DISSERTAÇÃO Karen Vitor Carvalho
DISSERTAÇÃO Karen Vitor Carvalho
DISSERTAÇÃO Karen Vitor Carvalho
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE
NANOEMULSÕES COM EXTRATO ETANÓLICO BRUTO
DAS FOLHAS DE Melaleuca leucadendron E CLORIDRATO
DE PILOCARPINA PARA O USO POTENCIAL COMO
RADIOPROTETOR TÓPICO
OURO PRETO – MG
2014
KAREN VITOR CARVALHO
DESENVOLVIMENTO E AVALIAÇÃO DE
NANOEMULSÕES COM EXTRATO ETANÓLICO BRUTO
DAS FOLHAS DE Melaleuca leucadendron E CLORIDRATO
DE PILOCARPINA PARA O USO POTENCIAL COMO
RADIOPROTETOR TÓPICO
OURO PRETO – MG
2014
FICHA CATALOGRÁFICA
CDU: 615.849
Catalogação: www.sisbin.ufop.br
“Eu me sinto como uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me
em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras,
enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos.”
Isaac Newton
Aos meus pais,
meus maiores exemplos e minha
maior fonte de energia e coragem
À Deus por estar comigo a cada instante! Obrigada por cuidar de mim, da minha família
e dos meus amigos, permitindo que encontremos apoio uns nos outros!
Aos meus pais, ao Ritchelly e à vó Geralda, por serem a minha família, o meu porto
seguro! Obrigada pelo amor, pela dedicação e por acreditarem em mim mesmo quando
eu duvidei!
Aos meus demais familiares, pelos bons conselhos, palavras de incentivo e por cada
pequeno gesto de afeto e cuidado! Em especial ao tio Hariph, à tia Zenaidia, à tia
Elisama e suas respectivas famílias, por estarem sempre presentes!
Aos amigos que me receberam no mestrado, Liliam, Zabelê, Shiara, Diego, Thais e
Fred, por me acolherem com os corações abertos! Obrigada pelo cuidado, pelas dicas,
pelas alegrias, enfim, pelo companheirismo que fez de vocês tão especiais para mim!
Aos amigos que vieram com o tempo, em especial Thales, Patrícia e Quênia, por
tornarem o meu dia-a-dia muito mais agradável! Obrigada por todo apoio, conversas e
descontrações!
Ao Gustavo e à Marina, por sua imensa dedicação e disponibilidade! Obrigada por toda
a boa vontade, abrindo mão de finais de semana e feriados para me ajudar! Sou muito
grata pela amizade que construímos e por me fazerem acreditar que era possível
concluir os experimentos!
Aos amigos de Sericita, que eu trago sempre na bagagem, por serem parte de mais essa
conquista! Obrigada por todo amor e torcida dedicados a mim!
À gloriosa Republica Tcheca, por ser uma segunda casa para mim! Obrigada Ricardo,
por me levar até eles! Obrigada moradores, ex-alunos e agregados, por serem amigos
admiráveis, que o convívio transformou em família!
Ao professor Gustavo, meu co-orientador, por sua assistência! Obrigada pelas sugestões
enriquecedoras que fez!
À professora Sandra, por sua colaboração! Obrigada por aceitar essa parceria, me
ensinar sobre uma área nova e me disponibilizar o Gustavo e a Marina!
Aos professores Milton e Daniel por aceitarem participar da banca e contribuir para o
enriquecimento desse estudo! Obrigada pela prontidão!
Aos funcionários do Cipharma, em especial à Mirella, Léo, Paty, Ramon e Jhon, por
sua disponibilidade e boa vontade! Obrigada pelo apoio e convívio!
Ao Josino e à Renata Guerra, por todo esclarecimento e ajuda que foram prestados!
Obrigada pela disposição!
À ilustre Escola de Farmácia, por ter a honra de fazer parte da sua história!
