Massa (Da) Massa (Da) pI pI Expressão Código Sequência Similariedade Microrganismo Base de
count score teórica observada teórico observado 167 384 Hits identificada Dados
hypothetical protein M. anisopliae
79 1 10 193 36.156 40.000 7,07 7,67 0 0 gi|322705372 2 MAA_07504 ARSEF 23 NCBInr
80 1 22 319 26.499 28.573 5,45 4,42 0 0 gi|556657 4 trypsin-like protease 1 M. anisopliae NCBInr
81 1 22 308 26.499 28.598 5,45 4,39 0 0 gi|556657 4 trypsin-like protease 1 M. anisopliae NCBInr
82 1 0 47 20.355 34.033 4,9 5,78 0 0 VIR_HUMAN 4 Protein virilizer homolog Homo sapiens SwissProt
M. anisopliae
83 1 11 125 37.708 34.033 6,44 5,78 0 0 gi|322705292 2 carbohydrate-binding protein ARSEF 23 NCBInr
subtilisin-like serine protease
84 1 12 271 42.763 30.637 5,81 6,89 0 0 gi|16305048 5 PR1D M. anisopliae NCBInr
subtilisin-like serine protease
85 1 12 182 42.763 30.637 5,81 7,5 0 0 gi|16305048 3 PR1D M. anisopliae NCBInr
86 1 5 62 26.615 27.646 5,68 6,35 0 0 gi|4768909 1 trypsin-related protease M. anisopliae NCBInr
M. anisopliae
90 2 20 136 16.241 17.778 7,27 5,02 0,84 -0,84 gi|322708481 3 proteinase inhibitor I1, Kazal ARSEF 23 NCBInr
M. anisopliae
92 2 20 183 16.241 17.205 7,27 6,97 0,98 -0,98 gi|322708481 3 proteinase inhibitor I1, Kazal ARSEF 23 NCBInr
eliciting plant response-like M. anisopliae
94 2 41 137 14.491 13.350 4,86 4,14 -1,03 1,03 gi|322710287 4 protein ARSEF 23 NCBInr
95 1 13 98 18.229 12.323 5,88 6,91 0 0 gi|322712415 MAA_01062 ARSEF 23 NCBInr
D 1 22 324 26.499 30.181 5,45 4,39 0 0 gi|556657 4 trypsin-like protease 1 M. anisopliae NCBInr
C 1 12 84 26.499 32.388 5,45 4,4 0 0 gi|556657 2 trypsin-like protease 1 M. anisopliae NCBInr
E 1 5 61 26.615 25.956 5,68 7,5 0 0 gi|4768909 1 trypsin-related protease M. anisopliae NCBInr
86
Resultados
Figura 21. Endo-N-acetyl-β-D-glucosaminidase de M. anisopliae identificada. MS dos
peptídeos tripíticos (A) e MS/MS do peptídeo tripítico (B).
87
Resultados
4.6 PURIFICAÇÃO DAS QUITINASES EXTRACELULARES PRODUZIDAS
EM FSS
Na figura 22 observa - se o perfil cromatográfico em DEAE-Celulose para as
quitinases produzidas pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de
M. anisopliae em FSS. Nesta condição, dois picos de atividade foram obtidos para
todos os isolados. O pico I (PI) representa a fração enzimática que não interagiu com
a resina e o pico II (PII), é a fração que interagiu com a resina. O PII167 foi eluído
com 300 mM de NaCl. Já os picos PII360, PII384 e PII425 foram eluídos com 224
mM, 197 mM e 156 mM de NaCl, respectivamente.
As frações PI que apresentaram atividade quitinásica foram reunidas em um
único “pool”, assim como as frações PII. Cada “poll” foi dialisado “overnight” contra
água destilada a 4ºC e armazenado para posterior utilização nos estudos de
caracterização bioquímica. Adicionalmente, o PII384 foi aplicado em coluna
cromatográfica Sephadex G-100 (Figura 23), obtendo-se um único pico com atividade
quitinásica (SPI). Os índices de recuperação e purificação para cada pool enzimático
obtido são apresentados na tabela 17.
88
Resultados
0,35 A 3,5 0,7 3,5

Pico II B Pico II
0,30 3,0 0,6 3,0
NaCl (0 -1 M)
Atividade quitinásica (U / mL)
Atividade quitinásica (U/mL)
NaCl (0 -1 M)
0,25 2,5 0,5 2,5
Abs. 280 nm
Abs. 280 nm
0,20 2,0 0,4 2,0
0,15 1,5 0,3 1,5

Pico I Pico I
0,10 1,0 0,2 1,0
0,05 0,5 0,1 0,5
0,00 0,0 0,0 0,0

0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 120
Frações nº Frações nº
3,5
0,35 C 3,5 D
0,5
Pico II Pico II 3,0
NaCl (0 -1 M)
0,30 3,0
NaCl (0 - 1 M)
0,4 2,5
0,25 2,5
Abs. 280nm
Abs. 280 nm
2,0
0,20 2,0 0,3
Pico I
Pico I 1,5
0,15 1,5
0,2
0,10 1,0 1,0
0,1
0,05 0,5 0,5
0,00 0,0 0,0 0,0

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 20 40 60 80 100 120 140 160
Frações nº Fraç‫م‬o n‫؛‬
Figura 22. Perfil cromatográfico coluna de troca iônica DEAE-Celulose para as
quitinases extracelulares produzidas em FSS pelos isolados IBCB 167 (A), IBCB 360
(B), IBCB 384(C) e IBCB 425(D) do fungo M. anisopliae. Símbolos: Atividade
enzimática (■); Abs 280 nm (▲).
89
Resultados
2,5 1200
SPI 1000
2,0
800
1,5
Abs. 280 nm
600
1,0
400
0,5
200
0,0 0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Frações
Figura 23. Perfil cromatográfico da coluna de exclusão molecular
Sephadex G – 100 para as quitinases extracelulares produzidas em
FSS pelo isolado IBCB 384 do fungo M. anisopliae. Símbolos:
Atividade enzimática (■) e Abs. 280 nm (▲).
90
Resultados
Tabela 17. Purificação das quitinases extracelulares produzidas pelos isolados IBCB 167, IBCB
360, IBCB 384 e IBCB 425 do fungo M. anisopliae.
Volume Proteínas Atividade AE Rendimento Fator de

IBCB 167 (mL) (mg Totais) (U Totais) (U/mg prot) (%) Purificação (X)
Extrato Bruto 140 73,52 13,29 0,18 100 1
DEAE-Celulose Pico I 14 2,62 0,58 0,22 4 1,22
DEAE-Celulose Pico II 35 13,26 4,82 0,36 36 2
IBCB 360
Extrato Bruto 140 71,7 32,21 0,45 100 1
DEAE-Celulose Pico I 23 2,01 0,99 0,49 3,75 2
DEAE-Celulose Pico II 47 25,26 10,4 0,41 32 1
IBCB 384
Extrato Bruto 170 54,52 47,25 0,86 100 1
DEAE-Celulose Pico I 44 5,33 11,42 2,14 24,17 2,48
DEAE-Celulose Pico II 84 18,05 15,64 0,87 33,1 1,01
Sephadex G 100 PI 2 2,25 4,78 2,12 10,12 2,46
IBCB 425
Extrato Bruto 145 68,99 79,61 1,15 100 1
DEAE-Celulose Pico I 28 2,45 4,84 1,97 6,07 1,71
DEAE-Celulose Pico II 38 16,19 21,16 1,3 26 1,13
AE= Atividade específica.
91
Resultados
4.7 ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA E IDENTIFICAÇÃO
DAS PROTEÍNAS DA FRAÇÃO SPI DO ISOLADO IBCB 384
Na figura 24 observa - se o perfil eletroforético em condições desnaturantes
(SDS – PAGE 4 - 15%) das proteínas extracelulares produzidas em FSS pelos
isolado IBCB 384, após dois processos de purificação, DEAE-Celulose e Sephadex
G-100. Analisando o perfil eletroforético verificamos a presença de diversas
proteínas com massas moleculares diferentes. Estas proteínas presentes na amostra
foram reduzidas, alquiladas, aplicadas em eletrospray, identificadas e descritas na
(Tabela 18). As bandas proteicas assinaladas pelos números 3, 5 e 8 apresentam
massas moleculares observadas iguais ou próximas das massas moleculares
descritas na tabela 18.
M 384 SPI
168kDa
116 kDa 1
90kDa 2
58 kDa 3
48,5 kDa
4
5
36,5kDa
26,6 kDa 6
7
8
Figura 24. Perfil eletroforético em condição desnaturante (SDS-PAGE 4-15%)

para a fração SPI do isolado IBCB 384 crescido em FSS tendo crisálida como
fonte de carbono, após Sephadex G-100. Marcador de massa molecular (M).
92
Resultados
Tabela 18. Identificação das proteínas secretadas pelo isolado IBCB 384 de M. anisopliae, contidas na fração SPI obtida, após Sephadex
G-100.
Score Cover % Massa PI Código de Similariedade Dados
teórica (Da) teórico acesso
492 14 26.439 5,87 gi|322702995 YcaC amidohydrolase (M. anisopliae ARSEF 23) NCBInr
275 1 110.524 4,97 gi|322695977 putative glyoxal oxidase precursor (M. acridum CQMa 102) NCBInr
252 8 63.902 6,27 gi|322712530 putative glucoamylase GMY2 (M. anisopliae ARSEF 23) NCBInr
207 29 40.994 5,32 gi|322705330 Lactonohydrolase (M. anisopliae ARSEF 23) NCBInr
203 4 63.142 6,6 gi|322695444 GMC oxidoreductase (M. acridum CQMa 102) NCBInr
202 14 53.319 4,81 gi|322712522 GPI-anchored cell wall beta-1,3-endoglucanase EglC (M. anisopliae ARSEF 23) NCBInr
190 2 58.944 5,49 gi|322709036 glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase subunit A (M. anisopliae ARSEF 23) NCBInr
182 9 42.746 5,42 gi|322697834 thioredoxin reductase, putative (M. acridum CQMa 102) NCBInr
170 21 25.457 4,71 gi|322704490 hypothetical protein MAA_08391 (M. anisopliae ARSEF 23) NCBInr
153 4 87.423 6,37 gi|16973362 subtilisin-like serine protease PR1C (M. anisopliae) NCBInr
153 6 37.861 4,91 gi|322703962 TRI14-like protein (M. anisopliae ARSEF 23) NCBInr
153 3 58.470 4,77 gi|322705665 tripeptidyl-peptidase 1 precursor (M. anisopliae ARSEF 23) NCBInr
128 10 54.215 5,4 gi|322705296 carboxypeptidase Y precursor (M. anisopliae ARSEF 23) NCBInr
* Significância para proteínas com score > 62 (p≤0,05).
93
Resultados
Tabela 18. Continuação.
Score Cover % Massa pI Código de Similariedade Dados

teórica (Da) teórico acesso
107 13 38.683 5,06 gi|9971109 subtilisin-like protease PR1K (M. anisopliae) NCBInr
105 12 24.900 6,75 gi|322707797 manganese superoxide dismutase (M. anisopliae ARSEF 23) NCBInr
104 23 17.899 4,93 gi|6624948 DNase1 protein (M. anisopliae) NCBInr
88 3 48.380 6,77 gi|322702039 hypothetical protein MAC_00278 (M. acridum CQMa 102) NCBInr
82 15 22.344 7,01 gi|322704200 Cupin family protein (M. anisopliae ARSEF 23) NCBInr
61 2 48.090 5,13 gi|169601268 hypothetical protein SNOG_03494 (Phaeosphaeria nodorum SN15) NCBInr
51 10 42.860 5,44 gi|322708430 vacuolar protease A (M. anisopliae ARSEF 23) NCBInr
46 3 62.648 8,58 gi|322705325 cellobiose dehydrogenase (M. anisopliae ARSEF 23) NCBInr
39 11 16.675 4,78 gi|322696294 Cupin family protein (M. acridum CQMa 102) NCBInr
30 3 55.827 4,93 gi|398388235 peptidase M28 (Zymoseptoria tritici IPO323) NCBInr
46 3 40.819 5,47 gi|322708454 phosphorylcholine phosphatase (M. acridum CQMa 102) NCBInr
phosphatidylglycerol/phosphatidylinositol
44 10 19.490 4,83 gi|322704711 transfer protein precursor (M. anisopliae ARSEF 23) NCBInr
42 1 80.585 5,44 gi|322702496 RecName: Full=Catalase R (Aspergillus niger) NCBInr
36 2 63.954 5,39 gi|322705475 beta-fructofuranosidase (M. anisopliae ARSEF 23) NCBInr

* Significância para proteínas com score > 62 (p≤0,05).
94
Resultados
4.8 DETERMINAÇÃO DA TEMPERATURA E pH ÓTIMO APARENTE DE
ATIVIDADE PARA AS QUITINASES PARCIALMENTE PURIFICADAS
PRODUZIDAS PELOS DIFERENTES ISOLADOS DE M. anisopliae
Na figura 25 pode – se observar que a temperatura ótima aparente de atividade
para a quitinase extracelular produzida pelos isolados IBCB 360, IBCB 384 e IBCB
425 de M. anisopliae foi de 60ºC e de 50ºC para o isolado IBCB 167. Analisando a
atividade encontrada para os isolados IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 na
temperatura ótima de 60ºC verificamos que a quitinase produzida pelo isolado IBCB
425 foi 4 vezes mais ativa se comparada a quitinase produzida pelo isolado IBCB
384. Considerando a temperatura ótima de atividade da quitinase produzida pelo
isolado IBCB 167, verificamos que a atividade enzimática foi cerca de 2,6 vezes
menor que a observada para a quitinase do isolado 425 em sua temperatura ótima. Já
em temperaturas superiores a 60ºC ocorre o declínio da atividade quitinásica para
todos os isolados.
Com relação ao pH ótimo aparente de atividade todos os isolados
apresentaram atividade quitinásica na faixa de pH de 3,0 a 6,0 (Figura 26). O pH
ótimo de atividade para as enzimas produzidas pelos isolados IBCB 360 e IBCB 425
foi 5,0 utilizando-se tampão ácido cítrico 50mM. Entretanto, o pH ótimo de atividade
encontrado para a enzima produzida pelo isolado IBCB 167 foi de 5,5 e na faixa de
4,0 a 5,5 para a quitinases do isolado IBCB 384. Sendo assim pode - se observar mais
uma vez características diferentes entre as quitinases produzidas pelos isolados
estudados.
95
Resultados
100 A B
100
Atividade quitinásica relativa (%)

80
80
60
60
40
40
20
20
100% = 1,53 (U/g) 100% = 2,77 (U/g)
0
0
30 40 50 60 70 80
30 40 50 60 70 80
Temperatura (ºC) Temperatura (ºC)
100 100
C D
80 80
60 60
40 40
20 20
100% = 1 (U/g) 100% = 4 (U/g)
0 0
30 40 50 60 70 80 30 40 50 60 70 80
Temperatura (ºC) Temperatura (ºC)
Figura 25. Determinação da temperatura ótima aparente de atividade para as quitinases

extracelulares parcialmente purificadas e produzidas em FSS pelos isolados IBCB 167 (A), IBCB
360 (B), IBCB 384 (C) e IBCB 425 (D) de M. anisopliae. Desvio padrão para todos os pontos:
0,003 a 0,012.
96
Resultados
120
110 100
A B
100

