CURSO DE BACHARELADO EM ZOOTECNIA

BIOTECNOLOGIA NA REPRODUÇÃO ANIMAL: UMA

VISÃO TEÓRICO/PRÁTICA DE PRODUÇÃO IN VITRO DE
EMBRIÕES BOVINOS

ANA CAROLINA ALVES DA GUARDA

AGOSTO- GO
2023
 INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E
TECNOLOGIA GOIANO - CÂMPUS RIO VERDE

CURSO DE BACHARELADO EM ZOOTECNIA

BIOTECNOLOGIA NA REPRODUÇÃO ANIMAL: UMA

VISÃO TEÓRICO/PRÁTICA DE PRODUÇÃO IN VITRO DE
EMBRIÕES BOVINOS

ANA CAROLINA ALVES DA GUARDA

Trabalho de Conclusão de curso

apresentado ao Instituto Federal Goiano –
Câmpus Rio Verde, como requisito parcial
para a obtenção do Grau de Bacharel em
Zootecnia.

Orientadora: Prof. Dra. Ana Paula Cardoso

Gomide

Rio Verde - GO
Agosto, 2023
 ANA CAROLINA ALVES DA GUARDA

BIOTECNOLOGIA NA REPRODUÇÃO ANIMAL: UMA VISÃO

TEÓRICA/PRÁTICA DE PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES
BOVINOS

Trabalho de Curso DEFENDIDO e APROVADO em 11 de agosto de 2023, pela Banca

Examinadora constituída pelos membros:

Katrynne Freitas Lima Jéssica Viana Cabral

Zootecnista Zootecnista
Instituto Federal Goiano Instituto Federal Goiano
Campus Rio Verde – GO Campus Rio Verde – GO

_______________________________________________

Profa. Dra. Ana Paula Cardoso Gomide

Instituto Federal Goiano
Campus Rio Verde - GO

Rio Verde - GO
Agosto, 2023
 AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, pela proteção, sabedoria, paciência e saúde. Agradeço

também a minha filha Ana Laura Alves Carneiro pela paciência e compreensão, fui ausente
durante esse período da graduação, pois tive que dedicar aos estudos na instituição de ensino
superior e nos estágios. Gratidão, por sempre me apoiar, pelo carinho e compreensão durante
essa jornada.
A minha mãe Ana Lucia Alves Ferreira da Guarda, sem você nada disso teria
concretizado. Obrigada mãe, por todo amor, carinho, dedicação e esforço. Ao meu pai Wilson
José da Guarda (in memorian), por me ensinar a ver a vida de uma forma mais leve, feliz e com
muita intensidade. Ao meu avô Justiniano Alves Silva (in memorian), que sempre fez tudo,
exatamente tudo para me ver feliz. Em vida vocês me apoiaram, me amaram e permaneceram
ao meu lado, sempre me dando força e incentivando a seguir meus sonhos e realizar meus
objetivos.
Aos meus tios, Lucelio Alves Ferreira e Luceni Alves Ferreira e minha avó Margarida
Ferreira da Silva que junto de meus pais me apoiaram e amaram. Agradeço as minhas primas,
Juliana Alves da Guarda, Jordana Alves da Guarda, Tatiane Alves da Guarda, Natane
Guilhermina da Guarda, Nayara Alves Ferreira e Nayane Alves Ferreira, por toda ajuda,
carinho, amor e preocupação.
As minhas amigas Anna Beatriz Borges Carvalho, Luana Almeida Cortina e Julia
Lorraine Barbosa Burgo, que sempre estiveram comigo durante minha vida e trajetória
acadêmica, sempre acreditaram em mim, me deram forças, carinho e amor. Durante a minha
jornada acadêmica pude conhecer e fazer amigas que levarei para o resto da minha vida.
Agradeço a Yara Carolina Santana, Anna Clara Barbosa, Isadora Rissato, Katrynne Freitas,
Samylla Murielle, Ana Claudia Duarte, vocês estiveram ao meu lado em todos os momentos
difíceis da minha vida, e até hoje são presentes independente da distância.
A minha orientadora Ana Paula Cardoso Gomide, agradeço por não desistir de mim,
obrigada pelos conselhos, por sempre me atender e me escutar nos meus momentos difíceis.
Agradeço a todos aqueles que estão presentes na minha vida, me incentivando a
continuar e não desistir. Enfim, será mais um sonho realizado, e percebi o quanto fui guerreira
para concluir o ensino superior. Foram anos felizes e ao mesmo tempo difíceis, cada momento
foi dedicado com muita intensidade, fui forte em momentos que jamais imaginaria ser, mas
venci!
 RESUMO

GUARDA, Ana Carolina Alves. Biotecnologia na reprodução animal: Uma visão

teórico/prática de produção in vitro de embriões bovino. 2023. 28p. Trabalho de Conclusão
de curso (Bacharelado de Zootecnia). Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia
Goiano – Câmpus Rio Verde, Rio Verde, GO, 2023.

