VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA DE ANÁLISE DE CONTAMINANTES

EMERGENTES EM ÁGUAS NATURAIS E ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA A

GÁS COM ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CG-EM)

IZABELA GONÇALVES DA SILVA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO – UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

DEZEMBRO – 2016
 VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA DE ANÁLISE DE CONTAMINANTES
EMERGENTES EM ÁGUAS NATURAIS E ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA A
GÁS COM ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CG-EM)

IZABELA GONÇALVES DA SILVA

“Monografia apresentada ao Centro de

Ciências e Tecnologia da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro, como parte das exigências
para obtenção do título de Licenciatura
em Química.”

Orientadora: Profª Drª Maria Cristina Canela

Co-orientadora: M.Sc. Thayana Paranhos Portal

CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ

DEZEMBRO – 2016

II
III
 AGRADECIMENTOS

Agradeço a ti meu Deus, por tua bondade e fidelidade, por estar comigo todos os
dias até aqui. “Nunca me deixes esquecer, que tudo que tenho, tudo que sou e o
que vier a ser, vem de ti Senhor”.

Quero agradecer à minha mãe que sempre me apoiou incondicionalmente e nunca

se esqueceu de mim em suas orações. Também ao meu esposo pela paciência e
compreensão. Suas palavras sempre me encorajaram a seguir adiante. Da mesma
forma às minhas irmãs e cunhados, agradeço pelo apoio.

Agradeço a minha orientadora, Prof.ª Maria Cristina Canela pela oportunidade

concedida, pela paciência, ajuda e palavras de incentivo até o fim deste trabalho.
Também pela dedicação nas aulas de química analítica e química ambiental, onde
tanto aprendi.

A minha co-orientadora Thayana, que se tornou uma amiga muito querida. Obrigada
por ter compartilhado comigo seu conhecimento, seu tempo, seus conselhos.
Agradeço a todos do laboratório 103 pelos momentos que passamos juntos: Camila,
Ruth, Iago, Luel, Isis, Ronan e Poliana.

A professora Cibele que sempre foi muito prestativa e tanto nos ajudou com o
planejamento fatorial. Muito Obrigada!!

Agradeço a turma A da licenciatura em química. Foi um prazer estar com vocês.

Obrigada Larissa Maciel, Keila, Larissa Alves, Luiza, Raquel, Mariana, Carol,
Fernanda, Larissa Manhães, Nathanya, Suzana e Rodrigo Lopes. Vocês se
tornaram mais que companheiros de jornada, se tornaram amigos que guardarei
para sempre em meu coração. Um agradecimento especial ao meu amigo Rodrigo
Stellet, que tanto me ajudou esse ano. Com seu bom humor fez até as coisas mais
difíceis e complicadas se tornarem engraçadas e divertidas. Obrigada por ter sido
meu companheiro nos estágios III e IV, na monografia, no IC, nas aulas de físico
química, nas andanças pela UENF em busca de documentos, na correria para
conseguir horas científicas e culturais e até nas caronas esporádicas à Guarus.

A todos que contribuíram de diferentes formas para a concretização desse sonho:

Meu muito obrigada!
IV
 SUMÁRIO

LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................... VII

LISTA DE FIGURAS................................................................................................. IX
LISTA DE TABELAS ................................................................................................ XI
RESUMO ................................................................................................................. 12
ABSTRACT............................................................................................................... 13
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 14
2. OBJETIVO .................................................................................................. 16
3. REVISÃO BIBLIOGRAFIA..................................................................... 16
3.1. Contaminantes Emergentes em Ambientes Aquáticos: Definição, Fontes de
Contaminação e Efeitos Adversos............................................................................ 16
3.2. Classe de Contaminantes Emergentes.......................................................... 18
3.2.1. Produtos Farmacêuticos............................................................................. 18
3.2.2 Interferentes Endócrinos................................................................................. 19
3.2.2.1 Xenoestrogênios........................................................................................... 21
3.2.2.2 Estrogênios Sintéticos.................................................................................. 24
3.2.3 Cafeína como Indicador de Contaminação por Interferentes Endócrinos....... 25
3.3. Extração e Análise de Compostos Emergentes ............................................ 26
3.3.1 Preparo da Amostra: Extração em Fase Sólida.............................................. 26
3.3.2 Métodos de Análise......................................................................................... 28
3.3.2.1 Cromatografia Gasosa e Derivatização........................................................ 28
3.4. Validação de Metodologia para Analise........................................................... 30
3.4.1. Conceitos gerais............................................................................................. 30
3.4.2 Parâmetros Analíticos para Validação............................................................ 31
4. METODOLOGIA ........................................................................................... 38
4.1 Equipamentos, Materiais e Reagentes.............................................................. 38
4.2 Métodos Analíticos............................................................................................. 40
4.2.1 Curva em fase Aquosa.................................................................................... 40
4.2.2 Curva em fase Orgânica................................................................................ 44
4.3 Validação da Metodologia................................................................................. 44
4.3.1 Seletividade..................................................................................................... 44
4.3.2 Exatidão........................................................................................................... 44
4.3.3 Precisão........................................................................................................... 45
4.3.4 Linearidade na faixa de interesse................................................................... 45
4.3.5 Limite de Quantificação e Limite de Detecção................................................ 45

V
4.4 Planejamento Fatorial........................................................................................ 45
4.5 Amostragem....................................................................................................... 48
4.5.1 Preparo da Amostra e Extração...................................................................... 50
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................... 51
5.1 Validação............................................................................................................ 51
5.1.1 Seletividade..................................................................................................... 51
5.1.2 Exatidão........................................................................................................... 54
5.1.3 Precisão........................................................................................................... 55
5.1.4 Linearidade...................................................................................................... 56
5.1.5 Limite de Quantificação e Detecção................................................................ 57
5.2 Planejamento Fatorial......................................................................................... 57
5.3 Amostragem....................................................................................................... 58
6. CONCLUSÃO ............................................................................................. 59
7.REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................... 61
ANEXOS................................................................................................................... 66
Anexo 1 .................................................................................................................... 66
Anexo 2..................................................................................................................... 68

VI
 LISTA DE ABREVIATURAS

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ACN Acetonitrila
ATZ Atrazina
BPA Bisfenol A
BPA16D Bisfenol A 16 Deuterado
CAF Cafeína
CE Contaminantes Emergentes
CG Cromatografia Gasosa
DCN Diclofenaco
DPR Desvio Padrão Relativo
EE2 17 alfa etinil estradiol
EM Espectrometria de Massas
IBAMA Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
ICH International Conference on Harmonisation
INMETRO Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial
ISO International Standard Organization
IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry
LME Limite de Migração específico
MeOH Metanol
MS Ministério da Saúde
MSD Mass selective detector
NIEHS National Institute of Environmental Health Science
NIST National Institute of Standards and Technology
NPN 4 n nonilfnenol
PNSB Pesquisa Nacional de Saneamento Básico
PPM Partes por Milhão
RDC Resolução da Diretoria Colegiada
RPS Rio Paraíba do Sul
SIM Simazina

VII
SIM Selective Ion Monitoring
SNIS Sistema Nacional de Informações sobre Saneamento
TCS Triclosan
UNESCO United Nations Educational Scientifc and Cultural Organazation
USEPA United State Environmental Protection Agency
USGS United States Geological Survey

VIII
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Mapa com a distribuição de municípios atendidos com rede de

esgoto sanitário no Brasil (PNSB, 2008)......................................................... 15
Figura 2 Estrutura Química do Diclofenaco (NIST)........................................... 19
Figura 3 Glândulas dos seres humanos que produzem hormônios
reguladores de diferentes atividades no organismo (Fonte: Beraldo, 2012)....... 20
Figura 4 Formas de Interação entre os Desreguladores Endócrinos e os
Receptores Hormonais. (Beraldo, 2012)........................................................... 21
Figura 5 Estrutura Química da Simazina e da Atrazina (NIST)......................... 23
Figura 6 Estrutura Química do Bisfenol A (NIST).............................................. 23
Figura 7 Estrutura Química do Nonilfenol (NIST).............................................. 24
Figura 8 Estrutura Química do Triclosan (NIST)............................................... 24
Figura 9 Estrutura Química do 17-alfa-etinil-estradiol (NIST)........................... 25
Figura 10 Estrutura Química da Cafeína (NIST)............................................... 26

Figura 11 Esquema da Extração em Fase Sólida (Canela et al, 2014)............ 27

Figura 12 Diagrama de polaridade - volatilidade mostrando a tendência para
a escolha entre cromatografia gasosa ou líquida conforme características
físico-químicas das substancias. (Silva e Collins, 2011).................................... 28
Figura 13 Diagrama de funcionamento do espectrômetro de massas (Skoog,
2006).................................................................................................................. 30
Figura 14 Sistema de Extração em Fase Sólida............................................... 42
Figura 15 Fluxograma do planejamento fatorial................................................ 47
Figura 16 Divisão do Rio Paraíba do Sul (Brasil, 2015).................................... 49
Figura 17 Vista Rio Paraíba do Sul na região de Campos dos Goytacazes
(Soares,2016)................................................................................................................ 49
Figura 18 Fluxograma para Extração em Fase sólida....................................... 50
Figura 19 Cromatograma dos compostos analisados........................................ 51
Figura 20 Cromatograma baseado no íon de maior abundancia relativa para o
Diclofenaco e o respetivo espectro de massa................................................
52
Figura 21 Cromatograma baseado no íon de maior abundancia relativa para o
Bisfenol A 16 Deuterado e o respetivo espectro de massa...........................
52

IX
Figura 22 Cromatograma baseado no segundo íon de maior abundancia
relativa para o Bisfenol A e o respetivo espectro de massa.............................. 53
Figura 23 Comparação entre Cromatograma e Branco da Extração................. 53

Figura 24 Gráfico com resultado do ensaio de recuperação em % aplicando o

método proposto............................................................................................... 54

Figura 25 Gráfico com resultado do desvio padrão relativo da curva em fase

aquosa aplicando o método proposto.............................................................. 55

X
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Parâmetros avaliados em uma validação de métodos

segundo agências nacionais e internacionais....................................... 31
Tabela 2 Lista de Padrões com informações complementares............ 39
Tabela 3 Concentrações da curva em fase aquosa com respectivas
massas recuperadas e massas injetadas............................................... 41
Tabela 4 Íons selecionados para análise no método SIM.................... 42
Tabela 5 Parâmetros cromatográficos que foram utilizados para a
realização das análises......................................................................... 43
Tabela 6 Variáveis e níveis para análise de extração.......................... 46
Tabela 7 Condições avaliadas no planejamento fatorial...................... 46
Tabela 8 Locais de Coleta em Campos dos Goytacazes..................... 48
Tabela 9 Equação da reta e coeficiente de correlação para as
substancias analisadas na curva em fase aquosa................................ 56
Tabela 10 Resultados em % de recuperação do planejamento
fatorial................................................................................................... 57