Atividae quitinásica relativa (%)
90
80
80
70
60
60
50
40
40
30
20 20
10
100% = 1,4 (U/g)
100% = 1 (U/g)
0 0
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5
pH pH
120
C D
110 100
100
90
80
80
70
60
60
50
40
40
30
20 20
100% = 1 (U/g) 100% = 5 (U/g)
10
0 0
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5
pH pH
Figura 26. Determinação do pH ótimo aparente de atividade em tampão ácido cítrico

para as quitinases extracelulares parcialmente purificadas e produzidas em FSS pelos
isolados IBCB 167 (A), IBCB 360 (B), IBCB 384 (C) e IBCB 425 (D) de M. anisopliae.
Desvio padrão para todos os pontos: 0,002 a 0,011.
97
Resultados
4.9 DETERMINAÇÃO DA ESTABILIDADE TÉRMICA E ESTABILIDADE
AO pH
Analisando-se a figura 27 verifica – se que as quitinases extracelulares dos
isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 foram estáveis a 30 ºC e 40 ºC.
Adicionalmente as quitinases produzidas pelos isolados IBCB 384 e IBCB 425 foram
estáveis a 50 ºC. Os valores de t50 encontrados para as quitinases dos isolados IBCB
167, IBCB 360 foram de 10 minutos e 20 minutos a 50ºC, respectivamente. Já os
valores de t50 para as quitinases dos isolados IBCB 360 e IBCB 384 foram de 5 e 10
minutos a 60ºC, respectivamente. Em geral a quitinase mais suscetível a temperatura,
portanto menos estável, foi produzida pelo isolado IBCB 360.
Na figura 28 observa – se que as quitinases dos isolados IBCB 384 e IBCB
425 foram as mais estáveis em uma ampla faixa de pH, quando comparadas com as
quitinases dos isolados IBCB 167 e IBCB 360. Adicionalmente a quitinase do isolado
IBCB 384 manteve 100% de sua atividade quando incubadas no pH 7,0 por um
período de 60 minutos. Já a quitinase do isolado IBCB 425 manteve
aproximadamente de 70% de sua atividade original em todos os valores de pH
testados. A quitinase do isolado IBCB 360 manteve 100% de sua atividade inicial no
pH 6,0 e a quitinase do isolado IBCB 167 manteve 60% de sua atividade inicial no pH
5,5. Entretanto as quitinases dos isolados IBCB 167 e IBCB 360 não foram estáveis
em baixos valores de pH. Considerando as estabilidades à temperatura e ao pH fica
evidente que as quitinases destes isolados têm comportamentos diferentes frente à
mesma situação.
98
Resultados
120 120
A B
100 100
Atividade quitin‫ل‬sica relat‫ي‬va (%)
Atividade quitinásica relátiva (%)

80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 0 10 20 30 40 50 60 70
Tempo (horas) Tempo (horas)
110
C D
100 100
90
80 80
70
60 60
50
40 40
30
20 20
10
0 0
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
Tempo (horas) Tempo (horas)
Figura 27. Estabilidade térmica das quitinase extracelulares parcialmente purificadas (PII)
dos isolados IBCB 167 (A), IBCB 360 (B), IBCB 384 (C) e IBCB 425 (D) do fungo M.
anisopliae. Símbolos: 30ºC (■), 40ºC (●), 50ºC (○), 60ºC (□) e 70ºC (▲).
99
Resultados
100
100
90 A B

80 90
70
80
60
50 70
40
60
30
20 50
10
40
0
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5
pH pH
100
100
C 90 D
80
Atividade quitinásica relativa(%)
80
70
60
60
50
40 40
30
20 20
10
0
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 0
2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5
pH
pH
Figura 28. Estabilidade ao pH das quitinases extracelulares parcialmente purificadas
(PII) dos isolados IBCB 167 (A), IBCB 360 (B), IBCB 384 (C) e IBCB 425 (D) do
fungo M. anisopliae. As enzimas foram mantidas em tampão ácido cítrico 50mM, pH
5,0 por 60 minutos a 4ºC.
100
Resultados
4.10 INFLUÊNCIA DE DIFERENTES COMPOSTOS SOBRE A
ATIVIDADE QUITINÁSICA
Na tabela 19 pode – se observar a influência de diferentes compostos na
concentração de 1mM sobre a atividade quitinásica extracelular parcialmente
purificada, dos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M.
anisopliae. As ativações máximas encontradas para as quitinases dos isolados IBCB
167 e IBCB 425, foram de 20% na presença de BaCl2 e de 50% na presença de
MnCl2, respectivamente. Também foi observado altas ativações da atividade
enzimáticas para a quitinases do isolado IBCB 425, na presença dos compostos CaCl2,
EDTA, KCl, MgCl2, NaBr, NH4Cl, e β- mercaptoetanol. Já para as quitinases dos
isolados IBCB 360 e IBCB 384 não foram encontradas ativação significativa, frente
aos sais testados. Deve-se destacar que as quitinases dos isolados, de forma geral,
apresentaram uma tolerância ao β - mercaptoetanol. Já os sais CuSO4, ZnSO4,
Zn(No3)2, HgCl2 e Pb(C2H3O2) provocaram a inibição da atividade enzimática das
quitinases produzidas por estes isolados.
101
Resultados
Tabela 19. Influência de diferentes compostos na atividade quitinásica extracelular dos isolados de M. anisopliae
Atividade Quitinásica Relativa (%)

1mM
Compostos 167 360 384 425
BaCl2 120 ± 5 101 ± 5 99 ± 1 130 ± 3
CaCl2 110 ± 5 95 ± 3 96 ± 3 132 ± 3
Cisteína 105 ± 2 94 ± 1,5 88 ± 5 128 ± 3
CoCl2 83 ± 5 61 ± 5 83 ± 5 65 ± 4
CuCl2 80 ± 2 71 ± 2 98 ± 1 102 ± 5
CuSO4 39 ± 5 37 ± 4 88 ± 3 42 ± 2
EDTA 117 ± 0,5 86 ± 5 98 ± 5 136 ± 5
FeCl3 109 ± 5 74 ± 3 103 ± 1 116 ± 3
FeSO4 82 ± 1 65 ± 4 108 ± 1 106 ± 5
HgCl2 99 ± 5 80 ± 5 91 ± 5 102 ± 5
KCl 110 ± 2 97 ± 5 99 ± 1 140 ± 2
KH2PO4 110 ± 2 87 ± 2 115 ± 5 111 ± 5
MgCl2 102 ± 0,5 90 ± 2 109 ± 1 149 ± 5
MgSO4 103 ± 3 89 ± 1 91 ± 1 125 ± 5
MnCl2 104 ± 3 75 ± 5 83 ± 5 150 ± 5
NaBr 117 ± 5 89 ± 1 92 ± 2 139 ± 3
NaCl 110 ± 3 91 ± 1,5 101 ± 4 141 ± 5
NaH2PO4 107 ± 5 88 ± 1 106 ± 3 121 ± 5
NH4Cl 105 ± 1,5 87 ± 5 98 ± 5 137 ± 4
Pb(C2H3O2) 91 ± 2 79 ± 5 99 ± 2 100 ± 4
Zn(NO3)2 83 ± 3 56 ± 5 70 ± 5 90 ± 5
ZnSO4 87 ± 2 57 ± 2 79 ± 1 98 ± 5
β- mercaptoetanol 109 ± 0,5 89 ± 4 108 ± 5 141 ± 3
Ausente 100 ± 2 100 ± 2 100 ± 3 100 ± 5
Os cultivos foram feitos conforme as condições estipuladas no DCCR e as culturas foram mantidas em estufa à 26ºC com umidade relativa ao redor de 76% por um
período de 216 horas e parcialmente purificadas.
102
Resultados
4.11 DETERMINAÇÃO DAS CONSTANTES CINÉTICAS Km E Vmáx PARA
AS QUITINASES DOS ISOLADOS IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 E IBCB 425
DE M. anisopliae
A determinação dos parâmetros cinéticos das quitinases produzidas em FSS e
purificadas, foram realizadas utilizando o substrato sintético 4-nitrofenil-N-Acetil-β-D
glucosaminideo. As formas enzimáticas apresentaram comportamento Michaeliano.
Na Tabela 20 podem ser observados os valores de Vmáx, Km e Vmáx/Km para todas as
quitinases produzidas pelos isolados de M. anisopliae, calculados de acordo com a
representação gráfica de Lineweaver–Burk (Figura 29). Como pode ser observado, a
quitinase do isolado IBCB 360 apresentou o menor valor de Km (0,57 mM), sendo o
isolado que possui a quitinase de maior afinidade pelo substrato, com Vmáx = 3,38
U/mg.
TABELA 20. Parâmetros cinéticos das quitináses produzidas pelos isolados IBCB 167,
IBCB 360, IBCB 384 E IBCB 425 de M. anisopliae.
Isolados Km (mM) Vmáx (U/mg) Vmáx/Km (U/mg mM-1) N
IBCB 167 0,68 1,79 2,63 1,05
IBCB 360 0,57 3,38 5,93 1,4
IBCB 384 0,66 1,96 2,97 1,05
IBCB 425 0,89 5,26 5,91 1,3
103
Resultados
A B
2,0 2,5
1,8
1,6 2,0
Atividade quitinásica (Umg/mim)

1,4
1,2 1,5
1,0
0,8 1,0
0,6
0,4 0,5
0,2
0,0 0,0
-0,2
0 1 2 3 4 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
[S] (mM) [S] (mM)
C D
1,4
2,5
1,2
1,0 2,0
0,8
1,5
0,6
1,0
0,4
0,2 0,5
0,0
0,0
-0,2
0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5
[S] (mM) [S] (mM)
Figura 29. Representação gráfica de Lineweaver–Burk para as quitinases extracelulares
purificadas dos isolados IBCB 167 (A), IBCB 360 (B), IBCB 384 (C) e IBCB 425 (D)
do fungo M. anisopliae. Inserto: representação gráfica de Michaelis – Menten.
104
Resultados
Parte IV
Experimentos in vivo
105
Resultados
4.12 ENSAIO DE VIRULÊNCIA
4.12.1 ENSAIO DE VIRULÊNCIA DOS ISOLADOS IBCB 384 E IBCB 425 DE
M. anisopliae SOBRE G. mellonella UTILIZANDO APLICAÇÃO TÓPICA
Para os ensaios in vivo utilizou – se os isolados IBCB 384 e IBCB 425, sendo
os mais virulentos à praga D. saccharalis. Neste ensaio de imersão foi testado o
potencial de virulência destes isolados de M. anisopliae sobre G. mellonella
utilizando aplicação tópica (Tabela 21). Observou – se que o isolado IBCB 425 foi o
mais virulento, por apresentar um TMS de 4,6 dias, quando comparado com o IBCB
384 (Tabela 21). Analisando a confirmação da mortalidade por micose observou – se
alta mortalidade provocada pelo isolado IBCB 384 e uma baixa mortalidade
provocada pelo isolado IBCB 425, devido a contaminação com fungos oportunistas.
Tabela 21. Ensaio de virulência das linhagens IBCB 384 e IBCB 425 de M.
anisopliae sobre G. mellonela.
Imersão
Mortalidade* Mortalidade (%)* TMS**
Tratamentos (média ± SE) (%) por micose (dia ± SE)
Controle 17 ± 3,3a 0±0a 13,8± 0,52a
IBCB 384 100 ± 0 b 83,33± 3,33 b 7,0± 0,35b
IBCB 425 100 ± 0 b 33,33± 3,33 c 4,6± 0,48c
*Colunas com mortalidade média que apresentam as mesmas letras não apresentam
diferença significativas pelo teste LSD (p≤0,05).
**Colunas com mortalidade média que apresentam as mesmas letras não apresentam
diferença significativas pelo teste log -rank (p≤0,05). Tempo médio de sobrevivências
(TMS) foi calculado para 15 dias.
106
Resultados
4.12.2 ENSAIO DE VIRULÊNCIA DOS ISOLADOS IBCB 384 E IBCB 425
SOBRE A LARVA DE G. mellonella UTILIZANDO CONÍDIOS INJETADOS
O ensaio do potencial de virulência dos isolados IBCB 384 e IBCB 425 de M.
anisopliae sobre G. mellonella utilizando conídios injetados (Tabela 22) mostrou que
os isolados IBCB 384 e IBCB 425 provocaram mortalidade semelhante (90 – 93%).
Entretanto os resultados encontrados para TMS mostram que o isolado IBCB 425 e
IBCB 384 não apresentam diferenças estatisticamente significantes se considerados os
valores absolutos. Porém, na prática, vale ressaltar que a diferença no TMS entre as
linhagens é de 1 dia. Esta diferença é muito significante, quando se leva em
consideração a ação devastadora de uma praga. Baseado neste quadro, o isolado IBCB
425 pode ser considerado mais virulento que o IBCB 384. Na figura 30 pode-se
observar claramente o potencial de crescimento micótico dos isolados analisados,
confirmando o potencial de desenvolvimento sobre a larva morta.
Tabela 22. Ensaio de virulência dos isolados IBCB 384 e IBCB 425 de M.
anisopliae sobre larvas de G. mellonella utilizando conídios injetados.
Mortalidade * Mortalidade (%)* TMS**
Tratamentos (média ± SE) (%) por micose (dia ± SE)
Controle 3,33 ± 3,33 a 0±0a 6,93 ± 0,06 a
IBCB 384 93,33 ± 3,33 bc 100 ± 0 b 5,9 ± 0,168 b
IBCB 425 90 ± 5,77 bc 100 ± 0 b 5,5 ± 0,25 b
*Colunas com mortalidade média que apresentam as mesmas letras não apresentam diferença
significativas pelo teste LSD (p≤0,05).
**Colunas com mortalidade média que apresentam as mesmas letras não apresentam diferença
significativas pelo teste log -rank (p≤0,05). Tempo médio de sobrevivências (TMS) foi calculado para 7
dias.
107
Resultados
Figura 30. Confirmação da mortalidade das larvas de G. mellonella (A) por crescimento
micótico dos isolados IBCB 384 (B) e IBCB 425 (C) de M. anisopliae após injeção de 800
conídios e incubação por 7 dias a 26°C.
108
Resultados
4.12.3 ENSAIO DE TOXICIDADE DOS ISOLADOS IBCB 384 E IBCB 425
CULTIVADOS EM FSbm SOBRE G. mellonella UTILIZANDO
MICROINJEÇÃO
Neste ensaio foi testado o potencial de toxicidade do extrato bruto, fração
dialisada e fração não dialisada obtidos dos isolados IBCB 384 e IBCB 425 de M.
anisopliae sobre larvas de G. mellonella utilizando a técnica de microinjeção (Tabela
23). Primeiramente foi analisada a toxicidade do extrato bruto, sendo que o isolado
IBCB 384 provocou alta mortalidade e apresentou TMS de 2,4 dias, sendo 2 vezes
mais virulento que o isolado IBCB 425 (Tabela 23). Na toxicidade da fração dialisada
observou - se que os isolados de M. anisopliae apresentaram mortalidade e virulência
semelhantes. Com relação a toxicidade da fração não dialisada dos isolados IBCB 384
e IBCB 425 causaram uma baixa mortalidade das larvas e um alto TMS foi obtido,
evidenciando que esta fração é de baixa toxicidade (Tabela 23). Em análise geral pode
- se verificar que para os isolados do fungo M. anisopliae a toxicidade está presente
na fração dialisada onde encontra – se moléculas menores de 3,5 kDa e os metabólitos
secundários.
109
Resultados
Tabela 23. Ensaio de toxicidade dos isolados IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae cultivadas em FSbm sobre larvas de G. mellonela utilizando
microinjeção.
Extrato bruto Dialisado Não dialisado
Mortalidade TMS a Proteína Mortalidade TMS b Proteína Mortalidade TMSb Proteína
Tratamentos (média ± SE) (%) (dia ± SE) mg/mL (média ± SE) (%) (dia ± SE) mg/mL (média ± SE) (%) (dia ± SE) mg/mL
Controle 11,66 ± 5,77 a 6,4 ± 0,14 a 0,75 13,33 ± 6,6 a 7,66 ± 0,16a 0,3 13,33 ± 6,6 a 7,66 ± 0,16a 0,75
IBCB 384 83,33 ± 5,77 b 2,40 ± 0,40b 1,2 58 ± 11 b 6,5 ± 0,41b 0,59 13,33 ± 6,6 a 7,9 ± 0,08 a 1,06
IBCB 425 46,66 ± 5,77 c 5,46 ± 0,36c 1,14 53 ± 18 b 6,63 ± 0,44b 0,49 33,33 ± 6,66 b 7,0 ± 0,38 a 0,58
*Colunas com mortalidade média que apresentam as mesmas letras não apresentam diferença significativas pelo teste LSD (p≤0,05).
**Colunas com mortalidade média que apresentam as mesmas letras não apresentam diferença significativas pelo teste log -rank (p≤0,05).
a Tempo médio de sobrevivências (TMS) foi calculado para 7 dias.
b Tempo médio de sobrevivências (TMS) foi calculado para 8 dias.
110
Resultados
4.12.4 EFEITO DA TOXICIDADE DO SORO OBTIDO DE LARVAS DE G.
mellonella INFECTADAS PELOS ISOLADOS IBCB 384 E IBCB 425
UTILIZANDO MICROINJEÇÃO
O potencial de toxicidade do soro obtido das larvas de G. mellonella
infectadas pelos isolados IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae utilizando a técnica
de microinjeção foi analisado (Tabela 24). Considerando que os soros obtidos para
este estudo são provenientes de larvas contaminadas com os isolados citados, os soros
foram nomeados como SORO-384 e SORO-425. Analisando a toxicidade do soro
obtido das larvas contaminadas pelos isolados de M. anisopliae, verificamos que o
isolado IBCB 384 foi mais eficiente, provocando mortalidade de 61% com TMS de
6,56 dias, sendo o isolado com o maior potencial de toxicidade e virulência, quando
comparado com o IBCB 425.
Foi observada a melanização da cutícula (parte externa) e da traquéia (parte
interna) quando injetado o soro infectado em larvas sadias (Figura 31). Ao analisar a
melanização da cutícula verificou –se que todas as larvas apresentaram melanização
com padrões diferentes, diferindo dos controles. Porém a larva que apresentou
melanização mais intensa foi a que recebeu o SORO-425. Observamos manchas de
melanização na traquéia das larvas durante o desenvolvimento dos isolados IBCB 384
e IBCB 425 na hemolinfa (Figura 31).
111
Resultados
Tabela 24. Ensaio de toxicidade do soro extraído de larvas de G. mellonela após