A pecuária brasileira está em constante desenvolvimento, paralelamente as biotecnologias da

reprodução e sua aplicação comercial tem se expandido. Biotecnologias vem sendo usadas para
maximizar a produtividade e eficiência reprodutiva, aumentando a produção de animais
geneticamente superiores, obtendo assim maior número de descendentes geneticamente
superiores em um curto período de tempo. Dentre as técnicas atuais, destaca-se a Produção in
vitro de embriões bovinos (PIV), o processo da produção in vitro de embriões envolve etapas
que incluem a obtenção dos oócitos, maturação, fecundação e o cultivo. Que juntamente com
as demais biotécnias da reprodução, foram responsáveis pela grande expansão da pecuária
brasileira, reduzindo o intervalo entre gerações e selecionando cada vez mais as reprodutoras.

Palavras-chave: biotecnologia, produção in vitro, embriões, reprodução, oócitos.

 LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Maturação Nuclear..................................................................................... 11

Figura 2 – Desenvolvimento embrionário e morfológico............................................ 13
Figura 3 – Avaliação morfológica do embrião até o 6º dia.......................................... 14
Figura 4 – Incubadora de Laboratório de CO2............................................................ 17
Figura 5 – Transportadora de oócitos e embriões (TED) ............................................ 18
Figura 6 – Seleção dos blastocistos............................................................................. 21
Figura 7 – Palhetas de envase...................................................................................... 22
Figura 8 – Mesa com equipamentos pata vitrificação.................................................. 23
Figura 9 – Congelamento de embriões........................................................................ 24
Figura 10 – Máquina de congelar embriões TK-1000®.............................................. 24
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO................................................................................................... 7
2 REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................. 9
2.1 Produção In Vitro de Embriões (PIVE) bovinos.............................................. 9
2.2 Aspiração folicular guiada por ultrassonografia (Ovum Pick-up OPU) ......... 9
2.3 MATURAÇÃO in vitro de oócitos (MIV)................................................................ 10
2.4 Fecundação in vitro de embriões bovinos (FIV)................................................. 12
2.5 Cultivo in vitro de embriões (CIV)...................................................................... 12
2.6 Congelamento de embriões.................................................................................. 15
3 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS E DISCUSSÃO........................................ 16
3.1 Limpeza, Manutenção e Esterilização................................................................ 17
3.2 Preparação de tubo de MIV (Maturação in vitro) e meio de lavagem.............. 17
3.3 Coleta e recepção de oócitos................................................................................ 18
3.4 FIV (Fertilização in vitro) (D0) ........................................................................... 19
3.5 Cultivo in vitro (CIV) (D1) .................................................................................. 20
3.6 Clivagem (CIV) (D5) ........................................................................................... 20
3.7 Previsão (D6) ........................................................................................................ 20
3.8 DIA 07 (D7) .......................................................................................................... 20
4 CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................................................. 25
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................. 28
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1. INTRODUÇÃO

Atualmente na pecuária nacional, a evolução da produtividade está associada as

evoluções cientificas e tecnológicas. A biotecnologia usada na reprodução animal vem sendo
desenvolvida e aprimorada, visando aumentar a eficiência reprodutiva, aumentando a produção
de animais geneticamente superiores, obtendo maior número de desentendes em um curto
período de tempo (RENESTRO, 2004).
A aplicação das biotécnicas de reprodução animal consiste em potencializar a eficiência
reprodutiva animal, e viabilizar a fertilidade, facilitando o encontro entre gametas feminino e
masculino para que ocorra a fertilização no animal – in vivo, como em laboratório – in vitro
(SALVADOR, 2019).
O Brasil é uma das referências mundiais em produção de embriões in vitro, segundo o
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), o país ingressou nas pesquisas
em 1990 e despontou nos anos de 2012 e 2013. Em 2017, conseguimos a segunda posição
mundial na produção global de embriões bovinos (SEBRAE, 2022). Em 2019 ocorreram
transformações significativas na indústria de embriões no Brasil, esse período marcou os 20
anos dos primeiros registros de transferência de embriões bovinos produzidos in vitro. Houve
mudança significativa não só em números, mas também na dinâmica do mercado de produtos
e serviços relacionados, valores econômicos e margens de lucro (GONÇALVES; VIANA,
2019).
Segundo Vieira (2012, p. 156):

A biotecnologia é uma forte ferramenta para a indústria pecuária. Várias biotecnias

como a inseminação artificial, criopreservação de gametas e embriões; superovulação
e transferência de embriões; sexagem espermática e embrionária, Recuperação de
oócitos e a fertilização in vitro; clonagem por transferência nuclear de células
embrionárias ou somáticas, transgenia e a biologia de células tronco, têm promovido
o desenvolvimento científico e tecnológico em todo mundo, tornando o Brasil uma
referência na produção in vitro de embriões.