XI
 12

RESUMO

A água é um recurso essencial à vida. Infelizmente a poluição hídrica tem sido um

tema muito discutido atualmente, pois têm aumentado a cada ano. Com o avanço da
ciência, e principalmente da química, milhares de compostos são produzidos e
consumidos diariamente. Dentre estes compostos estão os medicamentos, produtos
de limpeza e de higiene pessoal, aditivos industriais, pesticidas, alimentos
industrializados, entre outros. Em especial aqueles compostos que não são
monitorados por nenhuma legislação, mas que sendo passíveis de serem
prejudiciais à saúde e ao meio ambiente, são reconhecidos no meio cientifico como
contaminantes emergentes (CE). Somando-se a produção em grande escala, com a
falta de remanejamento adequado dos resíduos gerados e ainda a falta de
saneamento básico, o resultado é que esses compostos são despejados nos corpos
aquáticos, através do esgoto doméstico e industrial, muitas vezes, sem nenhum
tratamento. Este trabalho teve o objetivo de validar metodologia para análise de 7
contaminantes emergentes sendo eles: 4 n-nonilfenol, 17-alfa etinil estradiol,
Atrazina, Bisfenol A, Diclofenaco, Simazina e Triclosan, e 1 indicador de
contaminação por esgoto que foi a Cafeína. A metodologia incluiu extração em fase
sólida (EFS), utilizando o cartucho Oasis HLB (Waters) seguida por análise em
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). Após a
validação do método, o mesmo foi utilizado para analisar amostras de água bruta e
tratada, sendo as amostras superficiais oriundas do Rio Paraíba do Sul (RPS), e as
amostras subterrâneas provenientes de poços profundos da localidade de Donana.
Esses pontos foram escolhidos por serem as duas principais fontes de captação
para abastecimento da cidade de Campos dos Goytacazes. O RPS também
mereceu destaque por sofrer constantemente com o despejo de esgoto e resíduos
provenientes da indústria e da agricultura em toda sua extensão. Foram detectadas
a presença de Cafeína e Bisfenol A na amostra bruta do RPS e cafeína na amostra
tratada. As amostras coletadas em poços profundos não apresentaram valores
detectáveis, o que era de se esperar, pois a água captada em poço profundo está
menos propensa à contaminação por esgoto, principal fonte dos CE.
 13

ABSTRACT

Water is an essential resource for life. Unfortunately, water pollution has been
debated issue today, as it has increased every year. Advancements in the science,
and particularly in the chemistry, thousands of compounds are produced and
consumed daily. They are medicines, cleaning products and personal hygiene,
industrial additives, pesticides, processed foods, among others. Especially those
compounds that are not monitored by any legislation, but which are likely to be
harmful to health and the environment are recognized in the scientific environment as
emerging contaminants (EC). In addition to large-scale production, with the lack of
adequate re-management of the generated waste and the lack of basic sanitation,
the result is that these compounds are dumped into the aquatic bodies through the
domestic and industrial sewage, often without any treatment. This work had the
objective of validating methodology for the analysis of 8 emerging contaminants: 4 n-
nonylphenol, 17-alpha ethynyl estradiol, atrazine, bisphenol A, caffeine, diclofenac,
simazine and triclosan. The methodology included solid phase extraction (EFS) using
the Oasis HLB (Waters) cartridge followed by analysis in gas chromatography
coupled to mass spectrometry (GC-MS). After the validation of the method, it was
used to analyze raw and treated water samples, the surface samples coming from
the Paraíba do Sul River and the underground samples from deep wells in the
locality of Donana. These points were chosen because they are the main source
water supply for the city of Campos dos Goytacazes. The RPS also deserved to be
highlighted by constantly suffering from the discharge of sewage and waste from
industry and agriculture in its entire length. Caffeine and Bisphenol A were detected
in the raw sample of RPS and caffeine in the treated sample. The samples collected
in deep wells did not present detectable values, which was to be expected, because
the water collected in the deep well is less prone to contamination by sewage, the
main source of EC.
 14

1. INTRODUÇÃO

A água é um dos recursos naturais mais importantes à sobrevivência da vida.

Segundo o Relatório Mundial das Nações Unidas sobre o Desenvolvimento dos
Recursos Hídricos (UNESCO, do inglês United Nations Educational Scientifc And
Cultural Organazation, 2015), a água é essencial também na oferta da maioria dos
bens e serviços, incluindo alimentos, energia e produtos. Portanto, o consumo de
água só tende a aumentar, não só pelo aumento da população mundial, mas
também devido à falta do uso consciente deste recurso. Segundo este mesmo
relatório, nos últimos 20 anos o consumo de água dobrou em relação ao aumento da
população. Além do padrão de consumo irresponsável, outros fatores também foram
associados a possível futura falta de água, como as práticas agrícolas inadequadas
e a poluição dos mananciais, prejudicando a oferta de água limpa no mundo.

No Brasil, a principal fonte de contaminação das águas se dá por lançamento

de esgoto doméstico in natura nos corpos aquáticos (Silva e Collins, 2011). Segundo
o Censo Demográfico do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, (IBGE, 2010)
o esgotamento sanitário é o maior desafio em termos de saneamento básico,
influenciando diretamente na saúde da população bem como na preservação do
meio ambiente. A Pesquisa Nacional de Saneamento Básico (PNSB, 2008) afirmou
que mais da metade dos municípios brasileiros (em torno de 67%) não tem rede
geral coletora de esgoto, o que somam cerca de 32 milhões de domicílios. Dos
municípios que coletam esgoto, apenas 1/3 realizam algum tipo de tratamento.
Segundo o SNIS, Sistema Nacional de Informações sobre Saneamento (BRASIL,
2014), Campos dos Goytacazes, em 2014, coletava aproximadamente 70% do
esgoto produzido e tratava 100% do montante coletado. A figura 1 mostra as regiões
onde se concentram os municípios com atendimento de rede de esgoto sanitário, o
que acontece principalmente nas regiões sul e sudeste (PNSB, 2008).
 15

Figura 1- Mapa com a distribuição de municípios atendidos com rede de esgoto sanitário no
Brasil (PNSB, 2008).

O esgoto lançado nas águas superficiais possui além de matéria orgânica e

organismos patogênicos, vários contaminantes químicos sintéticos. Embora não se
possa negar a grande contribuição da química no cotidiano moderno, facilitando e
melhorando a qualidade de vida do ser humano, infelizmente todos os dias, milhares
de compostos químicos são despejados nos corpos aquáticos, através do esgoto
doméstico e industrial, muitas vezes, sem nenhum tratamento. Dentro desta
realidade, órgãos ambientais de diversos países têm desenvolvido pesquisas no
sentido de caracterizar e controlar as substâncias, incluindo os produtos químicos,
que podem impactar de forma negativa o meio ambiente e a saúde humana (Silva e
Collins, 2011). Um exemplo é a Agencia de Proteção Ambiental dos Estados Unidos
(USEPA, do inglês, United State Environmental Protection Agency), que em 2015
atualizou uma lista com 112 substâncias consideradas contaminantes prioritários.
São 100 substâncias químicas, incluindo fármacos, pesticidas, hormônios,
subprodutos de desinfecção, produtos utilizados na indústria, além de 12
contaminantes microbiológicos. Segundo a USEPA (2015), esta lista é composta por
contaminantes aos quais não existe nenhuma proposta de regulamentação ou
legislação vigente prevendo concentrações mínimas a fim de garantir a potabilidade
da água, mas que, sendo passíveis de serem encontradas, podem requerer no
futuro algum tipo de regulamentação. Esse objetivo tem sido alcançado por essa
 16

organização, uma vez que 4 substâncias químicas da lista de contaminantes

prioritários (USEPA, 2009) foram regulamentados em 2016 sendo eles: dimetoato,
1,3-dinitrobenzeno, terbufós, e terbufós sulfona. (USEPA, 2016). A definição da
USEPA para contaminantes prioritários não difere muito das definições para
contaminantes emergentes (CE), estabelecidos por inúmeras organizações e
autores. A concentração destes compostos em águas naturais e tratadas são da
ordem de ng/L a µg/L, exigindo métodos bastante sensíveis e etapas de pré-
concentração para que possam ser medidos com confiabilidade.

2. OBJETIVO

O objetivo deste trabalho foi validar metodologia de análise de alguns

contaminantes emergentes em águas naturais, encontrando as melhores
recuperações, analisando por cromatografia a gás com espectrometria de massas
(CG- EM).

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Contaminantes Emergentes em Ambientes Aquáticos: Definição, Fontes

de Contaminação e Efeitos Adversos.

Muitas definições aparecem na literatura para contaminantes emergentes.

Abaixo se encontram algumas definições:

 Definição da USEPA: “Poluentes que, atualmente, não são incluídos em

programas de monitoramento e que podem se tornar candidatos para
legislações futuras, dependendo de pesquisas sobre a toxicidade, efeitos
sobre a saúde, percepção pelo público, assim como dados sobre sua
ocorrência em vários ambientes.” (Rocha e Júnior,2014)
 Definição da Agência de Pesquisas Geológicas dos Estados Unidos (USGS,
do inglês, United States Geological Survey): “Qualquer produto químico
 17

sintético, ou natural, ou qualquer microorganismo, que não é normalmente

monitorado, mas tem o potencial para entrar no ambiente e causar danos
ecológicos e à saúde humana, sendo os efeitos conhecidos ou suspeitos”.
(USGS, 2016).

Qualquer composto químico presente em diversos produtos comerciais
(medicamentos, produtos de higiene, embalagens de alimentos, agrotóxicos,
entre outros) ou qualquer microorganismo que possa ser encontrado em
matrizes ambientais e biológicas, e que não sendo monitorado ou não
possuindo legislação regulatória, apresente risco à saúde humana e ao meio
ambiente. (Silva e Collins, 2011).

A contaminação do meio ambiente se dá pelo descarte desses compostos em

rios, solo e sedimentos (Silva e Collins, 2011), ocorrendo de duas formas:

 Por fontes pontuais, ou seja, com fácil identificação da origem. Os exemplos

são: derramamentos acidentais, enchentes e aporte de efluentes domésticos
e industriais, sem tratamento (esgoto bruto), ou até mesmo tratados,
diretamente em rios e lagos, sendo esta a principal fonte de contaminação
das águas superficiais. (Machado,2015; Ghiselli e Jardim, 2007).
 Por fontes não pontuais, também chamadas de difusas, com difícil
identificação quanto à sua origem, sendo alguns exemplos: deposições
atmosféricas, escoamentos superficiais vindos da agricultura e escoamentos
de águas de chuvas. (Machado, 2015; Ghiselli e Jardim, 2007).