RESUMO................................................................................................................... i
ABSTRACT............................................................................................................... ii
LISTA DE FIGURAS............................................................................................... iii
LISTA DE TABELAS.............................................................................................. v
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS............................................................. vii
1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 1
2. REVISÃO DA LITERATURA............................................................................ 4
2.1. O câncer............................................................................................................... 5
2.2. Radioterapia......................................................................................................... 6
2.2.1.Radiodermatites................................................................................................. 7
2.3. Radioprotetores.................................................................................................... 9
2.3.1. Atividade antioxidante...................................................................................... 10
2.3.1.1. Método de redução do radical DPPH............................................................ 12
2.3.1.2. Método de redução do radical ABTS............................................................ 12
2.4. Melaleuca leucadendron..................................................................................... 13
2.5. Cloridrato de pilocarpina..................................................................................... 15
2.6. Óleo de girassol................................................................................................... 16
2.7. Nanoemulsões...................................................................................................... 17
2.7.1. Estabilidade das nanoemulsões......................................................................... 19
2.7.2. Emulsificação pelo método da temperatura de inversão de fases..................... 20
2.7.3. Vantagens das nanoemulsões........................................................................... 20
3. OBJETIVOS......................................................................................................... 22
4. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 24
4.1. Materiais.............................................................................................................. 25
4.1.1. Material Botânico............................................................................................. 25
4.1.2. Material para o desenvolvimento das nanoemulsões........................................ 25
4.2. Obtenção do extrato............................................................................................. 26
4.3. Prospecção Fitoquímica....................................................................................... 27
4.3.1. Compostos fenólicos......................................................................................... 28
4.3.2. Triterpenos e esteróides.................................................................................... 28
4.3.3. Taninos............................................................................................................. 28
4.3.4. Flavonóides....................................................................................................... 28
4.3.5. Antranóides e cumarinas................................................................................... 29
4.3.6. Saponinas.......................................................................................................... 29
4.3.7. Alcalóides......................................................................................................... 29
4.4. Determinação do teor de fenóis totais................................................................. 29
4.5. Avaliação da capacidade antioxidante in vitro.................................................... 30
4.5.1. Método de redução do radical DPPH............................................................... 30
4.5.2. Método de redução do radical ABTS liofilizado.............................................. 31
4.6. Desenvolvimento das nanoemulsões O/A........................................................... 32
4.6.1. Emulsificação por inversão de fases................................................................. 32
4.6.2. Determinação da composição das nanoemulsões............................................. 32
4.6.3. Determinação do sistema tensoativo................................................................ 33
4.7. Avaliação macroscópica das formulações........................................................... 34
4.8. Avaliação microscópica das formulações............................................................ 34
4.9. Determinação da distribuição granulométrica..................................................... 34
4.10. Testes preliminares de estabilidade................................................................... 35
4.10.1. Estresse térmico.............................................................................................. 36
4.10.2. Centrifugação.................................................................................................. 36
4.11. Adição dos princípios ativos às nanoemulsões.................................................. 36
4.11.1. Adição do EEB............................................................................................... 36
4.11.2. Adição do cloridrato de pilocarpina............................................................... 37
4.12. Caracterização físico-química das nanoemulsões.............................................. 37
4.12.1. Avaliação macroscópica................................................................................. 37
4.12.2. Avaliação microscópica.................................................................................. 38
4.12.3. Determinação da distribuição granulométrica................................................ 38
4.12.4. Determinação do pH....................................................................................... 38
4.12.5. Determinação da temperatura de inversão de fases........................................ 38
4.12.6. Determinação do potencial zeta...................................................................... 38
4.13. Testes de estabilidade........................................................................................ 39
4.14. Determinação da citotoxicidade in vitro das nanoemulsões por MTT.............. 39
4.15. Determinação da atividade antioxidante in vitro das nanoemulsões................. 41
4.16. Análises estatísticas........................................................................................... 43
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................... 44
5.1. Obtenção do extrato............................................................................................. 45
5.2. Prospecção fitoquímica........................................................................................ 45
5.3. Determinação do teor de fenóis totais................................................................. 46
5.4. Avaliação da capacidade antioxidante in vitro.................................................... 48
5.4.1. Avaliação da capacidade antioxidante do extrato............................................. 48
5.4.1.1. Método de redução do radical DPPH............................................................ 48
5.4.1.2. Método de redução do radical ABTS liofilizado........................................... 49
5.4.2. Avaliação da capacidade antioxidante do cloridrato de pilocarpina................. 51
5.4.3. Avaliação da capacidade antioxidante do óleo de girassol............................... 51
5.4.3.1. Método de redução do radical DPPH............................................................ 51
5.4.3.2. Método de redução do radical ABTS liofilizado........................................... 53
5.5. Desenvolvimento das nanoemulsões O/A........................................................... 54
5.6. Determinação da distribuição granulométrica..................................................... 59
5.7. Testes preliminares de estabilidade..................................................................... 59
5.7.1. Estresse térmico................................................................................................ 60
5.7.2. Centrifugação.................................................................................................... 60
5.8. Adição dos princípios ativos às nanoemulsões.................................................... 61
5.8.1. Adição do EEB................................................................................................. 61
5.8.2 Adição do cloridrato de pilocarpina.................................................................. 63
5.9. Caracterização físico-química das nanoemulsões................................................ 64
5.9.1. Avaliação macroscópica................................................................................... 65
5.9.2. Avaliação microscópica.................................................................................... 65
5.9.3. Determinação da distribuição granulométrica.................................................. 65
5.9.4. Determinação do pH......................................................................................... 66
5.9.5. Determinação da temperatura de inversão de fases.......................................... 67
5.9.6. Determinação do potencial zeta........................................................................ 69
5.10. Testes de estabilidade........................................................................................ 71
5.10.1. Estresse térmico.............................................................................................. 71
5.10.2. Centrifugação.................................................................................................. 72
5.11. Determinação da citotoxicidade in vitro das nanoemulsões por MTT.............. 73
5.12. Determinação da atividade antioxidante in vitro das nanoemulsões................. 75
6. CONCLUSÃO....................................................................................................... 80
7.PERSPECTIVAS................................................................................................... 82
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 84
RESUMO
CARVALHO, K. V. Desenvolvimento e avaliação de nanoemulsões com extrato
etanólico bruto das folhas de Melaleuca leucadendron e cloridrato de pilocarpina
para o uso potencial como radioprotetor tópico. 2014. Dissertação (Mestrado).
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto.
i
ABSTRACT
CARVALHO, K. V. Development and evaluation of nanoemulsions with crude
ethanol extract of Melaleuca leucadendron’s leaves and pilocarpine hydrochloride
for potential use as a radioprotective topic. 2014. Dissertação (Mestrado). Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto.