No cenário atual da pecuária as técnicas de biotecnologia mais utilizadas são a

inseminação artificial (IA), transferência de embriões (TE) e a produção in vitro de embriões.
A definição do termo inseminação artificial (IA) implica a deposição de espermatozoides no
trato reprodutivo feminino por meios artificiais, em vez do serviço natural envolvendo
diretamente o macho (BARBOSA; MACHADO, 2008). O sêmen é depositado no aparelho
reprodutivo da fêmea; a fecundação, ou seja, a união do espermatozoide com o óvulo e a
formação de um novo ser ocorrem naturalmente (ASBIA, 2022).
 8

A inseminação artificial em tempo fixo (IATF), é considerada uma grande ferramenta

devido a possibilidade de inseminar uma grande quantidade de animais, em um período
determinado de tempo, sem a necessidade de observação de cio. O uso da IATF também permite
a indução da ciclicidade em vacas em anestro, diminuição do intervalo de partos, aumento dos
números de bezerros nascidos e sincronização dos cios de retorno das fêmeas falhas (GODOI;
SILVA; PAULA, 2010).
A Transferência de Embriões (TE) é uma biotecnologia que permite recolher embriões
de uma fêmea doadora e transferi-los para fêmeas receptoras com a finalidade de completarem
o período de gestação (PASA, 2008).
Já a produção in vitro de embriões (PIVE) é uma técnica de reprodução assistida que
consiste na preparação e cultivo de gametas em ambiente laboratorial para geração do zigoto, e
seu cultivo até o estádio de desenvolvimento embrionário desejado. Está relacionada a uma
série de procedimentos integrados, que vão desde o manejo reprodutivo das doadoras e
receptoras, punção folicular guiada por ultrassom, procedimentos no laboratório até a
transferência dos embriões (OLIVEIRA; SARAPIÃO; QUINTÃO, 2014). O domínio do
método in vitro de produção de embriões colocou o Brasil em uma posição de destaque neste
setor, despertando o interesse de outros países (PELLEGRINO, 2013).
 9

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Produção In Vitro de Embriões (PIVE) Bovinos

A produção in vitro (PIV) de embriões é uma importante biotécnica reprodutiva que

permite a interação entre o espermatozoide e o oócito fora do trato reprodutivo da fêmea, com
a formação de um novo indivíduo (MELLO et al., 2016).
A PIV vem sendo incorporada à reprodução animal, e sua utilização comercial cada vez
mais acessível, tornando se possível à recuperação de ovócitos de fêmeas vivas para a
fertilização in vitro (FIV) (SILVA, et al., 2015).
A técnica envolve as etapas de coleta, maturação, fecundação e cultivo in vitro sendo
que a eficiência das etapas de maturação e fecundação in vitro não difere daquela obtida in vivo
(MELLO, et al., 2016).

2.2 Aspiração folicular guiada por ultrassonografia (Ovum Pick-up - OPU)

Atualmente, utiliza-se a aspiração folicular guiada por ultrassom (OPU), que é

responsável pelo aproveitamento do material genético da fêmea. Essa técnica possui a vantagem
de poder ser realizada em qualquer fase do ciclo estral e não interferir no estado fisiológico do
animal (SILVA, et al., 2021).
As fêmeas doadoras selecionadas para participar da PIV, devem apresentar um quadro
nutricional adequado e serem geneticamente superiores. Não podem apresentar defeitos
anatômicos, patologia e etiologia genética, distúrbios reprodutivos e devem apresentar ciclos
estrais regulares (OLIVEIRA; SARAPIÃO; QUINTÃO, 2014).
A aspiração folicular transvaginal orientada por ultrassonografia ou OPU (Ovum Pick
Up) é a técnica de eleição para a obtenção de oócitos de doadoras vivas, em bovinos, destinados
à produção in vitro de embriões (PIV) (OLIVEIRA; SARAPIÃO; QUINTÃO, 2014).
A coleta de oócitos em fêmeas bovinas é realizada pela punção folicular com uma
agulha acoplada a uma sonda transvaginal, de forma que os folículos a serem puncionados são
observados na tela do ultrassom (SOUZA; ABADE, 2018).
Os oócitos utilizados são aspirados de folículos com diâmetro entre 2 a 8 mm, folículos
menores não apresentam competência para desenvolvimento, enquanto os maiores de 8 mm
encontram- se em atresia ou já iniciaram o processo de maturação, tornando- se inviáveis para
a FIV(MARIANO et al., 2015).
 10