Quanto à contaminação humana, a ingestão de água potável é a principal

fonte de incursão, uma vez que muitos desses compostos não são totalmente
retirados pelos métodos de tratamento convencionais empregados em ETA (Estação
de tratamento de água) e ETE (Estação de tratamento de esgoto) (Machado,2015).

Vários efeitos tóxicos, ou seja, efeitos desfavoráveis aos organismos vivos,

causados pelas diversas classes de contaminantes emergentes (Ghiselli e Jardim,
2007), mesmo em baixíssimas concentrações, têm sido destacados pelos autores da
área, estando resumidos abaixo: (Bechara, 1992; Baird, 2002; Birkett e Lester, 2003;
Hoffman et al., 2003 apud Ghiselli e Jardim, 2007; Larsson et al., 1999; Mendoza,
Rodrigues et al., 2011; Sumpter; Johnson, 2005; Waring; Harris, 2005; Ishibashi et
 18

al., 2004; apud Machado, 2015; Hayes et al., 2010; Herman-Giddens, 2007; Tanner,
1973; Weber et al., 2002; Harrison et al., 1997; Toppari et al., 1996; Sharpe e
Skakkebaek, 1993; Wolff et al., 1993; Wan et al., 2010; apud Raimundo, 2011 ).

 Disfunção do sistema endócrino e reprodutivo de seres humanos e animais;

 Antecipação da idade da menarca;
 Abortos espontâneos;
 Distúrbios metabólicos, como a disfunção na tireoide;
 Aumento de casos de câncer como de mama, testículo e próstata;
 Bactérias resistentes;
 Defeitos congênitos;
 Infertilidade Masculina (devido à queda da taxa de espermatozoides);
 Alterações no sistema neurológico.

3.2 Classes de Contaminantes Emergentes

Dentre os 8 compostos estudados neste trabalho, 7 pertencem à classe dos

interferentes endócrinos, sendo exceção apenas o Diclofenaco, que se encontra na
classe dos produtos farmacêuticos. Os interferentes endócrinos foram divididos em
três classes principais: estrogênios naturais, estrogênios sintéticos e
xenoestrogênios. Abaixo consta um breve resumo desses compostos, onde foram
analisados sua utilização na sociedade, propriedades físico-químicas e danos à
saúde e ao meio ambiente. As fórmulas estruturais foram retiradas da base de
dados do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST, do Inglês National
Institute of Standards and Technology).

3.2.1 Produtos Farmacêuticos

Os medicamentos têm chamado à atenção mundial dos pesquisadores devido

a sua intensa utilização. As técnicas de tratamento de esgoto convencionais não são
capazes de retirar totalmente os fármacos do esgoto tratado (Silva e Collins, 2011).
O diclofenaco é um anti-inflamatório de ação analgésica, antirreumática e
antitérmica. É um fármaco persistente durante o processo de tratamento de esgoto,
 19

e por isso de difícil remoção. (Ghiselli, 2006; Lonappan et al. 2016). Estudos
demonstraram que a exposição crônica ao Diclofenaco, em concentrações à nível de
ng L-1 apresentou efeito tóxico em peixes, retardando o crescimento do ovo, gerando
atraso na eclosão e até mesmo baixa taxa de eclodibilidade. (Letzel et al., 2009;
Hallare et al., 2004; apud Lonappan et al. 2016). Sendo o Diclofenaco facilmente
degradado pela luz solar, através da fotodegradação, uma grande preocupação tem
sido a pouca compreensão em relação aos seus metabólitos, uma vez que estudos
demonstraram que estes podem ser até seis vezes mais tóxicos que o próprio
Diclofenaco (Schitt – Jansen et al., 2007; Schulze et al., 2010; apud Lonappan et al).
Sabe-se também que alguns complexos metálicos de Diclofenaco tem ação
bactericida (Refat et al., 2014; apud Lonappan et all, 2016), havendo a chance de
que o Diclofenaco possa se ligar a poluentes inorgânicos, como os presentes no
esgoto, passando a apresentar toxicidade também para outros organismos.
(Lonappan et al. 2016).

Figura 2 – Estrutura Química do Diclofenaco (NIST)

3.2.2 Interferentes Endócrinos

Existe hoje diversos trabalhos científicos que relacionam a exposição de

substâncias químicas às disfunções no sistema endócrino dos seres humanos e
animais (Ghiselli e Jardim, 2007). Quanto à origem, os interferentes endócrinos
podem ser biogênicos (de origem natural), como por exemplo, os estrogênios do
metabolismo animal, ou antrópicos (produzido pelo homem), onde estão incluídos os
hormônios sintéticos, como por exemplo, os contraceptivos, e as substâncias
produzidas para utilização na indústria, na agricultura, entre outros. (Silva e Collins,
2011).
 20

O sistema endócrino é formado por glândulas, localizadas em diferentes

áreas do corpo, responsáveis por produzir hormônios que são liberados na corrente
sanguínea e que se ligam a determinados receptores presentes em vários órgãos e
tecidos. (USEPA, 2016). Os hormônios, geralmente produzidos em quantidades
muito baixas, têm como tarefa principal coordenar todo o funcionamento do
organismo, (Ghiselli e Jardim, 2007) por isso uma desregulação nesse sistema pode
causar prejuízo a todos as partes do corpo, sem exceções. Segundo a USEPA
(1997), os interferentes endócrinos interferem diretamente na síntese, secreção,
transporte, ligação, ação ou eliminação desses hormônios naturais do corpo.

Figura 3 Glândulas dos seres humanos que produzem hormônios reguladores de diferentes
atividades no organismo (Fonte: Beraldo, 2012).

Os desreguladores endócrinos atuam interagindo com os receptores

hormonais de três formas principais, conforme descrito pelo Instituto Nacional de
Ciências Ambientais e de Saúde dos Estados Unidos, (NIEHS, do inglês, National
Institute Of Environmental Health Science, 2016).

 Ligam-se ao receptor da célula, bloqueando a ligação do hormônio natural, de

forma que nenhuma resposta é produzida. Este processo é chamado de
antagonista (NIEHS, 2016).
 Ligam-se ao receptor da célula, imitando a ação do hormônio natural
(mimetização), produzindo uma resposta. Este processo é chamado de efeito
agonista (NIEHS, 2016).
 Interferem ou bloqueiam a maneira natural como os hormônios e receptores
são produzidos ou controlados (NIEHS, 2016), podendo alterar, por exemplo,
 21

a síntese e o transporte, afetando dessa forma a concentração dos mesmos.

(Ghiselli e Jardim, 2007).

Figura 4 Formas de Interação entre os Desreguladores Endócrinos e os Receptores

Hormonais. (Beraldo, 2012)

A principal fonte de contaminação humana por interferentes endócrinos tem

sido a alimentação, já que muitos desses compostos são utilizados tanto na
produção de alimentos industrializados como na confecção de suas embalagens.
(Ghiselli e Jardim, 2007). Outra fonte notável de contaminação é a ingestão de água,
uma vez que o processo de tratamento em ETAs e ETEs não tem sido eficiente para
remover esses compostos, principalmente devido à natureza polar da maioria deles
(Raimundo, 2011).

3.2.2.1 Xenoestrogenios

 Pesticidas

Todo pesticida tem como característica principal bloquear uma das vias
metabólicas de um organismo, levando à sua morte. A maioria dos pesticidas é
persistente no meio ambiente, têm considerável estabilidade química, baixa
solubilidade em água e é de fácil bioacumulação (Ghiselli e Jardim, 2007). Os
 22

herbicidas, principalmente os triazínicos, são considerados interferentes endócrinos,

destacando-se a Atrazina e a Simazina (Figura 5).

Figura 5 Estrutura Química da Simazina e da Atrazina respectivamente (NIST)

A principal forma de contaminação das águas superficiais se dá pela lixiviação

do solo usado na agricultura, onde se aplica os agrotóxicos (Machado, 2015).
Estudos mostraram que a Atrazina provocou a feminização de anfíbios e castração
de rãs em exposição crônica (Hayes et al., 2010 apud Raimundo, 2011). No Brasil, o
boletim de comercialização de agrotóxicos, mostra um aumento na comercialização
da Atrazina, onde este princípio ativo passa da 7° posição em 2009 para 4° posição
em 2012 em número de vendas (IBAMA, 2012). Segundo Pereira, tanto a Atrazina
quanto a Simazina possuem potencial de acumulação no meio ambiente e
mecanismos de toxicidade neuroendócrinos parecidos (Pereira, 2011).

A portaria 2914/2011 do Ministério da Saúde que trata da potabilidade da

água para consumo humano estabelece limites para Atrazina e Simazina em 2 µg/L,
mas segundo Montagner (2011) este limite é baseado em efeitos tóxicos que não
levam em consideração efeitos nocivos em concentrações mais baixas.

 Aditivos Industriais

O Bisfenol A é um aditivo empregado como monômero na produção de

plásticos do tipo policarbonato, muito utilizado na produção de embalagens para
alimentos e bebidas, como garrafas plásticas e mamadeiras. Também é componente
da resina epóxi, matéria prima utilizada no revestimento interno de embalagens
 23

metálicas e também de selantes dentários. (Ghiselli e Jardim, 2007; Beraldo, 2012;

Machado, 2015).

Figura 06 Estrutura Química do Bisfenol A (NIST)

O Brasil proibiu, através da Resolução da Diretoria Colegiada (RDC n° 41, de

16 de setembro de 2011) da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) a
comercialização de mamadeiras contendo Bisfenol A em sua composição. Para os
demais produtos fabricados ou importados foi estabelecido um limite máximo de
migração específico (LME) do Bisfenol A para o alimento em 0,6 mg/Kg.

 Surfactantes (não iônico)

Os surfactantes são moléculas anfifílicas, ou seja, possuem uma parte

hidrofílica (polar), que pode ser carregado ou não, e uma parte hidrofóbica (apolar),
sendo amplamente utilizado em produtos de limpeza e de higiene pessoal, entre
outros (Raimundo, 2011). Um grupo de surfactantes não iônicos muito utilizado pela
indústria são os alquilfenóis polietoxilados, sendo 80% de nonilfenol etoxilado e 20%
de octilfenol etoxilado (Machado, 2015). A degradação desses compostos em ETE é
geralmente incompleta, gerando subprodutos mais tóxicos e persistentes como o
nonilfenol e o octilfenol, que apresentam alta atividade estrogênica (Machado, 2015).
O nonilfenol é inclusive um dos contaminantes prioritários conforme a lista da
USEPA (2015).

