COVID-19 IgG | Dried Blood Spot

Instruções de Uso

Teste ELISA para determinação qualitativa de anticorpos IgG anti-coronavírus

SARS-CoV-2, causador da COVID-19, em amostras de sangue seco coletadas em papel filtro
 FINALIDADE

O kit Allserum EIA COVID-19 IgG | Dried Blood Spot é um sistema para determinação qualitativa de anticorpos
da classe IgG contra o coronavírus SARS-CoV-2 em amostras de sangue seco coletadas em papel filtro.
Somente para uso diagnóstico in vitro por profissionais habilitados da área médica e com especialização em
análises clínicas.

SIGNIFICADO CLÍNICO

Em dezembro de 2019, a cidade de Wuhan, capital da província de Hubei na China, tornou- se o epicentro do
surto de uma pneumonia de causa desconhecida. No início de janeiro de 2020, próximo ao dia 07, cientistas
chineses isolaram o novo coronavírus SARS-CoV-2 de pacientes infectados com a pneumonia severa, posterior-
mente denominada de COVID-19.
O ensaio para pesquisa do RNA viral, RT-PCR, possui valor diagnóstico durante o período inicial da infecção e é
considerado o padrão ouro, para identificação do vírus SARS-Cov-2. O ensaio para pesquisa de anticorpos, como
os de ELISA, é eficaz para identificação de indivíduos que tiveram exposição passada ao vírus, uma vez que anti-
corpos começam a ser produzidos entre 5-7 dias após o início dos sintomas. A pesquisa de anticorpos é ainda
uma importante ferramenta em estudos de soroprevalência, pois possibilita a identificação de indivíduos assin-
tomáticos ou oligossintomáticos, que foram expostos ao vírus.

Perfil de produção de anticorpos IgG e IgM versus tempo da infecção em pacientes acometidos
com COVID-19. Dados de referência para ensaio de quimioiluminescência.
Padoan et al., Clin Chem Lab, 2020. https://doi.org/10.1515/cclm-2020-0443

PRINCÍPIO DO MÉTODO

As amostras e controles são eluídos com o tampão de eluição diretamente nos pocinhos que estão recobertos
com proteínas recombinantes do nucleocapsídeo do vírus SARS-Cov-2 (fase sólida). Na primeira incubação os
anticorpos (IgG, IgA e IgM) anti-Sars-Cov-2 presente na amostra ligam-se as proteínas recombinantes da fase
sólida. Após o processo de lavagem todos os outros componentes da amostra não complexados são retirados.
Em uma segunda incubação os anticorpos da classe IgG anti-SARS-Cov-2 são detectados pela adição de um se-
gundo anticorpo policlonal anti-IgG humano conjugado a enzima peroxidase (HRP). Um segundo processo de
lavagem retira os componentes não fixados. A enzima capturada na fase sólida agindo no substrato, gera um
composto de coloração azul proporcional a quantidade de anticorpos anti-IgG presentes na amostra. A reação
é interrompida pela adição de uma solução ácida, alterando a coloração da reação para amarela, cuja absor-
bância é lida a 450/620 nm.

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 ARMAZENAMENTO, TRANSPORTE E VALIDADE

 A data de validade está impressa no rótulo de cada reagente.

 A validade do kit refere-se ao item com a data de validade mais curta.
 Não usar reagentes cuja data de validade tenha expirado.
 Todos os componentes devem ser mantidos sob refrigeração entre 2 a 8°C, mesmo após sua abertura
e utilização.
 Manter o kit ao abrigo da luz e da umidade.
 Os reagentes devem permanecer fora do refrigerador somente o tempo necessário para as dosagens.
Não congelar os reagentes.
 Os reagentes em uso, quando respeitado o armazenamento correto, são estáveis até a data de vali-
dade informada nos rótulos.
 Para efeitos da resolução RDC 348, de 17 de março de 2020, os kits de uso emergencial terão validade
de 6 meses.
Atenção: produto de uso único, não sendo passível de reutilização.

COMPOSIÇÃO E APRESENTAÇÕES

APRESENTAÇÕES
COMPONENTES COMPOSIÇÃO
192T 480T
Microplaca com 12 tiras com 8 pocinhos reco-
bertos com proteínas recombinantes do nucle-
MICROPLACA MP 2x96 Cav. 5x96 Cav.
ocapsídeo do coronavírus SARS-CoV-2.
Pronta para uso.
Anticorpo policlonal de cabra anti-IgG humana
CONJUGADO CJ conjugado com enzima peroxidase (HRP). 1x24 mL 1x60 mL
Pronto para uso.