Radiodermatites are side effects that may compromise dose and adherence to
radiotherapy in cancer patients. Non-toxic radioprotectors, to prevent or minimize these
damages, are necessary. Melaleuca leucadenron specie and pilocarpine possibly present
this ability. The aim of this study was to develop and evaluate nanoemulsions
containing crude ethanol extract of Melaleuca leucadendron’s leaves and pilocarpine
hydrochloride for potential use as a radioprotective topic. Extract of M. leucadendron
was obtained and presented phenolic content of 10.23%. Pilocarpine hydrochloride did
not show antioxidant activity. Extract and sunflower oil were highly antioxidant, with
IC50 of 17.0 ± 0.59 µg / mL and 6.39 ± 0.27 mg / mL, respectively, by DPPH method.
Stable nanoemulsions were obtained by combining sunflower oil, sorbitan
monostearate, and ethoxylated hydrogenated castor oil, by phase inversion method.
Good incorporation of the extract in nanoemulsion was obtained by sonication with the
hydrophilic surfactant before heating the oil phase. Pilocarpine hydrochloride was
added during the cooling process of the formulations. Free nanoemulsion and
nanoemulsions with extract, pilocarpine or both, presented particle size in the range of
70 and 80 nm, with low polydispersity. These four emulsions showed pH and phase
inversion temperature characteristic of stable systems, consistent with the method of
production used. Zeta potential of these nanoemulsions was more than 30 mV in
magnitude, giving them electrostatic stability. Formulations have not changes during the
period of 60 days, even after stability tests. Depending on the concentrations of the
extract and / or pilocarpine cytotoxicity was observed, and nanoemulsions with total
quantities of active lower 500 µg / mL showed a 80% cell viability. Nanoemulsions
were able to maintain, with just a sligth reduction, the antioxidant potential of the
extract and sunflower oil, and possible synergism between the two was observed.
Formulations with pilocarpine showed antioxidant activity due to the oil in its
composition. Effective concentrations were much lower than concentrations with
toxicity above the acceptable. Nanoemulsions obtained were characterized as potential
radioprotective for topical use, being necessary to confirm this action in subsequent
studies.
ii
LISTA DE FIGURAS
Figura 10: Etapas do processo de obtenção do extrato etanólico bruto das folhas
de Melaleuca leucadendron. A – Folhas secas pulverizadas. B – Solvente sendo
eliminado do extrato em evaporador rotativo............................................................. 26
Figura 13: Curva de calibração e sua respectiva equação linear obtidas para o
ácido-gálico pelo método Folin-Ciocalteu para quantificação de compostos
fenólicos (média ± desvio padrão, n = 3)................................................................... 46
Figura 14: Reação de neutralização de radical livre por estrutura fenólica básica,
através da doação de hidrogênio, originando intermediário pouco reativo................ 47
iii
Figura 16: Curva de calibração e sua respectiva equação linear obtidas para o α-
tocoferol pelo método de redução do radical ABTS liofilizado (média ± desvio
padrão, n = 3).............................................................................................................. 49
Figura 21: Emulsão CC13 durante resfriamento sob agitação, com aspecto
transparente azulado................................................................................................... 58
Figura 22: Fotomicrografia sob luz polarizada, das formulações com aspecto
macroscópico de nanoemulsões, 24 horas após o preparo, aumento de 1000X. A –
emulsão CC13. B – emulsão CC14............................................................................ 58
Figura 26: Viabilidade celular das nanoemulsões com EEB (E1 a E7) e das
nanoemulsões com cloridrato de pilocarpina (P1 a P7), avaliada pelo método
MTT, frente a macrófagos (média ± desvio padrão, n = 3)........................................ 74
iv
LISTA DE TABELAS
Tabela 16: Tabela 16: Temperatura de inversão de fases (TIF) obtida para
caracterização das nanoemulsões, 24 horas após o preparo....................................... 69
v
Tabela 17: Potencial zeta obtido para caracterização das nanoemulsões, 24 horas
após o preparo (média ±desvio padrão, n = 3)............................................................ 70
vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
vii
PCS Espectroscopia de correlação de fótons
SC Span 80 / Croduret 50 Special
SPSS Statistical Package for Social Sciences
TE Equivalentes de Trolox
TIF Temperatura de inversão de fases
UV Ultravioleta
UV- vis Ultravioleta-visível
VC Viabilidade celular
viii
Introdução
Introdução
1. INTRODUÇÃO
2
Introdução
3
Revisão da Literatura
Revisão da Literatura
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. O câncer
5
Revisão da Literatura
2.2. Radioterapia
6
Revisão da Literatura
2.2.1. Radiodermatites
Devido à sua elevada taxa de proliferação, a pele é um dos órgãos mais afetados
pelo tratamento radioterápico. Danos cutâneos precoces e tardios são descritos desde os
estudos pioneiros da radioatividade. As radiodermatites, como são denominadas, são
esperadas em cerca de 95 % dos pacientes que fazem terapia com radiação (KIROVA et
al., 2011; CHAN et al., 2014).
A pele normal é composta por epiderme, derme e hipoderme (FIGURA 1). A
epiderme encontra-se num processo constante de renovação celular, em equilíbrio com
as células que se descamam naturalmente. Aproximadamente 10 % das células basais da
epiderme são submetidas à mitose a cada dia, ocorrendo uma total substituição das
células epidérmicas a cada quatro semanas. A derme, parte subjacente, contém
estruturas de apoio, como vasos sanguíneos, nervos, glândulas, e folículos pilosos
(MCQUESTION, 2011).