Figura 7 Estrutura Química do Nonilfenol (NIST)

 24

 Produtos de Limpeza e Higiene Pessoal

Os produtos de higiene pessoal também têm despertado interesse, pois assim

como os fármacos, são grandemente utilizados e o tratamento convencional de
efluentes não é capaz de fazer sua completa retirada (Silva e Collins, 2011). O
Triclosan pode estar presente em cremes dentais, antissépticos bucais,
desodorantes, xampus e sabonetes devido a sua ação bactericida (Silva e Collins,
2011; Machado, 2015; Raimundo, 2011).

Figura 8 Estrutura Química do Triclosan (NIST)

Além de interferir no sistema endócrino, estudos tem demonstrado que o

triclosan pode contribuir para a resistência das bactérias aos antibióticos (Ishibashi
et al., 2004 apud Machado, 2015).

3.2.2.2. Estrogênios Sintéticos

 Anticoncepcionais

O hormônio sintético 17 alfa-etinil-estradiol compõe a lista da USEPA (2015)

de contaminantes prioritários, sendo um hormônio estrogênico usado em
contraceptivos orais veterinários e humanos. Segundo Raimundo (2011), a
exposição crônica à esse hormônio através de esgoto contaminado, levou a
feminização de peixes.
 25

Figura 9 Estrutura Química do 17-alfa-etinil-estradiol (NIST)

3.2.3 Cafeína como indicador de contaminação por interferentes

endócrinos

A cafeína pode ser encontrada em alimentos e medicamentos, sendo sua

presença nos corpos d’água uma importante indicação das condições do manancial.
Uma vez que os tratamentos de água convencionais não possuem recursos para
retirar completamente substâncias como a cafeína, a presença da mesma é utilizada
como indicador de contaminação fecal procedente do esgoto sanitário (Canela et al,
2014). Um trabalho evidenciado por Sodré mostra que no Brasil, a principal fonte de
cafeína nas águas superficiais se deve a descargas de esgoto bruto diretamente
lançado nos corpos aquáticos (Sodré, 2009). A cafeína é muito solúvel em água, e
como altas concentrações são encontradas no esgoto, ela se torna um marcador de
contaminação por esgoto muito sensível (Machado, 2015). Montagner, (2014)
relaciona a presença de cafeína com a atividade estrogênica de amostras de água.
Segundo este trabalho o aumento da concentração de cafeína é indicativo de
contaminação por esgoto e consequentemente da presença de outros compostos
que apresentam atividade estrogênica, como hormônios e produtos farmacêuticos.
Os testes de estrogenicidade confirmaram que quanto maior a concentração de
cafeína maior a probabilidade que a amostra apresente atividade estrogênica. É
importante destacar que a cafeína não é disruptor endócrino e não apresenta risco à
saúde humana, sendo sua presença um indicador de que outros compostos
oriundos do esgoto sanitário, entre eles, os disruptores endócrinos, poderão também
estar presentes.
 26

Figura 10 Estrutura Química da Cafeína (NIST)

3.3 Extração e Análise de Contaminantes Emergentes

Contaminantes emergentes têm sido determinados em diversas matrizes

ambientais, sendo que a matriz aquosa é a mais analisada. Em relação às técnicas
de extração e análise, a extração em fase sólida seguida de cromatografia gasosa
acoplada à espectrometria de massas ou cromatografia liquida de alta eficiência
acoplada à espectrometria de massas são as mais utilizadas por causa da
sensibilidade e seletividade das mesmas (Gerolin,2008).

3.3.1 Preparo da Amostra: Extração em Fase Sólida

A extração em fase sólida (EFS) é uma técnica simples de extração e de

concentração de compostos e que utiliza pequenas quantidades de solventes
(Gerolin, 2008), sendo a técnica mais empregada atualmente para amostras líquidas
(Silva e Collins, 2011), principalmente na análise traço de contaminantes orgânicos
em matrizes aquosas (Gerolin,2008). Geralmente a fase sólida, também chamada
de sorvente, se encontra dentro de um cartucho, empacotado entre dois filtros
(Canela et al, 2014; Gerolin, 2008), sendo que o tipo de material sorvente dependerá
das características do analito que se quer reter e de sua matriz de origem (Silva e
Collins, 2011; Gerolin, 2008). Algumas limitações da técnica são o alto custo do
equipamento de extração (manifold) e dos cartuchos, além da saturação do
sorvente.
 27

A seguir estão definidas as etapas (1-5) de extração em fase sólida (Canela et

al, 2014; Beraldo, 2012; Gerolin, 2008; Machado,2015):

1 2 3 4 5

Figura 11 Esquema da Extração em Fase Sólida (Canela et al, 2014)

 (1) Cartucho: Recipiente onde o material adsorvente está compactado entre

dois filtros. Este material geralmente contém fases poliméricas mistas que
apresentam interações hidrofílicas e hidrofóbicas, adsorvendo assim uma
maior faixa de compostos orgânicos, de polaridade média a intermediaria.
 (2) Condicionamento: Tem a finalidade de ativar o material adsorvente
através da passagem de um ou mais solventes orgânicos. É importante que
não se deixe o adsorvente secar nesta etapa para que não se criem caminhos
preferenciais que interfiram no resultado da extração.
 (3) Extração: Percolação da amostra a um fluxo baixo, com consequente
retenção de analito e impurezas.
 (4) Lavagem: É percolado um solvente que tenha afinidade pelos
interferentes, removendo-os, mantendo os analitos adsorvidos à fase solida.
 (5) Eluição: Passagem de um pequeno volume de solvente que remova os
analitos de interesse adsorvidos, resultando em uma amostra pré-
concentrada.
 28

3.3.2 Métodos de Análise

Duas técnicas de separação muito utilizadas em química analítica são a

cromatografia gasosa e a cromatografia líquida, sendo ambas as mais utilizadas
para determinação de compostos emergentes em água. O esquema abaixo mostra
qual a melhor técnica de separação baseado nas propriedades físico químicas de
polaridade e volatilidade para compostos orgânicos. A zona de interferência ocorre
quando os dois métodos de separação podem ser utilizados para determinados os
analito (Silva e Collins, 2011; Machado, 2015; Giger, 2008).

Figura 12 - Diagrama de polaridade - volatilidade mostrando a tendência para a escolha

entre cromatografia gasosa ou líquida conforme características físico-químicas das
substancias. (Silva e Collins, 2011)

3.3.2.1 Cromatografia Gasosa e Derivatização

Como pode ser visto na figura 12, a cromatografia gasosa produz melhores
separações quanto mais volátil e apolar for o composto. No entanto a maioria dos
contaminantes emergentes presentes em matrizes aquosas apresentam grupos
polares, logo menos voláteis (Machado, 2015). Para analisar tais substâncias por
 29

cromatografia gasosa é necessário realizar uma etapa a mais na preparação da

amostra chamada derivatização. A derivatização modifica grupos funcionais da
molécula, como os grupos carboxila, hidroxila, tiol e amino a fim de aumentar a
volatilidade, melhorando assim o limite de detecção por cromatografia gasosa
(Machado, 2015; Silva e Collins, 2011; Giger, 2008). Os reagentes derivatizantes
geralmente utilizados são o N-metilbis(trifluoroacetamida), conhecido como MBTFA
e o bis-(trimetilsilil)trifluoroacetamida, também chamado de BSTFA (Ghiselli,2006).

A detecção por espectro de massas (EM) e a ionização por impacto de

elétrons tem sido as técnicas mais utilizada em cromatografia gasosa para análise
de CE, devido aos ótimos limites de detecção alcançados e a utilização de
bibliotecas com milhares de espetros de massas para confirmação de estruturas
(Silva e Collins, 2011).

A espectrometria de massas identifica a substância através de padrões de

fragmentação e das razões massa/carga após a mesma receber uma descarga
elétrica que promove sua ionização (Canela et al, 2014). A figura 13 mostra um
diagrama de como funciona um espectrômetro de massas: a amostra é ionizada
pela fonte de ionização, produzindo íons moleculares e íons de fragmentos; o
analisador seleciona os íons pela razão massa carga; o detector produz um sinal
elétrico ao ser atingido pelos íons selecionados gerando um sinal que pode ser
ampliado e por fim é registrado (Skoog,2006).

Figura 13 - Diagrama de funcionamento do espectrômetro de massas (Skoog, 2006).

 30

3.4 Validação de Metodologia para Análise

3.4.1 Conceitos Gerais

O processo de validação é reconhecido por órgãos nacionais e internacionais

como um dos fatores fundamentais que garantem a qualidade e a confiabilidade em
uma análise química analítica (IUPAC, 1999). O termo validação tem sido definido
por inúmeros autores e agências reguladoras, sendo algumas destas definições
transcritas abaixo:

 Os laboratórios devem “demonstrar, por meio de validação, que os métodos

de ensaio que executam, conduzem à resultados confiáveis e adequados à
qualidade pretendida.” (INMETRO, 2011)
 “A validação deve garantir, por meio de estudos experimentais, que o método
atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade
dos resultados” (ANVISA, 2003).
 “O método de validação faz uso de um conjunto de testes onde se avalia
tanto as premissas no qual o método analítico é baseado, quanto se
estabelece e documentam-se suas características, demostrando assim se o
método é adequado para uma finalidade analítica particular”. (IUPAC, 1999)
 “Confirmação por testes e apresentação de evidencias objetivas de que
determinados requisitos são preenchidos para um dado uso intencional”. (ISO
17025, 1999)
 “O principal objetivo da validação de um método analítico é demonstrar que o
procedimento é adequado para a sua finalidade pretendida”. (ICH, 1995)
 “Determina a adequação de uma análise no sentido de fornecer a informação
desejada” (Skoog, 2006).

Quanto aos tipos de validação, a literatura nos informa sobre dois tipos: O
primeiro é a chamada validação completa, que requer a avaliação do desempenho
do método em vários laboratórios a fim de que se avaliar a sua reprodutibilidade. O
segundo é a validação do método para um laboratório em particular, cuja principal
 31

função é avaliar um método desenvolvido para uso local, não sendo necessário
avaliar a reprodutibilidade (IUPAC, 1999; Ribani et al, 2004).

