JULIA KHÉDE DOURADO VILLA

EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM VITAMINA K2 (MENAQUINONA-7),

VITAMINA D3 E CÁLCIO NA SAÚDE ÓSSEA E VASCULAR DE RATAS
OVARIECTOMIZADAS

Tese apresentada à Universidade Federal de

Viçosa, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em Bioquímica
Aplicada, para obtenção do título de Doctor
Scientiae.

VIÇOSA
MINAS GERAIS – BRASIL
2019
Ficha catalográfica preparada pela Biblioteca Central da Universidade
Federal de Viçosa - Câmpus Viçosa

T
Villa, Júlia Khéde Dourado, 1990-
Y712e Efeito da suplementação com vitamina K2
2019 (menaquinona-7), vitamina D3 e cálcio na saúde óssea e vascular
de ratas ovariectomizadas / Júlia Kléde Dourado Villa. Viçosa,
MC,2019.
x11i,79f.: il. (algumas color.) ; 29 cm.

Inclui anexos.
Orientador: Marisa Alves Nogueira Diaz.
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Viçosa.
Inclui bibliografia.

' 1.O.t"oporo.e. 2. Menopausa. 3. Cálcio. 4. Vitamina K.

5. Vitamina D. 6. Calcificação. 7. Sistema cardiovascular.
L Universidade Federal de Viçosa. Departamento de Bioquímica
e Biologia Molecular. Doutorado em Bioquímica Aplicada.
II. Título.

CDD 22 ed.616-716
 JULIA KHEDE DOURADO VILLA

EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM VTTAMINA K2 (MENAQUTNONA-7),

vrrAMrNA D3 E cÁLCIo NA sAúDE ósso.t E vAscuLAR DE RATAS
OVARIECTONIIZADAS

Tese apresentada à Universidade Federal de

Viçosa, como parte das exigências do
Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica Aplicada, para obtenção do
liÍttlo de Doctor Scientiae.

APROVADA: l5 de fevereiro de2019.

Maria Eliza de Castro Moreira

Hércia Stampini Duarle Martino Ramos Pizziolo

(Coorientadora) (Coorientadora)

Marisa Alves Nogueira Dia

(Orientadora)
“Compreendi que o amor englobava todas as vocações, que o amor era tudo”
Santa Teresinha do Menino Jesus

ii
Com amor dedico esse trabalho ao meu filho
Francisco, meu marido Jônio, meu avô
Jorge†, aos meus pais José Carlos e Stella e
aos meus irmãos Glauber, Aline, Daniel e
Luisa.

iii
 AGRADECIMENTOS

A Deus por, a cada dia, me dar o dom da vida e por tantas graças concedidas durante o
Doutorado;

Ao meu amado marido, Jônio Pizzol Caliman, doutorando do Departamento de

Engenharia Florestal da UFV, que me auxiliou na realização de toda a manipulação dos
animais, bem como deu suporte em todas as análises. Obrigada por ser minha fiel
companhia, alegre, bondosa e amorosa;

Ao meu filho, amado e querido, Francisco, com o qual fui presenteada durante o
Doutorado, que me acompanhou nas análises, ainda dentro da barriga, que trouxe luz a
nossa vida, meu companheirinho querido e misericordioso desse doutorado. Obrigada por
me olhar com amor em todas as situações;

Aos meus pais, Maria Stella Khéde e José Carlos Dourado Villa, por serem meus
exemplos, meus conselheiros, minha força e meu descanso. Agradeço pela doação e pelo
amor dedicados a mim por toda a vida;

Aos meus irmãos Daniel, Luisa, Glauber e Aline, às minhas sobrinhas, aos meus primos,
tios, avós, sogros por constituírem a essa amada instituição, que tanto prezo, a mais
importante para mim: Família;

À minha orientadora Marisa Alves Nogueira Diaz, por sua acolhida, dedicação,
disponibilidade e esforço para que pensássemos nos meios para chegarmos aos nossos
objetivos e para que superássemos todas as dificuldades ao longo do doutorado. Também
agradeço à Marisa pela confiança em mim, demonstrada ao longo de todo esse período;

À minha coorientadora, Virgínia Ramos Pizziolo, sempre atenciosa e disponível para

fazer com que nossos objetivos fossem alcançados. Obrigada por ser presença certa
sempre que precisei;

À minha coorientadora Hércia Stampini Duarte Martino, pelos conhecimentos e

experiências passados, por abrir as portas do Laboratório de Nutrição Experimental para

iv
a experimentação animal, para as análises e para o que mais eu precisasse. Agradeço a
todo seu apoio técnico, material e científico, doados com carinho, alegria e bondade;

Ao meu coorientador Fabrício Luciani Valente, primeiramente por deixar com que todas
as suas ações sejam guiadas pela bondade do seu coração, o que transpareceu para mim
desde nosso primeiro contato. Obrigada também por abrir as portas do Departamento de
Medicina Veterinária para a realização de diversas etapas desse trabalho;

Ao estagiário Tauan Maini Barbosa, que me ajudou grandemente, principalmente no

cuidado com os animais e no preparo das dietas. O agradeço pois foi importantíssimo na
execução desse trabalho;

Aos colegas do Laboratório BioNat pelas ajudas e parcerias em diversas análises e

procedimentos, bem como pelo companheirismo em todo esse período;

Aos colegas do Laboratório de Nutrição Experimental, pela importantíssima ajuda em

diversas etapas do trabalho, especialmente na experimentação animal, e por me
acolherem de forma tão especial, fazendo com que eu também fizesse parte dessa família;

Aos colegas do Departamento de Bioquímica Aplicada, em especial Vanessa Barros,

Raoni, Leonardo, Pollyanna Ferreira e Ananda, por me auxiliarem em análises com
reagentes químicos que eu não poderia manipular enquanto grávida;

À professora Lukiya Silva Campos Favarato e por toda a equipe do Departamento de

Medicina Veterinária envolvida nas cirurgias de ovariectomia das 70 ratas desse trabalho.
Agradeço a todos os envolvidos pelo impecável trabalho realizado;

Ao Sr. Adão e Sr. Cláudio do Laboratório de Patologia do Departamento de Medicina

Veterinária, pela competente, experiente e alegre ajuda na confecção das lâminas
histológicas;

À professora Luciana Navajas Rennó e ao técnico Mário, do Departamento de Zootecnia,

por disponibilizar o laboratório, equipamentos e técnica para realização das análises
bioquímicas;

v
Ao técnico Jefferson do Laboratório Biofármacos e também ao Laboratório de
Embalagens do Departamento de Tecnologia de Alimentos pela disponibilização do
laboratório e pelo auxílio na realização das análises de resistência óssea;

Ao Núcleo de Microscopia e Microanálise da UFV, onde foram realizadas as análises de

microtomografia óssea com excelente qualidade;

Aos animais que participaram desse experimento, cedidos pelo Biotério Central da UFV,
e a todos os animais utilizados em estudos experimentais;

À comunidade Pequena Via, que abriu as portas de um mundo novo para mim, aquelas
por onde só o Amor passa e gera seus frutos. Aos amigos-família de comunidade; À Santa
Teresinha do Menino Jesus, que, com seu jeito simples e doce, me ensina a amar;

Ao povo de Viçosa, que me encantou com seu jeitinho mineiro cativante;

Ao Departamento e Bioquímica Aplicada, pelo suporte e apoio em todas as etapas do

trabalho;

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela

concessão da bolsa de estudos.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) (processo

001).

A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para que o presente trabalho se

tornasse realidade.

vi
 SUMÁRIO

RESUMO .......................................................................................................................... x
ABSTRACT .................................................................................................................... xii
1. INTRODUÇÃO GERAL .............................................................................................. 1
2. REVISÃO DE LITERATURA ..................................................................................... 3
2.1 Artigo de revisão publicado..................................................................................... 4
2.2 Problematização: osteoporose e saúde vascular ...................................................... 5
2.2.1 Ossos ................................................................................................................. 5
2.2.2 Osteoporose e calcificação vascular na menopausa ......................................... 5
2.2.3 Terapias nutricionais convencionais ................................................................. 6
3. HIPÓTESES .................................................................................................................. 8
4. OBJETIVOS ................................................................................................................. 8
4.1 Objetivo geral .......................................................................................................... 8
4.2 Objetivos específicos ............................................................................................... 8
5. REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 10
6. ARTIGO I ................................................................................................................... 13
EFFECT OF VITAMIN K IN BONE METABOLISM AND VASCULAR
CALCIFICATION: A REVIEW OF MECHANISMS OF ACTION AND
EVIDENCES .................................................................................................................. 13
ABSTRACT .................................................................................................................... 13
6.1 INTRODUCTION ................................................................................................. 14
6.2 METHODOLOGY ................................................................................................ 15
6.3 RESULTS .............................................................................................................. 15
6.3.1 Vitamin K ....................................................................................................... 16
6.3.2 Vitamin K2 and osteoporosis .......................................................................... 19
6.3.2.1 Mechanisms of action .............................................................................. 19
6.3.2.2 Scientific evidences .................................................................................. 20
6.3.2.3 Animal studies.......................................................................................... 21
6.3.3 Vitamin K2 and vascular calcification ............................................................ 22
6.3.3.1 Mechanisms of action .............................................................................. 22
6.3.3.2 Scientific evidences .................................................................................. 23
6.3.3.3 Animal studies.......................................................................................... 25
6.4 CONCLUSIONS ................................................................................................... 26
6.5 REFERENCES ...................................................................................................... 30
vii
7. ARTIGO II .................................................................................................................. 39
SUPLEMENTO DE VITAMINA K2 REDUZ E O DE CÁLCIO AUMENTA A PERDA
ÓSSEA EM RATAS OVARIECTOMIZADAS ............................................................. 39
RESUMO ........................................................................................................................ 39
7.1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 40
7.2 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 41
7.2.1 Animais ........................................................................................................... 41
7.2.2 Indução da osteoporose por ovariectomia ...................................................... 41
7.2.3 Composição da dieta padrão ........................................................................... 42
7.2.4 Dosagens dos suplementos ............................................................................. 42
7.2.5 Grupos experimentais e eutanásia................................................................... 43
7.2.6 Peso e consumo alimentar............................................................................... 43
7.2.7 Dosagens sanguíneas ...................................................................................... 43
7.2.8 Determinação do conteúdo mineral ósseo ...................................................... 44
7.2.9 Histomorfometria óssea .................................................................................. 44
7.2.10 Resistência óssea........................................................................................... 45
7.2.11 Microtomografia ........................................................................................... 45
7.2.12 Radiografia.................................................................................................... 45
7.2.13 Análises estatísticas ...................................................................................... 46
7.2.14 Aspectos éticos ............................................................................................. 46
7.3 RESULTADOS ..................................................................................................... 46
7.3.1 Massa corporal e consumo alimentar.............................................................. 46
7.3.2 Análises bioquímicas ...................................................................................... 46
7.3.3 Resistência óssea............................................................................................. 48
7.3.4 Histomorfometria óssea .................................................................................. 48
7.3.5 Radiografia...................................................................................................... 48
7.3.6 Microtomografia ............................................................................................. 49
7.3.7 Conteúdo mineral ósseo .................................................................................. 50
7.4 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 51
7.5 REFERÊNCIAS .................................................................................................... 53
8. ARTIGO III................................................................................................................. 58
VITAMINA K2 DIMINUI O CONTEÚDO DE CÁLCIO NOS VASOS E MELHORA
O ESTADO ANTIOXIDANTE DE RATAS COM OSTEOPOROSE INDUZIDA POR
OVARIECTOMIA .......................................................................................................... 58
RESUMO ........................................................................................................................ 58

viii
 8.1 INTRODUÇÃO..................................................................................................... 59
8.2. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................. 60
8.2.1 Animais ........................................................................................................... 60
8.2.2 Indução da osteoporose por ovariectomia ...................................................... 60
8.2.3 Composição da dieta padrão ........................................................................... 61
8.2.4 Dosagens dos suplementos ............................................................................. 61
8.2.5 Grupos experimentais e eutanásia................................................................... 62
8.2.6 Peso e consumo alimentar............................................................................... 62
8.2.7 Dosagens sanguíneas ...................................................................................... 62
8.2.8 Análises histológicas....................................................................................... 63
8.2.9 Atividade antioxidante .................................................................................... 63
8.2.10 Conteúdo de cálcio nos vasos ....................................................................... 64
8.2.11 Análises estatísticas ...................................................................................... 64
8.2.12 Aspectos éticos ............................................................................................. 65
8.3 RESULTADOS ..................................................................................................... 65
8.3.1 Massa corporal e consumo alimentar.............................................................. 65
8.3.2 Análises bioquímicas ...................................................................................... 65
7.3.3 Estresse oxidativo do fígado ........................................................................... 66
8.3.4 Histomorfometria do fígado, coração, rins e vasos ........................................ 68
8.3.5 Conteúdo de cálcio dos vasos ......................................................................... 68
8.4 DISCUSSÃO ......................................................................................................... 69
8.5 REFERÊNCIAS .................................................................................................... 72
9. CONCLUSÕES GERAIS ........................................................................................... 76
ANEXO 1. Cálculo amostral........................................................................................... 78
ANEXO 2. Aprovação do projeto pelo Comitê de Ética no Uso de Animais – CEUA/UFV
......................................................................................................................................... 79

ix
 RESUMO

VILLA, Julia Khéde Dourado, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, fevereiro de 2019.
Efeito da suplementação com vitamina K2 (menaquinona-7), vitamina D3 e cálcio na
saúde óssea e vascular de ratas ovariectomizadas. Orientadora: Marisa Alves Nogueira
Diaz. Coorientadores: Virgínia Ramos Pizziolo, Hércia Stampini Duarte Martino e
Gaspar Diaz Muñoz.