7
Revisão da Literatura
8
Revisão da Literatura
2.3. Radioprotetores
9
Revisão da Literatura
10
Revisão da Literatura
11
Revisão da Literatura
12
Revisão da Literatura
O ABTS é mais reativo que o DPPH, completando a reação após 1 minuto. Por
ser solúvel tanto em água quanto em solventes orgânicos permite a análise de amostras
com diferentes polaridades (ARNAO, 2000; TIVERON et al., 2012).
Figura 3: Redução do radical ABTS por um antioxidante e sua formação por persulfato
de potássio.
Fonte: HUANG et al., 2005
13
Revisão da Literatura
antifúngica (YOSHIDA et al., 1996; PUJIARTI et al., 2011; RINI et al., 2012; SURH e
YUN, 2012).
14
Revisão da Literatura
15
Revisão da Literatura
16
Revisão da Literatura
2.7. Nanoemulsões
17
Revisão da Literatura
18
Revisão da Literatura
19
Revisão da Literatura
20
Revisão da Literatura
21
Objetivos
Objetivos
3. OBJETIVO GERAL
23
Material e Métodos
Material e Métodos
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. Materiais
25
Material e Métodos
Figura 10: Etapas do processo de obtenção do extrato etanólico bruto das folhas de
Melaleuca leucadendron. A – Folhas secas pulverizadas. B – Solvente sendo eliminado
do extrato em evaporador rotativo.
26
Material e Métodos
27
Material e Métodos
4.3.3. Taninos
4.3.4. Flavonóides
28
Material e Métodos
Foi realizada CCD utilizando tolueno/éter (1:1) saturado com ácido acético
glacial a 10% como fase móvel para análise de cumarinas. Para avaliar a presença de
antranóides a fase móvel utilizada foi acetato de etila/metanol/água (100:13,5:10).
O hidróxido de potássio metanólico foi o reagente de detecção. A reação foi
considerada positiva nas seguintes situações: sob a luz visível, antraquinonas
desenvolvem coloração vermelha; sob a luz UV365nm, antronas desenvolvem coloração
amarela e cumarinas ficam azuis.
4.3.6. Saponinas
4.3.7. Alcalóides
29
Material e Métodos
30
Material e Métodos
soluções etanólicas nas concentrações 0,5; 1; 2,5 e 5 mg/mL e para o óleo de girassol
soluções em acetona nas concentrações 2,5; 5; 7,5 e 10 mg/ mL.
Em tubos com 2,5 mL das variadas concentrações das amostras ou com 2,5 mL
de etanol puro, utilizado como controle negativo, foram acrescentados 1 mL de solução
etanólica de DPPH (Sigma-Aldrich) 0,004% m/v. Para o branco, à 2,5 mL das
diferentes concentrações, foram acrescentados 1 mL de etanol puro. Após 30 e 60
minutos, de incubação à temperatura ambiente e ao abrigo da luz, foi efetuada a leitura
das absorbâncias a 517 nm em Espectrofotômetro UV-vis Helios α Thermo Electron
Corporation.
As absorbâncias das amostras, após descontar o respectivo branco, foram
utilizadas para calcular o percentual de inibição do radical livre DPPH (%IDPPH), com
base na seguinte fórmula:
% IDPPH = [(CN-AM)/CN] x 100, onde:
IDPPH = inibição do DPPH;
CN = absorbância do controle negativo e
AM = absorbância da amostra descontada a absorbância do branco.
O experimento foi realizado em triplicata e com os valores médios foi elaborada
uma curva de inibição para o EEB, uma para o cloridrato de pilocarpina e uma para o
óleo. Com base nas equações lineares obtidas para cada curva foi calculada a
concentração das amostras que provocou 50% de inibição do DPPH (CE50), sendo os
valores expressos como média ± desvio padrão.
O radical catiônico ABTS foi produzido de acordo com o descrito por Re et al.
(1999), para isso uma solução aquosa a 7 mM do ABTS (Sigma-Aldrich) com 2,75 mM
de persulfato de potássio foi preparada. Essa solução foi deixada em repouso ao abrigo
da luz e à temperatura ambiente por 16 horas.
Após esse tempo, a solução foi utilizada para determinação da atividade
antioxidante segundo o método proposto por Durmaz (2012), utilizando α-tocoferol
como padrão. A solução com o radical foi completamente congelada a -80 ºC e
liofilizada em equipamento Liobras® L101, totalizando um tempo de 6 horas. O pó
obtido foi utilizado nas análises.
31
Material e Métodos
32
Material e Métodos
33
Material e Métodos
34
Material e Métodos
35
Material e Métodos
4.10.2. Centrifugação
36
Material e Métodos
37
Material e Métodos
4.12.4. Determinação do pH
38
Material e Métodos
um campo elétrico foi aplicado aos mesmos. As partículas com potencial zeta migraram
em direção ao eletrodo de carga oposta com uma velocidade que está relacionada à
magnitude do potencial. Essa mobilidade foi medida via M3-PALS (FELIX et al., 2013;
HONARY e ZAHIR, 2013b).