3.4.2 Parâmetros analíticos para validação

Não existe um procedimento de validação padrão, portanto devem ser

conhecidas e avaliadas as características gerais envolvidas em uma metodologia de
análise e a partir disto se elaborar o método mais eficiente de validação. Algumas
informações úteis seriam: tipo de analito e sua quantidade presente na amostra (de
traços a compostos majoritários), quantidade de amostra disponível, variação da
faixa de concentração, matriz, interferentes, possíveis produtos de degradação,
frequência de utilização do método, tipo de validação a ser aplicado, intensão do uso
(análise quantitativa ou qualitativa) etc.

Foram analisados quatro documentos oficiais, sendo dois nacionais e dois

internacionais, onde cada um traz uma lista de parâmetros de validação, que em
geral, trazem o mesmo significado, modificando apenas a finalidade de uso. A partir
desta comparação foi elaborada a tabela 1, onde estão listados somente os
parâmetros presentes em todos os documentos, concluindo assim serem
importantes para qualquer validação e por isso foram utilizados na metodologia
deste trabalho.

Tabela 1 – Parâmetros avaliados em uma validação de métodos segundo agências

nacionais e internacionais.

Parâmetros
*
Seletividade (INMETRO e IUPAC****) ou Especificidade (ANVISA** e ICH***)
Linearidade
Precisão
Exatidão
Limite de Detecção
Limite de Quantificação (INMETRO, ANVISA e ICH) ou Limite de Determinação
(IUPAC)
Faixa de Trabalho (INMETRO) ou Intervalo (IUPAC, ANVISA e ICH)
* INMETRO: Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial
 32

**ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária

***ICH: International Conference on Harmonisation

****IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry

Abaixo está uma breve definição sobre os parâmetros acima relacionados:

Seletividade: É a habilidade do método em medir o composto de interesse na

presença de outros componentes (impurezas, produtos de degradação,
componentes da própria matriz) que possam atuar como interferentes, aumentando
ou reduzindo o sinal analítico. A falta de seletividade pode comprometer seriamente
a linearidade, a exatidão e a precisão, por isso deve-se avaliar a presença de
qualquer importante interferente (IUPAC, 1999; INMETRO, 2011; ANVISA, 2003).
Para muitas análises, a seletividade é avaliada qualitativamente, através de ensaios
utilizando padrões, materiais de referências e amostras com e sem o analito. Pode-
se comparar o espectro do pico obtido na análise de uma amostra com o pico de um
padrão. Pode-se também comparar o branco da matriz e a matriz fortificada (Gerolin,
2008). Em relação aos métodos cromatográficos, a análise de um cromatograma
representativo já pode ser útil para avaliar a seletividade. Por exemplo, para
separações críticas, a especificidade pode ser demonstrada através de uma boa
resolução de separação entre dois picos com tempos de retenção próximos
(INMETRO, 2011; ICH, 1995).

Linearidade: É a capacidade do método em responder proporcionalmente ao

aumento de concentração do analito na amostra, dentro de uma determinada faixa
de aplicação (INMETRO, 2011). É preparada uma curva de calibração, de pelo
menos 5 pontos diferentes (INMETRO, 2011; ANVISA, 2003; ICH, 1995), utilizando
o método de padronização externa ou interna (INMETRO, 2011). As respostas
obtidas são utilizadas para calcular, pelo método dos mínimos quadrados, a
equação da reta (ou equação da regressão linear), que relaciona matematicamente
a relação entre o sinal medido e a concentração do padrão. Essa equação será
usada, para determinar a concentração do analito em uma amostra real, ao qual
será adicionado à mesma quantidade de padrão interno (Ribani, 2004). Quanto ao
número de replicatas usadas na construção da curva analítica para cada nível de
concentração, deve haver uma representatividade do que acontece na rotina do
 33

laboratório (INMETRO, 2011). A IUPAC (1999) recomenda no mínimo, a análise em

duplicata, sendo preferível fazer triplicatas ou mais repetições.

O INMETRO (2011) define a equação da reta da seguinte forma:

y = a + bx

Onde:

y = resposta medida pelo método (Pode ser a área ou altura do pico por exemplo)

x = concentração

a = interseção com eixo y, quando x for 0. (Coeficiente Linear)

b = inclinação da curva analítica (Coeficiente Angular)

O método dos mínimos quadrados fornece a reta que melhor se ajuste a

todos os pontos experimentais (Skoog, 2006). Destacando a importância do
coeficiente angular (b), podemos afirmar que quanto mais inclinada a reta, maior a
sensibilidade do método a pequenas variações de concentração, ou qualquer outra
propriedade medida (INMETRO, 2011; Gerolin, 2008). Outra informação importante
obtida a partir deste método é o coeficiente de correlação (r) que indica o quanto a
relação linear consegue explicar as variações de y (Skoog, 2006). Quanto mais
próximo de 1, maior a indicação de agrupamento dos pontos experimentais, o que
eleva a qualidade da curva, indicando um ajuste ideal dos dados pela linha de
regressão. (Ribani et al, 2004). A ANVISA (2003) determina que o coeficiente de
correlação deve ser no mínimo 0,99.

Entre os dois métodos de preparação da curva analítica citados, falaremos

aqui daquele que será utilizado neste trabalho, a padronização interna, que se
diferencia da padronização externa apenas por utilizar uma espécie de referência a
mais, conhecida como padrão interno. A utilização do padrão interno tem a função
de eliminar pequenas variações experimentais como temperatura da coluna e
volume de amostra, o que se mostra muito útil para cromatografia gasosa uma vez
que a injeção da amostra é feita manualmente. O padrão interno deve ter as
seguintes características: ser parecido com a substância a ser analisada, ter tempo
 34

de retenção próximo a ela, não reagir com nenhum outro componente da matriz,
além de não fazer parte amostra. (Ribani, 2004).

Padronização interna: Preparam-se soluções padrão de concentrações

conhecidas, às quais se adicionam uma mesma quantidade de um segundo padrão,
denominado padrão interno e analisa-se pelo método proposto. Com os sinais
medidos é possível gerar um gráfico de regressão linear, que relaciona a razão entre
as áreas padrão analito/padrão interno com a concentração real do padrão do
analito. A amostra também deverá conter a mesma quantidade de padrão interno
(Ribani et al, 2004). A área do padrão interno será comparada nas injeções das
soluções padrão e das amostras, assim poderá se verificar alguma variação de sinal
dos compostos analisados. (Silva e Collins, 2011).

Limite de quantificação: É a menor concentração do analito que pode ser

determinada mantendo-se a precisão e a exatidão (ANVISA, 2003). Uma das
maneiras de se determinar o LQ é analisando soluções com concentrações
decrescentes do analito e avaliando o ruído da linha base em comparação com o
sinal do analito: O limite de quantificação corresponderá a concentração que
apresentar relação sinal-ruído de 10:1 (ANVISA, 2003; ICH, 1995). Para analise de
concentrações traço porém, o INMETRO (2011) recomenda que o limite de
quantificação seja a menor concentração da curva analítica.

Limite de detecção: É a menor concentração do analito que pode ser

detectada com confiabilidade pelo método. Existem pelo menos 3 técnicas diferentes
para este tipo de análise: avaliação visual, relação sinal-ruído e método baseado na
curva analítica (Ribani et al, 2004). Neste trabalho procurou-se utilizar a segunda
opção, onde se analisa soluções com concentrações decrescentes do analito até o
menor nível detectável, correspondendo a um valor de sinal-ruído de 3:1 (ANVISA,
2003), ou ainda 2:1 (ICH, 1995). A apresentação de um cromatograma com essas
características já serve de embasamento para justificar o LD (ICH, 1995). O
INMETRO (2011) recomenda um número mínimo de 7 replicatas para este tipo de
ensaio, mas também informa que fazer muitas replicatas, neste caso, pode
“superestimar o limite de detecção”, logo é importante que este número represente o
que rotineiramente se faz no laboratório.
 35

Intervalo: Esse parâmetro é derivado do estudo da linearidade do método e

corresponde a faixa de concentração que abrange o limite máximo e mínimo de
quantificação em que o método pode ser aplicado, mantendo-se a exatidão,
linearidade e precisão (INMETRO, 2011; ANVISA, 2003; ICH, 1995). Inicialmente,
testa-se um intervalo de concentração preliminar, geralmente baseado em dados da
literatura para a análise em questão. Esse intervalo deve comportar a faixa de
aplicação do método, sendo ainda recomendado que a concentração mais esperada
a ser encontrada para a amostra se situe no centro desta faixa. Dentro da faixa de
trabalho é possível existir ainda a faixa linear de trabalho, onde o sinal do método
tem uma relação linear com a concentração ou propriedade medida do analito
(INMETRO, 2011).

Exatidão: É a proximidade com que um resultado medido se aproxima do

valor real (ANVISA, 2003). Este parâmetro deve ser determinado após o
estabelecimento da especificidade, linearidade e intervalo linear (ANVISA, 2003). Na
prática, a exatidão é calculada como porcentagem de recuperação da concentração
medida em relação à concentração teórica:

Exatidão = Recuperação em % = (concentração medida / concentração teórica) x 100

Dentre os procedimentos utilizados para avaliar a exatidão temos: materiais

de referência, comparação de métodos, adição padrão e ensaios de recuperação
(IUPAC, 1999; Ribani et al, 2004). Daremos ênfase ao ensaio de recuperação por
ser o método usado aqui para avaliar a exatidão. Em um teste de recuperação, as
amostras são fortificadas com quantidades conhecidas do analito (INMETRO, 2011),
sendo exigido pelo ICH a fortificação em pelo menos 3 níveis de concentração,
analisadas em triplicatas (IUPAC, 1999). A ANVISA também determina que essas
concentrações sejam baixa, média e alta em relação ao intervalo linear (ANVISA,
2003).

Segundo o ICH, uma boa recuperação não é garantia de exatidão, embora

um resultado baixo de recuperação é certamente um indício da falta do mesmo
(IUPAC, 1999). Isso se deve ao fato de que o analito adicionado pode não estar na
mesma forma do analito nativo da amostra, ocasionando assim uma recuperação
fora da realidade do que aconteceria em uma amostra real (Ribani et al, 2004).
Quanto aos níveis de recuperação aceitáveis, a literatura não oferece muitas
 36

informações a respeito. Para analise de resíduos, o GARP (Grupo de Analistas de

Resíduos de Pesticidas) (1999 apud Ribani, 2004) considera que os níveis de
recuperação aceitáveis podem ir de 70% a 120%, com precisão de +- 20%, e ainda
dependendo da complexidade da matriz ou da análise, se aceitam recuperação de
50 a 120 % com precisão de +- 15%.

Precisão: Avalia a proximidade dos valores em uma série de medidas de

uma mesma amostra (ANVISA, 2003). Pode ser expressa por três formas diferentes:
repetibilidade ou repetitividade, precisão intermediária, e reprodutibilidade (ANVISA,
2003; INMETRO, 2011).