Solução proteica tamponada com conservantes.

TAMPÃO DE ELUIÇÃO TE 1x30 mL 2x45 mL
Pronto para uso.

Soro humano contendo anticorpos IgG específi-

cos anti-coronavírus SARS-CoV-2 impregnados
CONTROLE POSITIVO C+ 1 unidade 1 unidade
em papel filtro.
Pronto para uso.
Soro humano isento de anticorpos IgG específi-
cos anti-coronavírus SARS-COV-2 impregnados
CONTROLE NEGATIVO C- 1 unidade 1 unidade
em papel filtro.
Pronto para uso.

SOLUÇÃO DE Solução tampão com detergente e conservantes.

1x60 mL 1x120 mL
LAVAGEM 20X SL Concentrada 20X.

3,3’,5,5’-tetra-metil-benzidina (TMB) em solução

tampão contendo peróxido de hidrogênio H2O2. 1x24 mL 1x60 mL
SUBSTRATO ST
Pronto para uso.

SOLUÇÃO DE Solução de ácido sulfúrico (H2SO4) 0,2 mol/L.

1x24 mL 1x60 mL
PARADA SP Pronta para uso.

Manual de Instruções 1 Un. 1 Un.

MATERIAIS AUXILIARES
Folhas Adesivas 6 Un. 15 Un.

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PRECAUÇÕES E CUIDADOS ESPECIAIS

1. Não pipetar reagentes com a boca. Utilizar sempre pipetas automáticas ou dispositivos de
sucção de reagentes;
2. Não misturar ou trocar lotes de reagentes diferentes;
3. Os controles contendo componentes de natureza humana foram testados e determinados
como não-reativos para HBsAg, HCV e HIV. Apesar disso, não há nenhum ensaio laboratorial
que possa oferecer completa confiabilidade de ausência de agentes infecciosos. Portanto,
manipular os controles como sendo potencialmente infecciosos;
4. As tiras da microplaca não utilizadas devem ser protegidas da umidade e mantidas na bolsa
plástica fornecida com o kit;
5. Evitar contaminação microbiana dos reagentes e não utilizar reagentes que tenham sinais de
contaminação ou precipitação;
6. Caso haja contato com quaisquer reagentes lavar a área afetada com água em abundância.
Em caso de ingestão de reagentes ou contato com os olhos e/ou mucosas, procurar auxílio
médico imediato levando esta instrução de uso;
7. Utilizar equipamentos de proteção individual, segundo normas de biossegurança;
8. A água (destilada ou deionizada) utilizada na limpeza do material ou nos procedimentos deve
ser recente e isenta de agentes contaminantes;
9. Certificar-se das condições adequadas de funcionamento dos equipamentos de análise;
10. O descarte do material utilizado deve ser feito segundo os critérios de biossegurança;
11. Lavar as mãos após trabalhar com material potencialmente infeccioso;
12. Utilizar sempre as tampas e frascos enviados com o kit para armazenamento dos reagentes.
Não intercambiar as tampas dos reagentes;
13. A data de validade está descrita no rótulo dos reagentes. Não utilizar produtos após a data
de validade;
14. Armazenar o produto conforme especificações do rótulo. O armazenamento inadequado po-
derá afetar a qualidade do produto;
15. Manter as boas práticas laboratoriais a fim de minimizar os erros pré-analíticos, analíticos e
pós-analíticos.
16. Reatividade cruzada com outros vírus e patógenos são descritos na literatura. Vide o item
“Reações cruzadas” para maiores informações sobre estudo de interferentes realizado com
este produto.

LIMITAÇÕES DO ENSAIO E RISCOS RESIDUAIS

- Um resultado negativo não exclui a presença do vírus. Outros métodos e técnicas devem ser
realizados para confirmação do resultado.
- Toda técnica ELISA pode apresentar resultados falsamente reativos.
- Utilizar amostras controle e/ou controles internos rotineiramente.