As amostras foram diluídas na proporção de 1:20 em água destilada e aplicadas
na célula capilar semi-descartável com o auxílio de uma seringa hipodérmica. As
medidas de potencial zeta foram realizadas à temperatura ambiente (25 ±2 ºC) e em
triplicata para cada nanoemulsão. Os resultados foram expressos como média ± desvio
padrão.
39
Material e Métodos
40
Material e Métodos
Tabela 3: Concentrações dos princípios ativos em cada uma das nanoemulsões avaliadas
quanto à citotoxicidade pelo método MTT
Ativo Concentração
Amostra
(% na nanoemulsão) avaliada
Nanoemulsões com EEB
E1 EEB (0,01) 100 µg/ mL
E2 EEB (0,02) 200 µg/ mL
E3 EEB (0,05) 500 µg/ mL
E4 EEB (0,1) 1 mg/ mL
E5 EEB (0,2) 2 mg/ mL
E6 EEB (0,5) 5 mg/ mL
E7 EEB (1,0) 10 mg/ mL
Nanoemulsões com cloridrato de pilocarpina
P1 Pilocarpina (0,01) 100 µg/ mL
P2 Pilocarpina (0,02) 200 µg/ mL
P3 Pilocarpina (0,05) 500 µg/ mL
P4 Pilocarpina (0,1) 1 mg/ mL
P5 Pilocarpina (0,2) 2 mg/ mL
P6 Pilocarpina (0,5) 5 mg/ mL
P7 Pilocarpina (1,0) 10 mg/ mL
Nanoemulsões com EEB e cloridrato de pilocarpina
EP1 EEB (0,01) + Pilocarpina (0,01) 100 µg/mL + 100 µg/mL
EP2 EEB (0,02) + Pilocarpina (0,01) 200 µg/mL + 100 µg/mL
EP3 EEB (0,02) + Pilocarpina (0,02) 200 µg/mL + 200 µg/mL
EP4 EEB (0,05) + Pilocarpina (0,05) 500 µg/mL + 500 µg/mL
Legenda: EEB = extrato etanólico bruto das folhas de Melaleuca leucadendron
41
Material e Métodos
com ambos ativos foram testadas nas combinações 0,01/0,01; 0,02/0,01; 0,02/0,02 e
0,05/0,05 % de EEB/ pilocarpina, respectivamente. A NB foi utilizada para avaliar a
atividade do óleo de girassol.
Com a finalidade de conferir a transparência necessária para leitura das
absorbâncias, as amostras foram diluídas em etanol. Para isso, 150 µL de cada
nanoemulsão avaliada foram acrescentados a 2,35 mL desse solvente. As concentrações
resultantes, nos 2,5 mL totais, podem ser observadas na tabela 4.
Tabela 4: Concentrações dos princípios ativos em cada uma das nanoemulsões avaliadas
quanto à capacidade antioxidante pelo método DPPH
Ativo avaliado Concentração final
Amostra
(% na nanoemulsão) (em 2,5 mL)
Nanoemulsão Base
NB Óleo de girassol (10) 6 mg/ mL
Nanoemulsões com EEB
E1 EEB (0,01) 6 µg/ mL
E2 EEB (0,02) 12 µg/ mL
E3 EEB (0,05) 30 µg/ mL
E4 EEB (0,1) 60 µg/ mL
E5 EEB (0,2) 120 µg/ mL
E6 EEB (0,5) 300 µg/ mL
Nanoemulsões com cloridrato de pilocarpina
P1 Pilocarpina (0,01) 6 µg/ mL
P2 Pilocarpina (0,02) 12 µg/ mL
P3 Pilocarpina (0,05) 30 µg/ mL
P4 Pilocarpina (0,1) 60 µg/ mL
P5 Pilocarpina (0,2) 120 µg/ mL
P6 Pilocarpina (0,5) 300 µg/ mL
Nanoemulsões com EEB e cloridrato de pilocarpina
EP1 EEB (0,01) + Pilocarpina (0,01) 6 µg/ mL + 6 µg/ mL
EP2 EEB (0,02) + Pilocarpina (0,01) 12 µg/ mL + 6 µg/ mL
EP3 EEB (0,02) + Pilocarpina (0,02) 12 µg/ mL + 12 µg/ mL
EP4 EEB (0,05) + Pilocarpina (0,05) 30 µg/ mL + 30 µg/ mL
Legenda: EEB = extrato etanólico bruto das folhas de Melaleuca leucadendron
Em tubos com 2,5 mL das variadas concentrações das amostras ou com 2,5 mL
de etanol puro, utilizado como controle negativo, foram acrescentados 1 mL de solução
etanólica de DPPH (Sigma-Aldrich) 0,004% m/v. Para o branco, à 2,5 mL das
diferentes concentrações, foram acrescentados 1 mL de etanol puro.
Após 30 e 60 minutos, de incubação à temperatura ambiente e ao abrigo da luz,
200 µL do conteúdo de cada tubo foi transferido para poços de placa de ELISA. Foi
efetuada a leitura das absorbâncias a 517 nm em Leitor de ELISA (Anthos 2010).
42
Material e Métodos
43
Resultados e Discussão
Resultados e Discussão
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram obtidos 50,1g de EEB das folhas de Melaleuca leucadendron (Figura 12)
a partir das 600g de folhas secas pulverizadas. O rendimento do extrato, portanto, foi de
8,35%.