A osteoporose é um grave problema de saúde pública, associado ao risco aumentado de

fraturas ósseas e mortalidade. A mobilização de cálcio dos ossos aumenta o risco de
deposição extra esquelética do mineral e calcificação vascular, principalmente quando
associada à suplementação de cálcio. Além do risco de calcificação de tecidos moles,
efeitos fracos e inconsistentes têm sido associados aos suplementos de cálcio e vitamina
D sobre a massa óssea, apesar de sua comum recomendação na prática clínica. Benefícios
exclusivos da vitamina K2 na saúde óssea e vascular têm sido verificados, mas sua
recomendação ainda é baixa na prática clínica. A vitamina K2 atua como cofator
enzimático no processo de carboxilação de proteínas, como a osteocalcina e proteína Gla
de matriz (MGP), inibidoras, respectivamente, da osteoporose e calcificação vascular. A
vitamina K2 também demonstrou induzir a apoptose de osteoclastos e reduzir a
diferenciação de suas células progenitoras, aumentar o número e atividade dos
osteoblastos e modular seus genes alvo. Reversão da calcificação vascular foi verificada
após administração de altas ou baixas doses desta vitamina em animais. O objetivo desse
trabalho foi avaliar a ação, isolada e sinérgica, dos suplementos de vitaminas K2
(menaquinona-7), vitamina D3 e cálcio, na saúde óssea e vascular de ratas com perda
óssea induzida por ovariectomia. O experimento foi conduzido com 70 ratas alimentadas
com dieta padrão AIN-93M. Com 12 semanas de vida, a osteoporose foi induzida por
retirada dos ovários (ovariectomia, ovx), que simula a deficiência de estrogênio após a
menopausa. Após 6 semanas da ovx, os animais foram divididos nos grupos: (1) controle-
sham (falsa ovariectomia, com incisão abdominal sem retirada dos ovários) não tratado;
(2) controle-ovx não tratado; (3) ovx + cálcio; (4) ovx + K2 (5) ovx + cálcio + K2 (6) ovx
+ cálcio + D3 (7) ovx + cálcio + K2 + D3. Na quarta semana, os animais do grupo 6,
suplementados até então com cálcio e vitamina D3, passaram a receber cálcio e vitamina
K2, afim de avaliar o efeito da troca de tratamento. Foi analisado o conteúdo mineral
ósseo de cálcio, magnésio, fósforo e potássio. A quantificação de cálcio foi realizada nos
vasos. No soro foram determinados teores de cálcio, magnésio, fosfatase alcalina,
aspartato aminotransferase, alanina aminotransferase, ácido úrico, uréia, proteína total e
albumina. Atividade antioxidante foi verificada no fígado dos animais. Análises

x
histológicas foram realizada nos ossos, vasos, fígado, rim e coração. Nos fêmures também
foi realizada análise de microtomografia, radiografia e resistência óssea. O nível de
significância para análises estatísticas foi de 5%. Antes do início dos tratamentos, as ratas
ovariectomizadas ganharam mais peso do que as sadias, porém essa diferença
desapareceu duas semanas após a intervenção. A ovariectomia promoveu a osteoporose
nos animais, confirmada nas análises de histologia, radiografia e microtomografia. Ratas
ovariectomizadas também apresentaram redução do cálcio ósseo e sérico, que foi evitada
com a suplementação de vitamina K2. O tratamento com vitamina K2, bem como a troca
de tratamento, a partir da quarta semana, de Ca+D3 para Ca+K2, promoveram aumento
do volume trabecular ósseo perdido, de forma que estes grupos ficaram semelhante ao
grupo ctr-sham. Animais suplementados com cálcio, de forma isolada ou conjunta,
demontraram redução da massa óssea ao longo do período de estudo. Já os animais
tratados apenas com vitamina K2 ou que sofreram a troca de tratamento tiveram a massa
óssea mantida, de acordo com a microtomografia ou aumentada, de acordo com a
radiografia. Não foi observada calcificação vascular nos animais, entretanto, apenas o
suplemento de vitamina K2 promoveu redução da quantidade de cálcio nos vasos,
mostrando um possível benefício da vitamina na calcificação vascular. De forma geral, a
vitamina K2, de forma isolada ou associada aos outros suplementos, melhorou o perfil
antioxidante dos animais, o que pode ser um fator protetor para a saúde vascular. Os
tratamentos não causaram alterações na integridade hepática ou dano renal.

xi
 ABSTRACT

VILLA, Julia Khéde Dourado, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, February, 2019.
Effect of supplementation with vitamin K2 (menaquinone-7), vitamin D3 and
calcium on the bone and vascular health of ovariectomized rats. Adviser: Marisa
Alves Nogueira Diaz. Co-advisers: Virgínia Ramos Pizziolo, Hércia Stampini Duarte
Martino and Gaspar Diaz Muñoz.

Osteoporosis is a serious public health problem, associated with an increased risk of bone
fractures and mortality. Bone calcium mobilization increases the risk of extraskeletal
mineral deposition and vascular calcification, especially when associated with calcium
supplementation. In addition to the risk of soft tissue calcification, inconsistent effects
have been associated with calcium and vitamin D supplements on bone mass despite their
common recommendation in clinical practice. Exclusive benefits of vitamin K2 in bone
and vascular health have been verified, but it is not widely used in clinical practice.
Vitamin K2 acts as an enzymatic cofactor in the carboxylation of proteins, such as
osteocalcin and matrix Gla protein (MGP) which are inhibitors of osteoporosis and
vascular calcification, respectively. Vitamin K2 also induced the apoptosis of osteoclasts
and reduced the differentiation of their progenitor cells, increased the number and activity
of osteoblasts and modulated their target genes. Vascular calcification reversal was
verified after administration of high or low doses of this vitamin in animals. The objective
of this work was to evaluate the isolated and synergistic action of vitamin K2
(menaquinone-7), vitamin D3 and calcium supplementation on the bone and vascular
health of rats with bone loss induced by ovariectomy. The experiment was conducted
with 70 rats fed standard diet AIN-93M. At 12 weeks, osteoporosis was induced by
ovarian removal (ovariectomy, ovx), which mimics estrogen deficiency after menopause.
After 6 weeks of ovx, the animals were divided into groups: (1) control-sham (false
ovariectomy with abdominal incision without removal of the ovaries) untreated; (2)
control-ovx untreated; (3) ovx + calcium; (4) ovx + K2 (5) ovx + calcium + K2 (6) ovx +
calcium + D3 (7) ovx + calcium + K2 + D3. In the fourth week, the animals in group 6,
supplemented until then with calcium + vitamin D3, started receiving calcium + vitamin
K2, to evaluate the effect of the treatment change. The bone mineral content of calcium,
magnesium, phosphorus and potassium was analyzed. Quantification of calcium was also
performed in vessels. Calcium, magnesium, alkaline phosphatase, aspartate
aminotransferase, alanine aminotransferase, uric acid, urea, total protein and albumin
were determined in serum. Antioxidant activity was verified in the liver of the animals.

xii
Histological analyzes were performed on bones, vessels, liver, kidney and heart. In the
femurs, microtomography, radiography and bone resistance analysis were also
performed. The level of significance for statistical analysis was 5%. Before the
treatments, ovariectomized rats gained more weight than healthy rats, but this difference
disappeared two weeks after the intervention. Ovariectomy promoted osteoporosis in the
animals, confirmed in the histology, radiography and microtomography analyzes.
Ovariectomized rats also showed reduction of bone and serum calcium, which was
avoided with vitamin K2 supplementation. Treatment with vitamin K2, as well as the
exchange of treatment, from the fourth week of Ca + D3 to Ca + K2, promoted an increase
in trabecular bone volume, so that these groups were similar to the ctr-sham group.
Animals supplemented with calcium showed a reduction in bone mass throughout the
study period. On the other hand, the animals treated with vitamin K2 alone or that changed
treatment had the bone mass maintained according to the microtomography or increased
according to the radiography. Vascular calcification was not observed in the animals,
however, only the vitamin K2 supplement promoted reduction of the amount of calcium
in the vessels, showing a possible benefit of the vitamin in vascular calcification. In
general, vitamin K2, alone or in association with other supplements, has improved the
antioxidant profile of the animals, which may be a protective factor for vascular health.
Treatments did not cause changes in liver integrity or renal damage.

xiii
1. INTRODUÇÃO GERAL
A osteoporose é um problema de saúde grave em todo o mundo, que está associado
ao maior risco de fraturas ósseas e mortalidade. Pacientes com osteoporose possuem risco
aumentado de desenvolver calcificação vascular (CV), principalmente quando usam
suplementos de cálcio (BOLLAND et al., 2010; LI et al., 2012; XIAO et al., 2013).
Depósitos de cálcio em artérias coronárias podem comprometer respostas vasomotoras e
reduzir a elasticidade, aumentando os riscos de hipertensão arterial, estenose da aorta,
hipertrofia cardíaca, infarto do miocárdio e isquemia de membros inferiores
(LAMPROPOULOS; PAPAIOANNOU; D’CRUZ, 2012).
O tratamento da osteoporose geralmente envolve o uso de suplementos de cálcio e
vitamina D, entretanto, a eficácia destes é controversa na literatura. A suplementação de
cálcio e vitamina D, recomendada pelas Diretrizes Terapêuticas da Osteoporose
(BRASIL, 2014) para mulheres na pós-menopausa, tem sido muito usada na prática
clínica. Entretanto, efeitos fracos e inconsistentes têm sido atribuídos a esses suplementos
sobre a densidade mineral óssea (DMO) e o risco de fraturas (BOLLAND et al., 2015;
TAI et al., 2015). Além disso, o risco de eventos cardiovasculares, como infarto do
miocárdio, associado à suplementação de cálcio, devido ao depósito desse mineral em
tecidos moles, como vasos, é um fator que deve ser considerado na escolha do tratamento
a ser empregado (BOLLAND et al., 2010; LI et al., 2012; XIAO et al., 2013). Vale
ressaltar que, ao contrário dos suplementos de cálcio, alimentos fontes de cálcio exercem
efeito protetor sobre a massa óssea (REID et al., 2002; REID et al., 2005). Em relação
aos suplementos de vitamina D, controvérsias quanto à eficácia têm sido verificadas. O
aumento da absorção intestinal de cálcio promovido pela vitamina D e a ação dessa
vitamina sobre osteoblastos e osteoclastos têm sido indicados como mecanismos de ação
dessa vitamina para promover o ganho de massa óssea (BISCHOFF-FERRARI et al.,
2005; BIKLE, 2012). Entretanto, poucas evidências de benefícios sobre a DMO e
prevenção de foram verificados em diversos estudos incluídos em revisões sistemáticas
de ensaios clínicos randomizados (CHAPUY et al., 1992; AVENELL et al., 2009).
Além dos suplementos de cálcio e vitamina D, medicamentos, como alendronato e
risedronato de sódio, e a terapia hormonal para reposição dos níveis de estrogênio também
são recomendados. Opções eficientes, não medicamentosas, acessíveis e de baixos custo
e risco, que não apenas evitem a perda, mas promovam a reposição da massa óssea, são
demandas importantes na prática clínica. Nesse contexto, benefícios exclusivos têm sido
1
atribuídos à vitamina K2 na prevenção e tratamento da osteoporose e CV. Também
chamada menaquinona (MK), a vitamina K2 é encontrada, em baixa quantidade, em
alguns alimentos como gema de ovo, carnes, fígado, e, em maior concentração em
alimentos fermentados, como chucrute, queijos e, especialmente, o natto, um alimento
tradicional japonês feito da soja fermentada. Além disso, a vitamina K2 pode ser
produzida a partir da vitamina K1 pela bactéria Escherichia coli no intestino humano
(MEGANATHAN, 2001).
Na estrutura química da vitamina K está presente a menadiona, uma estrutura em anel,
cuja cadeia lateral pode conter um grupo fitilo, produzindo a vitamina K1, ou de 1 a 14
repetições de grupos isoprenóides, dando origem às diferentes formas de vitamina K2
(Figura 1).
Algumas proteínas, cuja atividade é dependente da vitamina K2, são consideradas
inibidoras da calcificação vascular, como a proteína Gla de matriz (MGP), ou promotoras
da mineralização óssea, como a osteocalcina (HAUSCHKA et al., 1989; SCHINKE;
MCKEE; KARSENTY, 1999) e Gla-rich protein (GRP) (VIEGAS et al., 2008). A
essencialidade da vitamina K para a atividade biológica dessas proteínas se deve ao seu
papel como um cofator no processo pós-traducional de γ-glutamilcarboxilação. Além
disso, a vitamina K2 promove aumento no número e da atividade dos osteoblastos
(URAYAMA et al., 2000), modula de genes alvo em osteoblastos (ICHIKAWA et al.,
2007), e promove a regeneração da fratura (KOITAYA et al., 2009).
Estudos que avaliem o efeito da vitamina K2 na saúde óssea e vascular são escassos
no Brasil, porém crescentes na literatura internacional, e o uso dessa vitamina para o
manejo dessas complicações na prática clínica é baixo. Vista a observada baixa eficácia
dos suplementos de cálcio e vitamina D, bem como o risco cardiovascular associado aos
suplementos de cálcio, esse estudo visa testar um tratamento pouco empregado na prática
clínica, a suplementação com vitamina K2, de forma isolada ou conjunta com os
suplementos de cálcio e vitamina D. Não foram encontrados estudos que apresentassem
objetivo semelhante ao do presente trabalho: avaliar o efeito isolado e conjunto dos
suplementos de vitamina K2, vitamina D3 e cálcio em animais com osteoporose induzida
por ovariectomia. Este experimento foi elaborado para empregar as terapias nutricionais
usualmente recomendadas para o tratamento osteoporose causada por depleção de
estrogênio, incluindo nesse contexto a avaliação do papel da vitamina K2.

2
2. REVISÃO DE LITERATURA
Foram revisados os pontos-chave desse trabalho: os ossos e suas alterações
metabólicas, fisiológicas e morfológicas associadas às mudanças hormonais da
menopausa/ovariectomia experimental; a calcificação vascular associada à perda óssea e
à suplementação de cálcio; a eficiência da terapia nutricional usualmente empregada:
suplementação de cálcio associada ou não à vitamina D3; e o papel da vitamina K2 no
contexto da perda óssea e da calcificação vascular.
Essa revisão está apresentada na forma de artigo de revisão, já publicado na revista
Critical Reviews in Food Science and Nutrition (doi: 10.1080/10408398.2016.1211616;
fator de impacto: 6.202), cuja capa está apresentada na página seguinte e a descrição da
íntegra na seção Resultados. O artigo de revisão aborda principalmente o papel da
vitamina K2 na saúde óssea e vascular e, por isso, nessa seção foi acrescentada uma
revisão complementar, abordando a problematização da osteoporose e saúde vascular,
metabolismo ósseo, suplementação de cálcio e suplementação de vitamina D.

3
2.1 Artigo de revisão publicado

4
2.2 Problematização: osteoporose e saúde vascular
2.2.1 Ossos
Os ossos constituem um tecido que sofre um processo contínuo de renovação e
remodelação, sendo osteoblastos, osteoclastos e osteócitos as células envolvidas em tais
mecanismos. A remodelação óssea envolve a formação (por osteoblastos) e reabsorção
óssea (por osteoclastos), dois processos antagônicos, mas que ocorrem de forma acoplada
(VIEIRA, 1999). Osteoblastos e osteoclastos se movem sobre a superfície óssea e os
osteócitos têm função de manutenção do tecido, recrutando osteoblastos ou osteoclastos
conforme alterações físicas e químicas do osso (VIEIRA, 1999; ZERBINI; SOUZA,
2001).
A matriz óssea formada por osteoblastos é posteriormente mineralizada, e dentre as
substâncias que a compõem se destacam a proteína Gla de matriz (osteocalcina), colágeno
tipo I e fosfatase alcalina. Os osteócitos, que são derivados dos osteoblastos embebidos
na matriz óssea, permanecem conectados à superfície óssea por canalículos
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004).
Os principais tecidos ósseos são o trabecular, mais esponjoso e metabolicamente
ativo, preenchido por medula óssea, e o cortical, mais sólido, preenchido por lamelas de
matriz calcificada (VIEIRA, 1999). Predominantemente, o osso é constituído pelos
cristais de hidroxiapatita [Ca10(PO4)6(OH)2], uma porção mineral que têm forma alongada
e hexagonal. Esses cristais conferem resistência, força de compressão e rigidez. Outra
porção, que constitui 20% da massa óssea, é formada principalmente por fibras de
colágeno tipo I, além de substâncias de adesão e água que dão flexibilidade, elasticidade
e resistência à tração ao osso (DURÁN, 2011).

2.2.2 Osteoporose e calcificação vascular na menopausa

A osteoporose é um problema de saúde grave caracterizado pela perda de massa e
deterioração da microarquitetura óssea cortical e esponjosa, principalmente indivíduos de
maior idade e mulheres na pós-menopausa. Ela predispõe ao risco aumentado de fraturas
e mortalidade, devido à redução da densidade mineral óssea (DMO) e o consequente
aumento da fragilidade do tecido (SOUZA, 2010). A osteoporose possui difícil
diagnóstico, por ser em geral uma doença silenciosa, até que ocorra a primeira fratura.
Entretanto, a doença também pode envolver dores em função da perda óssea, mas que
costumam ser brandas (SOUZA, 2010).
5
 O equilíbrio ósseo é alterado pelo predomínio da formação, por osteoblastos, ou da
reabsorção, por osteoclastos, que pode ser determinado por condições como sexo, idade,
alterações hormonais da menopausa, uso de glicocorticoides e anticonvulsivantes,
hereditariedade, disponibilidade de nutrientes, inflamação sistêmica e nível de atividade
física (VIEIRA, 1999; SOUZA, 2010). O estrogênio possui receptores em osteoblastos e
osteoclastos, e a depleção de sua produção é um forte determinante para o
desenvolvimento da osteoporose. Esse hormônio, cuja produção é mínima após a
menopausa devido à insuficiência ovariana, exerce ação antirreabsortiva no osso, por
reduzir o número e função de osteoclastos (de VILLIERS, 2015). A redução da DMO
devido à deficiência de estrogênio é mediada por diversas vias, que envolvem várias
citocinas, sendo as principais delas as que compõem a tríade ligante do receptor do
ativador do fator nuclear kappa B (NFkB) (RANKL); o receptor do ativador do NFkB
(RANK); e a osteoprotegerina (OPG). Avanços na compreensão dos genes envolvidos na
remodelação óssea indicam que a osteoporose e CV compartilham mecanismos
patogênicos comuns, como os mediados pela tríade RANK/RANKL/OPG, proteína Gla
de matriz, hormônio da paratireoide (PTH) e vitaminas D e K2. (LAMPROPOULOS;
PAPAIOANNOU; D’CRUZ, 2012, VASSALLE; MAZZONE, 2016). Esse fato sustenta
os estudos que evidenciam a ocorrência simultânea de osteoporose e doenças
cardiovasculares associadas à CV (LAMPROPOULOS; PAPAIOANNOU; D’CRUZ,
2012). Desse modo, terapias comuns podem ser aplicadas em ambas as doenças
(ZHANG; FENG, 2016; VASSALLE; MAZZONE, 2016).