microinjeção de conídios dos isolados IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae.
Mortalidade a TMS Proteína
Tratamentos (média ± SE) (%) (dia ± SE) mg por larva
Controle + 28,33 ± 7,23 a 8,3 a 0,01
IBCB 384 60,83 ± 6,2 b 6,56 b 0,01
IBCB 425 35 ± 8,63 ab 7,73 a 0,01
*Colunas com mortalidade média que apresentam as mesmas letras não

apresentam diferença significativas pelo teste LSD (p≤0,05).
**Colunas com mortalidade média que apresentam as mesmas letras não
apresentam diferença significativas pelo teste log -rank (p≤0,05).
Tempo médio de sobrevivência (TMS) foi calculado para 9 dias.
a Mortalidade do controle foi de 13%, TMS de 8,73c e 0,01mg /8µL de proteína.
112
Resultados
Cutícula Traquéia Hemolinfa
Figura 31. Efeito da toxicidade do soro obtido de larvas de G. mellonella contaminada
com os isolados IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae após injeção de 800 conídios por
larva e incubado por 72h.
113
Discussão
5. DISCUSSÃO
Atualmente a agricultura vem enfrentando um sério problema associado à
resistência dos insetos pragas frente aos produtos químicos utilizados para combatê -
los. Uma alternativa para controlar estes insetos é aplicar fungos entomopatogênicos
nas lavouras (WRAIGHT & BRADLEY, 1996). O estudo destes fungos tem
despertado muito interesse, pois grande parte destas espécies de fungos são
especializadas na penetração via tegumentos, onde ocorre a secreção de enzimas que
degradam a cutícula do inseto, tais como proteases, lipases e quitinases, entre outras
(St LEGER et al., 1988b), estando relacionadas a patogenicidade e a virulência
(PARIS & SEGRETAIN, 1978).
A produção destas enzimas relacionadas com a patogenicidade e virulência
ocorrem durante o ciclo de infecção do patógeno sobre o hospedeiro, permitindo o
desenvolvimento da patogênese. A patogênese inclui (i) crescimento do tudo
germinativo na cutícula do inseto e simultaneamente a produção de enzimas
hidrolíticas; (ii) produção de substâncias mucilaginosas para facilitar a adesão; (iii)
formação do apressório; (iv) penetração através do grampo de penetração, até atingir a
hemocele e a hemolinfa. Na hemolinfa infectada desenvolvem – se os corpos hifais;
há produção de complexos enzimáticos e metabólitos tóxicos que ativam o sistema de
defesa do hospedeiro. O confronto entre patógeno e hospedeiro termina com o
aparecimento do micélio e a conidiogênese na superfície do hospedeiro, fechando o
ciclo de infecção (SMALL & BIDOCKA, 2005; ARRUDA et al., 2005). O complexo
enzimático é de extrema importância, pois as enzimas proteases, lipases e quitinases,
entre outras, são produzidas e secretadas desde o primeiro contato do fungo com o seu
hospedeiro como, por exemplo, a protease Pr1 que faz parte de uma gama de
proteases, responsáveis pela degradação de proteínas complexadas com a quitina que
114
Discussão
constitui a cutícula do hospedeiro, sendo regulada durante a formação do apressório e
conidiogênese (SMALL & BIDOCKA, 2005).
As lipases são importantes, pois a cutícula e os integumentos dos insetos possuem
gorduras, lipoproteínas e ceras. Estas substâncias dificultam a adesão do conídio,
como foi observado por Lord & Howard (2004) para os conídios de B. bassiana,
Aspergillus parasiticus e M. anisopliae utilizados para infectar Liposcelis
bostrychophila. As quitinases são fatores de virulência em entomopatógenos,
fitopatógenos e micopatógenos segundo Charnley (1997), St Leger et al. (1998),
Kishimoto et al. (2002) e Barreto et al. (2004). Elas são produzidas já na fase inicial
de penetração do fungo, agindo sobre a quitina da cutícula do inseto, facilitando a
penetração do fungo. A secreção desta enzima é regulada por um sistema de indução e
repressão, sendo necessárias quantidades mínimas da enzima para iniciar a
degradação do substrato (FRANCESCHINI et al., 2001 e SILVA et al., 2005). A
maior parte das quitinases produzidas e secretadas por M. anisopliae são ácidas e
sofrem influência do pH do meio (St LEGER et al., 1996b). Os genes chit1, chit2,
chit3 de M. anisopliae que codificam quitinases já foram estudados. O gene chit 1
codifica uma endo quitinase de 42kDa e pI de 5,8 (BOGO et al., 1998). O gene chit 2
também codifica uma quitinase de 42kDa, porém com pI de 4,8 (Baratto et al., 2003 e
2006). Já o gene ortologo de chit3 codifica a quitinase CHIT30, que possui atividade
endo e exoquitinásica (Silva et al., 2005). Mesmo com os estudos já realizados, ainda
falta informação sobre a regulação e secreção do complexo quitinolítico produzido
por M. anisopliae. Estas informações são importantes na compreensão da relação
patógeno hospedeiro e consequentemente, para mitigar os problemas com insetos
praga, evitando os danos incalculáveis no campo (St. LEGER et al., 1996c ; Hu & St.
LEGER, 2002). De acordo com Patil et al. (2000) a penetração do fungo e a
115
Discussão
colonização do hospedeiro é possivelmente facilitada pela presença de um complexo
multienzimático, onde o sinergismo entre as enzimas são importantes e a atuação
individual é essencial.
Com o objetivo de selecionar isolados do gênero Metarhizium para controlar a
praga Diatraea saccharalis, Zappelini (2009) obteve como resultado porcentagens
diferentes de mortalidade da praga para cada isolado da espécie Metarhizium
anisopliae testado. Examinando os resultados obtidos no trabalho de Zappelini (2009)
e outras informações descritas na literatura sobre a relação entre enzimas e virulência
de fungos (BOLDO et al., 2009), optamos por investigar a produção e as
características bioquímicas das quitinases produzidas pelos isolados IBCB 167, IBCB
360, IBCB 384 e IBCB 425 da espécie M. anisopliae, cujas porcentagens de
mortalidade confirmada para a praga D. saccharalis foram de 55%, 68%, 96% e 82%,
respectivamente.
Inicialmente, analisou-se a morfometria de hifas e conídios dos quatro isolados
através do microcultivo em lâmina e posterior análise por MEV. O microcultivo em
lâmina possibilita a visualização das estruturas íntegras, sendo uma ótima técnica para
identificação de fungos, pois nela é nítido o desenvolvimento de macro e
microconídeos (PRADO, 2007). As medidas realizadas para a largura dos conídios
dos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 não apresentaram
diferenças estatisticamente relevantes. Já na análise da largura das hifas e
comprimento dos conídios, dos quatro isolados estudados, ocorreram diferenças
significativas. Estas diferenças estão entre os isolados IBCB 167 e IBCB 425 para
hifas e entre os isolados IBCB 384 e IBCB 425 para comprimento de conídios. Desta
forma as diferenças não estão restritas apenas as características bioquímicas, mas
também em relação à morfometria de hifas e conídios. No trabalho de Arruda et al.
116
Discussão
(2005), utilizando MEV para analisar a morfologia dos conídios de diferente isolados
de Metarhizium spp., todos os conídios apresentaram a forma alongada. Verificaram
ainda que alguns conídios são grandes e outros menores, e que as superfíces dos
conídos podem ser irregulares e murchas ou regulares e intumescidas. Estes resultados
se assemelham aos obtidos no presente trabalho. Como exemplo da utilização desta
técnica para analisar estruturas fúngicas cita-se o trabalho de Nampoothiri et al.
(2004) que observaram o desenvolvimento das hifas do T. harzianum em farelo de
trigo e os trabalhos de Arruda et al. (2005) e Santi et al. (2009) que observaram
conídios de M. anisopliae.
A identificação morfológica foi confirmada pela identificação molecular,
utilizando ITS, cuja região de amplificação foi a sequência parcial da subunidade
menor do rRNA, ITS1, gene 5.8S, ITS2 e sequência parcial da subunidade maior do
rRNA. As sequências obtidas apresentaram alta identidade com outras sequências de
M. anisopliae depositadas no GenBank, sendo os quatro isolados identificados como
M. anisopliae var. anisopliae. Através do alinhamento entre as sequências obtidas e a
sequência depositada no GenBank para o isolado LRC 189 M. anisopliae var.
anisopliae, foi possível observar regiões conservadas e não conservadas. Gao et al.
(2011), Bischoff et al. (2009) e Arruda et al. (2005) também utilizaram ITS para
identificar espécies de M. anisopliae. Os espaços intergênicos alteram – se
rapidamente ao longo do tempo, portando são menos conservados e são utilizados
para identificar espécies ou variedades pertencentes ao mesmo gênero
(SOUFRAMANIEN et al., 2003; LIU et al., 2002) .
Uma vez confirmada a indentificação dos isolados, a produção de quitinases em
FSbm e FSS foi avaliada, considerando que são enzimas chaves no processo de
infecção e patogênese. A maior produção quitinásica intracelular foi em FSbm no
117
Discussão
meio EG para todos os isolados, com destaque para isolado IBCB 425. Considerando
a quitinase extracelular o melhor produtor foi o isolado IBCB 384, mantido sob
agitação a 26ºC por 168h. Quando os isolados foram cultivados em meios indutores
observou – se que os isolado IBCB 425 foi o que mais se destacou. Ao analisar o
cultivo dos isolados na presença de substratos indutores, houve um favorecimento da
secreção da quitinase. Porém, quando os isolados foram cultivados em meios não
indutores, observamos uma boa produção de quitinase intracelular, mas não
favoreceram a secreção da quitinase. O fato destes meios não favorecerem a secreção
da quitinase extracelular, pode causar alguns problemas para os fungos
entomopatogênicos, pois para este tipo de fungo é extremamente importante a
secreção da quitinase, porque esta enzima faz parte de um complexo enzimático que
permite que o patógeno infecte o hospedeiro. Nos trabalhos de Fleuri et al. (2009) e
Liu et al. (2003) também foi verificado a indução da secreção de quitinase, ao cultivar
os microrganismos Cellulosimicrobium cellulans 191 e Verticillium lecanii F091 em
fermentação submersa, utilizando quitinina. De forma geral o cultivo destes isolados
em EG favorece a produção da quitinase intracelular, ao passo que cultivar estes
isolados em meios com indutores aumenta a secreção da enzima. Considerando a
produção enzimática total (intracelular + extracelular) em condição estacionária e sob
agitação, as maiores produções quitinásicas foram obtidas para os isolados IBCB 167
e IBCB 384 sob a condição de agitação e para os isolados IBCB 360 e IBCB 425 sob
condição estacionária. Entretanto o isolado IBCB 384 foi o que mais se destacou sob
agitação e o isolado IBCB 360 se destacou na condição estacionária. No trabalho
desenvolvido por Braga et al. (1998), a FSbm sob agitação adicionada de quitina
como fonte de carbono, também foi utilizada para desenvolvimento de M. anisopliae,
onde foi verificado um bom crescimento deste microrganismo, assim como observado
118
Discussão
para os quatro isolados deste estudo. A condição de agitação possui características
que favorecem a produção enzimática tais como, melhor oxigenação do meio de
cultivo, homogenização do meio e aumento do contato entre o microrganismo e os
nutrientes do meio de cultivo. Estas características que a condição de agitação possui
provavelmente influênciou a produção quitinásica observada neste trabalho. Liu et al.
(2003) investigaram a influencia da condição de agitação e a velocidade de agitação
sobre a produção de quitinase, ao cultivar V. lecanii F091 em meio de cultivo
contendo 0,41% de pó da casca de camarão. Foi concluído que a condição de agitação
favoreceu a produção de quitinase, como observado neste trabalho. Porém, é relatado
que altas velocidades de agitação causam efeitos negativos como ruptura de células,
alterações morfológicas e queda na produtividade. Considerando - se a produção
quitinásica extracelular em FSbm foi padronizada, a utilização do meio EC sob
agitação foi usada para continuidade dos estudos, uma vez que este favoreceu a
secreção da quitinase.
Muitos elementos e fatores afetam o desenvolvimento do microrganismo e
consequentemente a produção de uma determinada enzima. Alguns parâmetros podem
ser citados como a composição do meio de cultivo, o pH, a temperatura, as fontes de
carbono, nitrogênio e fósforo, entre outros. Estudos realizados por Ortiz-Urquiza et al.
(2010b) utilizando o fungo M. anisopliae, confirmaram que diferentes fontes de
carbono e fontes de nitrogênio, influenciam a produção de biomassa fúngica, a
produção de blastosporos, na secreção de proteínas com atividade inseticida e na
secreção de moléculas tóxicas.
Desta forma, a produção de quitinase extracelular em FSbm foi maior para os
quatro isolados quando o meio foi suplementado com D. saccharalis (Ds), ou
crisálida. É importante destacar ainda que a crisálida utilizada como substrato para a
119
Discussão
produção de quitinases é um resíduo biológico do processo de produção do fio de
seda, pois a crisálida é a pupa do bicho da seda, sendo posteriormente descartada.
Encontrar uma aplicação para este resíduo biológico é interessante e atrativo, podendo
ser utilizado para a produção de enzimas. Interessantemente, alguns destes resíduos,
provenientes de vegetais ou de animais, apresentam grandes vantagens quando
utilizados para o cultivo de microrganismos como, por exemplo, redução dos custos
de produção, favorecendo o crescimento do microrganismo e a produção de enzimas
(PEIXOTO-NOGUEIRA, 2009).
O tempo de incubação de um microrganismo influência muito a produção
enzimática. A incubação por um período breve pode não resultar na produção máxima
da enzima, já que o microrganismo encontra-se na fase de crescimento vegetativo. Em
adição, o crescimento da cultura por um período longo pode levar a exaustão dos
nutrientes, conduzindo a um declínio no crescimento e na produção enzimática
(PELCZAR et al., 1996). O crescimento microbiano divide-se em quatro fases, sendo
elas, a fase de adaptação do microrganismo ao meio de cultivo (fase LAG), uma fase
caracterizada por um crescimento rápido e uniforme (fase LOG), a qual o
microrganismo já adaptado ao meio utiliza todos os recursos oferecidos por este para
o seu desenvolvimento, uma fase estacionária na qual o crescimento do
microrganismo é interrompido pela escassez nutricional do meio e uma fase de
declínio, onde o meio não tem mais nutriente e também apresenta uma série de
compostos do metabolismo do próprio microrganismo, os quais são responsáveis pela
lise das hifas e conseqüentemente morte celular (ESPOSITO et al., 2004).
Considerando as diferentes formas de cultivo, cada microrganismo apresenta seu
melhor tempo de crescimento e produção enzimática como, por exemplo, Bacillus
amyloliquefaciens V656 (SAN-LANG et al., 2002) cuja produção máxima de duas
120
Discussão
quitinases extracelulares foi obtida em 48 h. Já para Oerskovia xanthineolytica e C.
cellulans 191 a produção quitinásica máxima foi observada em 72 h (WAGHMARE
et al., 2010 e FLEURI et al., 2009). De acordo com Kang et al. (1999), uma nova
quitinase produzida por M. anisopliae, teve sua produção máxima em 96 h.
Entretanto, a produção de quitinase por Paecilomyces lilacinus ocorreu em 240 h
(KHAN et al., 2003). Os melhores períodos de incubação para produção enzimática
encontrados no presente trabalho foram diferentes, sendo as maiores produções
quitinásicas intracelulares dos isolados obtidas entre 72 h e 216 h, não coincidindo
com os picos de crescimento observado para os isolados IBCB 360 (96h), IBCB 387
(96 h) e IBCB (72 h), sendo apenas coincidente para o isolado IBCB 167. Contudo a
maior atividade quitinásica extracelular produzida pelos isolados IBCB 167, IBCB
360, IBCB 384 e IBCB 425 foram verificadas entre os períodos de 96 h e 144 h. Os
períodos encontrados nos trabalhos de Waghmare et al. (2010), Fleuri et al. (2009) e
Moraes et al. (2003) para a produção da quitinase extracelular pelos microrganismos
O. xanthineolytica, C. cellulans e M. anisopliae, respectivamente, foram diferentes de
todos os períodos encontrados para a produção da forma extracelular do presente
trabalho. Analisando a produção da quitinase intracelular e extracelular verificou – se
que cada isolado apresentou comportamentos de produção e secreção diferentes e
peculiares, corroborando com os relatos feitos por Gimenez-Pecci et al. (2002) onde
diferentes isolados de uma mesma espécie produzem níveis diferentes de enzimas
extracelulares.
Com relação a produção quitinásica em FSS, os maiores níveis enzimáticos
foram obtidos quando foi utilizada crisálida como substrato umedecido com solução
de extrato de levedura (1%) na proporção 1,3:1 (m/v) para os isolados IBCB 167,
IBCB 360 e IBCB 425. Já para o isolado IBCB 384 a maior secreção de quitinase foi
121
Discussão
obtida quando o meio foi umedecido com solução de sais de Khanna na mesma
proporção. A solução de extrato de levedura e de sais de Khanna provavelmente
supriram alguma necessidade nutricional do microrganismo favorecendo seu
metabolismo e consequentemente a produção enzimática, o que não foi observado na
presença da água de torneira. A solução de sais de Khanna possui a maior quantidade
e diversidades de sais, quando comparada com a composição da água de torneira
descrita no item 3.6.1.2, justificando o melhor desenvolvimento dos isolados. Já a
solução de extrato de levedura é extremamente rica em diversos nutrientes como
proteínas, vitaminas do complexo B, ácido fólico,biotina, niacina, minerais, mananas
e glucanas (HALASZ & LÁSZTITY, 1991). Estes nutrientes influenciam no
crescimento do fungo e consequentemente na produção enzimática, como foi
observado neste trabalho. Após a seleção do substrato e da solução umidificante, a
produção enzimática foi otimizada por planejamento experimental. Esta ferramenta
permite estudar a interação de variáveis independentes e contínuas no processo de
produção enzimática (ROBRIGUES & LEMMA, 2009). Bhanu et al. (2008)
utilizaram o planejamento fatorial para avaliar o efeito do pH, extrato de levedura e
mistura de fontes de carbono na produção de conídios por M. anisopliae. Patel et al.
(2007) utlilizaram um planejamento do tipo Plackett–Burman com oito variáveis para
a produção de quitinase por Paenibacillus sabina JD2, permitindo a seleção prévia
das variáveis relevantes. Neste trabalho foi utilizado um planejamento de 2ª ordem,
utilizando pontos externos e repetições de pontos centrais para as variáveis
independentes tempo de crescimento e umidade, as quais mostraram efeito positivo na
produção de quitinase extracelular para todos os isolados, elevando a produção
quitinolítica. O DCCR realizado para cada um dos isolados foi estatisticamente
válido, pois o F-calculado foi maior que o F-tabelado. Os valores de R2 obtidos no
122
Discussão
DCCR para cada isolado, onde R2 é o coeficiente de explicação que fornece uma
media da proporção da variação em relação à variação total das respostas, foram
próximos a 1 (RODRIGUES & LEMMA, 2009). Desta forma foi possível obter as
gráficos de superfície de resposta bem como as equações que descrevem o modelo
para cada uma das enzimas estudadas. Para os isolados IBCB 167, IBCB 384 e IBCB
425 a interação entre as variáveis não foi significante, diferindo do observado para o
isolado IBCB 360. A adição de solução umificante ao meio foi positiva e significante,
pois quanto mais úmido o meio, maior a produção. Porém, o meio de cultivo com
umidade excessiva tem um efeito negativo na produção da quitinase. A maior
produção de quitinase extracelular ocorreu com umidade igual ou superior a 48% e
por períodos acima de 5 dias. Este comportamento foi observado em todos os
isolados. Fica claro que estes isolados têm uma preferência por meios mais úmidos,
entretanto são capazes de produzir quitinases em meios com umidade reduzida. Esta
flexibilidade demonstrada por todos os isolados é importante, visto que no meio
ambiente a presença de água é inconstante. Os resultados obtidos nestes
planejamentos foram validados, aumentando o grau de confiabilidade dos experientos.
Os planejamentos ainda permitem um melhoramento da produção enzimática
utilizando as equações obtidas. Simultaneamente as atividades enzimáticas das
proteases e lipases secretadas nas condições padronizadas para FSS foram
quantificadas. Estas enzimas são importantes para o processo de infecção entre o
patógeno e hospedeiro, auxiliando na compreensão desta relação extremamente
complexa. O isolado que destacou - se na produção de ambas as enzimas foi o IBCB
425. Este resultado corrobora ao observado neste trabalho e por Zappelini (2009) com
relação a de degradação da cutícula dos insetos. O isolado IBCB 425 também
123
Discussão
destacou – se no controle das pragas Mahanarva fimbriolata e Deois flavopicta
segundo Loureiro et al. (2005) e Perreira et al. (2008).
Quando comparadas a FSbm e FSS, a produção de quitinase extracelular foi
máxima, no período de 216 h em FSS, diferindo dos períodos encontrados para FSbm.
Nos trabalhos de Patel et al. (2007) e Suresh & Chandrasekaran (1999) com