45
Resultados e Discussão
0.300
0.250
Absorbância a 760 nm
0.200
0.150
0.000
0 50 100 150 200 250 300
Figura 13: Curva de calibração e sua respectiva equação linear obtidas para o ácido-
gálico pelo método Folin-Ciocalteu para quantificação de compostos fenólicos (média ±
desvio padrão, n = 3)
46
Resultados e Discussão
Figura 14: Reação de neutralização de radical livre por estrutura fenólica básica, através
da doação de hidrogênio, originando intermediário pouco reativo
Com isto, além de agirem como antioxidantes, esses compostos podem inibir o
óxido nítrico, um radical livre presente no organismo. Esse radical é um modulador da
inflamação e sua neutralização pode acelerar a cicatrização de feridas cutâneas
(PRIYADARSINI, 1997; NAKAJIMA et al., 2007; REBELO et al., 2014; TAIRA et
al., 2015).
A presença de compostos fenólicos tem sido constantemente relacionada com
potencial antioxidante e com outras atividades biológicas, como anti-inflamatória e
antiproliferativa (BASTIANETTO et al., 2000; SILVA et al., 2009; ABDEL-HAMEED
et al., 2014; LIU et al. 2014; LOU et al., 2014). De acordo com García-Lafuente et al.
47
Resultados e Discussão
(2014), que avaliaram extratos ricos em fenóis, um elevado teor desses compostos pode
ser associado a elevadas atividades antioxidante e anti-inflamatória.
100
90
80 y = 3.1987x - 4.3771
70 R² = 0.9904
Inibição do DPPH (%)
60
50
40
30
Inibição 30 min
20 Inibição 60 min
10 Linear 30 min
0
0 5 10 15 20 25 30
Concentração do extrato (µg/mL)
48
Resultados e Discussão
representado na Tabela 6 (WU et al., 2009; SAHA et al., 2009; LAY et al., 2014; SHI et
al., 2014; YU et al., 2014).
0.7
0.65
y = -0.0005x + 0.6671
0.6 R² = 0.991
Absorbância a 720 nm
0.55
0.5
0.45
0.4
0.35
0.3
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
Figura 16: Curva de calibração e sua respectiva equação linear obtidas para o α-
tocoferol pelo método de redução do radical ABTS liofilizado (média ± desvio padrão,
n = 3)
49
Resultados e Discussão
50
Resultados e Discussão
mesma classe, que tem sido estudado como um possível radioprotetor (SEBASTIÀ et
al., 2011; JEONG et al., 2014; XU, L. et al., 2014).
Fundamentado nos resultados e nos dados da literatura, o EEB das folhas de
Melaleuca leucadendron representa uma boa fonte de princípios ativos para as
nanoemulsões. Foi observada elevada capacidade de redução de radicais livres, que é
um dos mecanismos pelos quais os radioprotetores agem. Além disto, pode apresentar,
em sua composição, substâncias capazes de proteger os danos causados pela
radioterapia através de outras formas de ação (NAIR et al., 2001; GAUTER-
FLECKENSTEIN et al., 2014).
51
Resultados e Discussão
100
90
80 y = 9.2843x - 9.3558
R² = 0.982
70
Inibição do DPPH (%)
60
50
40
Inibição 30 min
30 Inibição 60 min
20 Linear 30 min
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Concentração do óleo (mg/mL)
Com essa CE50, o óleo de girassol não se apresenta um antioxidante tão potente
quanto alguns antioxidantes sintéticos como o BHT (CE50 = 0,58 mg/mL) e o α-
tocoferol (CE50 = 0,10 mg/mL) (ZHANG et al., 2006). Contudo, em comparação a
outros óleos vegetais e essenciais como relatado na Tabela 7, sua atividade pode ser
considerada satisfatória (ZHANG et al., 2006; SHAHSAVARI et al., 2008;
VALAVANIDIS et al., 2004; BAUER et al., 2013).
52
Resultados e Discussão
De acordo com esses dados foi encontrada uma capacidade de reduzir o radical
ABTS de 4322 mg EAT/ kg de óleo. Esses valores confirmam sua capacidade
antioxidante, que por esse método, utilizando α-tocoferol como padrão, também foi
superior à atividade descrita para os óleos de milho (1300 mg EAT/kg), oliva (300 mg
EAT/kg) e soja (1100 mg EAT/kg) (DURMAZ, 2012).
No óleo de girassol são encontrados antioxidantes naturais como os tocoferois e
compostos fenólicos. Essas substâncias apresentam elevada capacidade sequestradora
de radicais livres e podem ser relacionadas ao potencial antioxidante encontrado por
ambas as metodologias avaliadas (WARNER e MOUNTS, 1990; LUDWIG et al., 2011;
BAKRE et al., 2014).
O principal componente do óleo de girassol é um ácido graxo considerado
essencial, o ácido linoléico – cerca de 65 % (BETT et al., 2004; MARQUES et al.,
2004; KOWALSKI, 2007; HSIEH et al., 2008). Esse ácido graxo exerce papel de
mediador pró-inflamatório, sendo essencial para a regulação dos eventos bioquímicos
que precedem a fibroplasia e estando associado às ações cicatrizantes e anti-
inflamatórias comumente relatadas para o óleo (GLASGOW e ELING, 1990;
RODRIGUES et al., 2004; MAGALHÃES et al., 2008; BONFERONI et al., 2014).