2.2.3 Terapias nutricionais convencionais

Suplementação de cálcio
Efeitos fracos e inconsistentes sobre o risco de fraturas foram atribuídos à
suplementação de cálcio em cerca de 70.000 participantes estudados em uma meta-análise
de 26 ensaios clínicos randomizados (BOLLAND et al., 2015). A suplementação de
cálcio aumentou a DMO no período de 1 ano, porém foi observado que esses efeitos
foram fracos e não progressivos, em uma meta-análise envolvendo 12.000 participantes
de 51 ensaios clínicos randomizados (TAI et al., 2015).
A associação entre cálcio dietético e risco cardiovascular é controversa na literatura.
Estudos sugerem o consumo de alimentos fontes de cálcio como fator protetor (BOSTICK
et al., 1999; REID et al., 2002; REID et al., 2005). No entanto, outros trabalhos advertem
6
que suplementos de cálcio podem aumentar o risco de infarto do miocárdio. Em uma
coorte de 23.980 membros, participantes da European Prospective Investigation into
Cancer and Nutrition, acompanhados por 11 anos, verificou-se que indivíduos que
consumiam alimentos fontes de cálcio, como laticínios, apresentaram risco reduzido de
infarto do miocárdio (HR= 0,69, IC 95%: 0,50-0,94). No entanto, os usuários de
suplementos de cálcio tiveram risco significativamente aumentado de infarto (HR=1,86;
IC 95% 1,17-2,96) (LI et al., 2012). Em estudo de revisão de literatura, que avaliou um
subgrupo de cinco estudos randomizados, duplo cegos e controlados com placebo,
verificou-se que o risco de infarto do miocárdio aumentou 31%, de acidente vascular
cerebral de 20% dentre os pacientes que utilizavam suplemento de cálcio, comparados ao
grupo placebo (BOLLAND et al., 2010). Em estudo com 388.229 participantes do
National Institutes of Health–AARP Diet and Health Study, verificou-se que durante os
12 anos de acompanhamento, 51% de homens e 70% das mulheres utilizaram suplemento
de cálcio. Neste estudo, houve, apenas entre os homens, maior risco de morte por doença
cardiovascular (RR 1000 vs 0 mg de Ca/dia = 1,20; IC 95%, 1,05-1,36) (XIAO et al.,
2013).

Suplementação de vitamina D
A vitamina D tem sido considerada na prática clínica, assim como o cálcio, parte
importante do tratamento e prevenção da osteoporose. O aumento da vitamina D no soro,
indicado por níveis séricos de 25-hidroxivitamina D3, a partir da qual é formado o
metabólito ativo 1,25-dihidroxivitamina D3, aumenta a absorção intestinal de cálcio e está
associada a melhorias na saúde óssea (BISCHOFF-FERRARI et al., 2005; BIKLE, 2012).
Além disso, receptores de vitamina D, bem como a enzima responsável pela formação do
metabólito ativo, são encontrados em osteoblastos e osteoclastos, o que indica a ação
direta da vitamina D sobre essas células. Receptores de vitamina D também estão
presentes nas células envolvidas na aterosclerose e parece regular uma vasta gama de
processos como crescimento vascular, migração e a diferenciação celular; modulação da
resposta imune; expressão de citocinas; e vias inflamatórias e fibróticas (KASSI et al.,
2013). A produção local de 1,25-dihidroxivitamina D3 em osteoblastos demonstrou
desempenhar um papel na diferenciação e mineralização dos osteoblastos e na regulação
da gênese e atividade dos osteoclastos (GARDINER et al., 2000).

7
 Embora diversas evidências mostrem o importante papel da vitamina D na saúde
óssea, ainda há controvérsias na literatura quanto sua função na osteoporose. Uma revisão
sistemática de 23 ensaios clínicos randomizados mostrou poucas evidências do benefício
da suplementação de vitamina D sobre a DMO. Foram observados pequenos, mas
significativos aumentos na DMO no colo femoral, mas não na anca total. Os autores
relatam que os efeitos da combinação de cálcio e vitamina D são indistinguíveis dos de
cálcio isoladamente, o que sugere a pequena contribuição da vitamina D na maioria dos
estudos (CHAPUY et al., 1992). Em estudo de revisão com 45 ensaios clínicos, foi
verificado maior risco de hipercalcemia em pessoas que recebem vitamina D, com ou sem
cálcio, e que parece improvável a suplementação de vitamina D ser eficaz na prevenção
de fraturas (AVENELL et al., 2009). Ressalta-se que os resultados encontrados podem
ser diferentes caso haja deficiência de vitamina D e cálcio, quando a suplementação
mostrou ser eficiente no aumento da DMO (CHAPUY et al., 1992).

3. HIPÓTESES
A hipótese desse estudo é que a vitamina K2 tem efeito na melhoria do
metabolismo ósseo e protege contra a calcificação vascular associada à mobilização de
cálcio do osso para os tecidos moles e à suplementação de cálcio nas ratas. Outra hipótese
a ser testada é a ação sinérgica da vitamina K2, vitamina D3 e cálcio na saúde óssea dos
animais.

4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo geral
Avaliar o efeito da vitamina K2, da vitamina D3 e do cálcio na saúde óssea e
vascular de ratas Wistar ovariectomizadas.

4.2 Objetivos específicos

- Escrever artigo de revisão sobre o efeito da vitamina K2 no metabolismo ósseo
e na saúde vascular;
- Avaliar a ação da suplementação de vitamina K2 isoladamente e em conjunto com
a de vitamina D3 e cálcio, no volume trabecular ósseo, conteúdo mineral ósseo e
resistência óssea;

8
 - Avaliar a ação da suplementação de vitamina K2 isoladamente e em conjunto com
a de vitamina D3 e cálcio no conteúdo de cálcio nos vasos;
- Avaliar o efeito dos suplementos em marcadores sanguíneos associados ao
turnover ósseo;
- Avaliar o efeito da ovariectomia e dos suplementos no perfil antioxidante do
fígado;
- Verificar existência de toxicidade hepática e renal dos tratamentos.
- Realizar todas as análises considerando o tempo de intervenção de 4 ou 8 semanas
e comparar os resultados.

9
5. REFERÊNCIAS
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12
6. ARTIGO I
EFFECT OF VITAMIN K IN BONE METABOLISM AND VASCULAR
CALCIFICATION: A REVIEW OF MECHANISMS OF ACTION AND
EVIDENCES

ABSTRACT
Osteoporosis is a public health concern associated with an increased risk of bone fractures
and vascular calcification. Menaquinone (vitamin K2) presents unique benefits on these
issues, although largely unknown. Vitamin K2 has shown to stimulate bone formation by
promoting osteoblast differentiation and carboxylation of osteocalcin, and increasing
alkaline phosphatase, insulin-like growth factor-1, growth differentiation factor-15, and
stanniocalcin 2 levels. Furthermore, vitamin K2 reduces the pro-apoptotic proteins Fas
13
and Bax in osteoblasts, and decreases osteoclast differentiation by increasing
osteoprotegerin and reducing the receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand. In
blood vessels, vitamin K2 reduces the formation of hydroxyapatite, through the
carboxylation of matrix Gla protein and Gla rich protein, inhibits the apoptosis of vascular
smooth muscle cells, by increasing Gas-6, and reduces the transdifferentiation of vascular
smooth muscle cells to osteoblasts. The commonly used dosage of vitamin K2 in human
studies is 45 mg/day and its application can be an interesting strategy in benefitting bone
and vascular health, especially to osteoporotic post-menopausal women.

Keywords: Vitamin K2; osteoporosis; vascular calcification; bone.

6.1 INTRODUCTION
Osteoporosis is a serious public health issue throughout the world, especially for
postmenopausal women. It is associated with an increased risk of bone fractures and
mortality. Scientific evidences indicate that osteoporotic patients have an increased risk
of developing cardiovascular diseases, mainly due to vascular calcification (VC) [1–3].
Calcium deposits in coronary arteries can compromise vasomotor responses, by reducing
elasticity, increasing the risk of high blood pressure, aortic stenosis, cardiac hypertrophy,
heart attack, and ischemia of the lower limbs [3].
The optimal therapy for common physiological changes in postmenopausal
women, with or without osteoporosis, has not been established. Some drugs, such as
alendronate and risedronate, and supplements such as calcium and vitamin D, have been
used in clinical practice. In this context, vitamin K has been studied. Originally only
identified as essential for blood coagulation, vitamin K, especially vitamin K2, has been
associated with unique benefits in regulating bone metabolism and soft tissue
calcification. However, the effect of vitamin K2 is not well established and there are no
specific dietary recommendations for this nutrient.
The menaquinone, or vitamin K2, is essential for the activation of vitamin K-
dependent proteins (VKDP), acting as a cofactor for γ-glutamyl carboxylase in the post-
translational carboxylation of these proteins, transforming residues of glutamate (Glu) in
γ-carboxyglutamate (Gla) [4]. Some VKDP may play a role in bone and vascular
metabolism. The most studied are osteocalcin (OC) and matrix Gla protein (MGP). After
carboxylation, OC is better secreted by osteoblastic cells and can be deposited in a

14
mineralized bone matrix to accomplish its physiological role [5]. On the other hand, a
higher deposit of OC in calcified aorta was observed, indicating its osteogenic role in
vessels [6, 7]. MGP is considered an inhibitor of soft tissue calcification, because it is
able to strongly bind and inhibit the growth of calcium crystals [8, 9]. Additionally,
vitamin K2 promotes an increase in the number and activity of osteoblasts [10], modulates
target genes of bone mineralization in osteoblasts [11] and decreases osteoclast
differentiation [12].
Since vitamin K2 is only present in low amounts in the diet [13, 14], oral
supplementation can be considered an interesting option for improving the vitamin K2
status, especially in postmenopausal women, a risk group for osteoporosis and vascular
complications. The aim of this review was to investigate the effect of vitamin K2 on bone
metabolism and VC, considering the mechanisms involved in these processes.

6.2 METHODOLOGY
The search was conducted in Medline/Pubmed, Latin American and Caribbean
Health Sciences Literature (LILACS), Scientific Electronic Library Online (SciELO) and
Science Direct for original articles or reviews to assess the effect of vitamin K2 on bone
and/or cardiovascular health, published in the last ten years (2005-2015). Combinations
of the following keywords were used for the search: "vitamin K", "vitamin K2",
"menaquinone", "menatetrenone", "bone", "osteoporosis" and "vascular calcification". A
manual search was also conducted in the reference lists of selected articles for relevant
studies about the subject. Unpublished dissertations and theses or conference abstracts
were not included. Intervention studies performed with humans or animals, in vitro
studies, observational studies and literature reviews were included. Each article selected
to compose this review was critically analyzed.

6.3 RESULTS
The search strategy resulted in the selection of 94 articles (Fig. 1). The inclusion
of different types of study allows synthesizing a wide range of information about the
mechanisms of action of vitamin K2. These mechanisms may explain the effects on bone
and cardiovascular metabolisms found with the intake of vitamin K2, for which, despite
the biological plausibility, there are no specific dietary recommendations.

15
Fig. 1 Search and selection of articles

6.3.1 Vitamin K
Vitamin K is a term used to represent chemically similar liposoluble compounds,
which differ in their origin and function [15]. The two main forms of vitamin K are
phylloquinone (vitamin K1) and menaquinone (vitamin K2). Menadione, present in both
forms, is a ring structure whose side chain may contain a phytyl group, producing vitamin
K1, or 1 to 14 repetitions of isoprenoid groups, giving rise to different forms of vitamin
K2 [16].
Vitamin K is recycled in the body in order to maintain sufficient levels for
activating VKDP. In this process, vitamin K hydroquinone (KH2) is oxidized to vitamin
K epoxide (KO), which is in turn converted into vitamin K quinone by the enzyme
vitamin K epoxiredutase. Vitamin K quinone, which is present in the diet, is then
converted to KH2 by the vitamin K quinone reductase enzyme, closing the cycle. The two
enzymes involved in these reactions are dithiol-dependent. Another enzyme, NADPH-

16
dependent quinone reductase, is also capable of converting vitamin K quinone into KH2.
Warfarin, a drug commonly used in dialysis patients, inhibits the activity of dithiol-
dependent reductase, but not NADPH-dependent reductase [4] (Fig. 2a).
Vitamin K1 is transported by triglyceride-rich lipoproteins, which are directed
primarily from the intestine to the liver and act as a cofactor for carboxylation and
activation of coagulation proteins II, VII, IX, X and proteins C, S and Z [17, 18]. Vitamin
K2, conversely, is carried by both triglyceride-rich lipoproteins and by low-density
lipoproteins (LDL) to extrahepatic tissues [18], including arterial walls, which prefer to
accumulate and use vitamin K2 compared to K1 [16] (Fig. 2a). Thus, vitamin K2 can exert
more influence on the activation of VKDP in bone metabolism and in VC (Fig. 2b).
Menaquinone may be abbreviated as MK-n, where "n" is the number of isoprenoid
groups present in the side chain. The most common and most studied dietary supplements
of vitamin K2 are MK-4 and MK-7. In a study with healthy women, MK-7 compared to
MK-4 was found to have greater bioavailability, contribute more to the increase of
vitamin K in serum, and therefore have greater importance to extrahepatic tissues [19]. In
food, MK-4 is found mainly in animal products such as egg yolk, meat, liver, and butter.
In fermented foods, particularly in fermented soybean ("natto"), typical in the Japanese
diet, cheese, curd and sauerkraut, the long chain menaquinones are found (MK-7 to MK-
10), which are synthesized by bacteria [16, 19]. In addition, higher menaquinones
(notably MK-10) are also produced by intestinal bacteria [16, 20]. In relation to vitamin
K1, its main sources are green leafy vegetables such as kale, spinach and lettuce, and
brassicas such as brussel sprouts and broccoli.
The dosage commonly used in human studies is 45 mg/day, since it was associated
with greater benefit to bone and vascular health in Japan, a pioneer in studies in this area
[21–25]. This dose is 500 times higher than the Adequate Intake (AI) of vitamin K (90
μg/day). However the tolerable upper intake level (UL) was not determined and there is
no specific recommendation for vitamins K1 and K2 [26]. None of the analyzed studies
reported risks associated with the supplementation of vitamin K or concerns about
coagulation or thromboembolic events. Furthermore, it is speculated that the AI of 90
μg/day is too low to permit the adequate extrahepatic VKPD carboxylation, since the AI
for vitamin K is solely based on the intake of vitamin K1 and hepatic activation clotting
factors [27].