Paenibacillus sabina JD2 e Beauveria bassiana cultivados em FSS os períodos
máximos de produção de quitinase encontrados foram 96 h e 44 h, respectivamente.
Analisando a produção da quitinase intracelular e extracelular verificamos que cada
isolado apresentou comportamentos de produção e secreção diferentes. O mais
interessante é que a produção de quitinase tende ser maior quando os isolados são
cultivados em FSS quando comparados a FSbm. Este resultado é de extrema
importância, uma vez que a FSS se aproxima das reais condições encontradas pelo
fungo na natureza. No trabalho de Bhanu et al. (2008) o fungo M. anisopliae também
foi cultivado em FSS, diferindo da maioria dos trabalhos relatados na literatura que
são com FSbm como, por exemplo, os trabalhos de Braga et al. (1998) para M.
anisopliae, Fleuri et al. (2009) para Cellulosimicrobium cellulans e San-Long & Chio
(1998) para Pseudomonas aeruginosa K-187. A produção de quitinase extracelular
em FSbm e FSS foi favorecida quando os isolados foram cultivados em meios
adicionados de crisálida. Fica claro, que a secreção de quitinases para o meio externo
é maior na presença de indutores.
Ápos a padronização da melhor condição de cultivo para a produção da
quitinases em FSbm e FSS, e considerando a importância do complexo enzimático no
processo de infecção, os secretomas obtidos dos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB
384 e IBCB 425 de M. anisopliae em FSbm na presença ou na ausência de um indutor
foram avaliados inicialmente utilizando eletroforese unidimensional, permitindo
124
Discussão
observar algumas diferenças. Diversas proteínas foram secretadas em ambas as
situações de cultivo se comparadas aos controles. Algumas das bandas proteicas
observadas são comuns entre os secretomas dos isolados, porém em intensidades
diferentes entre si, o que reflete o nível de expressão proteico para cada isolado.
Bandas proteicas maiores que 72 kDa estão ausentes para os isolados IBCB 360 e
IBCB 425. O menor número de bandas proteicas foi observado para o isolado IBCB
360. Em ambas as condições estudadas, ou seja, na presença e na ausência de
indutores, houve a secreção de proteínas com massas moleculares inferior a 31 kDa, o
que pode indicar a presença de destruxinas ou outros metabólitos secundários. É
evidente que quando os isolados foram crescidos em meio de cultivo com crisálida
(indutor) observamos maior número bandas proteicas, representando uma maior
secreção de proteínas do que na situação de crescimento com glicose. Mesmo assim,
os isolados ainda apresentam comportamentos de secreção diferentes entre si, levando
a inferir que as diferenças observadas estão relacionadas com os potencias de
patogenicidade e virulência de cada um dos isolados. Estas proteínas podem estar
relacionadas com o processo de infecção de M. anisopliae sobre insetos, sendo que
algumas delas podem ser quitinases, uma vez que estas apresentam massa molecular
muito diversa como apontado nos trabalhos de Pinto et al. (1997), que identificaram
uma quitinase de 30 kDa ; Sakai et al. (1998) identificaram 3 quitinases de Bacillus
linhagem MH-1 com massas moleculares de 71 kDa, 62 kDa e 53 kDa. Já Kang et al.
(1999) verificaram seis quitinases diferentes de M. anisopliae, com massas
moleculares variando de 30 kDa a 110 kDa. Boa parte das proteínas observadas neste
trabalho se encontram na faixa de massa molecular observada por Kang et al. (1999).
Baseados nos resultados encontrados em gel de uma dimensão, os secretomas dos
isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 analisados utilizando
125
Discussão
eletroforese bidimensional, que é uma ferramenta mais sensível. Oh et al. (2010)
utilizaram eletroforese bidimensional para estudar a fase precoce da germinação do
conídio de A. nidulans e Grinyer et al. (2005) utilizaram esta ferramenta na
investigação proteômica do fungo Trichoderma atroviride desenvolvido sobre parede
celular de Rhizoctonia solani. A eletroforese bidimensional permite verificar com
clareza as proteínas semelhantes ou diferentemente secretadas de acordo com a massa
molecular e pI de cada uma delas em uma mesma condição ou não. Neste contexto
duas análises diferentes foram realizadas, sendo uma para um mesmo isolado em duas
condições de cultivo, presença de glicose ou crisálida, e outra entre os diferentes
isolados em uma mesma condição de cultivo. Para um mesmo isolado a secreção
proteica foi maior quando utilizada crisálida se comparado ao cultivo com glicose.
Murade et al. (2008) também investigaram o secretoma de M. anisopliae
produzido na presença e ausência de exoesqueleto de Callosobruchus maculates,
utilizando géis bidimensionais. Em seu trabalho foram identificadas várias enzimas,
como a metionina gomaliase (pI 6,65 e 43 kDa), a proteinase (pI 5,99 e 57 kDa), a
tripsina (pI 5,68 e 26 kDa) e ATPase (pI 9,57 e 43 kDa). Nos trabalhos realizados
por St-Leger et al. (1996a; 1998 e 1999), duas isoformas de tripsina (pI 4,4 com 30
kDa e 4,9 com 27 kDa) foram identificadas quando o fungo M. anisopliae foi
cultivado com o exoesqueleto de barata. Entretanto, quando M. anisopliae foi
cultivado em meio adicionado de quitina observou-se três isoformas de uma quitina
deacetilase (26 kDa , 37 kDa e 70 kDa) (NAHAR et al., 2004). Sendo assim, M.
anisopliae produz uma diversidade de proteínas que estão relacionadas a
patogenicidade. A síntese destas proteínas é influenciada pelo meio indutor utilizado,
assim como as enzimas que participam do processo de infecção.
126
Discussão
Os isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425, quando
considerado o secretoma, apresentam bandas proteicas semelhantes em ambas as
condições de cultivo, bem como algumas proteínas exclusivas quando cultivados em
EG e em EC. O isolado que secretou o menor número de proteinas, em ambas
condições de cultivo, foi o IBCB 425.
Sendo assim, considerando os quatro isolados estudados, optamos por realizar a
identificação das proteínas secretadas pelos isolados IBCB 167 (menos virulento) e
IBCB 384 (mais virulento), cultivados em meio tendo crisálida (indutor) como fonte
de carbono. Diferentes bandas proteicas foram identificadas nos géis bidimensionais e
analisadas pelo software Image Master v.7 GE. Foram obtidas, digeridas e analisadas
101 bandas proteicas, sendo identificadas 77 proteínas e apenas 24 não foram
identificadas. A não identificação destas proteínas pode estar relacionada a diversos
problemas como: i) pequena quantidade de amostra, ii) digestão ineficiente e iii)
alteração no espectro de massas, provocado por um erro no aparelho. O número de
proteínas identificadas superou o obtido por Murad et al. (2008) quando cultivou o
fungo M. anisopliae em presença de Callosobruchus maculatus. Entre as proteínas
identificadas, uma diversidade de enzimas relacionadas a vários processos
metabólicos foram observadas, como descrito nos trabalhos de Barros et al. (2010),
Oh et al. (2010), Manalil et al. (2009) e Murad et al. (2008). Desta forma o foco foi
apenas identificar qualitativamente as semelhanças ou diferenças entre os isolados
estudados, sendo que 28% das proteínas identificadas estão presentes em ambos os
isolados.
As proteínas secretadas diferentemente pelos isolados representam pequenas
mudanças na via biossintética e secretora decorrente da ativação ou inibição de genes.
Interessantemente, não existe uma relação direta vista neste trabalho, entre quantidade
127
Discussão
de proteínas secretadas e o potencial de virulência. O isolado IBCB 384 foi o que
apresentou o menor número de proteínas exclusivas secretadas, porém, segundo
Zappelini (2009), este isolado foi o mais virulento para D. saccharalis. Já no trabalho
de Loureiro et al. (2005) este isolado provocou 98% da mortalidade de Mahanarva
fimbriolata. Sua eficiência está correlacionada com suas características individuais
(carga genética), que certamente sofrem influência do meio ambiente, causando
alterações evolutivas correlacionadas com os mecanismos de defesa do hospedeiro
(GAO et al., 2011).
Entre as 77 enzimas identificadas e suas isoformas, algumas delas como subtilisin-
like serine protease PR1D de M. anisopliae foi identificada no trabalho de Santi et al.
(2009) e Murad et al. (2008). A subtilisin-like serine protease PR1 é uma enzima
importante no processo de virulência, pois ela catalisa a separação das proteínas
conjugadas a quitina, que compõem a cutícula dos insetos (SMALL & BIDOCKA,
2005 e SANTI et al. 2009). Murad et al. (2008) identificaram as enzimas trypsin-like
protease e a oxidoredutase que também foram identificadas neste trabalho. Foi
identificado também o domínio WSC, que é um suposto domínio para ligação de
carboidratos, composto por oito resíduos de cisteína conservados. Este domínio está
presente em Trichoderma harzianum na enzima beta-1, 3 exoglucanase, na a proteína
SLG1 de leveduras e no fungo M. anisopliae (GAO et al., 2011). Nos secretomas
analisados foram encontradas endonucleases e exonucleases da família das fosfatases.
Estas enzimas catalizam a hidrólise dos ácidos nucleicos e participam da replicação e
reparo do DNA. A thioredoxin identificada, está envolvida em vários processos
biológicos, como a síntese de DNA, defesa antioxidante, modulação da apoptose e
resposta immune. Esta proteína também foi detectada no trabalho de proteômica
utilizando M. anisopliae infectando Dermolepida albohirtum (MANALIL et al.,
128
Discussão
2009). Manosidase e catalase foram também identificadas. A manosidase cataboliza
carboibratos, sendo importante para o metabolismo energético do patógeno. Esta
enzima foi relatada no trabalho de Brito et al. (2011) utilizando Trichoderma spp.
cultivado em presença de parede celular de Fusarium solani, Fusarium oxysporum,
Rhizoctonia solani e Sclerotinia sclerotiorum. Já a catalase tem um desempenho
importante no sistema detoxificação, desenvolvido durante a infecção do hospedeiro
(SREE & PADMA, 2008).
A enzima endo-N-acetyl-β-D-glucosaminidase merece destaque, pois ela é uma
das enzimas que pertencem ao complexo quitinolítico e as enzimas deste complexo
estão relacionadas a mecanismos de virulência como descrito por Fang et al. (2008),
Murad et al. (2008), Boldo et al. (2009) e Santi et al. (2009). A endo-N-acetyl-β-D-
glucosaminidase identificada apresentou pI observado de 7,71 e massa molecular de
28 kDa. Já a endo-N-acetyl-β-D-glucosaminidase produzida por Stigmatella
aurantiaca DW4 descrita por Bourgerie et al. (1994) apresentou massa molecular
similar porém o pI foi de 6,8. Os resultados obtidos, neste trabalho evidenciam as
diferenças presentes entre os isolados, e permitem um melhor entendimento do
potencial de patogenicidade destes isolados como descrito por Zappelini (2009) e
Loureiro et al. (2005), considerando que a patogenicidade está relacionada com a
produção de um complexo enzimático. O estudo de proteínas secretadas é interessante
e auxilia na elucidação do processo de infecção entre patógeno e hospedeiro do ponto
de vista bioquímico, bem como das características de virulência. Sendo possível
quantificar e analisar as enzimas importantes para o processo de infecção, permitindo
assim, selecionar microrganismos com potencial para controlar diversos insetos-
pragas.
129
Discussão
Considerando a importância das quitinases no processo de infecção, os
extratos brutos contendo estas enzimas produzidas pelos isolados IBCB 167, IBCB
360, IBCB 384 e IBCB 425 cultivados em FSS, foram submetidos a purificação, uma
vez que a maior produção quitinásica foi encontrada neste tipo de fermentação. O
processo utilizado neste trabalho foi semelhante ao empregado por Kyoung-Ja et al.
(2003) para a enzima produzida por Streptomyces sp. M-20 aplicando-se extrato
enzimático em coluna cromatográfica DEAE-Celulose. No trabalho de Kyoung-Ja et
al. (2003), o perfil cromatográfico revelou apenas um pico de atividade, diferindo do
perfil encontrado por nós para todos os isolados, com a separação do extrato bruto
enzimático em dois picos com atividade quitinásica. Os picos II dos isolados IBCB
167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425, que interagiram com a resina, foram eluídos
com diferentes concentrações de NaCl, mostrando que elas apresentam diferenças no
total global de cargas negativas. Kang et al. (1999) estudaram a produção de
quitinases por M. anisopliae e obtiveram dois picos de atividade quitinásica em
DEAE–Sephacel, semelhante ao encontrado neste trabalho. Porém, no estudo
desenvolvido por Pinto et al. (1997) com o mesmo microrganismo e o mesmo tipo de
coluna cromatográfica foi identificado apenas um pico de atividade. Já a quitinase
produzida por P. lilacinus foi eluída como única forma em coluna DEAE - Sephacel
(KHAN et al., 2003). Os resultados relatados acima mostram que a espécie M.
anisopliae apresenta uma grande capacidade de produzir isoformas de quitinases
dependendo da condição de cultivo e do isolado. Alguns trabalhos relatam a utilização
de DEAE - Sepharose, como descrito por San-long et al. (2002) para B.
amyloliquefaciens V656 e P. lilacinus, obtendo-se dois picos de atividade quitinásica,
diferindo do resultado encontrado para a quitinase produzida por Thermomyces
lanuginosus com apenas um pico de atividade quitinásica (GUO RUN – FANG et al.,
130
Discussão
2008). Assim a diversidade de isoformas e características bioquímicas das quitinases
produzidas por vários microrganismos são extensas e intrigantes. O processo de
purificação teve continuidade apenas para o isolado IBCB 384, pois este é o isolado
mais virulento segundo Zappelini (2009), o que foi confirmado com relação aos
estudos de virulência e toxidade apresentados anteriormente na seção de resultados.
Portanto, o pico PII384 proveniente de DEAE-Celulose, com maior atividade
quitinásica, foi aplicado em Sephadex G-100, obtendo uma única fração quitinásica
(SPI). O perfil eletroforético (SDS - PAGE 4-15%) desta fração obtida, evidenciou a
presença de várias proteínas com massas moleculares diversificadas, sendo analisadas
por eletrospray e posteriormente identicadas no banco de dados NCBI. Algumas das
proteínas identificadas nesta fração quando o isolado IBCB 384 foi cultivado em FSS
foram semelhantes às encontradas em FSbm. A purificação das quitinases tem sido
conduzidas utilizando outras colunas cromatográficas como Sepharose CL 4B 200
(FLEURI et al.,2009) e coluna de afinidade “swollen chitin” ( DEANE et al., 1998),
DEAE Sepharose e Pheny1 - Sepharose (GUO et al., 2008). Diferentes massas
moleculares têm sido observadas para as quitinases como, por exemplo, 27,5 kDa, 48
kDa, 61 kDa e 110 kDa, descritas nos trabalhos de Deane et al. (1998), Kyoung-Ja
Kim et al. (2003), Guo et al. ( 2008), Fleuri et al. (2009) e Guo et al. ( 2004),
respectivamente. A não identificação de uma quitinase na fração SPI deve-se
provavelmente a baixa concentração da enzima, embora tenha sido observada a
atividade quitinásica.
Tendo-se otimizado alguns parâmetros ideais para a produção das quitinases
pelos diferentes isolados de M. anisopliae, a temperatura de reação para a máxima
atividade enzimática extracelular foi obtida a 60ºC para os isolados IBCB 360, IBCB
384 e IBCB 425 de M. anisopliae, semelhante a temperatura ótima encontrada para a
131
Discussão
quitinase secretada por Bacillus alvei (SAN-LONG et al., 2001) e diferente da
temperatura ótima de 55 ºC encontrada para a enzima de Thermomyces lanuginosus
SY2 (RUN-FANG et al., 2008). Para o isolado IBCB 167 a temperatura ótima de
atividade foi de 50ºC, igual a obtida para as quitinases C1 de O. xanthineolytica
NCIM 2839 (WAGHMARE et al., 2010), de Bacillus cereus e de Bacillus spahericus
(SAN-LONG et al., 2001), e a de Trichoderma harzianum (DEANE et al., 1998). A
temperatura ótima encontrada para o isolado IBCB 167 foi superior a temperatura
ótima encontrada para a enzima produzida por Beauveria bassiana CG432 (SASSÁ et
al., 2008) e por M. anisopliae (Pinto et al., 1997). As quitinases dos isolados IBCB
167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 apresentaram atividade a 30 ºC. A ação de
quitinases em temperaturas ambientes, como 30 ºC, é muito relevante, pois esta
temperatura é facilmente atingida no ambiente natural, onde são encontrados os
fungos entomopatogênicos. Sendo assim, ter quitinases ativas nesta temperatura
facilitará o processo de infecção do patógeno sobre o hospedeiro.
As quitinases extracelulares dos isolados estudados não foram estáveis a 70ºC,
sendo o mesmo observado no trabalho de Binod et al. (2005) para quitinase
extracelular produzida por Penicillium aculeatum NRRL 2129. Entretanto estas
quitinases foram estáveis a 30 ºC e 40 ºC. A quitinase do isolado IBCB 425 foi a mais
estável frente as diversas temperaturas testadas. No panorama geral de estabilidade
térmica a quitinase mais suscetível e com menor estabilidade térmica foi a do isolado
IBCB 360. Estes resultados se assemelham com o encontrado no trabalho de Sassa et
al. (2008) onde a quitinase produzida por Beauveria bassiana foi estável a 45 ºC.
Contudo existem três endoquitinases produzidas por Bacillus sp. MH-1 que foram
estáveis por 10 minutos a 75 ºC (SAKAI et al., 1998), diferindo do resultado
encontrado neste trabalho. Para os fungos entomopatogênicos é muito importante ter a
132
Discussão
capacidade de produzir e secretar enzimas termoestáveis em uma ampla faixa de
temperatura. Pois estes fungos estão presentes em diversos nichos que sofrem com as
intempéries climáticas como, por exemplo, a variação da temperatura durante o dia e
a noite, e a ausência de enzimas termoestáveis pode causar problemas no
desenvolvimento do fungo e problemas na infecção do hospedeiro. Os fungos
estudados neste trabalho apresentam esta capacidade.
Os valores de pH ótimo de atividade para as quitinases produzidas pelos
isolado IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 do fungo M. anisopliae foram
coincidentes com aqueles relatados na literatura para outros microrganismos. Em
Streptomyces sp. M-20 a atividade quitinásica máxima ocorreu em pH 5,0
(KYAUNG-JÁ KIMS et al., 2003), sendo o mesmo observado para as quitinases
produzidas pelos isolados IBCB 360 e IBCB 425, com excessão para a quitinase do
isolado IBCB 167, que foi pH 5,5. Já para o isolado IBCB 384 verifica - se uma faixa
de pH ótimo que vai de 4,0 a 5,5, coincidindo com a faixa de pH onde as quitinases
são ativas segundo a literatura. As quitinases do microrganismo B. bassiana (SASSA
et al., 2008) apresentaram vários valores ótimos de pH sendo eles 5,5, 6,0 e 8,5
evidenciando que este microrganismo produz isoformas diferentes de quitinase. Já a
quitinase secretada por Bacillus circunlans 4.1 (WIWAT et al., 1999) apresentou pH
ótimo de 8,0, diferindo do resultado encontrado em nosso trabalho e no estudo
realizado por Park et al. (2000) cujo o pH ótimo foi de 6,0. Waghmare et al. (2010)
verificaram que para as quitinases produzidas por O. xanthineolytica a atividade
máxima para C1 e C2 foram em pH 7,5 e 8,0, respectivamente. Entretanto, o pH
ótimo de atividade quitinásica para T. harzanium (DEANE et al., 1998) foi de 3,5.
Analisando os dados encontrados na literatura, fica evidente que as quitinases, de
forma geral, apresentam uma ampla faixa de pH em que são ativas. É interessante
133
Discussão
ressaltar que tampões diferentes apresentam forças iônicas diferentes, interferindo na
solubilização do substrato e no rearranjo do sítio catalítico da enzima. Por exemplo, o
aumento da concentração dos íons constituintes do tampão pode reduzir
significativamente a atividade das quitinases (SASSA et al., 2008).
Possivelmente, a predominância de cargas negativas na estrutura molecular das
quitinases é decisiva para a interação com regiões positivas do substrato quitina nas
condições ótimas de pH como observados por Sassa et al. (2008). Este fenômeno
pode explicar o resultado observado nesta pesquisa para as quitinases produzidas
pelos isolados de M. anisopliae.
Ainda observando o efeito do pH na atividade quitinásica, as quitinases
extracelulares dos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 foram
estáveis em diferentes valores de pH por uma hora. As quitinases dos isolados IBCB
360 e IBCB 384 foram estáveis em pH 6,0. O mesmo comportamento foi observado
para a quitinase de Bacillus amyloliquefaciens V656 (SAN-LONG et al., 2002). A
quitinase do isolado IBCB 167 manteve 60% de atividade em pH 5,5, assim como
observado por Sassa et al. (2008) para a quitinase de Beauveria bassiana também foi
estável em pH 5,5. A quitinases do isolado IBCB 384 foi completamente estável no
pH 7,0. De forma geral, a quitinase do isolado IBCB 425, foi a que se manteve mais
ativa nos pH testados. A quitinase produzida por T. lanuginosus SY2 manteve sua
atividade em uma ampla faixa de pH (3,0 a 9,0) (GUO RUN – FANG et al., 2008),