Repetitividade (INMETRO, 2011), Repetibilidade ou Precisão Intra-Corrida

(ANVISA, 2003).

O INMETRO (2011) caracteriza as condições de repetitividade:

 Mesmo procedimento de medição

 Mesmo local
 Mesmo analista
 Mesmo instrumento
 Menor espaço de tempo possível

A ANVISA e o ICH recomendam as mesmas condições de análise do teste de

recuperação já descritas aqui, ou ainda a análise de seis replicatas de uma amostra
com concentração próxima do valor real esperado para o analito.

Precisão Intermediária (INMETRO, 2011) ou Precisão Inter-Corrida

(ANVISA, 2003)

Representa o nível de variação dos resultados de um laboratório (INMETRO, 2011),

logo o mais aconselhável a ser feito no caso de validação de métodos criados em
laboratórios de pesquisa de universidades. O INMETRO também caracteriza as
condições de precisão intermediária. Mantém se o mesmo procedimento de medição
e local. Podem-se variar um ou mais dos demais parâmetros (dias, analistas e
equipamentos). A ANVISA (2003) recomenda um mínimo de 2 dias diferentes com
analistas diferentes.
 37

Reprodutibilidade (INMETRO, 2011) ou precisão inter-laboratorial

(ANVISA 2003).

Utilizada em estudos entre laboratórios. Não é nosso objeto de estudo.

A precisão pode ser expressa como desvio padrão relativo (DPR) ou

coeficiente de variação (CV) (INMETRO, 2011; ANVISA 2003):

√∑𝑛
𝑖=1(𝑥𝑖−𝐶𝑀𝐷)
2
DESVPAD = 𝑛−1

Onde:

DESVPAD  Desvio Padrão

Xi  Medida

CMD Concentração Média dos Dados

n  número de amostras

𝐷𝐸𝑆𝑉𝑃𝐴𝐷
𝐶𝑉 = 𝐷𝑃𝑅 = 𝑋 100
𝐶𝑀𝐷

Onde:

CV  Coeficiente de variação

DPR  Desvio padrão relativo

DESVPAD  Desvio Padrão

CMD Concentração Média dos Resultados

Aceitam-se DPR de até 20% quando se trata da análise de traços ou

impurezas e com matriz complexa (Ribani et al, 2004).
 38

4. METODOLOGIA

A validação da metodologia para análise de compostos emergentes foi

realizada utilizando-se curvas analíticas em fase aquosa e orgânica. Posteriormente,
foi realizado um planejamento fatorial com objetivo de otimizar o método e também
obter as melhores condições de análise para todos os compostos de interesse.
Finalmente, foi realizada uma coleta em águas superficial e subterrânea, onde se
utilizou o método validado.

4.1 Equipamentos, Materiais e Reagentes

 Cromatógrafo a gás (Shimadzu CG-2010) acoplado ao detector de

espectrometria de massas (Shimadzu CG-EM-Q Plus) e coluna capilar SLB-
5ms Supelco (30m, I.D. 0,25 mm, 0,25 μm).
 Manifold para extração em fase sólida (Agilent Technologies®) de 20
posições acoplado à bomba de vácuo (Quimis, modelo Q-355J).
 Balança analítica (Shimadzu, modelo: AY220 de capacidade máxima de
medida 220 g).
 pHmetro Micronal modelo mPA 210
 Sistema de obtenção de água ultrapura tipo I – Sartorius
 Micro seringa para cromatografia gasosa de 10 μL (Hamilton).
 Micro pipetadores automáticos Gilson: 2 a 20 μL, 20 a 200 μL e 100 a1000
μL.
 Rotaevaporador Fisatom, modelo 550, série 1033810, 115V, 60Hz, 1200W
 Estufa de secagem e esterilização Solab, SL-100, 110V.
Os padrões utilizados nesse estudo foram adquiridos da Sigma Aldrich® e da
Supelco, sendo os mesmos citados na tabela 2. Os solventes foram adquiridos da
Tedia: acetonitrila (ACN), (99,7%) e metanol (MeOH), (99,9%). Toda a vidraria foi
lavada com água ultra-pura e Extran alcalino (Merck) 10%. Na etapa de filtragem, foi
utilizado funil para filtração simples e lã de vidro. Na extração foram usados
cartuchos de extração em fase sólida HBL (Oasis Waters com 500 mg de sorbente)
e rolhas e mangueiras de politetrafluoretileno (PTFE). Para concentrar e evaporar as
 39

amostras foram usados o rotaevaporador e gás argônio (5.0, Air Liquid)

respectivamente.

Tabela 2 – Lista de Padrões com informações complementares

Massa
Molar
Substância Sigla Fórmula Fornecedor Pureza
g mol-1
%

Atrazina ATZ C8H14ClN5 215,68 * 99

17alfa- EE2 C 20H24O2 296,18 * 98

etinilestradiol

Simazina SIM C7H12ClN5 201,66 * > 99

Triclosan TCS C12H7Cl3O2 289,54 * >99

4-n-nonilfenol NPN C 15H24O 220,35 * > 99

Cafeína CAF C 8H10 N4O2 194,19 * 99

Bisfenol A BPA C15H16O2 228,12 * 97

Bisfenol A 16 BPA16D C15D16O2 244 ** >99

Deuterado

Diclofenaco DCN C 14H11Cl2NO2.Na 296,15 * >99

* Sigma Aldrich ** Supelco

 40

4.2 Métodos Analíticos

4.2.1 Curva em fase Aquosa

A curva em fase aquosa é também chamada de curva recuperada uma vez

que passa por todo o processo de extração. Uma solução estoque foi preparada na
concentração de 400 mg L-1 para cada padrão, pesando-se 4 mg dos compostos
sólidos e adicionando-os em um balão volumétrico de 10 mL, o qual foi completado
com metanol. Por diluição desta solução, foram preparadas as soluções da curva
analítica nas concentrações de 1, 2, 4, 20, 40 e 100 mg L -1. Após todo o processo de
extração, no extrato final, para injeção no equipamento CG-EM, foram
acrescentados 250 μL do padrão interno em todas as amostras (padronização
interna) e 250 μL de metanol completando-se o volume para 500 μL. Para injeção no
cromatógrafo foi utilizado 1 μL da solução final.

Na tabela 3 se encontram os valores de cada padrão da curva analítica em

mg L-1, que corresponde à concentração no extrato final, com a respectiva massa
recuperada em mg e massa injetada em μg.
 41

Tabela 3 Concentrações da curva em fase aquosa com respectivas massas

recuperadas no volume final de 500 μL e massas injetadas no volume de 1 μL.

Concentração Curva analítica Massa Recuperada Massa Injetada

(mg L-1) mg (μg)

1 0,0005 0,001
2 0,001 0,002
4 0,002 0,004
20 0,01 0,02
40 0,02 0,04
100 0,05 0,1

Um branco foi também preparado usando água desionizada, passando por

todo o processo de extração, sendo então adicionado o padrão interno para injeção
no cromatógrafo.

A solução do padrão interno Bisfenol A 16 Deuterado de 20 mg L-1 foi

preparada pesando-se 2 mg do padrão em um balão de 10 mL, e seu volume foi
completado com metanol.

O processo de extração teve os seguintes passos: condicionamento do

cartucho com 7,5 ml de MeOH seguido por 10,0 ml de água; percolação de 1 L da
amostra; lavagem com 10 ml de água, secagem no vácuo por 20 minutos e eluição
com 5,0 ml de MeOH, seguido por 2,5 ml de ACN.

A extração da curva em fase aquosa e de todas as demais amostras foi feita

utilizando o cartucho HLB, (do inglês Hydrophilic-Lipophilic-Balanced) com 500 mg
de sorbente contendo uma mistura de N- vinil pirrolidona (de caráter hidrofílico) e
Divinilbenzeno (de caráter lipofílico), da marca Oasis Waters. O sistema de extração
em fase sólida foi composto de manifold para extração em fase sólida (Supelco)
acoplado à bomba de vácuo, conforme demonstra a figura 14 (Quimis, modelo Q-
355J)
 42

Figura 14 Sistema de Extração em Fase Sólida

A análise da curva aquosa e de todas as demais amostras foram realizadas

por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas utilizando o método
SIM (do inglês, Selective Ion Monitoring) onde foram escolhidos 3 íons mais
abundantes para serem monitorados de cada composto analisado conforme a tabela
4. Para todas as amostras também foram injetados 1 μL de solução.

Tabela 4 Íons selecionados para análise no método SIM

Padrões m/z* 1 m/z 2 m/z 3

4-nonilfenol 220 107 120

17-a-etinilestradiol 296 213 160

Atrazina 215 200 173

Bisfenol A 228 213 119

Bisfenol A D16 224 125 244

Cafeína 194 109 67

Diclofenaco 295 214 242

Simazina 201 186 173

Triclosan 288 218 146

*m/z relação massa/carga do íon

 43

As condições cromatográficas, também utilizadas para todas as amostras

analisadas, estão apresentadas na tabela abaixo.

Tabela 5 Parâmetros cromatográficos que foram utilizados para a realização das análises

Características da coluna SLB 5ms, 30 m x 0,25 µm

Modo Split

Gás de arraste Hélio

Temperatura do injetor 250°C

Temperatura da coluna 80 °C

Temperatura da fonte de íons 200

Fluxo total 18,2 mL/min

Razão de split 10,0

Método SIM

Volume de Injeção 1 μL

Tempo Total da Corrida 35,35 min

Rampa de Aquecimento

Razão (°C/min) Temperatura (°C) Tempo de

espera (min)

- 80.0 1.00

10 160.0 0.00

6,5 250.0 0.00

20 300.0 10.0
 44

4.2.2 Curva em fase Orgânica

A curva em fase orgânica, também chamada de curva de calibração, foi feita

diretamente em solvente, em duas faixas de concentração: 20, 40, 100 mg L -1 (alta)
e 1; 2 e 4, mg L-1 (baixa). Para sua confecção foram feitas as devidas diluições a
partir da solução estoque de 400 mg L-1. Também foram acrescentados 250 μL do
padrão interno e completando-se o volume para 500 μL, com metanol.

4.3 Validação da Metodologia

4.3.1 Seletividade

Para avaliar a seletividade foi utilizado um cromatograma representativo,

proveniente da análise da solução da curva em fase aquosa na concentração de 4
mg L-1 e também a comparação deste com o cromatograma do branco.