17
Fig. 2 (a) Vitamin K cycle and potential mechanisms of action in the activation of
coagulation factors and in the modulation of bone metabolism and vascular calcification.
Vitamin K hydroquinone (KH2) is oxidized to vitamin K epoxide (KO), which is
converted to vitamin K quinone. Then, vitamin K quinone is reconverted to KH2, closing
the cycle. The two enzymes involved in the aforementioned reactions are dependent of
dithiol and inhibited by warfarin. The quinone reductase enzyme, NADPH-dependent, is
also capable of converting vitamin K quinone in KH2. Vitamin K1 is carried by
triglyceride-rich lipoproteins to the liver and acts as a cofactor in carboxylation reactions
of coagulation factors. Vitamin K2 is carried by both triglyceride-rich lipoproteins and by
low-density lipoproteins (LDL) to extrahepatic tissues. (b) Vitamin K2 actions to improve
bone metabolism and prevent vascular calcification. ODF: osteoclast differentiation
factor; RANKL: receptor activator of nuclear factor κB ligand; OPG: osteoprotegerin;

18
OCIF: osteoclastogenesis inhibitory factor; AP: alkaline phosphatase; cOC: carboxylated
osteocalcin; IGF-1: insulin-like growth factor 1; GDF-15: growth differentiation factor-
15; STC2: stanniocalcin 2; cGRP: carboxylated Gla rich protein; Gas-6: growth arrest
specific gene 6; VSMCs: vascular smooth muscle cells; cMGP: carboxylated matrix Gla
protein; BMP: Bone morphogenetic protein.

The effect of a low dose (1.5 mg) of vitamin K2 (MK-4) was tested in a
randomized, double-blind, placebo-controlled study on the bone health of
postmenopausal women. After 6 and 12 months, the concentrations of uncarboxylated
OC (ucOC) and pentosidine (marker of glycation endproducts) were significantly lower
in the group supplemented with K2 than in the control group. Furthermore, the bone
mineral density (BMD) was lower in the control group at 12 months compared to the sixth
month, and there was no significant decrease in BMD in the group supplemented with K2
throughout the study [28].
Metabolically, vitamin K1 can be converted to K2 to act on reducing the calcium
content of soft tissue, such as the kidney where the higher content of vitamin K2 compared
to that of K1 indicates that K2 has specific actions in this function [29, 30]. Furthermore,
it was observed that vitamin K2 has greater efficacy, compared to K1, in activating VKDP
[4, 31], in increasing mineralization, and reducing bone resorption [32, 33]. In human
intervention, vitamin K2 has shown higher effect compared to controls or other
compounds traditionally used for improving bone and/or vascular health, as calcium
and/or vitamin D3 supplements, residronate and alendronate [22–25, 28, 34–47] (Tables
1 and 2).

6.3.2 Vitamin K2 and osteoporosis

6.3.2.1 Mechanisms of action
OC is one of the most abundant matrix proteins found in bones that could affect
the growth or maturation of the mineral phase [48, 49]. Its retention in bone is dependent
on γ-carboxylation promoted by vitamin K2 [8, 48]. OC is secreted by mature osteoblasts,
odontoblasts and hypertrophied chondrocytes, and its production is increased in response
to administrating vitamin K2 [24]. Gla residues present on the carboxylated OC (cOC)
may interact with hydroxyapatite crystals in the mineralization process [50]. Besides the
importance of Gla residues in bone mineralization, glutamate (Glu) has receptors on all
mature bone cells and can affect the bone remodeling. Glu also acts as a neuropeptide and

19
may be released in a specific site according to local needs, as cells of bone tissue, and
may represent a regulator able to locally control the activity of bone cells [51].
Besides acting on the activation of OC, vitamin K2 also promotes apoptosis of
osteoclasts and reduction of their progenitor cells differentiation and bone remodeling
[12]. Furthermore, it was found that vitamin K2 promotes an increase in the number and
activity of osteoblasts [10]. The addition of vitamin K2 in osteoblast cell cultures resulted
in dose-dependent reductions of the expression of apoptotic agents Fas and Bax, and
reduction of the cytotoxic effects of Fas ligand (FasL), which mainly occurred after
treatment with tumor necrosis factor (TNF)-α, a pro-apoptotic indicator [10]. In
osteoblasts treated with MK-4, increased expressions of potential promoters of
differentiation and proliferation of osteoblasts, growth differentiation factor-15 (GDF-15)
and stanniocalcin 2 (STC2), were observed. In this study, these effects were not observed
in response to MK-7 or vitamin K1 [11]. Vitamin K2 also promoted increase of insulin-
like growth factor-1 (IGF-1) in osteoblasts [52], which is associated with increased
differentiation of these cells and the bone formation in postmenopausal women [53].
These results indicate that vitamin K2 has positive effects on osteoblasts and inhibitory
effects on osteoclasts, which is beneficial in treating osteoporosis.
In a study with bone marrow cells, which contains both progenitor cells of
osteoclasts and osteoblasts, the treatment with MK-4, but not with vitamin K1, stimulated
the activity of alkaline phosphatase (AP) and OC expression, which are markers of early
and late osteoblast differentiation, respectively. In this study it was also found that MK-
4 inhibited the expression of RANKL and promoted the reduction in the number of
osteoclast-like cells in bone marrow [54]. Increased AP activity and reduced expressions
of RANKL/ODF were also observed in another study of cells treated with MK-4 in the
presence or absence of the glucocorticoid dexamethasone, a vitamin K antagonist (VKA).
In this study, an increased expression of OPG in stromal cells was also observed [55].

6.3.2.2 Scientific evidences

Most studies that relate vitamin K2 and bone metabolism were conducted with
women in the postmenopausal period and the most significant results are observed in the
presence of osteoporosis. Table 1 shows that supplementation with vitamin K2 is effective
mainly in VKDP activation, verified by the increase in the carboxylated form and
reduction in the uncarboxylated form of OC. Inconsistent findings were observed
20
regarding the role of vitamin K2 on BMD. However, a meta-analysis found that vitamin
K was effective in increasing BMD at the lumbar spine, but not at the femoral neck [56].
A meta-analysis of 19 randomized clinical trials showed that vitamin K2 was
effective in maintaining BMD in postmenopausal women with osteoporosis and no effect
was found for those without osteoporosis [57]. In this study, it was found that vitamin K2
reduced the incidence of fractures and ucOC concentration, and increased cOC,
suggesting a positive effect on bone metabolism. OC concentrations were also directly
associated with a lower rate of calcification progression of the abdominal aorta and lower
mortality in elderly men [58].
Regarding the action of vitamin K2 on IGF-1, the effect of supplementation of
dairy products fortified with calcium, vitamin D3 and Vitamin K1 or K2 (MK-7) was tested
for 12 months on bone metabolism variables in postmenopausal women. It was found that
the group that received calcium and vitamins D3 and K2 had higher levels of IGF-1 in
serum compared to the groups that received only calcium and vitamin D3 or calcium and
vitamins D3 and K1. In this study, BMD was increased in both groups supplemented with
K1 or K2 [52].

6.3.2.3 Animal studies

Vitamin K2 showed, in animal models, to have an effect on bone mass recovery,
whose loss was induced by ovariectomy or by the administration of VKAs, such as
glucocorticoids, warfarin and phenytoin [32, 59–61]. These drugs indirectly inhibit the
VKDP carboxylation by interfering in the regeneration of vitamin K. Bone loss induced
by drugs is a serious problem in clinical practice, and its prevention by the use of vitamin
K2 can be an important and safe strategy for health promotion.
The effect of vitamin K2 in bone formation was demonstrated after administering
prednisolone, a VKA glucocorticoid, in rats. At 4 weeks, BMD was significantly reduced
with treatment of 100 mg/kg of prednisolone. At 8 weeks, the dosages of 10 or 30 mg/kg
of prednisolone resulted in a reduction of BMD. Vitamin K2 (15 mg/kg) was given for 8
weeks as a dietary supplement and inhibited the decrease of BMD and the decrease in
mineralizing surface and bone formation rate, induced by 30 mg/kg of prednisolone [32].
The antiepileptic drug phenytoin also resulted in significant reduction in BMD, mainly
when the serum and bone levels of vitamin K2 decreased due to phenytoin administration.
The bone loss was prevented by the combined administration of phenytoin and vitamin
21
K2 [60]. In rats with adenine-induced chronic kidney disease (CKD), the treatment with
warfarin resulted in significantly greater ucOC and significantly less cOC. In the study, a
significant increase in cOC in the high dietary K group was found [61].

6.3.3 Vitamin K2 and vascular calcification

6.3.3.1 Mechanisms of action
Some studies suggest that the mechanism for VC is similar to skeletal bone
formation and involves the calcification of an extracellular matrix mediated by an
osteoblast-like phenotype [6, 62]. Moreover, it is reported that the process of VC involves
other mechanisms, such as the apoptosis of vascular smooth muscle cells (VSMCs),
responsible for the synthesis of MGP, the most studied VKDP with role in VC [63].
Vitamin K2 acts as a cofactor in the post-translational γ-carboxylation of MGP, which
promotes its biological activity in the vasculature as an inhibitor of VC [64]. The
carboxylated MGP (cMGP) is able to strongly bind and inhibit the growth of calcium
crystals [58]. This effect was observed in human atherosclerotic plaques, where MGP
avoided calcium precipitation [9]. The cMGP is also a potent bone morphogenetic
inhibitor protein-2/4 (BMP-2/4), which promotes VSMCs transdifferentiation to
osteoblasts in the vessel wall, which precedes VC and can lead to an accelerated
progression of atherosclerosis [65, 66]. In an in vitro study, MGP containing Gla residue,
but not the MGP containing Glu, inhibited the transdifferentiation of VSMCs,
emphasizing the importance of vitamin K2 in the activation of MGP [65].
In addition to cMGP, other forms such as uncarboxylated MGP (ucMGP),
phosphorylated MGP (pMGP), and dephosphorylated MGP (dpMGP) can be quantified
in serum and plasma, and their use may be dependent on the aim of the study. The total
ucMGP may be a more useful VC marker because of its ability to bind to calcium. The
dephosphorylated and uncarboxylated MGP (dp-ucMGP) is considered a marker of
cardiovascular disease, such as aortic valve disease, aortic stenosis and heart failure, and
mortality in patients with cardiovascular risk [67–70]. Vitamin K2 supplementation has
been also associated with the reduction of dp-ucMGP in patients with kidney disease [71]
and healthy individuals [17].
The action of vitamin K2 in VC is also associated with activation of other
important VKDPs, such as the growth arrest specific gene 6 (Gas-6) and the Gla Rich
Protein (GRP). Gas-6 needs γ-carboxylation to stimulate the anti-apoptotic activity of
22
Bcl-2 and to inhibit the pro-apoptotic protein caspase-3, protecting the VSMCs of
apoptosis induced by the starvation of fibroblasts and calcification [72]. Furthermore,
Gas-6 acts as a growth promoter of VSMCs in synergy with other growth factors in
VSMCs. These data suggest that Gas-6 prevents atherosclerotic vascular degeneration.
GRP is a low studied VKDP, expressed by chondrocytes, chondroblasts, osteoblasts and
osteocytes, that has large amounts of Gla residues [73]. GRP has shown to be present in
the cartilage and bone of rats, as well as in soft tissues of rats and humans [73].
Accumulation of GRP was observed in locations affected by pathological calcifications,
and the affinity between Gla residues and calcium suggests the association between this
protein and CV. GRP has the ability to bind to hydroxyapatite and to be highly
accumulated at sites of calcifications in human samples derived from patients diagnosed
with skin and vascular calcification pathologies [74].

6.3.3.2 Scientific evidences

VC is a major risk factor in the development of cardiovascular events such as
atherosclerosis and myocardial infarction and its development is a strong negative
indicator of cardiovascular morbidity and mortality [75–78]. Few human studies have
investigated the action of vitamin K2 in VC and mostly evaluated the circulanting levels
of MGP, which is a less invasive method. Morphological assessments are generally more
applicable to animal studies. This fact shows the importance of assessing the different
forms of MGP in human studies and the influence of vitamin K2 on the activity of this
protein [27]. Besides being measured in blood and bone, MGP can also be measured in
various soft tissues, which was associated with sclerosis of the inner and middle layers in
vessels, since their levels were increased in atherosclerosis [27]. Schurgers et al. indicated
that ucMGP is a risk factor for VC and that the present RDA values are too low to ensure
full carboxylation of MGP [27]. In a study of patients with type 2 diabetes, it was found
that dp-ucMGP, but not total MGP and dpMGP, was associated with an increased risk of
cardiovascular disease, high blood pressure and heart failure [79].
Postmenopausal women with calcified lesions in the aorta presented lower intakes
of vitamin K [80]. In Rotterdam Study, the intake of vitamin K2, but not of vitamin K1, of
4807 seniors was inversely associated with aortic calcification and mortality from all
causes [14]. In a cross-sectional study with 1689 women 49-70 years old, where the
consumption of vitamins K1 and K2 was analyzed according to a validated food frequency
23
questionnaire, it was observed that calcification of breast arteries was less common (9%
of calcification) in women allocated in the highest quartile of vitamin K2 intake compared
with those in the lowest quartile (13% of calcification). No differences in the prevalence
of VC were observed over the K1 consumption quartiles [13]. In a prospective cohort
European Prospective Investigation Into Cancer and Nutrition (EPIC), composed of
16,057 women aged 49 to70, the reduction in VC risk was associated with higher intakes
of vitamin K2, but not of vitamin K1 [81]. Similar results were observed in a study of 564
women after menopause [34]. In the EPIC study, the strongest protective effect against
coronary heart disease was attributed to MK-7, MK-8 and MK-9 [81].
Patients with CKD, especially those on dialysis, commonly present a low
nutritional status of vitamin K [82]. This occurs because the occurrence of VC in these
patients is high, and consequently, the demand for vitamin K to activate the MGP in the
vasculature can be high [83]. Poor nutritional status of vitamin K may also occur due to
dietary restrictions of potassium (green leafy vegetables, also rich in vitamin K1) and
phosphate (dairy products, also rich in vitamin K2) recommended for these patients [84].
The supplementation of vitamin K2 for CKD patients seems to be interesting, as shown
by the reduction of ucOC after 6 weeks of treatment [47]. The effect of GRP, another
VKDP, was also observed in a group of patients with CDK. GRP was highly accumulated
at sites of medial calcification, either in mildly calcified arteries or in extensive and
advanced lesions. In contrast, in normal situations the absence of GRP in the extracellular
matrix was observed, which reveals that GRP is definitively associated with the processes
of abnormal calcification in the vascular system [74].
Oral antiocoagulants are VKAs drugs commonly used in clinical practice for the
management of thromboembolic disorders, which are able to reduce blood coagulation,
but also causes bone and cardiovascular complications [84]. In low-risk fibrillation atrial
patients, the use of VKAs resulted in higher coronary artery calcium scores, compared to
patients without VKA treatment. In this study, the mean coronary calcium scores
increased significantly with the duration of VKA use [85]. Warfarin is a VKA, commonly
administered to patients on dialysis, which have a high prevalence of VC due to its use
[86, 87]. Studies that evaluated the concomitant administration of vitamin K2 and VKAs
indicated the benefits of a high intake of vitamin K2 in these conditions. In a randomized
study was verified the positive effect of daily supplementation of vitamin K2 in 53
hemodialysis patients with vitamin K deficiency, possibly associated to the use of
24
warfarin. The supplementation dose was 45, 135 or 360 μg/day for 6 weeks and the dose-
dependent effect on γ-carboxylation of MGP was observed [47]. Benefits of vitamin K2
consumption for hemodialysis patients were also found in an observational study of 387
individuals who had significant prevalence of deficiency (below the 5th percentile of the
control group) of MK-7 (35.4%), MK-4 (14.5%) and vitamin K1 (23.5%). In these
individuals, MK-4 deficiency was a predictor of aortic calcification (OR = 2.82, 95% CI
1.14 to 7.01) and MK-7 deficiency was an iliac calcification predictor (OR = 1 64, 95%
CI 1.03 to 2.60) [88]. Despite the use of VKAs being considered a causative factor for
VC, overwhelming evidence in humans is still needed. One should also consider that the
importance of therapy with anticoagulants may exceed its prejudicial effect on VC in
some cases [89].