semelhante ao encontrado para a quitinase do isolado IBCB 425. É interessante
ressaltar que microrganismos que produzem quitinases com atividade e estabilidade
em uma ampla faixa de pH, podem aumentar seu potencial de infecção, visto que os
microrganismos podem entrar em contato com pH diferentes no interior do corpo do
seu hospedeiro, como, por exemplo, nas ordens Orthoptera e Dictyoptera e algumas
134
Discussão
famílias de Coleoptera que possuem a porção anterior do intestino médio ácida e a
parte posterior neutra ou levemente alcalina. Já em Hemiptera e Hymenoptera o
intestino tende a ser ácido. Porém, o conteúdo intestinal é alcalino para a ordem
Lepidoptera (TERRA & FERREIRA, 1994).
Quando o M. anisopliae entra em contato com o hospedeiro, ele é exposto a pH
diferentes, fazendo com que este fungo utilize sua capacidade de regular o pH do
meio ou ambiental. Ele realiza esta regulação, produzindo amônia para alcalinizar o
meio e proporcionar condições ótimas para atuação de suas enzimas. Entretando a
resposta deste fungo ao pH ambiental, leva a reglulação da transcrição de genes que
codifcam quitinases e proteases que são fatores de virulência importantes para este
fungo (St. Leger et al., 1998). Vários fungos filamentosos, incluindo M. anisopliae
regulam o pH ambiental, que provavelmente está relacionado ao sistema de regulação.
Segundo Maccabe et al.( 1996) e Negrete-Urtasun et al.(1997) seis genes participam
deste sistema de regulação do pH em Aspergillus spp o principal fator de transcrição
é o PacC dedo de zinco, um ativador de genes expressos em condição alcalina e um
repressor genes expressor em condições ácidas. Sendo assim as quitinases produzidas
pelos isolados e analisadas apresentam esta flexibilidade de atividade e estabilidade
frente a diferentes valores de pH, garantindo assim o seu potencial de infecção. Em
suma, as quitinases dos isolados apresentaram comportamentos bioquímicos
diferentes com relação a estabilidade térmica e a estabilidade ao pH.
Com relação a ativação ou inibição das enzimas sabe-se que historicamente que os
íons são onipresentes e desempenham importantes funções influenciando as
propriedades dos sistemas biológicos. Outro exemplo é o aumento da condutividade
da água por várias ordens de grandeza devido a presença de íons. Para as enzimas
uma pequena mudança no pH do meio onde se encontram íons gera alterações
135
Discussão
cinéticas, além de alterar a sua estrutura terciária tornando - a mais ativa ou inativa.
Ainda podem interferir na solubilidade levando a precipitação da enzima, podendo
inclusive modificar a carga elétrica global desta molécula (LEHNINGER et al.,
2011). Assim as quitinases produzidas pelos isolados de M. anisopliae apresentaram
comportamentos diferentes frente à presença de sais na reação, sendo inibidas ou
ativadas.
A ativação máxima encontrada para as quitinases dos isolados IBCB 167 e IBCB
425 foi na presença de 1mM do sal BaCl2 e MnCl2, respectivamente. Entretanto, não
foi encontrada uma ativação significativa para as quitinases dos isolados IBCB 360 e
IBCB 384, frente aos sais testados. Deve-se destacar que as quitinases dos isolados de
forma geral, não foram inibidas fortemente por β- mercaptoetanol. Todavia ocorreu
inibição da atividade quitinásica destes isolados, quando adicionou-se os sais CuSO4,
ZnSO4, Zn(No3)2, HgCl2 e Pb(C2H3O2) na reação enzimática. Sakai et al. (1998) e
Adrangi et al. (2010) verificaram a influência de íons metálicos na atividade
quitinásica de Bacillus sp. MH-1 e Massilia timonae e observaram uma ativação
enzimática na presença de Mn2+, como observado por nós. Ainda Sakai et al. (1998)
verificaram ativação enzimática na presença de CaCl2 que também foi descrita no
trabalho de Lee et al. (2007) para a quitinase de Bacillus sp. Lee et al. (2007)
relataram os íons Ba2+ e Co2+ como ativadores da quitinase. Diferindo dos autores
acima, Kim et al. (2003) observaram ativação enzimática da quitinase produzida por
Streptomyces sp. M-20 na presença de β - mercaptoetanol. Sendo assim, os íons
descritos na literatura como ativadores da quitinase apresentaram - se também como
bons ativadores para as quitinases deste trabalho.
A inibição da atividade quitinásica por Zn2+, Cu2+, Hg2+ foi relatada para a enzima
de Bacillus sp. (LEE et al., 2007). Ueno et al. (1990), Sakai et al. (1998), Kim et al.
136
Discussão
(2003) e Adrangi et al. (2010) também relataram a inibição da quitinase por Hg2+.
Novamente observou – se uma similaridade entre resultados encontrados neste
trabalho e aqueles já descritos na literatura como inibidores de quitinases. A inibição
por Hg2+ sugere a presença de grupos thiol no sítio catalítico os quais são importantes
para a atividade das enzimas, como citado no trabalho de Guimarães et al. (2009) e no
trabalho de Kim et al. (2003). A ativação observada para as quitinase do isolado
IBCB 425 em presença de β- mercaptoetanol também indica a presença de grupos
sulfidril no sítio catalítico da enzima e este resultado é reforçado quando observou –
se a inibição da atividade enzimática frente ao íon Hg2+. Já o agente quelante EDTA
exerceu influência na atividade quitinásica mostrando que os íons metálicos são
importantes para atividade enzimática.
Pensando no mecanismo de hidrólise da quitina, é extremamente coerente
encontrarmos na natureza uma multiplicidade de quitinases, que estão relacionadas
com a necessidade de produzir isoformas com atividades de quitina diacetilase, endo e
exoquitinases para hidrolisar totalmente o polímero de quitina (NAHAR et al., 2004).
Modificações pós-traducionais ocorrem particularmente, pela adição de diferentes
tipos e porcentagens de moléculas de carboidratos na cadeia polipeptídica das
quitinases (HARMAN et al., 1993). Neste contexto, os parâmetros cinéticos das
quitinases produzidas em FSS e purificadas foram analisados.
Todas as formas enzimáticas apresentaram comportamento Michaeliano. A
quitinase do isolado IBCB 360 foi a que apresentou maior afinidade pelo o substrato
4-nitrofenil-N-Acetil-β-D glucosaminideo. Já quitinase produzida por Streptomyces
sp. M-20 não hidrolizou o substrato 4-nitrofenil-N-Acetil-β-D glucosaminideo e nem
quitobiose (KYOUNG-JA et al., 2003). Pinto et al. (1997) também utilizaram o
substrato sintético p-nitrofenil-N-diacetilquitobiose, para verificar os parâmetros
137
Discussão
cinéticos da quitinase extracelular de M. anisopliae, cujo Km e Vmáx foram de 0,537
mmoL e 4,86 nmoL.mL-1min-1, respectivamente. Apesar de ser um sustrato síntetico
diferente, do utilizado neste trabalho, o valor de Km foi parecido ao encontrado para a
enzima do isolado IBCB 360. A quitinase produzida por Tenebrio molitor (TmChi)
apresentou baixa atividade para o substrato quitina coloidal e alta espificidade pelo
substrato sintético metilumbeliferil-β-N', N'-diacetil-chitobioside, com Km de 0,0014
(mM) e Kcat de 350 s. A mesma quitinase também apresentou comportamento
michaeliano, não sofrendo inibição frente ao produto final N-Acetil-glucosamina,
liberado após degradação da quitina e muitas enzimas podem ser inibidas pelos
produtos finais das reações enzimáticas (GENTA et al., 2006).
Outros trabalhos avaliaram os parâmetros cinéticos das quitinases utilizando
quitina coloidal como substrato, como foi apresentado por Guo et al. (2004 e 2008)
para as enzimas de Aeromonas schubertii e T. lanuginosus cujos os valores de Km
foram 2,9 mM e 9,56 mg mL-1. Kopparapu et al. (2012) descreveram uma quitinase
de Paecilomyces com Km de 3,6 mg mL-1, apresentando maior afinidade por quitina
coloidal do que a quitinase de T. lanuginosus. Analisando os resultados de afinidade
pelo substrato obtidos neste trabalho e confrontado com os resultados de afinidade por
substratos naturais e sintéticos, como citados acima, é evidente que a patogenicidade e
a vilurência não estão relacionadas diretamente a afinidade da enzima pelo substrato,
visto que na natureza os microrganimos estão expostos a vários fatores bióticos e
abióticos, que favorecem ou não o processo de infecção.
Depois dos estudos de caracterização bioquímica das quitinases secretadas pelos
isolados estudados, o pontencial de patogenicidade e toxicidade dos isolados IBCB
384 e IBCB 425 sobre larvas de G. mellonella, que é um inseto modelo para estudos
de patogênese, foi avaliado (MYLONAKIS, 2008). Os isolados IBCB 384 e IBCB
138
Discussão
425 foram escolhidos porque foram os que provocaram as maiores porcentagens de
mortalidade da praga D. saccharalis de acordo com Zappelini (2009).
O ensaio utilizando aplicação tópica sobre G. mellonella permitiu verificar qual
dos isolados apresentava maior potencial de atuação na fase de pré-infecção. Nesta
fase os fungos entomopatogênicos necessitam produzir enzimas que degradam a
cutícula do inseto (FANG et al., 2005 ; SHAH et al., 2005). Dentro deste contexto, o
isolado IBCB 425 de M. anisopliae provocou alta mortalidade (100%), com TMS
menor (5 dias), evidenciando o seu potencial de pré-infecção. Este resultado difere do
encontrado por Zappelini (2009), onde ele utilizou aplição tópica dos isolados IBCB
384 e IBCB 425 pulverizando a suspensão de conídios em Torre de Potter, sobre
lagartas de D. saccharalis entre o 3º e 4º instar. Neste caso o isolado IBCB 425
apresentou TMS de 10 dias e mortalidade de 62%, não sendo considerado o isolado
mais patogênico e virulento. No entanto, é evidente que o isolado IBCB 425 não foi
tão eficiente, na fase de pré-infecção sobre D. saccharalis, devido à possíveis
problemas de adptação do fungo e consequentemente de secreção do complexo
enzimático responsável pela degradação da cutícula da larva. Já para o isolado IBCB
384 não foi observado tal dificuldade, pois o TMS encontrado no trabalho de
Zappelini (2009) é muito próximo do valor encontrado por nós. A mortalidade das
larvas por micose, verificando-se a extrusão dos isolados, foi observada. Assim,
concluímos que a mortalidade das larvas realmente foi provocada pelos isolados e que
eles não apresentam dificuldades de desenvolvimento micelial no interior do inseto.
Resultado semelhante foi verificado no trabalho de Loureiro et al. (2005) aplicando os
isolados IBCB 384 e IBCB 425 sobre M. fimbriolata. Tal dificuldade foi observada
nos resultados obtidos no trabalho de Romero (2012) para isolados de B. bassiana
sobre larvas de Spodoptera littoralis, que são endofíticas.
139
Discussão
Após verificar o desempenho dos isolados na fase de pré-infecção, a técnica de
microinjeção, ou seja, a injeção de conídios ou de extratos enzimáticos brutos
produzidos pelos isolados IBCB 384 e IBCB 425, diretamente na hemocele foi
avaliada. Assim, os isolados não foram expostos a primeira barreira contra a infecção,
que é a cutícula dos insetos, favorecendo a observação do desenvolvimento da fase de
infecção propriamente dita. Esta técnica também foi utilizada nos trabalhos de Ortiz-
Urquiza et al. (2010a, 2010b), Wang et al. (2007) e Fan et al. (2012). Quando
injetados conídios dos isolados IBCB 384 e IBCB 425 em larvas de G. mellonella, o
desenvolvimento fúngico ocorreu em in vivo. Os isolados provocaram mortalidades
semelhantes e a diferença entre os valores de TMS não foi significante. No entanto a
diferença entre os valores TMS obtidos para os isolados é de aproximadamente 1 dia,
o que na prática é muito significante, quando se leva em consideração a ação
devastadora de uma praga sobre uma plantação. Baseado neste quadro, o isolado
IBCB 425 pode ser considerado mais virulento que o IBCB 384.
Os fungos entomopatogênicos sofrem influência do meio de cultivo ao qual
estão expostos. Esta influência é importante porque pode alterar o seu potencial de
virulência. A influência do meio de cultivo foi estudada por Ortiz-Urquiza et al.
(2010a, 2010b) utilizando B. bassiana e M. anisopliae. Sendo assim, se faz necessário
verificar o crescimento destes isolados in vitro e in vivo, para que se possa investigar e
comparar as produções dos fatores de virulências. Esta comparação também foi
realizada no trabalho de Ortiz-Urquiza et al. (2010a) e Funguet & Vey (2004) para B.
bassiana.
A produção dos fatores de virulências in vivo presentes no soro da larva,
revelou que o SORO-384 foi o mais tóxico por provocar a maior mortalidade,
enquanto o isolado IBCB 384 foi o mais virulento por apresentar o menor TMS,
140
Discussão
quando comparado com o isolado IBCB 425. Após injeção do soro infectado em
larvas sadias, houve melanização na cutícula e na traquéia. A melanização da cutícula
foi observada em todas as larvas, porém as larvas apresentaram intensidades
diferentes de melanização da cutícula e os tipos de melanização observados, neste
trabalho foi semelhante aos tipos de melanização descritos por Fuguet & Vey (2004),
quando larvas de G. mellonela foram infectadas com conídios injetados. Estas larvas
desenvolveram três tipos de melanização cuticular, sendo elas, A, B e C. A
melanização tipo A é a mais comum e caracterizada pela formação de pontos negros;
a melanização tipo B recebe o nome de leopardo, pois as manchas se assemelham as
pintas do leopardo (borda escura e centro claro); e a melanização tipo C é
caracterizada por grandes regiões de melanização, que cobrem a maior parte da
superfície cuticular (FUGUET & VEY, 2004). Observando a hemolinfa das larvas
infectadas pelos isolados IBCB 384 e IBCB 425 foi detectada a presença de corpos
hinfais do fungo M. anisopliae no período de 72h. Os corpos hifais encontrados neste
trabalho são semelhantes aos observados no trabalho de Zhang & Xia (2009)
utilizando M. anisopliae.
O potencial de virulência e toxicidade dos isolados, foi avaliado também in
vitro, utilizando o extrato bruto, a fração dialisa e a fração não dialisada dos isolados
IBCB 384 e IBCB 425 sobre G. mellonella utilizando a microinjeção. O extrato bruto
do IBCB 384 provocou alta mortalidade, sendo e o mesmo mais tóxico que o extrato
bruto do isolado IBCB 425, mostrando que estes isolados de M. anisopliae possuem
estratégias diferentes de infecção e virulência, pois até o momento o isolado IBCB
425 destacou – se na fase pré infecçcão.
Outro efeito observado foi a paralisia das larvas logo após ser injetado o
extrato bruto do isolado IBCB 425. Este efeito de paralisia também foi observado por
141
Discussão
Romero (2012) e Fuguet & Vey (2004) para isolados de B. bassiana sobre larvas de
G. mellonella. Para entender a toxicidade dos extratos brutos e encontrar a molécula
responsável por esta toxicidade, submetemos estes extratos a uma diálise, cujo os
resultados foram duas frações que receberam o nome de dialisado e não dialisado.
Ambas as frações causaram mortalidade das larvas de G. mellonella confirmando a
presença de moléculas tóxicas nestas frações. A fração dialisada contém moléculas
menores que 3,5 kDa. As frações dialisadas de cada isolado foram injetadas em larvas
de G. mellonella, provocando uma mortalidade de 53 a 58%, sendo a fração mais
tóxica. As frações não dialisadas apresentam moléculas maiores que 3,5 kDa de baixa
toxicidade, causando baixa mortalidade e valores de TMS maiores, quando
comparado com a fração dialisada.
Comparando os resultados encontrados nos ensaios de toxicidade para os
isolados IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae é evidente que a fração dialisada é a
mais tóxica, sendo coerente com os trabalhos de Wang et al. (2004) e Soledade et al.
(2002). Nesta fração são encontrados os metabólitos secundários como as destruxinas,
que são hexadepsipeptídeos cíclicos, composto por ácido α-hidroxi e cinco resíduos
de aminoácidos. O fungo M. anisopliae produz uma diversidade de destruxinas, sendo
elas as destruxinas A, B, C, D e E. As destruxinas desempenham diversas atividades
biológicas como inseticida e fitotóxica, além de causar paralisia tetânica nas larvas,
como observado neste trabalho. Na fase de pós - infecção foi investigado o
crescimento dos fungos e secreção de compostos tóxicos in vitro e in vivo. Sendo
assim, concluí - se que ambos os isolados foram patogênicos para G. mellonella,
porém apresentam estratégias de virulência diferentes. Os isolados de M. anisopliae
são eficientes na fase de infecção, sendo evidente que o isolado IBCB 425 possui uma
estratégia de crescimento e o isolado IBCB 384 apresenta uma estratégia tóxica. No
142
Discussão
trabalho de Kershaw et al. (1999), com isolados de M. anisopliae, também foram
demonstradas estratégias diferentes de virulências, como as que foram observadas
neste trabalho.
Considerando os resultados encontrados para os dois isolados patogênicos, ou
seja, IBCB 384 e IBCB 425 segundo Zappelini (2009) e Loureiro et al. (2005), as
quitinases de ambos, foram tolerantes a várias temperaturas e pH, facilitando a
infecção do fungo sobre o inseto. O isolado IBCB 384 pode ser considerado o mais
virulento de acordo com as características bioquímicas observadas, corroborando com
os resultados encontrados por Zappelini, (2009). Além de produzir uma molécula
altamente tóxica, cuja massa molecular é igual ou menor que 3,5 kDa, que
possivelmente pode ser um metabólito. Já o isolado IBCB 425 destacou-se na
produção de quitinases, lipases e proteases quando cultivado em FSS. Também é o
isolado que apresenta o conídio de maior comprimento e a hifa mais larga. Estas
características contribuem para o melhor desempenho deste isolado na fase da pré -
infecção. Além disso, ambos utilizam estratégias diferentes de infecção e virulência,
onde o IBCB 384 utiliza estratégia tóxica e o IBCB 425 utiliza estratégia de
crescimento.
143
Conclusão
6. CONCLUSÃO
Todos os isolados em estudo identificados como M. anisopliae var. anisopliae,
são capazes de produzir quitinases tanto intracelularmente quanto
extracelularmente em ambas as formas de cultivo, ou seja, FSbm e FSS. Embora
tenham sido caracterizados como uma mesma variedade, diferenças morfológicas
entre conídios e hifas foram observadas. O maior produtor de quitinase intracelular
é o isolado IBCB 425 e o maior produtor de quitinase extracelular é o isolado
IBCB 384. O tempo para obtenção dos maiores níveis enzimáticos variou de 72 h a
216 h. Considerando a FSS, o isolado IBCB 360 é o maior produtor de quitinases,
porém o isolado IBCB 425 destaca - se também na produção de lipases e proteases.
Com relação a o secretoma, a maior secreção proteica é obtida na presença de
indutor (crisálida), com destaque para o isolado IBCB 425. A maioria das proteínas
presentes nos secretomas dos isolados IBCB 167 e IBCB 384, foram identificadas,
sendo apenas 28% comuns entre os isolados. Entre elas está a enzima endo-N-
acetyl-β-D-glucosaminidase, enzima pertencente ao complexo quitinolítico e
relacionada com mecanismos de patogenicidade.
Aparentemente todos os isolados estudados possuem diferentes isoformas de
quitinases. A temperatura ótima aparente para as quitinases extracelulares
produzidas pelos isolados variou de 50ºC a 60ºC e o pH ótimo de 4,0 a 5,5. Todas
as quitinases são estáveis a 30ºC e 40ºC, sendo a quitinase do IBCB 425 a mais
estável. A quitinase do isolado IBCB 384 é mais estável frente aos pH testados. A
ativação máxima para as quitinases dos isolados IBCB 167 e IBCB 425, é na
presença de BaCl2 e MnCl2, respectivamente, enquanto que as quitinases dos
isolados IBCB 360 e IBCB 384 não são ativadas. As quitinases estudadas são
144
Conclusão
tolerantes ao β- mercaptoetanol e inibidas por CuSO4, ZnSO4, Zn(No3)2, HgCl2 e
Pb(C2H3O2). Apresentaram ainda comportamento Michaeliano, sendo a maior
afinidade pelo substrato sintético 4-nitrofenil-N-Acetil-β-D glucosaminideo (NP-
GlcNAc) observada para a quitinase do isolado IBCB 360.
O isolado IBCB 425 apresenta o melhor desempenho na fase de pré-infecção e
o isolado IBCB 384 apresenta o melhor desempenho na de fase pós – infecção,
sendo o mais virulento.
Os resultados obtidos para a a carcterização bioquímica da enzima quitinase
produzida pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 do fungo
entomopatogênico M. anisopliae var. anisopliae, cultivados na presença de
crisálida, são relevantes e ressalta as diferenças entre eles. A patogenicidade e
virulência devem ser estudadas caso a caso, pois muitos fatores interferem no
processo de infecção e na relação patógeno/hospedeiro. Os isolados IBCB 167,
IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 do fungo entomopatogênico M. anisopliae
apresentam potencial de patogenicidade que deve ser investigado sobre outros
hospedeiros.
145
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Anexo
ANEXO ARTIGO CIÊNTÍFICO:
Optimization of the Chitinase Production by
Different Metarhizium anisopliae Strains under
Solid-State Fermentation with Silkworm Chrysalis
as Substrate Using CCRD
171
Advances in Microbiology, 2012, 2, 268-276
doi:10.4236/aim.2012.23032 Published Online September 2012 (http://www.SciRP.org/journal/aim)
Optimization of the Chitinase Production by Different