INSUMOS E EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS NÃO FORNECIDOS

 Água destilada ou deionizada;

 Picotador de 3,2 mm;
 Leitora de ELISA com filtro para 450/620 nm;
 Lavadora de placas (Opcional);
 Cronômetro;
 Pipetas manuais ou automáticas;
 Ponteiras descartáveis;
 Estufa 37°C
 Vidrarias.
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AMOSTRA BIOLÓGICA

 Sangue seco em papel filtro (S&S 903), obtido de punção digital

PROCEDIMENTO PARA COLETA
1. Utilizar um cartão de coleta para cada amostra, não tocar na área destinada à aplicação da
amostra;
2. O laboratório deve ter um Procedimento Operacional Padrão (POP) para a coleta de amostras;
3. Realizar a assepsia com álcool 70 °GL do local a ser puncionado, que poderá ser polpa digital;
4. Utilizar lancetas estéreis e inoxidáveis para realizar a punção. Não reutilizar as lancetas.

5. Descartá-las em local próprio para objetos perfuro cortantes;

6. Realizar a punção e desprezar a primeira gota. Coletar as gotas subsequentes no papel filtro
de forma que essas transponham completamente o papel;
7. Deixar o sangue secar a temperatura ambiente. Não utilizar estufas ou outros processos que
acelerem a secagem do material;
8. Após secas, guardar as amostras em sacos plásticos fechados hermeticamente.

PREPARO DOS REAGENTES E PROCEDIMENTO PRÉ-OPERACIONAIS

 Antes da realização do teste, estabilizar todos os reagentes e amostras à temperatura ambi-

ente (15 a 30°C) e homogeneizá-los suavemente.
Solução de lavagem SL
 A solução de lavagem é fornecida concentrada 20X. Para o preparo da solução de lavagem de
uso diluir uma (1) parte da solução de lavagem concentrada [20X] para dezenove (19) partes
de água deionizada ou destilada (1:20). A solução após preparada deverá ser estocada em
frasco limpo e seco devidamente tampado. Cristais na solução concentrada desaparecerão
após aquecimento em banho-maria a 37°C. Estável por trinta dias se armazenada entre 2 e 8°C.

Sugestão de esquema de placa

Sugerimos a orientação ao Reagente Posição

lado para dispensar controles
Branco A1
e amostras, reservando um
poço para o branco: Controle Positivo B1
Controle Negativo C1, D1
Amostras E1 em diante

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PROCEDIMENTO

PASSO 1 Permitir que reagentes e amostras atinjam a temperatura ambiente;

Picotar um disco de 3 mm (1/8”) das amostras de papel filtro e controles na microplaca

PASSO 2 MP conforme o esquema de placa escolhido. Caso sejam utilizados controles internos, os
mesmos deverão ser dispensados entre as posições das amostras.

PASSO 3 Pipetar 150 µL do Tampão de Eluição TE nas respectivas amostras e controles picotados;

PASSO 4 Cobrir as tiras com a folha adesiva, agitar por 10 minutos;

PASSO 5 Incubar por 40 minutos a 37ºC;

Após a incubação, retirar os picotes por inversão. As amostras remanescentes devem ser
PASSO 6 retiradas com auxílio de uma garrafa lavadora (pisseta) contendo solução de lavagem ou
com uma agulha (para cada amostra);

Adicionar 300 µL da SL diluída (vide preparo dos reagentes) em cada cavidade da MP

aspirando posteriormente. Repetir o processo mais 4 vezes (total de 5 lavagens). Esta
etapa deve ser realizada adequadamente para garantir resultados confiáveis e precisos.
PASSO 7
Remover o fluido restante batendo vigorosamente a placa invertida sobre folhas de papel
absorvente. Lavadoras de microplacas podem ser utilizadas, bastando para isso configurá-
las conforme o procedimento acima;

PASSO 8 Dispensar 100 µL do conjugado CJ em cada cavidade, exceto no A1 (Branco);

PASSO 9 Cobrir as tiras com a folha adesiva e incubar por 40 minutos à 37ºC;

PASSO 10 Repetir o procedimento de lavagem descrito no passo 7;

PASSO 11 Dispensar 100 µL do substrato ST em cada pocinho, inclusive no A1 (Branco);

Cobrir com a folha adesiva e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente ao abrigo
PASSO 12
da luz;

PASSO 13 Dispensar 100 µL da solução de parada SP em cada cavidade, inclusive no A1 (Branco);

PASSO 14 Ler a absorbância a 450/620 nm, dentro de no máximo 30 minutos.