No laboratório de embriões são preparados tubos de maturação para que os oócitos

coletados da aspiração sejam armazenados. Nos tubos contem óleo mineral, meio de maturação,
infundidos com mistura gasosa composta de 5% CO2, 5% O2 e 90% N2. Depois vedados com
rolha de silicone. Os tubos seguem para o laboratório em transportados de embriões (TED),
com temperatura controlada (+/-36ºc). Ao chegar, são armazenados sem tampa nas incubadoras
de MIV, em atmosfera controlada à 38,5ºC, 5 % CO2 e umidade saturada, permanecendo até
que se complete o período de maturação. Este é finalizado após 24 horas da OPU, quando o
oócito finalmente está apto a ser fecundado pelo espermatozoide (SOUZA, 2021).
Os oócitos são classificados em I, II, III e IV, de acordo com a quantidade de células
cumulus. Oócitos com citoplasma regular e com mais de três camadas de células cumulus com
pactas, se classifica como grau I. Oócito apresentando citoplasma regular ou com algumas
granulações finas e com uma a três camadas de células cumulus, considera se grau II. Grau III
são oócidos desnudos, apresenta menos de três ou apenas uma camada de célula cumulus. Grau
IV são oócitos desnudos, não apresenta células cumulus.
Os oócitos de Grau I, II e III são considerados viáveis para serem encaminhados para
maturação (SOUZA, 2021).

2.3 MATURAÇÃO in vitro de oócitos (MIV)

A maturação é necessária para que o oócito adquira a capacidade de ser fecundado

posteriormente. Para que a fecundação ocorra o oócito deve se desenvolver até o estágio de
blastocisto, sofrendo diversas transformações tanto em seu citoplasma quanto em seu núcleo
(PENITENTE FILHO, OLIVEIRA; TORRES, 2011).
A partir do momento em que o oócito é retirado do contato com as células foliculares o
processo de maturação nuclear se dá início. A maturação nuclear do oócito compreende a
progressão do estágio diplóteno da primeira prófase meiótica até a fase de metáfase II (MII). O
período de maturação varia de 18 a 24 horas em atmosfera controlada contendo 5% de CO2 em
ar e umidade saturada (PENITENTE FILHO, OLIVEIRA; TORRES, 2011).
Desta forma, nota-se que a maturação nuclear do oócito é marcada pela progressão do
estágio diplóteno, desde a prófase meiótica I, até a fase metáfase II. A figura a seguir apresenta
as etapas de maturação nuclear descrita pelos autores.
A primeira modificação do núcleo é a condensação da cromatina e a dissolução da
membrana nuclear, processo de ruptura da vesícula germinativa (SILVA, et al., 2017).
 11

Logo após o tempo de incubação da MIV, os oócitos completam a maturação com a

extrusão do primeiro corpúsculo polar e estão prontos para a fecundação (SOUZA; ABADE,
2018).

Figura 1 – Maturação Nuclear

Fonte: Oliveira; Sarapião; Quintão (2014, p. 33).

Durante a maturação, os oócitos passam por várias alterações nucleares e

citoplasmáticas. Os eventos nucleares incluem: quebra da vesícula germinativa (GBVD),
desaparecimento do nucléolo, condensação da cromatina, extrusão do primeiro corpúsculo
polar e formação do segundo fuso meiótico (GOTTARDI; MINGOTI, 2009).

Os oócitos foram transferidos para o meio de maturação, constituído pelo Meio

(Sigma, M4530) suplementado com 10% de SFB, 5,0μg/mL de LH (Lutropin-v,
Vetrepharm), 0,5μg/mL de FSH (Folltropin-v, Vetrepharm), 0,2M de piruvato e
50g/mL de gentamicina. Os oócitos foram cultivados separadamente na presença de
quercetina (0,4, 2, 10 e 50M), cisteamina (100M) e na ausência dos antioxidantes
(controle) durante 22 horas, em gotas de 100μL de meio de maturação sob óleo
mineral, montadas em placa de Petri, a 38,5ºC e atmosfera de 5% de CO2. (GUEMRA
et al., 2013, p. 1618).
 12

2.4 Fecundação in vitro de embriões bovinos (FIV)

A fecundação in vitro ocorre através da incubação de oócitos maduros com

espermatozóides capacitados, em meio de fecundação. Ocorrendo a combinação do material
genético dos gametas e a formação do zigoto (OLIVEIRA; SARAPIÃO; QUINTÃO, 2014).
Após a maturação os oócitos, são lavados em uma gota contendo meio TL e outra contendo
meio FIV em seguida transferidos para uma placa Petri de 35mm contendo 5 microgotas de 100
μL de meio de fecundação cobertas com óleo mineral (SILVA, et al., 2017). O meio FIV é
composto por o meio Tyrode modificado (TALP) acrescido de soluções de Penicilamida,
Hipotaurina e Epinefrina (PHE) e 10μg/ml de heparina. Os gametas permaneceram incubados
em microgotas recobertas com óleo mineral, por 18-20 horas a 38,5°C em atmosfera de 5% de
CO2 em ar (DAYAN, 2001).
O sêmen proveniente de palhetas de congeladas, passa por uma separação após a
descongelação, a fim de se utilizar somente espermatozoides viáveis. Os métodos de separação
espermática mais utilizados são o gradiente de PERCOLL e o swim-up. O swim-up é baseado
na mobilidade dos espermatozoides móveis migrarem do sedimento formado após
centrifugação para um meio de cultura enriquecido sobreposto aos mesmos (SOUZA; ABADE,
2018).