Topicamente, segundo Marques et al. (2004), o óleo de girassol pode ser
considerado um tratamento alternativo para o processo cicatricial de segunda intenção,
contribuindo para o fechamento mais rápido de feridas com grande espessura. Ele já tem
sido utilizado para esses fins, como um dos componentes do Dersani®, um medicamento
empregado no tratamento de lesões cutâneas (MANDELBAUM et al., 2003;
GONÇALVES et al., 2010; PRICHOA et al., 2011).
53
Resultados e Discussão
54
Resultados e Discussão
sistema tensoativo. Os resultados estão de acordo com Walther et al. (2005) que
relataram que nenhuma emulsão combinando Span 80 e esse óleo apresenta
estabilidade. Segundo Yang et al. (2012) elevadas concentrações de monooleato de
sorbitano, em fase oleosa contendo óleo de girassol, provocam redução da estabilidade
e/ou coagulação de micropartículas.
55
Resultados e Discussão
Figura 19: Fotomicrografia, sob luz polarizada, de uma das formulações utilizando o
sistema tensoativo Crill 3/ Croduret 50 Special num total de 10 % de fase oleosa,
emulsão CC5, 24 horas após o preparo, aumento de 400X.
56
Resultados e Discussão
Figura 20: Fotomicrografia, sob luz polarizada, da emulsão CC15, utilizando o sistema
tensoativo Crill 3/ Croduret 50 Special num total de 20 % de fase oleosa, 24 horas após
o preparo, aumento de 400X
Além disto, o fato de terem sido observadas partículas grandes em CC15, ainda
no aumento de 400 vezes, não foi condizente com o esperado para uma nanoemulsão.
As formulações CC13 (40/60-CRI/CRO) e CC14 (50/50-CRI/CRO), estáveis
macroscopicamente após 24 horas, apresentaram aspecto transparente azulado (Figura
21) característico de nanoemulsões (SADURNÍ et al., 2005; KLASSEN et al., 2014).
57
Resultados e Discussão
Figura 21: Emulsão CC13 durante resfriamento sob agitação, com aspecto transparente
azulado
Figura 22: Fotomicrografia sob luz polarizada, das formulações com aspecto
macroscópico de nanoemulsões, 24 horas após o preparo, aumento de 1000X.
A – emulsão CC13. B – emulsão CC14
58
Resultados e Discussão
59
Resultados e Discussão
5.7.2. Centrifugação
60
Resultados e Discussão
61
Resultados e Discussão
Figura 24: Formulações contendo 0,1% de EEB. A – nanoemulsão obtida pelo método
I. B – nanoemulsão obtida pelo método III
Nas emulsões obtidas pelo método III foi alcançada excelente incorporação do
extrato. No entanto, em concentrações superiores a 0,5% de EEB foram notadas
62
Resultados e Discussão
63
Resultados e Discussão
Isto justifica os bons resultados obtidos com a sua adição após o preparo das
nanoemulsões O/A, em que a fase dispersante e, nesse caso, o maior componente, foi
água.
64
Resultados e Discussão
65
Resultados e Discussão
5.9.4. Determinação do pH
66
Resultados e Discussão
Os valores foram todos próximos a 6,5. Quando analisado por ANOVA, não
houve diferenças significativas entre o pH das diferentes nanoemulsões, a um nível de
significância de 0,05. Esses resultados, próximos da neutralidade à ligeiramente ácidos,
são geralmente característicos de sistemas nanoemulsionados. Schwarz et al. (2012),
Nirmala et al. (2014) e Rocha-Filho (2014) encontraram valores semelhantes para as
nanoemulsões desenvolvidas em seus estudos.
O pH é um parâmetro de caracterização e também de monitoramento da
estabilidade das formulações. De acordo com a literatura, nanoemulsões estáveis, física
e quimicamente, apresentam valores na faixa de 6,5 a 8 (FRONZA et al., 2004;
MASMOUDI et al., 2005; CARNEIRO, 2013). Segundo Ozturk et al. (2014) esses
sistemas são estáveis numa faixa ainda mais ampla de pH, de 3 a 8.
Alterações no valor do pH indicam a ocorrência de reações químicas ou
crescimento bacteriano. Um decréscimo nos valores pode ser decorrente da oxidação da
fase oleosa ou da hidrólise de triglicerídeos, gerando ácidos graxos livres (MASMOUDI
et al., 2005; PEREIRA 2008).
Com o decorrer dos 30 dias de armazenamento, não houve variação significativa
nos valores de pH em nenhuma das nanoemulsões (p > 0,05). Pode-se sugerir que as
formulações permaneceram estáveis, não sendo detectadas alterações químicas de seus
componentes.
O pH de produtos dérmicos é um fator importante para evitar irritação da pele e
para não deixá-la suscetível à infecção bacteriana. É interessante que formulações
tópicas apresentem valores ligeiramente ácidos, uma vez que o pH cutâneo encontra-se
em torno de 4,5 a 6. Portanto, os resultados obtidos, para NB, NE, NP e NEP,
confirmam a compatibilidade dessas nanoemulsões com o uso a que se destinam
(BORGES et al., 2013; CLARES et al., 2014).
67
Resultados e Discussão
determinar o tipo de emulsão, pode ser utilizada para caracterizar a inversão de fases
(BOUCHAMA et al., 2003).