Os produtos Allserum podem ser utilizados em sistemas automatizados para imunoensaio,

desde que estes sejam abertos para quaisquer fabricantes e que os procedimentos (proto-
NOTA colos) de execução dos testes sejam realizados de forma similar à descrita nesta instrução
de uso.

VALIDAÇÃO DO ENSAIO

Os resultados de um ensaio serão considerados válidos quando:

 Branco: ≤ 0, 100
 Controle Negativo: ≤ 0,300 (após descontar o branco)
 Controle Positivo: Após descontar a absorbância do branco ≥ 0,800 D.O.
 INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS

Quando não for possível zerar o aparelho, descontar o valor da Absorbância do “branco” (A1), das demais Absor-
bâncias obtidas.
Considerar cada placa individualmente para o cálculo dos resultados.
 Valor médio de Absorbância do Controle Negativo [VMCN]
Calcular o valor médio das Absorbâncias do controle negativo:

Fórmula Exemplo
(𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴1 + 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴2) (0,220 + 0,252)
𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉 = 𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉 = = 0,236
2 2
 Valor do "Cut-Off" [CO]
O Cut-off é determinado pelo valor médio dos controle negativos (VMCN) mais o fator de 0,200

Fórmula Exemplo
𝐶𝐶𝐶𝐶 = 𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉𝑉 + 0,200 𝐶𝐶𝐶𝐶 = 0,236 + 0,200 = 0,436

 Índex de cada amostra

 Dividir o valor da Absorbância de cada amostra pelo valor do CO:
Fórmula Exemplo
𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴. 𝑑𝑑𝑑𝑑 𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴𝐴 1,810
Í𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛 = Í𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛𝑛 = = 4,15
𝐶𝐶𝐶𝐶 0,436

Observado índex Interpretação

Valores (médios) de Absorbância do soro
>1,2 POSITIVO
mais de 20% acima do CO
Valores (médios) de Absorbância do soro
0,8–1,2 INDETERMINADO
entre 20% acima e 20% abaixo do CO
Valores (médios) de Absorbância do soro
<0,8 NEGATIVO
mais de 20% abaixo do CO

CARACTERÍSTICAS DO SISTEMA

Sensibilidade e Especificidade
A sensibilidade e especificidade diagnósticas foram avaliadas por meio de amostras verdadeiramente positivas
(RT-PCR detectável para SARS-CoV-2) e painel de amostras negativas, disponíveis nas soroteca da MBiolog, ela-
borado anterior a circulação do vírus no Brasil. Os resultados encontrados estão descritos na tabela abaixo.

Allserum EIA COVID-19 IgG RT-PCR

TOTAL
Dried Blood Spot Detectável Não Detectável
Reativo (+) VP 36 FP 1 37 (VP+FP)
Não Reativo (-) VN 5 VN 63 68 (FN+VN)
TOTAL (VP+VN) 41 (FP+VN) 64 105 (VP+FP+FN+VN)

Sensibilidade %: (VP/VP+FN) = 88% Especificidade %: (VN/VN+FP) = 98%

VP: Verdadeiros Positivos FP: Falsos Positivos FN: Falsos Negativos VN: Verdadeiros Negativos

7|P á g i n a
A sensibilidade acima encontrada foi relacionada ao tempo, em dias, relativo entre o ao início dos sintomas e a
coleta das amostras.

Início dos Sintomas N Reativo (+) Não Reativo (-) Sensibilidade

< 10 dias 7 4 3 70%
> 10 dias 33 31 2 94%
Assintomático 1 1 0 —

Foram ainda realizados ensaio comparativo entre kit de mesma metodologia (ELISA) em amostras de soros e
plasma registrado na ANVISA (Kit Comercial de Referência) e o Kit Allserum EIA Covid-19 IgG | Dried Blood Spot
com as mesmas amostras impregnadas em papel filtro. Os resultados encontrados estão descritos na tabela
abaixo.