O Percoll é composto de partículas de sílica coloidal (15-30 nm de

diâmetro) coberto com polivinilpirrolidona (PVP), preparado em diferentes
concentrações para formar um gradiente necessário de separação espermática. Em
geral é preparada uma solução de Percoll 90% e 45%, sendo o conteúdo de uma
palheta de sêmen descongelado e depositado sob este gradiente em seguida
centrifugado e o pellet utilizado para a inseminação in vitro (MACHADO, 2009, p.
15).

Após a separação, os espermatozoides são diluídos a uma concentração final de 1 a 5 x

106 espermatozoides viáveis/ml de meio (PENITENTE FILHO, OLIVEIRA; TORRES, 2011),
calculada de acordo com a motilidade e concentração da fração viva de espermatozoides obtida
após a centrifugação em gradiente Percoll (SOUZA; ABADE, 2018).

2.5 Cultivo in vitro de embriões (CIV)

A CIV é o período de desenvolvimento do oócito fertilizado até o estágio de blastócito,

consiste em fases importantes como a ativação do genoma embrionário, distinção embrionária,
 13

compactação dos blastômeros, formação e expansão do blastocele e o rompimento da zona

pelúcia (SOUZA; ABADE, 2018).

Figura 2 – Desenvolvimento embrionário e morfológico

Fonte: Projeto Alfa (2021)1

O cultivo embrionário in vitro requer um ambiente adequado, com tempo, atmosfera e

temperatura (39ºC) controlados (5% de O2, 5% de CO2 e 90% de N2). O tempo de cultivo in
vitro tem apresentado variação de 7 a 9 dias, dependendo do objetivo da rotina de PIV (MELLO,
et al., 2016).
Após 24 horas da fecundação in vitro, os oócitos são desnudados com auxílio de uma
pipeta e transferidos para o meio de cultivo in vitro (CIV), um meio comum
utilizado pelos laboratórios para essa etapa é o meio Synthetic Oviductal Fluid (SOF) (SOUZA;
ABADE, 2018).

1
Figura disponível em: https://www.projetoalfa.com.br/blog/qualidade-do-embriao. Acesso em: 10 nov. 2022.
 14

Figura 3 – Avaliação morfológica do embrião até o 6º dia

Fonte: IPGO (2019)2

O desenvolvimento dos oócitos pode ser interpretado da seguinte forma: o dia da OPU
como dia 1 (D -1), a fase de fecundação in vitro como dia 0 (D0), passados 24h, temos o dia-1
(D1) que é a etapa de cultivo in vitro. O dia-3 (D3) são passadas 48 horas, que são realizadas
as etapas de 1º feeding eclivagem. Para o dia-5 espera -se por mais 48 horas. O 2º feeding,
(processo onde substitui o meio de cultura onde estão inseridos os embriões, e no dia 6 (D6)
realiza-se a previsão e no dia 7 (D7) a taxa de blastocisto é avaliada e acontece a saída dos
embriões para envase a fresco ou congelamento).
Segundo Missio (2015, p. 24):

Os embriões são avaliados sob estereomicroscópio quanto a clivagem em D2 (48

horas após a FIV) e em D6, D7 e D8 para as taxas de blastocistos. Essas avaliações
em vários dias de CIV, serve para predizer a viabilidade do embrião, através do seu
estágio de desenvolvimento e morfologia.

São classificados da seguinte forma:

 Mórula (Mo): é possível distinguir individualmente os blastômeros e sua massa

ocupa quase todo o espaço perivitelino. A massa embrionária possui no mínimo 16
células.
 Mórula compacta (Mc): D5-D6, possui aproximadamente 32-64 blastômeros. Seus
blastômeros estão unidos e constituem uma massa compacta que ocupa de 60-70% do
espaço perivitelino, sendo a compactação considerada com um dos sinais da
diferenciação embrionária embora os blastômeros conservem sua capacidade
totipotente.
 Blastocisto inicial (Bi): D7, possui 100-200 células. Caracteriza-se pelo começo do
transporte do fluido das células trofoectodérmicas e pela formação do blastocele no