Na Figura 25 está representada a condutividade elétrica das nanoemulsões, em
função da temperatura. As formulações aumentaram levemente a condutividade à
medida que a temperatura aumentou. Chegaram, então, a um ponto onde ocorreu a
inversão de fases, ocasionando um decréscimo brusco da mesma. As curvas obtidas
encontram-se de acordo com o perfil descrito para emulsões na literatura
(FERNANDEZ et al., 2004; KLASSEN et al., 2014).
350
325
300
Condutividade (μS.cm-1)
275
250
225
200
175 NB
NE
150 NP
NEP
125
100
25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85
Temperatura (ºC)
68
Resultados e Discussão
Tabela 16: Temperatura de inversão de fases (TIF) obtida para caracterização das
nanoemulsões, 24 horas após o preparo
Amostra TIF (ºC)
NB 81,5
NE 79,2
NP 81,7
NEP 80,5
Legenda: TIF = temperatura de inversão de fases; NB = nanoemulsão base; NE =
nanoemulsão com EEB; NP = nanoemulsão com pilocarpina; NEP = nanoemulsão com
EEB e pilocarpina
69
Resultados e Discussão
Tabela 17: Potencial zeta obtido para caracterização das nanoemulsões, 24 horas após o
preparo (média ±desvio padrão, n = 3)
Amostra Potencial Zeta (mV)
NB -46,0 ± 0,79
NE -30,3 ± 3,07
NP -43,1 ± 0,71
NEP -43,3 ± 3,00
Legenda: NB = nanoemulsão base; NE = nanoemulsão com EEB; NP = nanoemulsão
com pilocarpina; NEP = nanoemulsão com EEB e pilocarpina
70
Resultados e Discussão
Nas nanoemulsões, a energia livre das fases, oleosa e aquosa, separadas é menor
do que a da própria formulação. Por essa razão, são sistemas termodinamicamente
instáveis. No entanto, quando adicionados estabilizadores apropriados, como os
tensoativos, suas características podem ser mantidas por um período considerável
(ZEEB et al., 2014).
Durante os 60 dias de armazenamento, nenhuma alteração macroscópica foi
observada em NB, NE, NP e NEP. As emulsões permaneceram sem separação de fases,
cremeação ou floculação e mantiveram suas características organolépticas.
71
Resultados e Discussão
5.10.2. Centrifugação
72
Resultados e Discussão
73
Resultados e Discussão
100.00
90.00
Figura 26: Viabilidade celular das nanoemulsões com EEB (E1 a E7) e das
nanoemulsões com cloridrato de pilocarpina (P1 a P7), avaliada pelo método MTT,
frente a macrófagos (média ± desvio padrão, n = 3)
100.00
90.00
Viabilidade celular (%)
80.00
70.00
60.00
50.00
EP1 EP2 EP3 EP4
Nanoemulsões com EEB e pilocarpina
Figura 27: Viabilidade celular das nanoemulsões com EEB e cloridrato de pilocarpina,
avaliada pelo método MTT, frente a macrófagos (média ± desvio padrão, n = 3). Nessas
formulações, as concentrações em %, de EEB e pilocarpina, respectivamente, são: EP1
= 0,01/0,01; EP2 = 0,02/0,01; EP3 = 0,02/0,02 e EP4 = 0,05/0,05
74
Resultados e Discussão
75
Resultados e Discussão
76
Resultados e Discussão
80
70
y = 1.7294x + 17.687
60 R² = 0.9819
77
Resultados e Discussão
para NB. Esses fatos levam a acreditar que o cloridrato de pilocarpina realmente não
apresenta capacidade antioxidante e que a atividade encontrada de P1 a P7 foi
decorrente dos componentes da própria nanoemulsão.
78
Resultados e Discussão
79
Conclusão
Conclusão
6. CONCLUSÃO
O EEB das folhas de Melaleuca leucadendron foi obtido com bom rendimento e
apresentou elevado teor de compostos fenólicos.
O óleo de girassol e o EEB apresentaram elevada capacidade antioxidante e
foram considerados bons componentes para formulações com esperada ação
radioprotetora.
O cloridrato de pilocarpina não possui atividade antioxidante. Caso apresente
potencial radioprotetor, como tem sido descrito, deve-se a outro mecanismo de ação.
Utilizando monoestearato de sorbitano e óleo de rícino hidrogenado e etoxilado
associados ao óleo de girassol foram alcançadas emulsões estáveis, com tamanho e IP
característicos de sistemas nanoestruturados.
As formulações desenvolvidas com extrato e/ou pilocarpina apresentaram
propriedades características de nanoemulsões e se mantiveram estáveis por 60 dias,
mesmo após condições de estresse.
Toxicidade inferior a 20 % foi observada nas nanoemulsões com concentrações
totais dos ativos inferiores a 500 µg/ mL, podendo-se esperar que em concentrações
abaixo desse valor a utilização tópica não deverá causar irritação considerável à pele.
As nanoemulsões mantiveram a capacidade antioxidante do óleo de girassol e do
EEB livres. Porém, uma pequena redução de potencial foi observada.
As concentrações em que houve baixa toxicidade e boa eficácia poderão ser
utilizadas como base para definir as análises desenvolvidas futuramente.
As propriedades encontradas para as nanoemulsões obtidas com EEB e/ou
cloridrato de pilocarpina permitem pressupor que esses sistemas sejam potenciais
radioprotetores para uso tópico.
81
Perspectivas
Perspectivas
7. PERSPECTIVAS
83
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