Allserum EIA COVID-19 IgG Kit ELISA comercial (soro/plasma)

TOTAL
Dried Blood Spot Reativo (+) Não Reativo (-)
Reativo (+) VP 36 FP 1 37 (VP+FP)
Não Reativo (-) VN 2 VN 63 65 (FN+VN)
TOTAL (VP+VN) 38 (FP+VN) 64 102 (VP+FP+FN+VN)

Sensibilidade %: (VP/VP+FN) = 95% Especificidade %: (VN/VN+FP) = 98%

VP: Verdadeiros Positivos FP: Falsos Positivos FN: Falsos Negativos VN: Verdadeiros Negativos

Precisão intra e inter-ensaio

Para determinar a precisão intra-ensaio (repetibilidade) e inter-ensaio (reprodutibilidade), foram
testadas amostras de diferentes graus de reatividade (D.O 450/620). Para o intra-ensaio, foi reali-
zado ensaio único com 20 repetições de cada uma das amostras (baixa, média e alta reatividade).
Para o inter-ensaio foram realizados 3 ensaios, em dias alternados, com 20 repetições de cada uma
das amostras. Os resultados encontrados foram analisados em programas estatísticos e seguem des-
critos abaixo:
(INTRA-ENSAIO) N Média Desvio Padrão Coeficiente de Variação
Baixa D.O 20 0,12 0,041 34,50%
Média D.O 20 0,57 0,013 2,26%
Alta D.O 20 1,62 0,0292 1,80%
INTER -ENSAIO N Média Desvio Padrão Coeficiente de Variação
Baixa D.O 60 0,126 0,047 37,73%%
Média D.O 60 0,585 0,087 14,96%
Alta D.O 60 1,62 0,083 5,15%

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Interferentes
A especificidade analítica foi testada através da avaliação de interferentes bioquímicos e de amos-
tras reativas para outras patologias.
Para a verificação de substâncias interferentes e anticorpos contra outras patologias, amostras não
reagentes foram contaminadas e impregnadas em papel filtro, procedendo posteriormente com os
ensaios do kit Allserum EIA Covid-19 IgG | Dried Blood Spot.
Os parâmetros bioquímicos, nas concentrações descritas, não interferiram nos resultados.

Analito Valor
Hemoglobina 10 g/L
Triglicérides 6 mmol/L
Albumina 2.64 g/dL
Bilirrubina 1000 µmol/L

Reações Cruzadas
A reação cruzada foi acessada testando soros de pacientes acometidos por outras patologias, de
painel de interferentes elaborado anteriormente a circulação do vírus SARS-CoV-2 no Brasil. Os an-
ticorpos presentes para tais patologias são principalmente os da classe IgG, porém é possível a exis-
tência de outras classes de anticorpos em variáveis títulos.

Patologias N Interferência
Chikungunya 5 Não verificado
Sífilis 5 Não verificado
HCV 5 Não verificado
HIV 5 Não verificado
HTLV 5 Não verificado
Rubéola 5 Não verificado
Leishmaniose 5 Verificado em 1 Amostra (Index 1,2)
Malária 5 Não encontrado
Toxoplasmose 5 Não encontrado
Citomegalovírus 5 Não encontrado
Esporocitose 4 Verificado em 1 Amostra (Index 1,2)
HSV 6 Não encontrado
Chagas 5 Não encontrado
Dengue 5 Não encontrado
Amostras de Vacinados (H1N1) 9 Não encontrado
Vírus Sincicial Respiratório | RSV 5 Não encontrado

9|P á g i n a
 TERMO DE GARANTIA

A qualidade dos reagentes é assegurada até a data de validade mencionada na embalagem de apresentação,
desde que armazenados e transportados nas condições adequadas.

SIMBOLOGIA UTILIZADA

RISCO BIOLÓGICO NÚMERO DO LOTE

REAGENTE CORROSIVO PRODUTO PARA DIAGNÓSTICO

(Manipular com precaução) IN VITRO

REAGENTE FOTOSSENSÍVEL DATA DE VALIDADE

(Manter ao abrigo da luz) (último dia do mês)

LIMITE DE TEMPERATURA CONSULTAR

(conservar a) INSTRUÇÕES DE USO

O CONTEÚDO É SUFICIENTE
FABRICANTE
PARA <N> TESTES

Rua Gama, 337 | Vila Paris | Contagem/MG | CEP: 32372-120

CNPJ: 03.590.360/0001-89
Tel.: (31) 3507.0707 | (31)3507.0700
[email protected] | www.mbiolog.com.br

Revisão: 01 – 07/2020 Farm. Resp.: Fabrício Galvão de Brito - CRF-MG: 9587

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