4.3.2 Exatidão

A exatidão foi analisada através do teste de recuperação da curva em fase

aquosa. O teste de recuperação tem a função de avaliar quanto do analito é perdido
durante o preparo da amostra (extração e concentração) até o momento da análise
(Portal, 2014). A referência foi a curva em fase orgânica, com as mesmas
concentrações da curva aquosa recuperada. Esses resultados foram comparados e
a taxa de recuperação foi a diferença entre a área do padrão na Fase Orgânica e a
área do mesmo padrão na Fase Aquosa. As curvas foram preparadas conforme
determina o ICH (1995), com pelo menos 3 níveis de concentração e analisadas em
triplicatas. Também foi seguido a recomendação da ANVISA (2003) de que essas
concentrações fossem baixa, média e alta em relação ao intervalo de concentração
esperado. Porém devido a problemas no cromatógrafo, a análise da curva em fase
orgânica não mostrou picos nas concentrações mais baixas (1,2 e 4 mg L-1), sendo
que a recuperação só pôde ser analisada nas concentrações maiores (20,40 e 100
ppm).
 45

4.3.3 Precisão

A precisão foi calculada pelo desvio padrão relativo (DPR) da curva analítica em
fase aquosa, conforme determina o INMETRO (2011) e ANVISA (2003), utilizando
se as condições de repetibilidade ou precisão intra-corrida.

4.3.4 Linearidade na faixa de interesse

Para avaliar a linearidade foi utilizada novamente a curva em fase aquosa

utilizando o método de padronização interna. Recorreu-se ao método dos mínimos
quadrados para calcular a equação da reta, de onde se obteve o coeficiente angular
e linear da reta. Os gráficos gerados relacionaram a razão entre as áreas do padrão
do analito/padrão interno com as concentrações reais do padrão do analito. Por
conta da recuperação da curva em fase aquosa na concentração de 2 ppm não ter
dado resultado na faixa de precisão adequada para o Diclofenaco e por não poder
ter sido calculado o desvio padrão relativo para o Triclosan (pois só houve 1 pico das
3 injeções) esta concentração não foi incluída na curva em fase aquosa utilizada
para avaliar a linearidade do método. Mesmo desconsiderando a concentração de 2
ppm, a curva ainda assim obteve 5 pontos, conforme preconiza o INMETRO (2011)
e a ANVISA (2003) e foram realizadas análises em triplicatas conforme recomenda a
IUPAC (1999).

4.3.5 Limite de Quantificação e Limite de Detecção

O limite de quantificação foi o menor valor de concentração da curva analítica

em fase aquosa (1 mg L-1 /), conforme recomenda o INMETRO (2011) para análise
em nível traço. O limite de detecção não pôde ser calculado porque o mesmo seria
feito pelo método da relação sinal ruído, mas o cromatógrafo estava em manutenção
e não pode ser utilizado até a conclusão deste trabalho.

4.4 Planejamento Fatorial

O planejamento fatorial foi realizado a fim de se obter as melhores condições

de extração para analisar todos os compostos de interesse. Foi feito um
planejamento fatorial 23, onde foram analisadas 3 variáveis em 2 níveis (alto e
 46

baixo), totalizando 8 experimentos. As variáveis avaliadas foram: número de

cartuchos (variável 1), tipo de solvente (variável 2) e ajuste de pH (variável 3).
Abaixo se encontram as respectivas variáveis e seus níveis (Tabela 6), seguido por
uma tabela com as condições utilizadas em cada experimento (Tabela 7).

Tabela 6 Variáveis e níveis para análise de extração

Variável 1 Nível baixo (-1): 1 cartucho

Variável 1 Nível alto (1): 2 cartuchos
Variável 2 Nível baixo (-1): MeOH
Variável 2 Nível alto (1): MeOH/ACN
Variável 3 Nível baixo (-1): Sem ajuste de pH
Variável 3 Nível alto (1): Ajuste pH =3

Tabela 7 Condições avaliadas no planejamento fatorial

Experimento V1 V2 V3

1 -1 -1 -1

2 1 -1 -1

3 -1 1 -1

4 1 1 -1

5 -1 -1 1

6 1 -1 1

7 -1 1 1

8 1 1 1

O experimento foi realizado na concentração de 40 mg L -1, que corresponde à

concentração no extrato final. Após todo o processo de extração, no extrato final,
 47

para injeção no equipamento CG-EM, foram acrescentados 250 μL do padrão

interno em todas as amostras (padronização interna) e 250 μL de metanol
completando-se o volume para 500 μL. Para injeção no cromatógrafo foi utilizado 1
μL da solução final. A massa recuperada corresponde a 0,02 mg e a massa injetada
em 0,04 μg.
Abaixo se encontra um fluxograma experimental (Figura 15), onde estão
destacadas em vermelho as variáveis analisadas.

Figura 15 - Fluxograma do planejamento fatorial

 48

Os resultados foram obtidos em termos de porcentagem de recuperação. O

planejamento fatorial apontou modificações no método de extração, que depois de
reformulado, foi aplicado na extração das amostras coletadas.

4.5 Amostragem

Para a coleta foram utilizados frascos de vidro âmbar, previamente lavados

com sabão Extran 10%, água destilada, água deionizada e acetona. A coleta foi
realizada no dia 13 de junho de 2016, sendo coletadas 4 amostras conforme a
tabela 8:

Tabela 8 Locais de Coleta em Campos dos Goytacazes

Origem Captação

Coroa – Bruta (Rio) Rio Paraíba do Sul (RPS)

Coroa – Tratada (Torneira) Rio Paraíba do Sul (RPS)

Donana – Bruta (Poço) Poço Profundo

Donana – Tratada (Torneira) Poço Profundo

A amostra bruta de água superficial foi coletada na região baixa do Rio

Paraíba do Sul (RPS) (Região Hidrográfica - RH - IX), conforme figura 16, próximo
ao ponto de captação da estação de tratamento de água (ETA) Coroa e a amostra
de água tratada foi coletada em residência abastecida pela mesma ETA, em torneira
logo após o hidrômetro (antes de chegar à caixa d’água). A amostra bruta de água
subterrânea foi coletada em poço profundo na localidade de Donana. A amostra
tratada de água subterrânea foi coletada em residência provida pela ETA Donana,
que é abastecida da mesma forma, com água de poço profundo.
 49

Figura 16 Divisão do Rio Paraíba do Sul (Brasil, 2015)

Figura 17 Vista Rio Paraíba do Sul na região de Campos dos Goytacazes (Soares,2016).

4.5.1 Preparo da Amostra e Extração

As amostras foram filtradas em funil de vidro com lã de vidro, tiveram seu pH

ajustado para 3, seguindo então para o processo de extração, que ocorreu no tempo
 50

máximo de 24 horas após a coleta. As etapas de preparo da amostra, extração e

análise envolveram as etapas, conforme o fluxograma da figura 18

Figura 18 Fluxograma para Extração em Fase sólida

 51

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Validação

5.1.1 Seletividade

Ao analisar o cromatograma da figura 19 referente à solução de 4 mg L-1

utilizados na curva em fase aquosa (linha rosa), pode se verificar picos de
compostos com tempos de retenção próximos, como Simazina e Atrazina e também
Cafeína e 4-nonilfenol, mas que apresentaram uma boa resolução de separação. O
mesmo aconteceu para os compostos Triclosan e 17-alfa-etinilestradiol.

Houve, no entanto separações mais críticas, com tempos de retenção ainda

mais próximos, como entre os compostos Diclofenaco, Bisfenol A 16 Deuterado e
Bisfenol A. Para estes compostos não houve picos bem resolvidos o que poderia ser
esperado para o Bisfenol A e seu par deuterado, pois existia a possibilidade de
coeluição.

Figura 19 Cromatograma dos compostos analisados

Este fato não é um problema quando a análise é feita com detector de

massas, pois com o valor de massa/carga (m/z) do íon de maior abundância relativa
de cada substância é possível selecionar apenas o pico cromatográfico relacionado
aquela substância e dessa forma diferencia-la das demais. Foram escolhidos os íons
214, 224 e 119 para os compostos Diclofaneco, Bisfenol A 16 Deuterado e Bisfenol
A, respectivamente. As figuras 20, 21 e 22 mostram os cromatogramas baseados
nos íons monitorados e os respectivos espectros de massa. No anexo I encontram-
 52

se os cromatogramas com os respectivos espectros de massa das demais

substâncias.

Figura 20 Cromatograma baseado no íon de maior abundancia relativa para o Diclofenaco e

o respetivo espectro de massa.

Figura 21 Cromatograma baseado no íon de maior abundancia relativa para o Bisfenol A 16

Deuterado e o respetivo espectro de massa.
 53

Figura 22 Cromatograma baseado no segundo íon de maior abundancia relativa para o

Bisfenol A e o respetivo espectro de massa.

A figura 19 também compara o espectro dos picos obtidos na análise do

branco (linha em preto), que passou por todo o processo de extração, mas ao qual
foi adicionado somente o padrão interno. É possível observar que o branco não
apresentou compostos com o mesmo tempo de retenção das substâncias Simazina,
Atrazina, Cafeína, 4 n-nonilfenol, Triclosan e 17-alfa etinil estradiol. O padrão interno
aparece como o primeiro pico de cor preta, com tempo de retenção próximo ao do
padrão interno da amostra analisada. Um outro pico menor aparece ao lado deste,
mostrando que existe um interferente, proveniente da matriz ou que esteja se
desprendendo da coluna cromatográfica. Para melhor visualização, a figura 23
destaca esse intervalo.

Figura 23 Comparação entre Cromatograma e Branco da Extração.

 54

Com os resultados é possível afirmar o método se mostrou seletivo para os

compostos analisados.

5.1.2 Exatidão

A figura 24 mostra o gráfico com as recuperações obtidas em porcentagem.

Figura 24 Gráfico com resultado do ensaio de recuperação em % aplicando o método

proposto.

Como as recuperações foram muito baixas, onde somente 3 amostras

(Simazina na concentração de 100 mg L-1, e 17-alfa etinil estradiol nas
concentrações de 40 e 100 mg L-1) obtiveram recuperações acima de 50%, seguiu-
se com um planejamento fatorial para encontrar as melhores condições de análise.
É visto que muitos contaminantes emergentes são moléculas hidrofílicas com grupos
polares e pouco voláteis, logo o processo de derivatização também será essencial
para aumentar a volatilidade dos compostos analisados e assim melhorar a análise
dos mesmos por CG-EM (Machado, 2015). Como se trata de uma análise de muitos
compostos e com matriz complexa, esperava-se encontrar intervalos de recuperação
entre 50 e 120 %, com precisão de até +/-15%.
 55

5.1.3 Precisão

A figura 25 mostra os Desvios padrões Relativos (DPR) obtidos na análise da

curva em fase aquosa.