6.3.3.3 Animal studies

In a study with deficient MGP animals, a smaller stature at birth compared with
the control group was observed, due to heavy calcification of chondrocytes in growth
plates [66]. Death of MGP deficient animals was found 8 weeks after birth due to
extensive calcification of large and medium-sized arteries [90]. The administration of
warfarin to mice for 6 weeks induced inactivation of MGP and severe VC. However, the
replacement of the drug by high doses of vitamin K (K1 or K2) induced significant
regression of the arterial calcium content by approximately 50% [91]. Another study
demonstrated that animals fed with a diet low in vitamin K showed only 2% of cMGP in
the vessel wall [92]. Spronk et al. [93] observed the inhibition of warfarin-induced arterial
calcification by the concomitant administration of a high dose of vitamin K2 (30 mg/day
of MK-4), which was not observed with administration of vitamin K1.
In animals with adenine-induced renal disease, undergoing therapeutic doses of
warfarin, attenuation of the VC development after treatment with high doses of vitamin
K1 (100mg/kg diet) was observed. Administration of vitamin K1 resulted in increased
renal MK-4 concentration, possibly due to a conversion process of vitamin K1 to K2,
described previously by other authors [61].
In rats, GRP was found to be highly expressed in epidermis and dermis. In blood
vessels, γ-carboxylated GRP was highly accumulated in the walls of blood vessels and
capillaries, mainly in VSMC of the tunica intima [74]. The GRP gene is absent in

25
invertebrate and birds genomes, and was identified in most classes of vertebrates,
including mammals, sauropsids, amphibians, bony fish, and jawless fish [94]

6.4 CONCLUSIONS
Convincing data of the biological plausibility of the importance of vitamin K2 for
bone and vascular health have been published, especially in recent years. This revision
supports the hypothesis that vitamin K2 stimulates the carboxylation of important VKDP
for bone and vascular metabolism, such as OC, MGP and GRP. Whether carboxylated,
these proteins are better secreted by the cells, accumulate more in the tissue, and can
accomplish its physiological role. Vitamin K2 is also associated with the reduction of
arterial calcium deposits, by promoting the increase of VSMCs, and the inhibition of
transdifferentiation of VSMCs to osteoblasts. Furthermore, vitamin K2 promotes bone
formation by increasing the differentiation and reducing the apoptosis of osteoblast, and
by reducing bone resorption by inhibiting osteoclast differentiation. The effect of vitamin
K2 in BMD in humans is controversial and needs to be confirmed in more studies.
Benefits of vitamin K2 consumption were demonstrated especially in the occurrence of
bone loss in human or animal studies.
Vitamin K1 has not shown to have comparable beneficial effects in most studies,
although it has been described as increasing the blood and tissue levels of vitamin K2 due
to a conversion process. Most studies were conducted in Japan, where the fermented
soybeans natto, the most abundant food source of vitamin K2 known, is part of the typical
diet. In Japan, therapeutic doses of this vitamin K2 are used as a supplement to treat
osteoporosis and VC. Considering that most studies were conducted in Japan and have
relatively small sample size, we highlight the need of results using larger population
samples, mainly from other geographic areas. Faced with literature data, the consumption
of natural sources of vitamin K2 and the oral supplementation, especially in the presence
of osteoporosis and/or VC, can be considered as an interesting option for maintaining
good nutritional status in favor of bone and vascular health promotion.

Funding: This study was financed in part by the Coordenação de Aperfeiçoamento

de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Finance Code 001.

Conflict of Interest: The authors declare that they have no conflict of interest.

26
Table 1 Effect of menaquinone (vitamin K2) supplementation on bone metabolism in human studies.

Difference in No. Difference in % change of

No. patients Study population; Difference in % BMD
Authors Intervention Fractures biological measurements
(K2; control) duration (K2 vs. control)
(K2 vs. control) (K2 vs. control)

Healty postmenopausal 45 mg/day

Iwamoto et al. [22] n=19; n=17 + 3.1 (lumbar spine; p<0.05) NA NA
women; 1 year menaquinone

Postmenopausal women,
45 mg/day -8 (RR=0.44 (95%
Ishida et al. [23] n=66; n=66 aged 50-75 years; 2 + 1.4 (radius; p=0.03) + 20% in OC (p<0.05)
menaquinone CI 0.20 to 0.99)
years

+ 36.3% in OC (p=0.0081); - 46.6%

Osteoporotic women; 2 45 mg/day -21 (RR= 0.43;
Shiraki et al. [24] n=120; n=121 + 3.2 (lumbar vertebrae; p=0.001) ucOC (p<0.0001); no significant
years menaquinone p=0.0273)
difference in urinary DPD

Healty men and healthy

postmenopausal women, 360 µg/day - 74.5% in ucOC/cOC ratio
Dalmeijer et al. [37] n=18; n=20 NA NA
aged 40-65 years; 12 menaquinone (p<0.001)
weeks
- 30.5% in ucOC (p<0.001), + 21%
in cOC (p=0.004); - 17.3% in
Postmenopausal women, 1.5 mg/day No significant differences were
Koitaya et al. [44] n=24; n=24 NA pentosidine (p=0.02); no significant
aged 50-65 years; 1 year menaquinone observed
differences in BAP and
DPD/creatinine
Postmenopausal women,
1.5 mg/day - 28,5% in ucOC (p<0.05); + 16.8%
Koitaya et al. [28] n=20; n=20 aged 53-65 years; 4 NA NA
menaquinone in cOC at 2 week (p<0.05)
weeks

27
 Postmenopausal women,
45 mg/day
Iwamoto et al. [41] n=22; n=20 aged 55-81 years; 2 + 1.69 (lumbar spine; p<0.001) NA NA
menaquinone
years

- 38.7% in
Postmenopausal women, 45 mg/day
n=2,016; n= incidence of new
Inoue et al. [40] aged 50 years or more; 3 menaquinone + 3 NA NA
1,999 vertebral fractures
years g/day calcium
(p=0.029)

Long-term hemodialysis
Westenfeld et al. patients, men and 360 μg/day - 34.4% in ucOC (p<0.05); no
n=50; n= 50 NA NA
[47] women, aged 18 years or menaquinone significant difference in AP
more; 6 weeks
CKD patients, men and 90 μg/day
Kurnatowska et al. No significant differences were
n=28; n=12 women, aged 18-70 menaquinone + 10 NA NA
[45] observed
years; 270 days μg vitamin day D3
- 60.7% in ucOC
Postmenopausal women
45 mg/day No significant differences were (p<0.0001); - 5.65% in OC
Binkley et al. [35] n=126; n=129 without osteoporosis; 1 NA
menaquinone observed (p=0.005); no significant
year
differences in BAP and NTX levels.
Women, 1-5 years after 360 μg/day + 7.69% in BAP (p=0.05); + 28.4%
No significant differences were
Emaus et al. [38] n=167; n=167 menopause, aged 50-60 menaquinone (natto NA in cOC (p<0.001); - 40.6% in ucOC
observed
years; 1 year capsules) (p<0.001)
Postmenopausal
45 mg/day + 17.9% in OC (p<0.05); - 25.8% in
Kasukawa et al. osteoporotic women, No significant differences were
n=26; n=29 menaquinone + 17.5 NA ucOC/OC (p<0.001); no significant
[43] aged 60 years or more; 1 observed
mg/week residronate differences in NTx, BAP and ucOC.
year

45 mg/day - 22% in DPD (p=0.032); - 36%

Postmenopausal women;
Hirao et al. [39] n= 21; n=23 menaquinone + 5 + 3.9 (femoral neck; p=0.03) NA ucOC (p=0.014); - 43% in
1 year
mg/day alendronate ucOC/OC (p=0.007)

+ 23.5% in OC (p=0.006); + 33% in

Postmenopausal women; 45 mg/day cOC (p=0.001); + 26.5% in urinary
Shiraki et al. [46] n=56; n=53 NA NA
6 months menaquinone NTx (p=0.019); - 57.1% in ucOC
(p=0.002)
28
 45 mg/day
Postmenopaulsal - 49.5% in ucOC (p=0.008); no
menaquinone + 400
Je et al. [42] n=18; n=27 women, aged 60 years or + 2.4 (lumbar spine; p=0.049) NA significant differences in OC and
UI/day vitamin D3 +
more; 6 months BAP
630 mg/day calcium

BMD: bone mineral density; OC: osteocalcin; ucOC: uncarboxylated OC; cOC: carboxylated OC; DPD: deoxypyridinoline; CKD: chronic kidney disease; OPG: osteoprotegerin; AP: alkaline
phosphatase; BAP: bone specific alkaline phosphatase; NTx: N-telopeptide of type 1 collagen; NA: not applicable

Table 2 Effect of menaquinone (vitamin K2) supplementation on vascular calcification in human studies

No. patients Difference in % change of biological measurements

Authors Study population; duration Intervention
(K2; control) (K2 vs. control)

Healty men and healthy postmenopausal - 46.2% in dp-ucMGP (p<0.001); no significant differences
Dalmeijer et al. [37] n=18; n=20 360 µg/day menaquinone
women, aged 40-65 years; 12 weeks in dp-cMGP and ucMGP

Long-term hemodialysis patients, men

Westenfeld et al. [47] n=50; n= 50 and women, aged 18 years or more; 6
- 41.7% in PIVKA-II (p<0.01); no significant difference
360 μg/day menaquinone
in fetuin-A.
weeks
Long-term hemodialysis patients, men
1080 μg menaquinone,
Caluwé et al. [36] n=53; n=59 and women, aged 18 years or more; 8 - 29% dp-ucMGP (p<0.001)
3x/week
weeks

- 57.1% in carotid intima-media thickness

CKD patients, men and women, aged 18- 90 μg/day menaquinone +
Kurnatowska et al. [45] n=28; n=12 (p<0.003); - 14.1% in dp-ucMGP (p=0.05); no significant
70 years; 270 days 10 μg vitamin D3/day
difference in coronary artery calcification score.

MGP: matrix Gla protein; cMGP: carboxylated MGP; ucMGP: uncarboxylated MGP; dp-ucMGP: desphosphorylated uncarboxylated MGP; PIVKA-II: protein induced by vitamin K absence;
CKD: chronic kidney disease

29
6.5 REFERENCES

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7. ARTIGO II
SUPLEMENTO DE VITAMINA K2 REDUZ E O DE CÁLCIO AUMENTA A
PERDA ÓSSEA EM RATAS OVARIECTOMIZADAS

RESUMO
Na osteoporose, a composição mineral do osso e a microarquitetura óssea estão
comprometidas. Vista a limitação dos tratamentos da osteoporose em repor a massa óssea
perdida, a prevenção é uma importante demanda na prática clínica. Nesse estudo,
investigamos o papel da vitamina K2, administrada isolada ou concomitantemente aos
suplementos de cálcio e vitamina D3, na osteoporose induzida por ovariectomia (ovx) em
ratas. Após 6 semanas da ovx, os animais foram divididos em grupos: (1) controle-sham
(falsa ovariectomia, com incisão abdominal sem retirada dos ovários) não tratado; (2)
controle-ovx não tratado; (3) ovx + cálcio; (4) ovx + K2 (5) ovx + cálcio + K2 (6) ovx +
cálcio + D3 (7) ovx + cálcio + K2 + D3. Na quarta semana de tratamento, os animais do
grupo 6, suplementados até então com cálcio e vitamina D3, passaram a receber, até a
oitava semana, cálcio e vitamina K2, afim de avaliar o efeito da troca de tratamento. Os
demais grupos permaneceram com o mesmo tratamento. Metade dos animais de cada
grupo foram eutanasiados com quatro semanas e a outra metade com oito semanas, para
avaliar o efeito do tempo de intervenção nos resultados analisados. Foi analisado o
conteúdo mineral ósseo de cálcio, magnésio, fósforo e potássio. No soro foram
determinados teores de cálcio, magnésio e fosfatase alcalina. O volume trabecular e a
microarquitetura óssea foram avaliadas por análises de histologia, microtomografia e
radiografia. O teste de resistência óssea foi relizado para avaliar a força necessária para
causar fratura. Animais suplementados com vitamina K2 apresentaram cálcio sérico
semelhante ao dos animais do grupo sham e ovx + cálcio. A vitamina K2 protegeu da
perda de volume ósseo trabecular nas ratas com perda óssea induzida por ovx e os
suplementos de cálcio e/ou vitamina D3 apresentaram efeitos inconsistentes sobre a
massa óssea. Não houve diferença quanto a fosfatase alcalina sérica e a resistência óssea
entre os tratamentos. Os resultados da histologia, microtomografia e radiografia tiveram
pontos em comum, sendo a microtomografia capaz de detectar diferenças entre os grupos
de forma mais minuciosa. A massa óssea dos animais osteoporóticos suplementados com
vitamina K2 foi semelhante à dos animais não-osteoporóticos e superior à dos grupos que
receberam cálcio. Além disso, de forma inédita observamos que a mudança de tratamento
de cálcio+D3 para cálcio+K2 reverteu, ao final da oitava semana, a perda óssea observada
na quarta semana. Diferente dos animais suplementados apenas com cálcio, o tratamento

39
com vitamina K2, combinada ou não com cálcio e/ou vitamina D3, promoveu conteúdo
de cálcio ósseo semelhante ao grupo não-osteoporótico. Concluímos que a vitamina K2
promove benefícios na massa óssea de ratas com osteoporose induzida e o cálcio e a
vitamina D3 têm efeitos inconsistentes.
Palavras-chave: menaquinona; osteoporose; tratamento; colecalciferol; ovariectomia.

7.1 INTRODUÇÃO
Na osteoporose a microarquitetura óssea e a composição mineral do osso,
predominantemente dada pelo cálcio incorporado na forma de cristais de hidroxiapatita,
estão comprometidas. Devido à saída de cálcio dos ossos marcar a patogênese da
osteoporose, a suplementação desse mineral de forma isolada ou combinada com a
vitamina D, se tornou uma recomendação comum para mulheres na pós-menopausa, com
a finalidade de reintroduzir cálcio no osso. Entretanto, os baixos níveis de estrogênio,
característicos deste período, inibem a fixação de minerais no esqueleto, mesmo com o
aumento do consumo de cálcio por meio de suplementos alimentares (DURÁN, 2011; de
VILLIERS, 2015).
Devido às alterações hormonais promoverem a perda e evitarem a deposição de
massa óssea, a prevenção e a interrupção da perda óssea são os focos essenciais para o
tratamento da osteoporose. A eficácia dos suplementos de cálcio e vitamina D em
melhorar a saúde óssea é controversa e, além disso, a suplementação de cálcio está
associada ao maior risco de calcificação dos vasos e infarto do miocárdio
(MICHAËLSSON et al., 2013; BOLLAND et al., 2010; BOLLAND et al., 2008). Assim,
opções simples e de baixos risco e custo para evitar a osteoporose são demandas
importantes na prática clínica.
Benefícios exclusivos têm sido atribuídos à vitamina K2 na prevenção e tratamento
da osteoporose. Também chamada menaquinona (MK), a vitamina K2 é encontrada,
porém em baixa quantidade, em alguns alimentos como gema de ovo, vísceras e em
produtos como queijos, repolho e soja fermentados, além de ser produzida a partir da
vitamina K1 pela bactéria Escherichia coli no intestino humano (MEGANATHAN,
2001).
A vitamina K2 ativa algumas proteínas promotoras da mineralização óssea, como
a osteocalcina (HAUSCHKA et al., 1989; SCHINKE; MCKEE; KARSENTY, 1999) e
gla rich protein (CANCELA; CONCEIÇÃO; LAIZÉ, 2012). A essencialidade da
vitamina K2 para a atividade biológica dessas proteínas se deve ao seu papel como cofator
no processo pós-traducional de γ-glutamilcarboxilação. Além disso, a vitamina K2

40
promove aumento no número e da atividade dos osteoblastos (URAYAMA et al., 2000),
modula de genes alvo em osteoblastos (ICHIKAWA et al., 2007) e promove a
cicatrização da fratura (KOITAYA et al., 2009).
Estudos que avaliem o efeito da vitamina K2 na saúde óssea são escassos no Brasil,
porém crescentes na literatura internacional, e o uso dessa vitamina para a prevenção e
tratamento da osteoporose na prática clínica é baixo. O objetivo deste estudo foi avaliar
o efeito da vitamina K2, administrada de forma isolada ou associada à vitamina D3 e ao
cálcio, na massa óssea em modelo experimental de osteoporose.