Metarhizium anisopliae Strains under Solid-State
Fermentation with Silkworm Chrysalis as Substrate
Using CCRD
Cynthia Barbosa Rustiguel, João Atílio Jorge, Luis Henrique Souza Guimarães*
Department of Biology, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazil
Email: *[email protected]
Received April 20, 2012; revised May 30, 2012; accepted June 7, 2012
ABSTRACT
Entomopathogenic fungi, such as Metarhizium anisopliae, are able to control various insect pests. These fungi attack
the integument of the host using an enzymatic complex. Among the enzymes found in this complex, chitinase is an im-
portant component. However, the relation between the chitinase production and the virulence from different M. ani-
sopliae strains has not been analyzed. In this manuscript it is presented the chitinase production by four M. anisopliae
strains with different potential of virulence in Solid-State Fermentation using silkworm chrysalis as substrate. The
higher chitinase level was obtained with the strain IBCB 360 (7.14 U/g of substrate) with potential virulence of 68% on
Diatrea saccharalis. The enzyme production was optimized for all strains using a factorial planning (CCRD) consider-
ing the cultivation time and medium humidity as independent variables. The maximal production of chitinase was ob-
tained at a range from 8 to 12-days old cultures and from 45% to 62% of moisture according to the surface response
plot, with high R2 value. The enzyme production by the strain IBCB 167 was increased two-folds under optimized con-
ditions, while for the strains IBCB 360 and 425 the chitinase production was increased four-folds and nine-folds for the
strain IBCB 384.
Keywords: Entomopathogenic Fungus; Metarhizium anisopliae; Chitinase; Solid-State Fermentation
1. Introduction [2]. Some studies have discussed the relation between the
production of enzymes with pathogenicity and virulence
The entomopathogenic fungi are pathogens with a broad-
[3-5]. The entomopathogenic fungus Metarhizium aniso-
spectrum of action which are able to attack insects that
pliae is a deuteromycete from Monoliaceae family
live in different ecological niches in different stages of
widely distributed in the nature that can be easily found
development. Most of these species are specialized in
in the soil. This fungus has been studied due to its ability
penetrating the tegument [1]. The interaction between
to control insect pests [1,6,7]. Zappelini (2009) [8] analyz-
pathogen and host is influenced by different factors such
ed different strains of the entomopathogenic fungi Beau-
as enzymes production, environment temperature and
veria bassiana and M. anisopliae to verify their potential
humidity, light and ultraviolet radiation, as well as by
of infection and mortality on Diatrea saccharalis and it
nutritional conditions and host susceptibility. Thus, the
was observed that the virulence from each one of the 27
complete cycle of infection involves the sequential stages
M. anisopliae strains analyzed was variable. The strain
of adhesion, germination, appressorium formation, for-
IBCB 167, for example, was able to kill around 55% of
mation of staple penetration, penetration, colonization
D. saccharalis while the strains IBCB 360, IBCB384 and
and reproduction of the pathogen in the insect [1]. En-
IBCB 425 showed a mortality power of 68% - 90%.
zymes play an important role during the penetration of
These different values can be attributed to the enzymatic
the fungus in the host, especially during adhesion and
complex associated to the virulence, including chitinase.
germination which occurs at the germ tube formation,
Chitinases (EC 3.2.1.14) are enzymes widely spread in
releasing enzymes that degrade the cuticle of the insect
nature that can be found in a great diversity of organisms,
as, for example, proteases and chitinases, among others
with special attention to the filamentous fungi. Chitinase
*
Corresponding author. catalyzes the hydrolysis of chitin, an insoluble linear
Copyright © 2012 SciRes. AiM