2
Figura disponível em: https://ipgo.com.br/fertilizacao-in-vitro-bebe-de-proveta-icsi/. Acesso em: 10 nov. 2022.
 15

interior do embrião. O Bi ocupa de 70-80% do espaço perivitelino, sendo possível

diferenciar o trofloblasto da massa celular interna.
 Blastocisto (Bl): D7-D8, contêm 100-200 células. Existe uma evidente
diferenciaçãoentre as células do trofloblasto e a massa celular interna (disco
embrionário) mais escura. A blastocele é evidente e o embrião ocupa a maior parte do
espaço perivitelino, nesta fase, também é possível a diferenciação visual da massa
celular interna e do trofoblasto.
 Blastocisto expandido (Bx): D7-D8, o embrião contém mais de 200 células, nesse
ponto o diâmetro aumenta consideravelmente com o consequente adelgaçamento da
zona pelúcida (ZP), que chega a atingir um terço de sua espessura inícial. A pressão
crescente do blastocisto em crescimento provoca a ruptura da ZP, através da qual
ocorre a eclosão.
 Blastocisto eclodido (Be): D8-D9, com 200-800 células, os embriões são liberados
da ZP. Podendo estar parcialmente fora da ZP (blastocisto em eclosão- Bn) ou
totalmente eclodidos.Embriões nesta fase são extremamente frágeis (MISSIO, 2015,
p. 24).

2.6 Congelamento de embriões

Após a classificação, os embriões podem ser destinados a implantação ou

criopreservação. A criopreservação de embriões permite a melhor utilização dos embriões
excedentes da transferência de embriões (TE) e da produção in vitro de embriões (PIV). Para
melhorar os índices de sobrevivência embrionária ao processo de congelação é necessária a
utilização de substâncias denominadas crioprotetores (SANTIN; BLUME; MONDADORI,
2012).
Atualmente as técnicas de criopreservação mais utilizadas são a directtransfer e a técnica
de vitrificação de embriões (SOUZA; ABADE, 2018). O congelamento de embriões Direct
Transfer – DT, baseia-se em uma forma de congelamento lenta e clássica. Cujo objetivo é
produzir um embrião congelado para transferência direta. Neste procedimento é necessário um
equipamento específico, a máquina de congelar embriões TK-1000®, e logo em seguida são
armazenados no botijão de nitrogênio (-196ºC) (GOMES; SANTOS, 2020).
Já a vitrificação é um método de congelamento ultrarrápido, que permite acelerar
significativamente o processo de criopreservação do embrião sem a utilização de um
congelador programável de alto custo, tornando assim o processo rápido, prático e menos
oneroso (SANTIN; BLUME; MONDADORI, 2012).
O DMSO é um dos crioprotetores intracelulares com alto peso molecular (PM =78,13)
devido a sua facilidade em induzir o estado vítreo, levou a ser um dos primeiros
crioprotetores utilizados nas soluções de vitrificação de embriões (GOMES; SANTOS, 2020).

Os crioprotetores intracelulares são importantes constituintes da solução de

congelamento/vitrificação, sendo a presença intracelular destes, essencial na
prevenção da formação de cristais de gelo, impedindo também a ocorrência de danos
 16

tóxicos e osmóticos. Uma das suas funções é de baixar o ponto de solidificação. Isto
é benéfico por várias razões, principalmente por fornecer um maior tempo para a
ocorrência da desidratação da célula, diminuindo a formação de cristais de gelo
intracelulares (GOMES; SANTOS, 2020, p. 888).

3 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS E DISCUSSÃO

O estágio foi realizado no laboratório de embriões da ABS Global, no município de

Mogi Mirim - São Paulo. Como supervisor de estágio, dispôs o médico veterinário Rafael
Martins, responsável pelo laboratório de embriões, o qual acompanhou e monitorou todas as
atividades semanais, totalizando 486 h.
O estágio foi desenvolvido acompanhando as atividades diárias realizadas no
laboratório de embriões. Auxiliando nas rotinas do laboratório e no preenchimento de planilhas;
higienização e esterilização dos materiais do laboratório; limpeza das incubadoras;
acompanhando a recepção de oócitos; auxílio no preparo dos tubos para OPU (aspiração de
oócitos); auxílio e acompanhamento na fertilização in vitro de embriões (FIV);
acompanhamento das rotinas de protocolos de verificação, desvitrificação de embriões e direct
transfer.