7.2 MATERIAIS E MÉTODOS

7.2.1 Animais
As 70 ratas (Rattus norvergicus, linhagem Wistar, variação albinus) usadas nesse
estudo foram adquiridas, com 30 dias de vida, no Biotério Central da Universidade
Federal de Viçosa. Os animais receberam ração comercial, até a data do início dos
tratamentos, e água deionizada ad libitum e foram alojados em gaiolas individuais de aço
inox, em ambiente com temperatura controlada a 22º C e ciclo claro e escuro de 12 horas.

7.2.2 Indução da osteoporose por ovariectomia

Ao atingir 12 semanas, quando os animais estavam em fase avançada da idade
adulta, eles foram submetidos à cirurgia de ovariectomia (ovx), com incisão abdominal e
retirada dos ovários, ou à laparotomia (sham), com incisão abdominal sem retirada dos
ovários, para induzir o estresse cirúrgico e seus efeitos. A ovx promove redução da
formação óssea e aumento da reabsorção, semelhante ao observado em mulheres após a
menopausa devido a deficiência de estrogênio (THOMPSON et al., 1995).
Trinta minutos antes do início das cirurgias ovx ou sham, os animais receberam, via
subcutânea, o anti-inflamatório flunixinameglumina (0,68 mg/kg) e o antibiótico
enrofloxocina (10 mg/kg). Os animais foram anestesiados com isoflurano diluído em
100% de oxigênio, por via inalatória, por meio de vaporizador calibrado. A concentração
do isoflurano foi ajustada de forma a manter o plano anestésico adequado. Após a indução
e estabilização anestésicas, os animais foram posicionados em decúbito dorsal sobre
colchão com aquecimento ativo e o campo operatório foi preparado com iodopovidona a
10%. Foi administrado, via subcutânea, o analgésico morfina na dose de 5 mg/kg.
Após as cirurgias, os animais permaneceram em câmara aquecida, a fim de manter
a temperatura corporal, e em seguida retornaram às gaiolas individuais. Os procedimentos
anestésico-cirúrgicos e pós-cirurgicos foram realizados no Hospital Veterinário do

41
Departamento de Veterinária da UFV sob a responsabilidade da Médica Veterinária
Lukiya Silva Campos Favarato.
O período de indução da osteoporose após a ovx foi de 6 semanas, prévias ao início
da intervenção, em que as ratas permaneceram em gaiolas individuais e receberam dieta
comercial peletizada e água ad libitum.

7.2.3 Composição da dieta padrão

A dieta administrada aos animais, concomitantemente aos tratamentos, foi
elaborada de acordo com as recomendações descritas na AIN-93M (REEVES; NIELSEN;
FAHEY, 1939). Dentre os conteúdos de micronutrientes recomendados, destacam-se os
que foram suplementados no período de intervenção: vitamina K (750 UI/kg de dieta),
vitamina D3 (1000 UI/kg de dieta), cálcio (5000 mg/kg de dieta). Vale ressaltar que o
conteúdo de vitamina K corresponde à vitamina K1. A dieta AIN-93 é isenta de vitamina
K2.

7.2.4 Dosagens dos suplementos

As dosagens usadas dos suplementos de cálcio e vitamina D3 foram proporcionais
às recomendações das Diretrizes Terapêuticas da Osteoporose (DTO) (BRASIL, 2014)
para humanos. Foi verificada a porcentagem recomendada dos suplementos em relação
às Dietary References Intakes (DRIs) para mulheres de 51-70 anos (IOM, 2011), período
que engloba a menopausa, e adicionada a mesma porcentagem na dieta padrão para ratos,
AIN-93M (REEVES; NIELSEN; FAHEY, 1939). A DTO recomenda suplementar, em
média, 1x e 1,67x as DRIs de cálcio e vitamina D3, respectivamente. Seguindo essa
proporção, adicionamos à dieta dos animais 5000 mg/kg de dieta de carbonato de cálcio
e 1670 UI/kg de dieta de vitamina D3.
Quanto à vitamina K2, não há recomendação nutricional para humanos ou animais
e para a determinação da dosagem foram considerados estudos anteriores e de toxicidade.
A dose usada nesse estudo foi de 12,5 mg/kg de dieta ou 718 µg/kg de peso corporal por
dia. Trabalhos já publicados apresentaram o uso de doses que variaram de 141 µg/kg de
dieta (YAMAGUCHI et al., 2000) a 201 mg/kg de dieta (FU et al., 2012). Não foi
observada toxicidade aguda, com dose diária de 2000 mg/kg de peso corporal, ou
subcrônica, com administração de 2,5, 5 ou 10 mg/kg de peso corporal em ratos (PUCAJ
et al., 2011). A dose utilizada nesse estudo foi mediana em relação aos estudos que usaram
a menor e a maior dose, de forma que a dose usada se encontra bem acima da dose mínima
em que foi observado efeito e abaixo da máxima.

42
 7.2.5 Grupos experimentais e eutanásia
Ao atingirem 18 semanas, após 6 semanas das cirurgias, os animais, até então
alimentados com ração comercial, passaram a receber a dieta padrão AIN-93M e foram
distribuídos, pelo método de estratificação por peso corporal, em 7 grupos de 10 animais,
sendo eles: (1) controle-sham (falsa ovariectomia, com incisão abdominal sem retirada
dos ovários) não tratado; (2) controle-ovx não tratado; (3) ovx + cálcio; (4) ovx + K2 (5)
ovx + cálcio + K2 (6) ovx + cálcio + D3 (7) ovx + cálcio + K2 + D3.
Após a 4ª semana de tratamento, cinco animais de cada grupo foram eutanasiados.
Os outros cinco animais de cada grupo foram eutanasiados ao final da 8ª semana de
tratamento, a fim de verificar o efeito do tempo de suplementação na saúde óssea. Da 4ª
até a 8ª semana as dietas experimentais permaneceram idênticas, exceto para o grupo 6,
em que a dieta contendo cálcio + vitamina D3 foi substituída por uma contendo cálcio +
vitamina K2. Essa alteração foi realizada para verificar o efeito da alteração do tratamento
nos desfechos analisados.
As eutanásias ocorreram após jejum de 12 horas, por exsanguinação/punção
cardíaca nos animais anestesiados com Isoflurano (Isoforine, Cristália®). Cerca de 6 mL
de sangue foram coletados usando agulha inserida no ventrículo esquerdo. As amostras
de sangue foram centrifugadas a 3000 rpm, por 10 minutos à 4º. Os fêmures direito e
esquerdo, e tíbias direita e esquerda foram retirados e lavados em tampão PBS. Parte de
cada tecido foi armazenado em formalina 10%, para análises histológicas, ou congelados
a -70ºC para outras análises.

7.2.6 Peso e consumo alimentar

Os pesos dos animais e a ingestão alimentar foram monitorados semanalmente. O
ganho de peso corporal foi determinado pela diferença entre os pesos no dia da eutanásia
e o do primeiro dia da intervenção. Foi calculado o ganho de peso e o coeficiente de
eficiência alimentar (CEA), de acordo com a fórmula: CEA = ganho de peso (g)/consumo
alimentar (g).

7.2.7 Dosagens sanguíneas

Foram feitas as dosagens séricas de fosfatase alcalina, cálcio, magnésio, por
colorimetria, usando o equipamento BS200 e kits específicos, fornecidos pela Bioclin®.

43
 7.2.8 Determinação do conteúdo mineral ósseo
O fêmur direito foi submetido à secagem em estufa de circulação forçada por 72
horas a 68-72ºC. Em seguida, as amostras foram pesadas e moídas. As vidrarias utilizadas
foram lavadas e descontaminadas em solução de HCl 2% por 5 minutos e levadas com
água deionizada.
Para a digestão ácida foi adicionada ao material a solução de ácido nítrico e
perclórico, na proporção 4:1, em tubos de digestão, que foram colocados em chapa pré-
aquecida, com temperatura inicial de 80ºC elevada gradativamente até 200ºC até que o
material ficasse cristalino (SARRUGE; HAAG, 1974). A determinação de cálcio e
magnésio foi realizada por espectrofotometria de absorção atômica, a de potássio por
fotometria de chama e a quantificação de fósforo por colorimetria pelo método do ácido
ascórbico (BRAGA; DEFELIPO, 1974).

7.2.9 Histomorfometria óssea

Os fêmures direitos dos animais foram fixados em formalina 10% por 72 horas e,
em seguida, armazenadas em álcool 70%. O fêmur foi descalcificado em solução de
citrato de sódio e ácido fórmico, que foi substituída a cada quatro dias durante 12 dias,
quando os ossos já estavam suficientemente descalcificados. Em seguida, realizou-se
lavagem em água corrente por 24 horas, seguida de imersão em solução de sulfato de
sódio 5%, por 24 horas, e cortes longitudinais das epífises. As amostras foram submetidas
a imersões em álcoois 70, 80, 90 e 100%, xilol e parafina, utilizando-se o aparelho
histotécnico para tecidos (Leica TP1020). Foram montados blocos de parafina e
realizados seis cortes de cada amostra, com espessura de 5 µm, em micrótomo de rotação
(Leica RM2245). Em seguida, após permanecerem em estufa por 2 horas, as lâminas com
os cortes histológicos foram desparafinizadas em xilol, reidratadas em água e em
concentrações descrescentes de álcool, e coradas com hematoxilina e eosina. As imagens
histológicas foram obtidas com aumento de 40x, em fotomicroscópio (Zeiss – Scope A1)
com sistema de captura de imagens (AxioCam 105 color Zeiss), em diferentes campos de
forma aleatória. As imagens das lâminas foram analisadas no programa Image J, pelo
método de contagem a partir da sobreposição de uma grade de 266 pontos. Nas imagens
dos ossos foi analisado o volume trabecular, na região localizada logo abaixo da linha de
crescimento.

44
 7.2.10 Resistência óssea
A resistência óssea foi medida a partir do ensaio de flexão com uso da máquina
universal para ensaios mecânicos Instron. Os ossos dos animais foram posicionados no
equipamento com extremidades apoiadas em suporte adaptado ao tamanho dos ossos. A
carga foi aplicada no centro da diáfise óssea com velocidade de deslocamento de
2mm/minuto. A compressão máxima, em Newtons (N), no momento da ruptura, foi
registrada pelo sistema computacional acoplado à máquina universal, com uso do
software Bluehill.

7.2.11 Microtomografia
A quantificação microestrutural foi realizada com uso de microtomógrafo de raio-
X de alta resolução SkyScan (modelo 1174v2) e os softwares fornecidos pelo fabricante
do scanner NRecon, DataViewer e CT-Analyzer. As imagens foram obtidas com a
voltagem de 50 kV, corrente de 670 µA, filtro de alumínio de 0.5 mm, rotação de 360º e
resolução de 18.11 µm. Foram analisados 50 slices de osso trabecular, localizados 10
slices abaixo da placa de crescimento. Foram medidos o volume trabecular (BV/TV),
espessura de trabécula (Tb/Th), número de trabéculas (Tb.N) e espessamento entre
trabéculas (Tb.Sp).

7.2.12 Radiografia
Os fêmures esquerdos dos animais foram radiografados e o tamanho da área
analisada, localizada na cabeça do fêmur, foi semelhante entre os animais. Para obtenção
das imagens foi padronizada voltagem de 44 kV, corrente de 100 mA, tempo de exposição
de 0,07 segundo e distância de um metro entre a fonte de emissão dos raios-X e o filme
radiográfico. Um penetrômetro de alumínio, com dimensões de 25 mm de largura e 60
mm de comprimento e 5 degraus com 3 mm de altura cada foi posicionado próximo aos
fêmures a serem radiografados para a determinação da densidade radiográfica.
As radiografias foram digitalizadas e analisadas com auxílio do software ImageJ.
As imagens foram convertidas para escala de cinza e os níveis de cinza de cada degrau
do penetrômetro foram quantificados e, em seguida, utilizados para a realização de uma
curva, em análise de regressão linear. Valores de densidade em milímetros de alumínio
(mmAl) em função dos níveis de cinza do penetrômetro, foram gerados para as
radiografias dos fêmures de cada animal.

45
 7.2.13 Análises estatísticas
Os dados foram expressos em média e desvio padrão. ANOVA one-way e o teste
post-Hoc Duncan foram utilizados para verificar a diferença entre as médias dos
diferentes grupos. A diferença nas médias da semana 4 e da semana 8, do mesmo grupo
foi verificada pelo teste t de Student. O nível de significância estabelecido foi de menos
de 5%.

7.2.14 Aspectos éticos

Todos os procedimentos experimentais com os animais foram realizados em
consonância com os princípios éticos na experimentação animal, após a apreciação deste
estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisas com animais da Universidade Federal de
Viçosa (Protocolo número 068/2016).

7.3 RESULTADOS
7.3.1 Massa corporal e consumo alimentar
O peso médio dos animais não diferiu no dia anterior às ovariectomias (203,6 ± 0,4
g). Seis semanas após as cirurgias, antes do início dos tratamentos, ratas ovariectomizadas
apresentaram maior peso corporal (272,3 ± 22,06 g) em relação às do grupo ctr-sham
(240,8 ± 22,1), no entanto, essa diferença desapareceu duas semanas após o início dos
tratamentos. Após 4 ou 8 semanas de tratamento, não houve diferença entre os grupos
quanto ao peso corporal. Na análise ao longo do tempo, apenas o grupo Ca+K2 apresentou
aumento de peso corporal. O consumo alimentar foi reduzido, na semana 4, nos grupos
suplementados com Ca+D3 antes da troca de tratamento, em relação aos demais grupos,
com exceção do grupo Ca+K2. Ao final da oitava semana, não houve diferença entre os
grupos quanto ao consumo alimentar (Tabela 1). De acordo com o consumo médio dos
animais, a dose de vitamina K2 administrada foi de 209,5 µg/dia. Não foram observadas
diferenças no peso e comprimento total do fêmur dos animais entre os grupos nem ao
longo do tempo (dados não apresentados).

7.3.2 Análises bioquímicas

A ovariectomia promoveu uma redução do conteúdo de cálcio no sangue dos
animais, vista pela diferença entre os grupos controle na quarta semana. Apenas os grupos
suplementados com cálcio ou vitamina K2 impediram essa redução e permaneceram com
níveis de cálcio sérico foi semelhantes ao grupo ctr-sham.

46
 Em relação à fosfatase alcalina (FA), houve redução em todos os animais
ovariectomizados, suplementados ou não, exceto para o grupo Ca+D3 na 4ª semana, antes
da troca de tratamento. Na oitava semana, todos os grupos apresentaram FA superior à
do grupo ctr-sham. Não foi observada diferença estatística quanto aos níveis de magnésio
(Tabela 2).

Tabela 1: Peso corporal e consumo alimentar dos animais dos diferentes grupos experimentais, nas
semanas 4 e 8. Dados expressos em média (desvio padrão).