C. B. RUSTIGUEL ET AL. 269
molecule constituted by N-acetyl glucosamine units

linked by β-1, 4 (GlcNAc) linking [9] found in insect
cuticle. The complete hydrolysis of chitin occurs through
a chitinolytic system which acts synergistically and con-
secutively [10]. Chitinases are divided into two main
classes, the endochitinases and the exochitinases. The
endochitinases cleave chitin at random sites within the
polymer, releasing chito-oligosaccharides (chitotetraose,
chitotriose). The exochitinases cleave chitin from its
non-reducing end, releasing dimers (GlcNAc)2 [11,12].
These enzymes have multiple biological roles as, for (a) (b)
example, in the infection of insects by entomopathogenic
Figure 1. Pictures from intact chrysalis (a) and triturated
fungi. According to Boldo et al. (2009) [5], M. ani-
chrysalis (b) from silkworm used as substrate for chitinase
sopliae produces different chitinases related to the infec-
production by different strains from M. anisopliae under
tion process on the host. However, the relation between
SSF.
the level of chitinase production by different strains of M.
anisopliae and their virulence has not been analyzed.
Hence, this manuscript presents the production of chiti- h and harvested by gauze using Whatman paper No.1.
nase by the strains IBCB 167, IBCB 360, IBCB384 and The free cell filtrate, identified as extracellular crude
IBCB 425 from M. anisopliae with different virulence extract, was dialyzed against distilled water at 4˚C over-
potential and the optimization of enzyme production by night and used for chitinase activity determination.
factorial design (CCRD).
2.3. Determination of the Chitinase Activity
2. Material and Methods The determination of the chitinase activity was accomp-
2.1. Microorganisms lished using 1 mM of the synthetic substrate 4-Nitro-
phenyl N-acetyl-β-D glucosaminide (Sigma®) in 100 mM
Four different strains (IBCB 167, 360, 384 and 425) from sodium acetate buffer, pH 5.0. The reaction was per-
M. anisopliae classified according to their virulence po- formed using 200 μL of the substrate solution and 200
tential and deposited in the Collection of Entomo- μL of the enzymatic sample. After incubation at 60˚C,
pathogenic Microorganisms “Oldemar Cardim Abreu” the reaction was stopped at different time intervals by
from the Laboratory of Biological Control, Biological adding 1 mL of 1 M NaOH. All experiments were per-
Institute of Campinas, São Paulo, Brazil were used. The formed in triplicate. The p-nitrophenolate released was
strains were maintained on PDA (potato dextrose agar) quantified at λ = 405 nm in a spectrophotometer. One
slants and stored at 4˚C in refrigerator. Spores from 15 unit of enzyme activity (U) was defined as the amount of
days-old cultures were used to obtain new cultures, enzyme required to hydrolyze 1 µmol of substrate per
which were initially maintained at 25˚C for 7 days and minute under the assay conditions.
then stored at 4˚C.
2.4. Optimization of the Enzyme Production
2.2. Obtainment of Cultures under Solid-State
Fermentation (SSF) and Crude Extract The optimization of enzyme production for all M. ani-
sopliae strains under SSF was carried out using a facto-
The cultures under SSF were obtained by inoculating of rial design (22) (CCRD), where the independent variables
1 mL of a spore suspension (105 spores/mL) on 4 g of were the time of growth (X) and humidity (Y). These
crushed dry chrysalis from silkworm (BRATAC S.A., parameters were chosen because the microbial growth
Brazil) (Figure 1) as substrate/carbon source moistened and, consequently, the enzyme production are drastically
with tap water, yeast extract solution (1% m/V), SR salt influenced by the culture conditions, including water
solution [20×] [13] or Khanna salt solution [14], pre- activity and cultivation time, among others. The tem-
viously autoclaved at 120˚C, 1.5 atm for 30 minutes. The perature was maintained at 26˚C since the influence of
cultures were maintained in a stove at 26˚C for different this variable is a well characterized parameter for M.
periods (96 - 312 hours) with relative humidity around anisopliae growth. Three repetitions were performed at
76% monitored by a thermo hygrometer. the central points (0) and two outer points (–1.41, +1.41)
After incubation, the cultures were added with 50 mL were considered, totalizing 11 trials (Table 1). The re-
of cold distilled water previously autoclaved in the same sults were subjected to analysis of variance (ANOVA)
conditions cited above, maintained under agitation for 1 with p values of 0.05 and 0.1 using the software Statis-

270 C. B. RUSTIGUEL ET AL.
tica 8.0 (Stat Soft). Values lower than the p values fixed (1.3:1 m/V). The solution of yeast extract has soluble
were considered statistically significant. The Pareto proteins, amino acids, biotin and it is rich in B complex
charts and surface response graphs were obtained using vitamins [15]. Amino acids are absorbed and utilized in
the same software. The equations that describe de model cellular metabolism, while the vitamins are important as
for the influence of each independent variable on the growth promoter and as co-enzymes [16]. These com-
enzymatic production were obtained using the same pounds present in the yeast extract solution as well as the
software and validated by the experimental results using composition of Khanna salt solution are able to supply
the best conditions of cultivation time (9 days-old cul- some nutritional necessity that can not be efficiently sup-
tures) and humidity (48%). plied by the other solutions analyzed. In addition, the
enzymatic production by IBCB 167 strain in the best
3. Results and Discussion condition was higher than that observed for the other
3.1. Influence of Salt Solution on the Enzyme strains also in the best conditions, regarding 5.3-folds
Production in SSF higher if compared to the IBCB 384 strain.
The availability of the nutrients and salts is an important 3.2. Optimization of Enzyme Production by
factor to the growth of microorganisms and, conse- CCRD
quently to the enzyme production. In Table 2, the influ-
ence of different salt solutions (tap water, yeast extract The experimental design is an important tool to analyze
solution, SR and Khanna salt solutions) on chitinase the enzyme production under different culture conditions,
production under SSF by M. anisopliae strains can be such as SSF, allowing to study the interaction of the in-
observed. Higher levels of chitinase were obtained when dependent variables. Bhanu et al. (2008) [17] used the
the substrate silkworm chrysalis was moistened with factorial design to evaluate the effect of pH, yeast extract
yeast extract (1%) at the ratio 1.3:1 (m/V) for the strains and mixtures of carbon sources on the production of co-
IBCB 167, 360 and 425, differing than that observed for nidia by M. anisopliae. Patel et al. (2007) [18] used a
the strain IBCB 384 with best enzyme production when Plackett-Burman with eight independent variables for
the substrate was moistened with Khanna salt solution chitinase production by Paenibacillus sabina JD2. The
influence of other parameters can also be evaluated as for
Table 1. Encoded and real values for both independent example the cultivation period and the humidity in SSF.
variables time of growth and medium humidity used for These parameters are determinant for fungal develop-
factorial design (CCRD) to evaluate the chitinase produc- ment and, consequently, for the enzyme production.
tion by four strains of M. anisopliae under SSF using silk- There is an optimal range of water activity for microbial
worm chrysalis as substrate.
growth that should be analyzed for each species. Ac-
Encoded values –1.41 –1.0 0 +1.0 +1.41 cording to Table 3, the influence of the independent
variables growth’ time and medium humidity on chiti-
Time of growth (days) 4 5 9 12 13
nase production by all four strains of M. anisopliae was
values
Real
Medium humidity (%) 23 30 48 65 72 analyzed using a 2nd-order planning. Both variables

k 1/4 showed a positive effect on the production of extracellu-
The encoded axial points were calculated using (2 ) , where k is the num-
ber of independent variables in the study. lar chitinase for all strains (IBCB 167, 360, 384 and 425),
regarding an increase in the enzymatic levels. The Pareto
Table 2. Influence of different salt solutions, tap water and chart for the enzyme production by the strain IBCB 167
solution of yeast extract in the production of chitinases by shows that the linear variable time of growth has a posi-
different isolates of the fungus M. anisopliae in SSF. tive effect on the enzyme production, but very long pe-
Extracellular chitinase activity (U/g substrate)
riods of time already have a negative effect. The linear
variable moisture shows that the addition of tap water is
Solution 167 360 384 425 favorable for chitinase production, but too much water
Tap water 0.73 ± 0.01 0.87 ± 0.01 0.35 ± 0.01 1.09 ± 0.01 turns the production into negative. The interaction be-
tween these variables was not significant (Figure 2(a)).
Yeast extract
solution
2.42 ± 0.05 1.76 ± 0.03 0.30 ± 0.01 1.33 ± 0.01 The CCRD performed for each strain was statistically
significant with the F-value calculated higher than the
SR salt
solution
0.63 ± 0.01 0.71 ± 0.01 0.20 ± 0.01 0.84 ± 0.01 F-value tabulated. The coefficient of determination (R2),
that explains the proportion of variation related to the
Khanna salt
solution
0.62 ± 0.01 0.72 ± 0.01 0.46 ± 0.01 0.85 ± 0.00 total variation of responses, obtained with the CCRD for
each strain was close to 1. The R2 obtained for the strain
The cultures were kept at 26˚C with relative humidity of around 76% for a
period of 168 hours. IBCB 167 was 0.87 (Table 4), with p value fixed at 0.1,

what allows the obtainment of the response surface plot chart (Figure 3(a)) shows that the linear variable time of
(Figure 2(b)) and the equation that describes the model growth has a positive effect on the production of chiti-
(Equation 1), where Z is the enzyme activity (U/g of nase, but a very long time has a negative effect as
substrate), x is the variable time of growth and y is the showed by the quadratic interaction. In addition, the lin-
variable humidity. ear variable moisture shows that the addition of tap water
is favorable for chitinase production, but the excess of
Z  5.36  1.63x  1.34x 2  1.09y  1.88y 2 (1)
water becomes unfavorable. The interaction between
2
Considering the strain IBCB 360, the R value was both variables had a negative effect. The F-value calcu-
0.89 with p-value fixed at 0.1, and all variables (linear lated was four-times higher than the F-value tabulated,
and quadratic mode) as well as the interaction between allowing the obtainment of the response surface plot
them were significant (Table 5). The respective Pareto (Figure 3(b)) and the equation that describes the model
Table 3. Total extracellular chitinase activity produced by isolates 360, 384 and 425 M. anisopliae cultured in SSF through the
CCRD.
Coded values Real values Chitinase activity (U/g substrate)
Treatments Time growth X Humidity Y Time growth Humidity % 167 360 384 425
1 –1.00 –1.00 5 30 0.00 0.00 0.00 0.04
2 1.00 –1.00 12 30 1.27 7.36 1.63 1.45
3 –1.00 1.00 5 65 1.14 3.90 0.72 4.26
4 1.00 1.00 12 65 3.49 4.68 2.81 6.27
5 0.00 0.00 9 48 5.38 6.18 4.60 6.38
6 0.00 0.00 9 48 5.10 7.23 3.63 6.02
7 0.00 0.00 9 48 5.59 6.96 4.51 5.84
8 –1.41 0.00 4 48 0.05 0.66 0.43 1.50
9 1.41 0.00 13 48 6.70 6.12 2.18 4.50
10 0.00 –1.41 9 23 0.40 0.33 0.44 0.55
11 0.00 1.41 9 72 4.17 6.98 1.29 3.29
(1)grow th(L)
humidity(Q)
grow th(Q)
(2)humidity(L)
1Lby2L
p= 0.1
Standardized effect estimate (absolute value)
(a) (b)
Figure 2. Pareto chart (a) and response surface plot (b) of the factorial design for the influence of the independent variable
time of growth and humidity on chitinase production by M. anisopliae IBCB 167 under SSF using silkworm chrysalis as sub-
strate.