3.1 Limpeza, Manutenção e Esterilização

Para evitar contaminação dentro do ambiente de PIVE (Produção In vitro de embriões),

todos os colaboradores do laboratório devem fazer a higienização das mãos antes de adentrar
no laboratório, também devem utilizar jalecos, pro pé, mulheres devem estar com os cabelos
presos; e evitar a utilização de produtos que deixam resíduos.
A limpeza dos equipamentos do laboratório era realizada nas segundas feiras, utilizando
álcool 70%, clorexidina e água destilada para a limpeza das superfícies. É feita a troca de água
das incubadoras, as mesmas são limpas e esterilizadas. Na estufa a temperatura é aferida, é feito
a troca de água, e medição de CO2.
 17

3.2 Preparação de tubo de MIV (Maturação in vitro) e meio de lavagem

Em tubos de Falcon é preparado o meio de lavagem e gás (de 5% CO2, 5% O2 e 90%

N2). São feitas alíquotas de 400ul de meio MIV para os tubos e 300ul de óleo mineral; esses
tubos com meios são gasificados (de 5% CO2, 5% O2 e 90% N2) por 15 segundo e tampados
com rolhas de silicone. Após isso são colocados na geladeira.
Para o preparo da lavagem, multiplica-se o número de doadoras por 500ul, colocando 5
ml de lavagem em tubos de Falcon, evitando a perda de pH.

Figura 4 – Incubadora de Laboratório de CO2

Fonte: Figura retirada da página virtual Medical Expo3

3.3 Coleta e recepção de oócitos

Para ser feita a aspiração folicular deve ser feita uma seleção criteriosa das doadoras,
deve ser observado as características reprodutivas, padrão genético, histórico de negação e
aleitamento da cria, escore corporal, características genéticas que sejam interessantes para o
proprietário, entre outros.
A aspiração folicular é uma biotécnica reprodutiva moderna, com o objetivo de coletar
oócitos de fêmeas bovinas, os mesmos são destinados a fecundação em laboratório, e

3
Figura disponível em: https://www.medicalexpo.com/pt/prod/thermo-scientific/product-78678-506932.html.
Acesso em: 10 nov. 2022.
 18

posteriormente transplantados. Técnica essa realizada por médicos veterinários, com auxílio da
ultrassonografia. Os oócitos utilizados aspirados de folículos e coletados quando estiverem
maduros e levados em meio de maturação para o laboratório de fertilização por meio de
transportadoras de embriões (TED).

Figura 5 – Transportadora de oócitos e embriões (TED)

Fonte: Arquivo pessoal. ABS Global, laboratório de embriões, Mogi Mirim - São Paulo, 06 jul. 2021.

Ao chegar ao laboratório os oócitos são recepcionados em tubos de ensaio vedados com

rolhas de silicone. Retira-se as rolhas dos tubos, que são colocadas nas incubadoras de trabalho
para que haja troca gasosa, onde vão permanecer por 24 horas para a realização da FIV
(Fertilização in vitro).
 19

3.4 FIV (Fertilização in vitro) (D0)

São utilizadas placas petris que identificadas nas tampas com o nome do procedimento
(FIV), nome do cliente, numero de vacas e nome do touro a ser utilizado. No fundo das placas
são desenhados quadrantes com o número e a quantidade de doadoras e gotas de meio FIV) a
serem recebidas.
O meio para fertilização é o “FIV Pronto ABS”. Cerca de 2 horas antes do uso, são
suplementados com HE, penicilamina-hipotaurina-epinefrina (PHE), filtrados e mantidos
aquecidos em incubadora, equivalendo para FIVs que ocorram pela manhã ou pela tarde
(SOUZA, 2021, p. 21).
Para a realização da FIV, é necessário realizar o cálculo e o preparo dos meios para a
FIV, fornecendo todas as informações necessárias para a realização deste cálculo. A FIV é
realizada entre 22 e 26 horas após o início da MIV. Vacas com produção de até 35 oócitos são
adicionados 1 gota do meio de FIV mais meio de lavagem. Já uma produção acima de 35 oócitos
são adicionadas 2 gotas de meio de TL mais meio FIV.
Os oócitos são retirados do meio de maturação e passados para placas de petri com meio
FIV Stoker com adição de epinefrina (PHE), TL sêmen e antibiótico.
Com os meios prontos, os mesmos são adicionados em placas petris identificadas com
o nome do cliente, nome da vaca e o touro que será utilizado para a fertilização e a data da
fertilização.
Para a FIV são utilizadas doses de sêmen sexado ou convencional. As palhetas são
descongeladas a temperaturas de 37ºC, por 45 a 60 segundos. Para cada dosagem de sêmen é
preparado um meio diferente que é colocado em pellet, após o preparo deste sêmen, utiliza se
a centrifuga.
Na centrifuga as doses de sêmen passam por dois ciclos de rotação; no primeiro ciclo
de rotação, se a dose for sexada, o tempo será de 10’ a 2500 RPM (419g), após a centrífuga o
sobrenadante é desprezado, e adiciona-se 1mol de meio FIV pronto.
Na segunda rotação o tempo será de 5’ a 1700 RPM (194g). Após isso a solução é
acondicionada em microtubos de 0.6 ml. São adicionados 10ul de dose do sêmen na placa petri
contendo os oócitos para fertilizar.
Para dose de sêmen convencional, a primeira rotação é de 5’ a 9000 RPM (5.400g), após
a centrifugação é retirado o sobrenadante e adicionado 1mol de meio de FIV touro.
Segunda rotação é de 3’ a 2000 RPM (100g), o pellet de espermatozoide é removido, e
acondicionados em microtubos a 0,6 ml.
 20

Após todos os procedimentos de cálculo, preparo do meio FIV, lavagem de oócitos e

preparo do sêmen, os oócitos estão prontos para a FIV. Os oócitos fertilizados são colocados
em na incubadora, ficando por 22 a 24horas.