Tratamento Peso corporal (g)* Consumo alimentar (g)

Semana 4 Semana 8 Semana 4 Semana 8

Ctr-sham 261,3 (29,9)1 272,8 (14,3)1 15,6 (1,7)a,1 13,7 (1,4)a,1

Ctr-ovx 280,8 (26,2)1 307,1 (13,2)1 14,4 (1,2)a,1 13,9 (0,9)a,1
Ca 280,3 (25,3)1 304,4 (18,0)1 15,2 (2,6)a,1 14,0 (1,6)a,1
K2 273,6 (22,1)1 301,0 (22,7)1 15,4 (1,1)a,1 13,1 (2,1)a,1
Ca+K2 269,2 (28,6)1 306,8 (7,2)2 13,8 (2,4)b,1 16,0 (4,8)a,1
Ca+D3/Ca+K2 252,8 (30,5)1 308,4 (45,2)1 11,3 (2,4)b,1 15,4 (1,4)a,2
Ca+K2+D3 283,4 (25,7)1 299,7 (15,7)1 14,2 (1,6)a,1 13,9 (1,2)a,1
Ctr-sham: Controle não osteoporótico; Ctr-ovx: controle osteoporótico; Ca: cálcio; K2: vitamina K2; D3:
vitamina D3. ANOVA post-Hoc Duncan para diferença entre grupos; teste t para diferença no mesmo
grupo, na semana 4 e na semana 8. Letras indicam diferenças entre grupos. Números indicam diferença no
mesmo grupo, na semana 4 e na semana 8. * indica ausência de diferença entre grupos.

Tabela 2: Marcadores bioquímicos plasmáticos dos animais dos diferentes grupos experimentais, nas
semanas 4 e 8. Dados expressos em média (desvio padrão).
Cálcio Magnésio* Fosfatase alcalina
Tratamento (mg.dL -1
) (mg.dL-1
) (U.L-1)
Semana 4 Semana 8 Semana 4* Semana 8* Semana 4 Semana 8

Ctr-sham 10.7 (0.5)a,1 10.4 (0.3)a,1 13.6 (0.4)1 11.1 (5.5)1 33.6 (7.0)b,1 29.2 (7.2)b,1
67.0
Ctr-ovx 10.0 (0.1)b,1 9.9 (0.3)b,1 10.5 (3.6)1 10.9 (4.3)1 57.0 (6.4)a.2
(17.1)a,1
10.2 53.4 64.2
Ca 10.5 (0.2)a,1 9.7 (3.1)1 11.4 (2.1)1
(0.3)a,b,c,1 (14.7)a.1 (14.8)a,1
10.4 62.8 60.5
K2 10.4 (0.6)a,1 11.3 (5.0)1 12.4 (3.5)1
(0.4)a.b,1 (10.1)a.1 (20.6)a,1
53.8 60.2
Ca+K2 9.8 (0.5)c,1 9.6 (0.2)b,1 13.1 (6.0)1 13.9 (3.3)1
(22.1)a.1 (18.5)a,1
46.0
Ca+D3/Ca+K2 9.8 (0.5)c,1 9.7 (0.2)b,1 16.1 (6.8)1 9.6 (3.0)1 71.6 (7.6)a,1
(10.7)b,2
66.6
Ca+K2+D3 9.6 (0.3)c,1 9.7 (0.2)b,1 12.1 (7.4)1 10.9 (2.5)1 55.2 (8.8)a,1
(16.2)a,1
Ctr-sham: Controle não osteoporótico; Ctr-ovx: controle osteoporótico; Ca: cálcio; K2: vitamina K2; D3:
vitamina D3. ANOVA post-Hoc Duncan para diferença entre grupos; teste t para diferença no mesmo
grupo, na semana 4 e na semana 8. Letras indicam diferenças entre grupos. Números indicam diferença no
mesmo grupo, na semana 4 e na semana 8. * indica ausência de diferença entre grupos.

47
 7.3.3 Resistência óssea
Não houve diferença entre os animais dos diferentes grupos quanto à resistência
óssea, avaliada pela compressão máxima, dada em Newtons (Tabela 3).

Tabela 3: Resistência óssea, em Newtons, dos animais dos diferentes grupos experimentais, nas semanas
4 e 8.
Compressão máxima (Newtons)
Tratamento
Média geral (DP)* Média (DP) semana 4* Média (DP) semana 8*
Ctr-sham 114.20 (5.31) 113.08 (4.85) 115.31 (6.07)
Ctr-ovx 115.37 (12.48) 111.41 (15.32) 119.32 (8.76)
Ca 115.32 (16.05) 111.57 (15.41) 119.07 (17.51)
K2 107.18 (22.73) 106.05 (30.55) 114.64 (12.41)
Ca+K2 118.49 (21.29) 122.50 (16.19) 126.32 (4.93)
Ca+D3/Ca+K2 119.36 (18.64) 112.31 (27.63) 123.59 (12.91)
Ca+K2+D3 118.01 (15.18) 119.06 (18.24) 116.97 (13.50)
Ctr-sham: Controle não osteoporótico; Ctr-ovx: controle osteoporótico; Ca: cálcio; K2: vitamina K2; D3:
vitamina D3. ANOVA para verificar diferença entre grupos; teste t para verificar diferença no mesmo
grupo, na semana 4 e na semana 8. * indica ausência de diferença entre grupos e quanto ao tempo de
intervenção

7.3.4 Histomorfometria óssea

A ovariectomia promoveu a redução do volume trabecular, vista pela diferença
entre o grupo ctr-sham e ctr-ovx, tanto na quarta quanto na oitava semana. Ao final da
quarta semana, os animais do grupo ctr-sham possuíam volume trabecular superior a
todos os demais animais ovariectomizados, tratados ou não. Na oitava semana, o grupo
ctr-sham permaneceu com volume trabecular superior ao ctr-ovx, entretanto houve
diferenças entre os tratamentos. A conservação da massa óssea nos grupos que receberam
apenas vitamina K2, Ca+K2 (após a troca de tratamento) e Ca+K2+D3 fizeram com que
estes, ao final da oitava semana, apresentassem volume trabecular semelhante ao do grupo
ctr-sham.
Em relação à diferença quanto ao tempo de intervenção, houve redução do volume
trabecular nos grupos que receberam Ca ou Ca+K2 (sem troca de tratamento) (Tabela 4;
Figura 1A).

7.3.5 Radiografia
A indução da osteoporose pela ovariectomia também foi constatada na análise das
radiografias dos fêmures dos animais, ao final da semana 4. Na quarta semana de
tratamento, o suplemento com Ca+K2 e com Ca+K2+D3 promoveu aumento da massa
óssea e o tratamento com Ca+D3, reduziu a densidade óssea, em relação ao grupo ctr-
ovx. Ao final da oitava semana, as análises radiológicas não detectaram diferença entre

48
os grupos. Houve aumento da massa óssea, da quarta para a oitava semana, apenas no
grupo que foi realizada a troca de tratamento, de Ca+D3 para Ca+K2.

Tabela 4: Análise histológica da porcentagem de osso trabecular e densidade óssea, em milímetros de

alumínio, com base nas radiografias dos fêmures dos animais dos diferentes grupos experimentais. Dados
expressos em média (desvio padrão)
Histologia - Osso trabecular (%) Radiografia - Densidade óssea (mmAl)
Semana 4* Semana 8 Semana 4 Semana 8
Ctr-sham 56.63 (7.89) 1
55.68 (4.35) a,1
1.64 (0.20) a,1
1.22 (0.37)a,1
Ctr-ovx 50.23 (7.21)1 46.13 (4.98)b,1 1.38 (0.09)b,1 1.18 (0.23)a,1
Ca 55.15 (6.68) 1
43.01 (7.35) b,2
1.14 (0.13) b,c,1
1.18 (0.20)a,1
K2 57.93 (10.96)1 54.45 (4.51)a,1 1.32 (0.07)b,1 1.36 (0.2)a,1
Ca+K2 54.40 (4.96)1 42.34 (5.28)b,2 1.49 (0.16)a,1 1.25 (0.29)a,1
Ca+D3/Ca+K2 50.87 (6.05) 1
47.27 (7.59) a,1
1.00 (0.32) c,1
1.34 (0.15)a,1
Ca+K2+D3 55.36 (7.60)1 50.15 (10.69)a,1 1.49 (0.16)a,1 1.34 (0.33)a,1
Ctr-sham: Controle não osteoporótico; Ctr-ovx: controle osteoporótico; Ca: cálcio. K2: vitamina K2; D3:
vitamina D3. ANOVA e post-Hoc Duncan. Letras indicam diferença entre os grupos. Números indicam
diferença no mesmo grupo, na semana 4 e na semana 8. *indica ausência de diferença entre grupos

7.3.6 Microtomografia
Assim como nas análises de histologia e radiografia, foi confirmada na
microtomografia a perda de massa óssea devido à ovariectomia. Na quarta semana, o
grupo ctr-sham apresentou volume trabecular superior a todos os demais grupos
ovariectomizados, tratados ou não, e não houve diferença entre os tratamentos. Na oitava
semana, a diferença entre o grupo ctr-ovx e ctr-sham desapareceu, uma vez que houve
uma queda mais acentuada do volume trabecular no grupo ctr-sham.
Na oitava semana, os grupos K2, Ca+K2 (que sofreu mudança de intervenção) e
o ctr-ovx foram semelhantes ao grupo ctr-sham. Uma queda ainda mais acentuada da
massa óssea foi verificada no grupo que recebeu apenas Ca, Ca+K2 (sem troca de
tatamento) ou Ca+K2+D3, o que fez com que esses grupos apresentasse volume
trabecular menor do que o grupo ctr-sham.
Em relação ao tempo de intervenção, houve redução do volume trabecular, da
quarta para a oitava semana, no grupo ctr-sham e em todos os grupos que receberam
suplemento de cálcio, de forma isolada ou conjunta (grupos Ca; Ca+K2 sem troca de
tratamento; e Ca+K2+D3). O grupo que recebeu apenas vitamina K2 e o que sofreu troca
de tratamento de Ca+D3 para Ca+K2 apresentou manutenção da massa óssea ao longo do
tempo.
Não houve diferença entre os grupos e quanto ao tempo de intervenção em relação
ao número de trabéculas, a espessura trabecular e ao espessamento ente trabéculas (Tabela
5; Figura 1B).

49
Tabela 5: Parâmetros analisados na microtomografia dos fêmures dos animais dos diferentes grupos
experimentais. Dados apresentados em média (desvio padrão).
Espessamento
Volume Espessura Número de
entre trabéculas
trabecular (%) trabecular (mm)* trabéculas (1/mm)*
(mm)*
Semana Semana Semana Semana Semana Semana
Semana 4 Semana 8
4 8 4 8 4 8
88.5 79.3 0.25 0.26 3.63 3.13 0.09 0.14
ctr-sham
(3.8)a,1 (3.8)a,2 (0.05) (0.03) (0.54) (0.25) (0.01) (0.01)
75.4 74.4 0.20 0.21 3.77 3.62 0.12 0.14
ctr-ovx
(3.5)b,1 (4.1)a,1 (0.02) (0.02) (0.53) (0.52) (0.02) (0.02)
79.6 68.1 0.21 0.22 3.88 3.11 0.11 0.16
Ca
(6.1)b,1 (8.4)b,2 (0.04) (0.03) (0.48) (0.24) (0.02) (0.01)
77.4 72.5 0.19 0.22 4.03 3.41 0.11 0.14
K2
(5.2)b,1 (3.9)a,1 (0.02) (0.04) (0.53) (0.58) (0.02) (0.02)
79.3 65.1 0.21 0.20 3.81 3.17 0.11 0.16
Ca+K2
(2.6)b,1 (5.7)b,2 (0.03) (0.02) (0.46) (0.27) (0.01) (0.01)
Ca+D3/Ca+ 76.3 73.7 0.19 0.21 4.01 3.56 0.12 0.14
K2 (4.8)b,1 (5.5)a,1 7(0.02) (0.01) (0.37) (0.17) (0.02) (0.02)
80.6 68.3 0.22 0.21 3.69 3.20 0.11 0.15
Ca+K2+D3
(2.5)b,1 (5.9)b,2 (0.02) (0.02) (0.28) (0.14) (0.01) (0.01)
Ctr-sham: Controle não osteoporótico; Ctr-ovx: controle osteoporótico; Ca: cálcio.
ANOVA 2-fatores e post-Hoc Duncan. Letras indicam diferença entre os grupos. Números indicam
diferença no mesmo grupo, ao longo do tempo
*indica ausência de diferença entre os grupos e quanto ao tempo de intervenção.

Figura 1 A) Lâminas histológicas, coradas com hematoxilina e eosina, dos fêmures dos animais dos
diferentes grupos experimentais; B) Slices em porção padronizada dos fêmures dos animais dos diferentes
grupos experimentais. Ca: cálcio; K2: vitamina K2; D3: vitamina D3.

7.3.7 Conteúdo mineral ósseo

Houve diminuição no conteúdo de cálcio nos ossos dos animais do grupo ctr-ovx
em relação ao grupo ctr-sham, indicando a ocorrência de descalcificação óssea associada
à ovariectomia nas ratas. A suplementação com cálcio não promoveu o aumento do
50
conteúdo de cálcio nos ossos das ratas. Já nos grupos tratados com vitamina K2, de forma
isolada ou combinada com cálcio e/ou vitamina D3, a perda de cálcio ósseo associada a
ovariectomia foi evitada, de forma que, ao final da oitava semana, estes grupos foram
semelhantes ao grupo ctr-sham. Não houve diferenças nos conteúdos ósseos de fósforo,
magnésio e potássio entre os grupos (Tabela 6).

Tabela 6: Conteúdo de minerais nos fêmures dos animais ao final de 8 semanas de tratamento dos animais
dos diferentes grupos experimentais. Dados apresentados em média (desvio padrão).
Ossos
Variável
Cálcio (dag/kg) Fósforo (dag/kg)* Magnésio (dag/kg)* Potássio (dag/kg)*
Ctr-sham 25.43 (0.91)a 4.41 (0.38) 0.31 (0.01) 0.19 (0.04)
Ctr-ovx 20.39 (1.66) b
5.12 (1.07) 0.35 (0.02) 0.17 (0.01)
Ca 20.62 (2.43) b
4.46 (0.31) 0.32 (0.03) 0.19 (0.03)
K2 21.22 (1.43)a,b 4.29 (0.23) 0.31 (0.02) 0.20 (0.02)
Ca+K2 22.87 (1.68) a,b
4.43 (0.20) 0.31 (0.01) 0.19 (0.02)
Ca+D3/Ca+K2 24.21 (1.88) a,b
4.57 (0.18) 0.30 (0.01) 0.19 (0.05)
Ca+K2+D3 23.23 (2.78)a,b 4.21 (0.44) 0.29 (0.02) 0.18 (0.05)
Ctr-sham: Controle não osteoporótico; Ctr-ovx: controle osteoporótico; Ca: cálcio.
ANOVA e post-Hoc Duncan. Letras indicam diferença entre os grupos.
*indica ausência de diferença entre grupos