Table 4. Analysis of variance (ANOVA) for chitinase pro- Table 5. Analysis of variance (ANOVA) for chitinase pro-
duction isolated 167 M. anisopliae grown in SSF. duction isolated 360 M. anisopliae grown in SSF.
Source for Sum of Degrees of Mean F Source for Sum of Degrees of Mean F
Variation Square Freedom Square Calculated Variation Square Freedom Square Calculated
Regression 54.59 3.00 18.19 15.15 Regression 76.50 4.00 19.13 12.10
Residual 8.39 7.00 1.20 Residual 9.48179 6.00 1.58
Total 62.99 10.00 Total 85.98456 10.00

2
Regression coefficient: R = 0.87; Ftab 0.90,3;7 = 3.07. Regression coefficient: R = 0.89; Ftab 0.90,3;7 = 3.18.
(1)grow th(L) 4.07
grow th(Q)
- 2.73
(2)humidity(L) 2.72
humidity(Q) - 2.50
1Lby2L -2.39
p= 0.1
Standardized ef f ect estimate (absolute v alue)
(a) (b)
Figure 3. Pareto chart (a) and response surface plot (b) of the factorial design for the influence of the independent variable
time of growth and humidity on chitinase production by M. anisopliae IBCB 360 under SSF using silkworm chrysalis as sub-
strate.
(Equation (2)), where Z is the enzyme activity (U/g of Z  4.25  0.78x  1.42x 2  0.39y  1.65y 2  0.12xy (3)
substrate), x is the variable growth time and y is the
variable humidity. According to Table 7, the R2 value was 0.93 for the
planning using the strain IBCB 425. The linear and
Z  6.79  1.98x  1.59x 2  1.33y  1.45y 2  1.64xy (2) quadratic effects for both independent variables were
The R2 value obtained for the strain IBCB 384 was statistically significant with p-value fixed at 0.05, but not
0.97, with p-value fixed at 0.1 (Table 6). The influence for the interaction effect (Figure 5(a)). The linear vari-
of all variables (linear and quadratic mode) was signifi- able time of growth had a positive effect on the produc-
cant. The same can not be observed for the interaction tion of chitinase, but long period has a negative effect as
between both variables. According to the Pareto chart shown by the quadratic effect. The analysis of the effect
(Figure 4(a)), the increase of the linear variable time of of the moisture showed that the addition of tap water was
growth has a positive effect on the chitinase production, favorable for chitinase production, but at high humidity
but a very long period lead to a negative effect. The lin- environment the enzymatic production is reduced (Fig-
ear variable humidity showed that the addition of tap ure 5(a)). The F-value calculated was 9 times higher
water is favorable for the enzyme production, but when than the F-tabulated allowing the obtainment of the re-
the humidity is excessive the production decreases. The sponse surface plot (Figure 4(b)) and of the adjusted
F-value calculated was 47.55 if compared to the F-value equation that describes the model (Equation (4)), where
tabulated of 3.62, what allows the obtainment of the re- Z is the enzyme activity (U/g of substrate), x is the vari-
sponse surface graph (Figure 4(b)) and the equation that able growth time and y is the variable humidity.
describes the model (Equation (3)), where Z is the en- Z  6.07  0.96x  1.40x 2  1.62y  1.95y 2 (4)
zyme activity (U/g of substrate), x is the variable growth
time and y is the variable humidity. The higher level of extracellular chitinase was ob-

Table 6. Analysis of variance (ANOVA) for chitinase pro- Table 7. Analysis of variance (ANOVA) for chitinase pro-
duction isolated 384 M. anisopliae grown in SSF. duction isolated 425 M. anisopliae grown in SSF.
Source for Sum of Degrees of Mean F Source for Sum of Degrees of Mean F
Variation Square Freedom Square Calculated Variation Square Freedom Square Calculated
Regression 26.76 3.00 8.92 47.55 Regression 53.77 3.00 17.92 29.34
Residual 0.93803 5.00 0.19 Residual 4.27600 7.00 0.61
Total 27.69867 10.00 Total 58.04445 10.00
Regression coefficient: R2 = 0.97; Ftab 0.90,3;5 = 3.62. Regression coefficient: R2 = 0.93; Ftab 0.95,3;7 = 3.07.
humidity(Q)
-9.00 humidity(Q) 4.07
growth(Q) -7.78 (2)humidity(L) 4.99
(1)growth(L)
5.01 growth(Q) -3.63
(2)humidity(L)
2.54 (1)growth(L) 2.96
1Lby2L 0.54 1Lby2L 0.33
p= 0.1 p= 0.05
Standardized effect estimate (absolute value) Standardized effect estimate (absolute value)
(a) (a)
(b)
Figure 4. Pareto chart (a) and response surface plot (b) of (b)
the factorial design for the influence of the independent Figure 5. Pareto chart (a) and response surface plot (b) of
variable time of growth and humidity on chitinase produc- the factorial design for the influence of the independent
tion by M. anisopliae IBCB 384 under SSF using silkworm variable time of growth and humidity on chitinase produc-
chrysalis as substrate. tion by M. anisopliae IBCB 425 under SSF using silkworm
chrysalis as substrate.
tained with the strain IBCB 360 (7.23 U/g of substrate)
with moisture ratio from 45% to 62% and incubation peri- - 65% of water under SSF using shrimp shellfish as sub-
ods of 8 to 12-days using silkworm chrysalis as substrate strate [19]. The optimization process of chitinase produc-
according to the analysis of the surface response plot. tion using CCRD allowed an increase in chitinase pro-
This same ratio for both variables was also observed for duction by all isolates if compared to the production
the other strains analyzed. Similarly, the chitinase pro- showed in Table 3. The enzyme production by the strain
duction by Aspergillus sp. S1-13 was increased with 58% IBCB 167 was increased two-times under optimized

conditions, while for the strains IBCB 360 and 425 the ruvianus was demonstrated by Boldo et al. (2009) [5].
chitinase production was increased four-times and nine- Mustafa & Kaur (2009) [28] also evaluated the produc-
times for the strain IBCB 384. Despite the good enzyme tion of extracellular enzymes from 12 strains of M. ani-
production with high humidity, M. anisopliae strains sopliae, observing a wide variation in the production of
were able to produce chitinases in dried conditions as extracellular enzymes. The extracellular lipase produced
well. This flexibility demonstrated by all strains is an by M. anisopliae also participates in the process of infec-
important factor that should be considered, since the tion [29]. The cultivation of M. anisopliae under FSbm
presence of water in the environment is unstable. Chiti- using cuticles of Dysdercus peruvianus, Boophilus mi-
nase production by the strain IBCB 360 under optimized croplus and Anticarsia gemmatalis as carbon sources
conditions was two times higher than that observed for showed differences in the secretion of total proteins,
the production by Trichoderma harzianum (3.14 U/g of chitinases and proteases [4]. These differences in the
substrate) under SSF using a mixture of chitin and wheat enzymes secretion are important as virulence factor di-
bran as substrate [20]. In addition, this is the first report rectly related with the potential of the fungus M. ani-
that shows the possibility to use chrysalis, a biological sopliae to recognize the structure of the cuticle of their
residue of the textile industry that is discarded into the host and to secrete the correct enzymatic pool. According
environment, as substrate for chitinase production by to Freimoser et al. (2003) [30], M. anisopliae can encode
different strains of M. anisopliae under SSF. different chitinase isoforms and other proteins as func-
All equations obtained were validated performing ex- tion of the material used as substrate.
periments using 9 day-old cultures and humidity adjusted The four M. anisopliae strains (IBCB 167, 360, 384
for 48%. Under these conditions the enzymatic activity and 425) studied have been recognized according to their
values experimentally obtained were 5.20, 7.07, 4.60 and potential to control the pest Diatraea saccharalis pro-
6.08 U/ g of substrate for the strains IBCB 167, 360, 384 moting the death of 55%, 68%, 90% and 82%, respect-
and 425, respectively, which are in agreement with the tively, of the insect [8]. However, the chitinase produc-
values obtained using the equations (Equation (1)-(4)) of tion by these strains had not been analyzed until this
5.36, 6.80, 4.25 and 6.07 U/g of substrate, respectively. moment. The chitinases produced by these strains can be
There are many works which demonstrate that the en- considered an important virulence factor. We found that
zymatic production using SSF is higher than those ob- the best producer of chitinase is the strain IBCB 360,
tained using Submerged Fermentation. The conditions what is not coincident with the best percentage of control
observed in SSF is much closer to the conditions found found to D. saccharalis. The strain IBCB 425 was the
in nature by the fungus. The chitinase production in both second best chitinase producer and was able to control
fermentation conditions has been reported for M. ani- 90% of the pest D. saccharalis. The strain IBCB 167 was
sopliae [17,21]. Usually, the conditions of the SSF are the third chitinase producer and did not show a good
simple and the substrate used has the necessary nutrients percentage of D. saccharalis control. Interestingly, the
for the growth of microorganism. The destination of the strain IBCB 384 was the lowest chitinase producer, but it
biological residues is a preoccupation around the world. was able to control 82% of the pest D. saccharalis. This
These residues, such as chrysalis can be used as alterna- is the first work that relates the production of extracellu-
tive substrates to produce enzymes, adding aggregate lar chitinase from these strains to understand the poten-
value to this organic residue and minimizing the negative tial capacity to control pests. It is important to highlight
impact in the environment. On the other hand, the use of that the potential of virulence of an entomopathogenic
low cost substrates has a significant advantage under fungus depends on different factors and not only of the
economic view, reducing the production costs in the in- chitinase production, what justifies the differences be-
dustry. Many works showing chitinase production have tween the chitinase production by each strain and its ca-
used colloidal chitin or crab and shrimp shell powder pacity to control D. saccharalis. These strains are able to
[22-25] as the main substrate/carbon source. Chitinase produce other virulence factors that were not quantified
production using arthropods cuticle was also demon- in this study. In addition, the use of chrysalis as substrate
strated by Da Silva et al. (2005) [4]. must induce the expression of other genes differently
Chitinase, among other enzymes, from entomophato- from that observed for the control of D. saccharalis.
genic fungi is related to pathogenicity and virulence. Differences in gene expression of M. anisopliae grown
Virulence is defined as the capacity degree that the mi- on cuticle or hemolymph from its host have been ob-
croorganisms have to cause disease [26]. The virulence served [31]. The results obtained are interesting and in-
of fungal strains over different arthropods is variable and dicate that chitinases produced by the strains IBCB 167,
it is related to the production of enzymes and other viru- 360, 384 and 425 of the fungus M. anisopliae on chrysa-
lence factors [27]. The production of endochitinase CH2 lis can have different degrees of participation in the in-
by M. anisopliae as a virulence factor on Dysdercuspe- fection process.

4. Conclusion Dissertation, Biological Institute, Campinas, São Paulo,

2009.
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CCRD, the strain IBCB 360 was the best chitinase pro- bial Technology, Vol. 26, No. 7, 2000, pp. 473-483.
doi:10.1016/S0141-0229(00)00134-4
ducer although this strain is not the best controller of D.
saccharalis, indicating that other virulence factors are [11] L. Duo-Chuan, “Review of Fungal Chitinases,” Mycopa-
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doi:10.1007/s11046-006-0024-y
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manuscript is part of the CBR Doctoral (Comparative
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Biology Post-Graduate Program, FFCLRP, USP). We chia and M. L. T. M. Polizeli, “Purification and Properties
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

Comparação das propriedades bioquímicas das quitinases

produzidas por diferentes isolados de Metarhizium anisopliae

Cynthia Barbosa Rustiguel

Tese apresentada à Faculdade de Filosofia,

Comparação das propriedades bioquímicas das quitinases

produzidas por diferentes isolados de Metarhizium anisopliae

Cynthia Barbosa Rustiguel

Tese apresentada à Faculdade de Filosofia,

Rustiguel, Cynthia Barbosa

Comparação das propriedades bioquímicas das quitinases produzidas

Ribeirão Preto, 2014

Aos meus Pais, Wanderley Rustiguel e Laúren Ap.

Barbosa Rustiguel (in memorian), por estarem sempre

comigo, pelo apoio, amor, carinho, amizade.

A minha avó Therezinha (in memorian) e meu Irmão

Wanderley Sammer pelo amor e carinho.

Ao Luís Fernando. A. de Sousa pelo amor e dedicação.

À Deus e todas as energias positivas do universo por

estar sempre ao meu lado, guiando meus passos.

Ao orientador, Professor Luis Henrique, por acreditar

em mim, pelo apoio, e pelo conhecimento transmitido. Muito

Aos professores João Atílio Jorge, Maria de Lourdes T. M.

Polizeli, Héctor Francisco Terenzi e Arthur Henrique

Cavalcanti de Oliveira por todo o apoio e amizade. Muito

Ao Professor José Cesar Rosa e Helen, pelo auxilio e

conhecimento transmitido. Muito obrigada!

Ao pesquisador e amigo José Eduardo pelo incentivo e

por ajudar nos momentos necessários. Muito obrigada!

Ao orientador, Professor Enrique Quesada Moraga, por

me receber com muito carinho e atenção em seu laboratório,

por me auxiliar e transmitir seus conhecimentos. Muito

Também agradeço muito a todos colegas do laboratório

de entomologia - Espanha pelo carinho, paciência e bons

momentos. ¡Muchas gracias!

tempo de desenvolvimento deste trabalho, companheiros,

professores e conselheiros. Em especial Josana e Zé.

Aos técnicos Maurício, Ricardo e Mariana pelo auxílio

A Vera e Renata secretárias da Pós - graduação da Biologia

Comparada pela disponibilidade e atenção.

À Universidad de Córdova Espanha, local onde

desenvolvi parte deste.

À Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão

Preto, local onde foi desenvolvido este trabalho.

Aos professores da FFCL de Ituverava, pelos

ensinamentos e incentivos. Especialmente ao Professor

Hertz Figueiredo dos Santos por me incentivar desde a

Ao Luís Fernando A. de Sousa, pela paciência, além de

estar sempre ao meu lado me apoiando.

As minhas amigas de infância, adolescência e todos os

amigos que fiz durante minha caminhada, agradeço pelo

Thaís e Gabriela obrigada pelo apoio.

Aos amigos Doralva, Maria, Luís Miguel, Juliana Zechi,

Luís Andrés, Jonathan, Gloria, Fakhri, Alexis, Luz Marina,

José Maria e Nestor por me acolher e cuidar de mim.

¡Muchas gracias, los quiero mucho!

À Simone por transmitir paixão pela pesquisa e pelos

conselhos. Muito Obrigada!

À Marita por todas as palavras generosas e conselhos!