Figura 25 Gráfico com resultado do desvio padrão relativo da curva em fase aquosa
aplicando o método proposto.

Era esperado um DPR de até 20% por se tratar da análise de traços com
matriz complexa, logo o método apresentou precisão para todos os compostos, em
toda a faixa de concentração da curva analítica, exceto para o Diclofenaco, na
concentração de 2 ppm que apresentou erro em torno de 30%. O desvio padrão do
Triclosan nesta mesma concentração também não pôde ser calculado porque só
apareceu o pico em uma das três injeções.
 56

5.1.4 Linearidade

A equação da reta que relaciona matematicamente a relação entre o sinal

medido e a concentração do padrão, (y = a + bx), foi calculada para cada
concentração e poderá ser usada, para determinar a concentração do analito (x) em
uma amostra real, através da resposta medida pelo método (y). Na tabela 9 estão a
equação da reta e o coeficiente de correlação da curva em fase aquosa. No anexo 2
se encontram os gráficos representativos de cada equação da reta.

Tabela 9 Equação da reta e coeficiente de correlação para as substancias analisadas na

curva em fase aquosa.

Substância Equação da Reta Coeficiente de correlação (r)

Simazina Y= 0,4082x + 1,9065 0,9918

Atrazina Y= 0,4925x - 1,1552 0,9963

Cafeina Y= 0,4579x + 3,2104 0,9862

4 n nonilfenol Y= 0,6465x + 1,1148 0,9978

Triclosan Y= 0,1168x – 0,2435 0,9994

Diclofenaco Y= 0,0801x + 0,4211 0,9892

Bisfenol A Y= 0,1101x + 0,4701 0,9925

17 Alfa Etinil Estradiol Y= 0,3324x + 0,1318 0,9980

O coeficiente angular (b), demonstra que quanto mais inclinada a reta (maior
o coeficiente angular), maior foi a sensibilidade do método a pequenas variações de
concentração. A ordem do aumento de sensibilidade, de acordo com o aumento do
coeficiente angular foi: Diclofenaco < Bisfenol A, Triclosan, < 17-a-Etinilestradiol <
Simazina < Cafeína < Atrazina < 4-nonilfenol.
 57

Quanto ao coeficiente de correlação (r), conforme a ANVISA determina, todos os

valores foram de no mínimo 0,99, indicando uma correlação muito forte entre as
variáveis x e y.

5.1.5 Limite de quantificação e Detecção

O limite de quantificação para o método foi o do menor padrão da curva

analítica, sendo o valor de 1 mg L-1. O limite de detecção não pode ser calculado,
pois o equipamento apresentou problemas e não foi possível utilizá-lo até o
fechamento deste trabalho.

5.2 Planejamento Fatorial

A tabela 10 mostra que planejamento demostrou que o experimento 2 e o

experimento 8 foram os que obtiveram as melhores condições de recuperação para
a maioria dos compostos, portanto foi escolhido as condições utilizadas no
experimento 8 para extrair as amostras coletadas.

Tabela 10 Resultados em % de recuperação do planejamento fatorial

(%) Recuperação Exp 1 Exp 2 Exp 3 Exp 4 Exp 5 Exp 6 Exp 7 Exp 8

4-nonilfenol 62,44 50,52 53,05 52,28 44,08 28,23 33,67 99,07

17-a-etinilestradiol 28,41 32,43 24,82 25,27 25,08 24,07 25,73 52,62

Atrazina 88,14 69,92 62,97 65,97 55,38 38,62 42,81 18,63

Bisfenol A 1,31 81,03 1,19 85,01 69,63 54,71 58,09 155,49

Cafeína 96,38 76,75 68,13 72,35 45,90 39,63 33,35 119,90

Diclofenaco 140,05 121,27 109,60 110,26 84,50 47,89 57,49 55,28

Simazina 49,55 60,20 38,76 56,89 47,63 33,87 36,54 17,64

Triclosan 37,37 39,71 35,28 29,82 36,51 29,40 24,75 99,57

 58

Observa-se através do planejamento fatorial que o fator mais importante, foi a

utilização de dois cartuchos para extração, ou seja, a extração de dois litros de
amostra, porém em cartuchos separados, juntando-se ao final, os extratos. Este
resultado é importante porque mostra que o cartucho tem limitação de extração e
que a melhor recuperação é obtida quando são usados dois cartuchos, apesar do
custo e demanda de tempo e trabalho. No caso do solvente, o melhor resultado foi
obtido usando a extração com metanol e acetonitrila. Com relação a variável 3,
apesar do resultado obtido no experimento 8 ter sido com ajuste de pH (pH = 3,00),
não há a necessidade de alterá-lo, porque no experimento 2, com o pH natural da
amostra, também foram obtidos bons resultados. Estudos posteriores serão
realizados para verificar a confiabilidade de realizar o ajuste ou não do valor do pH.

5.3 Amostragem

Nas amostras de água bruta superficial (RPS) foram detectadas, embora

abaixo do limite de quantificação, a presença de Cafeína e do composto emergente
Bisfenol A. Esse fato era esperado uma vez que o RPS é aporte de esgoto
doméstico e industrial ao longo de toda sua extensão. Nas amostras de água
superficial tratada (RPS) foi detectada a presença de Cafeína, indicador de
contaminação por esgoto, o que demonstra a falta de eficiência do tratamento
convencional na retirada completa deste contaminante. Na água subterrânea (bruta
e tratada de Donana) não houve a detecção de nenhuma substância, o que era de
se esperar, pois ambas fontes são poços profundos, onde é mais difícil haver
contaminação por esgoto doméstico, fonte de contaminantes emergentes.
 59

6. CONCLUSÃO

A validação de uma metodologia é fundamental para garantir a confiabilidade

dos resultados obtidos. Dessa forma, buscou-se em documentos nacionais e
internacionais, informações sobre os principais parâmetros de validação sendo eles:
seletividade, linearidade, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de
quantificação e faixa de trabalho. A validação foi feita com base no teste de
recuperação onde foram utilizadas duas curvas: uma em fase aquosa, também
chamada de curva recuperada porque passa por todo processo de preparo da
amostra e a outra em fase orgânica, também chamada de curva de calibração, pois
é usada como referência. O método demonstrou ser seletivo para todos os
compostos analisados, apresentando também boa linearidade no intervalo da curva
analítica (1 a 100 mg L-1), com coeficiente de correlação maior que 0,99 para todos
os compostos. A precisão também teve bom resultado, com desvio padrão relativo
superior a 20% apenas para uma amostra. O limite de quantificação foi a
concentração mais baixa da curva analítica conforme orienta o INMETRO (2011), já
o limite de detecção não pôde ser calculado porque o cromatógrafo apresentou
problemas e não pode ser utilizado até o fim deste trabalho. A exatidão foi motivo de
preocupação uma vez que as porcentagens de recuperação foram muito baixas
inicialmente, onde somente 3 amostras obtiveram recuperações acima de 50%.
Seguiu-se então com um planejamento fatorial para encontrar as melhores
condições de análise, cujo resultado obtido foi utilizado para modificar o método que
foi aplicado na análise das amostras coletadas. As variáveis modificadas foram
acidez (as amostras foram ajustadas a pH 3) e condicionamento com metanol e
acetonitrila. A análise envolvendo muitos compostos tende a ser complexa, pois as
características físico-químicas podem diferir muito entre si, principalmente quando os
analitos pertencem a classes diferentes. É possível observar pela estrutura dos
compostos analisados que a maioria deles apresenta também grupos polares, o que
diminui a eficiência da extração e análise por cromatografia a gás. Sendo assim,
outra proposta para melhorar os limites de quantificação é a etapa de derivatização,
modificando grupos de alta polaridade, como o grupo hidroxila (-OH), de forma a
aumentar a volatilidade dos mesmos.
 60

De acordo com os resultados, foram detectados, embora abaixo dos limites que
quantificação, na água bruta do RPS a Cafeína e o Bisfenol A. A cafeína é um
indicador de possível contaminação por esgoto, e o Bisfenol A está presente em
plásticos, tendo efeito estrogênico sobre humanos e animais. Na água tratada
proveniente do RPS também foi detectada a Cafeína, o que mostra que o tratamento
na ETA não foi eficiente em sua remoção, indicando possível contaminação por
esgoto. Como era esperado, a água captada e tratada de poços profundos não
apresentou a presença de contaminantes emergentes, uma vez que a água
subterrânea profunda está menos propensa à contaminação por esgoto, principal
fonte de CE.
 61

7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

ANVISA; Resolução RE nº 899, de 29/05/2003.

BELUCIO, Liana Pereira; SILVA, Ana Paula Nunes da; SOUZA, Leandro
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Meteorologia, [s.l.], v. 29, n. 4, p.494-504, dez. 2014. FapUNIFESP (SciELO).
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ANEXOS:

Anexo 1 Cromatogramas com os respectivos espectros de massa para cada

composto.

Cromatograma Geral

Espectro de Massa Simazina

Espectro de Massa Atrazina

 67

Espectro de Massa Cafeína

Espectro de Massa 4 n nonilfenol

Espectro de Massa Triclosan

Espectro de Massa 17 alfa etinil estradiol

 68

Anexo 2 Curva Analítica

simazina
50
Área Padrão/ Padrão Interno

40
30
20
10 y = 0,4082x + 1,9065
R² = 0,9836
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentração (mg L-1)

60
50
Atrazina
Área Padrão/ Padrão Interno

40
30
20 y = 0,4925x - 1,1552
10 R² = 0,9927
0
-10 0 20 40 60 80 100 120
Concentração (mg L-1)

60
50
Cafeína
Área Padrão/ Padrão Interno

40
30
20
y = 0,4579x + 3,2104
10 R² = 0,9725
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentração (mg L-1)
 69

4 n nonilfenol
80

Área Padrão/Padrão Interno

60
40
20 y = 0,6465x + 1,1148
R² = 0,9957
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentração (mg L-1 )

Triclosan
Área Padrão/ Padrão Interno

15

10

5 y = 0,1168x - 0,2435
R² = 0,9989
0
0 20 40 60 80 100 120
-5
Concentração (mg L-1)

10
8
Diclofenaco
Área Padrão/ Padrão Interno

6
4
y = 0,0801x + 0,4211
2 R² = 0,9785
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentração (mg L-1)
 70

15
Bisfenol A

Área Padrão/ Padrão

10

Interno
5 y = 0,1101x + 0,4701
R² = 0,9852
0
0 20 40 60 80 100 120

Concentração (mg L-1 )

40
17 alfa etinil estradiol
30
Área Padrão/Padrão

20
Interno

10 y = 0,3324x + 0,1318
R² = 0,9961
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentração (mg L-1)