3.5 Cultivo in vitro (CIV) (D1)

Neste procedimento os zigotos são retirados do meio FIV, passando para o meio de
cultivo, removendo os espermatozoides ainda aderidos na zona pelúcia e as células cumulus.
Esse procedimento conta o auxílio de uma pipeta é realizado a lavagem em gotas contendo o
meio CIV e depois transferidas para outra placa contendo o meio SOF. Os oócitos são lavados
pelo menos duas vezes no meio SOF. Após as 48 horas do início do cultivo o meio será
reduzido e trocado. Após esse procedimento de troca de meio, são validadas quantas estruturas
se dividiram e o número de células presente nelas. A apenas os oócitos que foram fecundados
são transferidos para outro meio e levados para a incubadora CIV, permanecendo por 72 horas.

3.6 Clivagem (CIV) (D5)

Nessa etapa realiza se a contagem das estruturas clivadas, observando a divisão dos
blastômeros, caso não tenha ocorrido divisão das células formando mórulas são descartados.
Após a contagem as estruturas voltam para a incubadora, para que no próximo dia seja feita a
previsão.

3.7 Previsão (D6)

Neste procedimento é feita a avaliação e contagem das mórulas e estimativa de

quantidade de embriões. A mórula é o estágio pré-embrionário, que acontece após o óvulo ser
fertilizado pelo espermatozoide.
A partir deste procedimento é feito o planejamento e preparação para o dia 7 (D7).

3.8 DIA 07 (D7)

São selecionados os blastocistos - estágio de desenvolvimento onde possui uma

cavidade em seu interior chamada de blastocele, expandidos no sétimo dia de desenvolvimento.
 21

Os procedimentos feitos no D7 são de acordo com a demanda do cliente. Eles são:

Transferência de embriões (TE), Verificação in vitro (VIT) e Direct transfer (DT).

Figura 6 – Seleção dos blastocistos

Fonte: Arquivo pessoal. ABS Global, laboratório de embriões, Mogi Mirim - São Paulo, 06 jul. 2021.

 TE – Neste procedimento os embriões são envasados em palhetas, para posteriormente

serem transferidos em receptoras.
 22

Figura 7 - Palhetas de envase

Fonte: Arquivo pessoal. ABS Global, laboratório de embriões, Mogi Mirim - São Paulo, 06 jul. 2021.

 VIT - Envasar os embriões, individualmente, em OPS, em um volume máximo de 2 µL

da solução, e submergi-los, imediatamente, em nitrogênio líquido, onde serão
armazenados.
 23

Figura 8 – Mesa com equipamentos pata vitrificação

Fonte: Arquivo pessoal. ABS Global, laboratório de embriões, Mogi Mirim - São Paulo, 06 jul. 2021.

 DT - Técnica de congelamento mais lento. Consiste no embrião congelado para

transferência direta. Neste procedimento é necessário um equipamento específico: a
máquina de congelar embriões.
 24

Figura 9 – Congelamento de embriões

Fonte: Arquivo pessoal. ABS Global, laboratório de embriões, Mogi Mirim - São Paulo, 06 jul. 2021.

Figura 10 - máquina de congelar embriões TK-1000®

Fonte: Arquivo pessoal. ABS Global, laboratório de embriões, Mogi Mirim - São Paulo, 06 jul. 2021.
 25

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS

Atualmente o Brasil é líder na produção de genética graças ao avanço dos estudos na

área de biotecnologia. A produção in vitro de embriões vem ocupando espaço no mercado,
devido os custos serem viáveis e inúmeros benefícios que tornam a técnica acessível para quem
busca um diferencial no seu rebanho.
As técnicas apresentadas
O estágio supervisionado possibilitou a oportunidade de adquirir experiência na ABS
Global, uma das maiores e importantes produtoras de embriões do mundo, com cerca de 41,5%
total de embriões faturáveis no mundo. Possibilitando vivenciar essa técnica e colocando em
pratica a todo conhecimento adquirida em minha trajetória acadêmica, e também obtenção de
novos conhecimentos e aperfeiçoamento de técnicas laboratoriais. Os conhecimentos e a
vivencia adquirida durante o estágio são de suma importância para a formação profissional.
 26

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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