7.4 DISCUSSÃO
Os principais achados desse estudo foram a redução do conteúdo de cálcio sérico
e no fêmur dos animais ovariectomizados e prevenção dessa perda pela vitamina K2. O
suplemento de cálcio preveniu o decréscimo de cálcio no sangue, mas não no osso. Além
disso, encontramos, nas análises de histologia, radiografia e microtomografia, a redução
da massa óssea em decorrência da ovariectomia dos animais, vista a diferença entre
grupos ctr-sham e ctr-ovx, semelhante ao observado anteriormente (Otomo et al., 2004;
Wu et al., 2014). Um importante diferencial desse estudo foi a redução, ao longo do
tempo, da massa óssea nos animais tratados apenas com cálcio e a manutenção da massa
óssea após a troca de tratamento, de Ca+D3 para Ca+K2, indicando benefício da
substituição do tratamento com vitamina D3 para vitamina K2. Ressaltamos que, de
forma geral, os grupos suplementados com vitamina K2, de forma isolada ou conjunta,
preveniram a perda de massa óssea devido à ovx, de forma que esses grupos
apresentassem volume trabecular semelhante ao do grupo não osteoporótico sham.
A perda de massa óssea em todos os grupos que receberam cálcio pode estar
associada a absorção competitiva a nível intestinal do cálcio magnésio e fósforo, também
importantes no processo de mineralização óssea (COZZOLINO, 1997). O cálcio em
excesso pode agir como antagonista na digestibilidade de fósforo e magnésio, formando
51
quelatos insolúveis e dificultando a absorção, causando deficiência secundária
(ANDERSON; HARVENSTEIN; BRAKE, 1995; VELLASCO; GOMES; DONZELE et
al., 2016). Ressaltamos que a piora da osteoporose associada à suplementação de cálcio
ou a ausência de efeito dessa suplementação vem sendo observada em estudos anteriores
(BOLLAND; LEUNG; TAI, 2015; BOLLAND; GREY; REID, 2015), entretanto sua
recomendação na prática clínica para tratamento da osteoporose ainda é bastante
observada.
A ausência de diferença entre o grupo ctr-sham e ctr-ovx, quanto ao volume
trabecular na oitava semana, detectada pela análise de microtomografia e radiografia pode
estar relacionada a importante perda de massa óssea observada nos animais não
osteoporóticos da quarta para a oitava semana, possivelmente decorrente da idade
avançada dos animais. No presente estudo, a ovariectomia fez com que as ratas ficassem
não apenas osteoporóticas, mas também com peso aumentado. Este fenômeno foi
observado em estudos anteriores com ratas (MAWATARI et al, 2000; OTOMO et al.,
2004) e também é constatado em mulheres (LINS, SICHIERI, 2001).
A maioria dos estudos usa a vitamina K2 MK-4 e a dose usualmente utilizada é
de 30 a 45 mg/dia. Os resultados encontrados nos estudos com MK-4 se assemelham aos
observados com o uso da MK-7, que, porém, é usualmente administrada em doses muito
menores. Utilizamos a dose de 12.5 mg de MK-7/kg de dieta, que foi semelhante entre os
grupos. Wu e et al (2014) trataram ratas ovx com 2, 4 ou 8 µg/dia de MK-7 ou com
cheonggukjang, uma pasta de soja fermentada presente na culinária coreana, contendo as
mesmas quantidades de MK-7. Eles observaram redução da fosfatase alcalina promovida
pelo consumo de MK-7 e o cheonggukjang. No presente estudo, a vitamina K2 não
promoveu redução da fosfatase alcalina aumentada devido à ovariectomia. Assim como
observamos, os suplementos MK-7 ou cheonggukjang preveniram a do volume trabecular
e do conteúdo de cálcio ósseo (WU et al., 2014).
O aumento da fosfatase alcalina nos animais ovariectomizados em comparação
com os operados por simulação, observado nesse estudo, indica a ocorrência dos
processos de formação e reabsorção óssea em ratas após a retirada dos ovários. Em
mulheres também é observado o aumento da fosfatase alcalina em decorrência da
menopausa (MAWATARI 2000, WU et al 2014).
A análise estrutural do osso indicou ausência de diferença no comprimento do
fêmur entre os grupos, semelhante ao observado em análise de tíbia (MAWATARI et al,
2000; HARA 2002) e do fêmur (OTOMO et al., 2004) de ratas ovariectomizadas não
tratadas e tratadas com vitamina K2.

52
 Nesse estudo a análise de resistência óssea não foi capaz de detectar diferenças
entre os grupos na força necessária para a quebra do osso. Otomo et al. (2004) também
não verificaram diferença entre ovx e sham na resistência do fêmur, apenas na da vértebra.
Os autores não observaram efeito da administração de vitamina K2 nesse parâmetro, ao
contrário do risedronato, que promoveu aumento da resistência femoral e vertebral. Outro
estudo com ratas ovariectomizadas demonstrou efeito semelhante da vitamina K2 e
raloxifeno, medicamento usado para tratamento da osteoporose (TASCI et al., 2011)
Nossos resultados não indicaram evidências que apoiassem o uso de suplementos
de cálcio para tratamento da osteoporose, sendo observada, inclusive, aumento da perda
óssea relacionado ao consumo desse suplemento. Dados do Auckland Calcium Study
indicaram que não há relação entre a ingestão dietética de cálcio e a taxa de perda óssea
ao longo de 5 anos em mulheres idosas saudáveis, com consumo variando de 400 a 1500
mg dia. Assim, dentro dessa ampla faixa de ingestão, os autores consideram que os
suplementos não são necessários para compensar uma possível deficiência dietética. No
citado estudo, de forma semelhante ao observado no presente trabalho, não houve eficácia
antifratura dos suplementos de cálcio (exceto em uma coorte com deficiência severa de
vitamina D). Além disso, os autores observaram um aumento de 17% nos cálculos renais
e de 20-40% no risco de infarto do miocárdio, o que, para eles, neutraliza qualquer
possível benefício na prevenção de fraturas (REID; BRISTOW, BOLLAND, 2015).
Outros pesquisadores indicaram que o efeito dos suplementos de cálcio na massa óssea
pode existir apenas quando a ingestão alimentar de cálcio é deficiente e afirmam que a
ingestão de cerca de 1000-1200 mg/dia de cálcio dietético parece ser suficiente para a
prevenção geral de fraturas (STRÖHLE; HADJI; HAHN, 2015).
Em conclusão, este estudo sugere que a administração de vitamina K2 (MK-7) por
8 semanas protege contra a perda de volume ósseo trabecular e do conteúdo de cálcio no
osso em ratas com perda óssea induzida por ovariectomia e que os suplementos de cálcio
pioram a perda óssea. A vitamina D3 possui efeitos inconsistentes sobre a massa óssea.

Financiamento: O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de

Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) – Código de
Financiamento 001.

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57
8. ARTIGO III
VITAMINA K2 DIMINUI O CONTEÚDO DE CÁLCIO NOS VASOS E
MELHORA O ESTADO ANTIOXIDANTE DE RATAS COM OSTEOPOROSE
INDUZIDA POR OVARIECTOMIA

RESUMO
Na osteoporose, a saída de cálcio (Ca) do osso pode aumentar a deposição desse
mineral em tecidos moles, como os vasos. Em humanos com perda de massa óssea,
suplementos de cálcio têm sido associados à piora da função vasomotora e ao maior risco
de infarto do miocárdio. Nesse estudo, avaliamos ação da vitamina K2, de forma isolada
ou combinada aos suplementos de cálcio e vitamina D3, no conteúdo de cálcio nos vasos,
no estresse oxidativo, bem como avaliamos a toxicidade hepática e renal associada às
suplementações em ratas com perda óssea induzida por ovariectomia (ovx). Após 6
semanas das cirurgias, os animais foram divididos em grupos: (1) controle-sham (incisão
abdominal sem retirada dos ovários) não tratado; (2) controle-ovx não tratado; (3) ovx +
Ca; (4) ovx + K2 (5) ovx + Ca + K2 (6) ovx + Ca + D3 (7) ovx + Ca + K2 + D3. Após
quatro semanas de tratamento, os animais suplementados até então com cálcio e vitamina
D3, passaram a receber cálcio e vitamina K2, afim de avaliar o efeito da troca de
tratamento. Foram realizadas dosagens séricas de aspartato aminotransferase (AST),
alanina aminotransferase (ALT), proteína total, albumina, cálcio, ácido úrico e uréia.
Análises histológicas foram realizadas na aorta abdominal, coração, fígado e rim. No
fígado também foi verificada função antioxidante, com análise da catalase (CAT),
superóxido dismutase (SOD), glutationa-S-transferase (GST), malondialdeído (MDA) e
óxido nítrico (ON). O conteúdo de cálcio nos vasos foi determinado por espectrometria
de absorção atômica. Dentre os principais achados, estão a ausência de diferença da AST
e ALT entre os grupos, indicando a não toxicidade dos tratamentos. A ovariectomia
promoveu diminuição da CAT e SOD nos animais tratados ou não. Todos os grupos
tratados com K2, de forma isolada ou associada aos outros suplementos, apresentaram
melhora da função antioxidante, com aumento da GST e diminuição do MDA da quarta
para a oitava semana, diferente dos grupos que não receberam vitamina K2. Ressaltamos
que o grupo antes tratado com Ca+D3, que passou a receber Ca+K2 a partir da quarta
semana teve os níveis de GST aumentados. Não houve diferença na histomorfometria do
rim, fígado, coração e vasos. Apenas a suplementação isolada de vitamina K2 promoveu
a diminuição do conteúdo de cálcio nos vasos em relação ao grupo sham. A osteoporose,

58
associada ou não ao suplemento de cálcio não induziu a calcificação vascular nesse
modelo animal.

Palavras-chave: calcificação vascular; estresse oxidativo; menaquinona, suplemento de

cálcio.

8.1 INTRODUÇÃO
A saúde óssea e de diversos tecidos moles é interligada por mecanismos
metabólicos, endócrinos e celulares, suscetíveis de modulação por aspectos nutricionais.
A osteoporose e a calcificação de tecidos moles compartilham mecanismos
fisiopatológicos comuns, que explica a progressão simultânea desses eventos e sugere a
existência de terapias comuns. A saída de cálcio do osso pode aumentar a concentração
desse mineral na corrente sanguínea e, consequentemente, sua deposição em tecidos
moles, principalmente quando associada ao uso de suplementos de cálcio (MCFARLANE
et al., 2004). Depósitos de cálcio em artérias coronárias podem comprometer respostas
vasomotoras e reduzir a elasticidade, aumentando os riscos de hipertensão arterial,
estenose da aorta, hipertrofia cardíaca, infarto do miocárdio, isquemia de membros
inferiores e pedras nos rins (LAMPROPOULOS; PAPAIOANNOU; D’CRUZ, 2012;
JACKSON et al., 2006; BOLLAND; GREY; REID, 2013). Assim, a ampla
recomendação do uso de suplementos de cálcio demonstra a distância ainda existente
entre as evidências científicas e a prática clínica. Além disso, a função vascular também
é comprometida pelo estresse oxidativo, marcado pelo desequilíbrio entre antioxidantes
e espécies reativas de oxigênio, que contribui marcadamente para a disfunção endotelial.
No contexto de fisiopatologia e terapias comuns para osteoporose e calcificação
vascular, surge a vitamina K2, ainda pouco usada na prática clínica, mas que possui
funções positivas no metabolismo ósseo (HARA; KOBAYASHI; AKIYAMA, 2002;
IWAMOTO et al., 2008; ONODERA et al., 2003; IWAMOTO; TAKEDA; SATO, 2006;
HUANG; WAN; LU, 2014) e na redução do dano e calcificação de tecidos moles (LUO
et al., 1997; MCCABE et al., 2013; PRICE; FAUS; WILLIAMSON, 1998; ABEDIN;
TINTUT; DEMER, 2004; BRANDENBURG et al., 2015; SHEA; HOLDEN, 2012). A
vitamina K2 é cofator de proteínas promotoras da formação óssea, como a osteocalcina e
Gla rich protein, e de proteínas inibidoras da calcificação de tecidos moles, como a
proteína Gla da matriz (MGP) (DALMEIJER et al., 2012; SCHINKE; MCKEE;
KARSENTY, 1999). A vitamina K2, ou menaquinona (MK), está presente, de forma não
muito abundante, em certos alimentos, como ovos, vísceras e alimentos fermentados,

59
como queijos, coalhada e chucrute. O alimento mais rico nessa vitamina, a soja
fermentada (“natto”), é alimento típico da culinária japonesa (SATO; SCHURGERS;
UENISHI, 2012). A vitamina K2 também pode ser produzida a partir da vitamina K1,
presente principalmente em vegetais de folhas verdes, pela bactéria Escherichia coli no
intestino humano (MEGANATHAN, 2001; SCHURGERS; VERMEER, 2000).
O objetivo desse estudo foi verificar a ocorrência de calcificação vascular associada
a suplementação de cálcio, bem como a ação da vitamina K2, de forma isolada ou
combinada ao suplemento de vitamina D3 sobre a calcificação vascular. Também
analisamos o efeito dos tratamentos no estresse oxidativo e na integridade hepática e renal
de ratas com perda óssea induzida por ovariectomia.

8.2. MATERIAL E MÉTODOS

8.2.1 Animais
Setenta ratas (Rattus norvergicus, linhagem Wistar, variação albinus) foram
adquiridas, com 30 dias de vida, no Biotério Central da UFV. Os animais receberam ração
comercial, até a data do início dos tratamentos, e água deionizada ad libitum e foram
alojados em gaiolas individuais de aço inox, em ambiente com temperatura controlada a
22º C e ciclo claro e escuro de 12 horas.

8.2.2 Indução da osteoporose por ovariectomia

Ao atingir 12 semanas, os animais foram submetidos à ovariectomia (ovx), com
incisão abdominal e retirada dos ovários, ou à laparotomia (ctr-sham), com incisão
abdominal sem retirada dos ovários, para induzir o estresse cirúrgico e seus efeitos
(cirurgia controle). Ovx promove redução da formação óssea e aumento da reabsorção,
semelhante ao observado em mulheres após a menopausa devido a deficiência de
estrogênio (THOMPSON et al., 1995).
Trinta minutos antes do início das cirurgias de ovariectomia e laparotomia, os
animais receberam, via subcutânea, o anti-inflamatório flunixinameglumina (0,68 mg/kg)
e o antibiótico enrofloxocina (10 mg/kg). Os animais foram anestesiados com isofluorano
100% diluído em oxigênio, por via inalatória, por meio de vaporizador calibrado. A
concentração do isoflurano foi ajustada de forma a manter o plano anestésico adequado.
Após a indução e estabilização anestésicas, os animais foram posicionados em decúbito
dorsal sobre colchão com aquecimento ativo e o campo operatório foi preparado com
iodopovidona a 10%. Foi administrado, via subcutânea, o analgésico morfina na dose de
5 mg/kg.

60
 Após as cirurgias, os animais permaneceram em câmara aquecida, a fim de manter
a temperatura corporal, e em seguida retornaram às gaiolas individuais. Os procedimentos
anestésico-cirúrgicos e pós-cirurgicos foram realizados no Hospital Veterinário do
Departamento de Veterinária da UFV sob a responsabilidade da Médica Veterinária
Lukiya Silva Campos Favarato.
O período de indução da osteoporose após a OVX foi de 6 semanas prévias ao início
da intervenção, em que as ratas permaneceram em gaiolas individuais e receberam dieta
comercial em pellets e água ad libitum.

8.2.3 Composição da dieta padrão

A dieta padrão foi elaborada de acordo com o recomendado na AIN-93M
(REEVES; NIELSEN; FAHEY, 1939). Dentre os conteúdos de micronutrientes dessa
dieta, destacam-se os que foram suplementados no período de intervenção: vitamina K
(750 UI/kg de dieta), vitamina D3 (1000 UI/kg de dieta), cálcio (5000 mg/kg de dieta).
Vale ressaltar que o conteúdo de vitamina K corresponde à vitamina K1. A dieta AIN-
93M é isenta de vitamina K2.

8.2.4 Dosagens dos suplementos

A dosagem usada dos suplementos de cálcio e vitamina D3 foi proporcional às
recomendações das Diretrizes Terapêuticas da Osteoporose (BRASIL, 2014) para
humanos. Nós verificamos a porcentagem recomendada de suplementação de em relação
às Dietary References Intakes (DRIs) para mulheres de 51-70 anos (IOM, 2011) e
adicionamos a mesma porcentagem na dieta padrão para ratos, AIN-93M (REEVES;
NIELSEN; FAHEY, 1939). A DTO recomenda suplementar, em média, 1x e 1,67x as
DRIs de cálcio e vitamina D3, respectivamente (FISBERG et al., 2013). Seguindo essa
proporção, adicionamos à dieta dos animais 5000 mg/kg de dieta de carbonato de cálcio
e 1670 UI/kg de dieta de vitamina D3.
Não há recomendações oficiais de vitamina K2 para humanos e animais. Dessa
forma, determinamos a suplementação a partir de estudos anteriores de toxicidade e para
o tratamento da osteoporose em animais. Em estudos experimentais, é grande a amplitude
de variação das dosagens usadas, de 141 µg/kg de dieta (YAMAGUCHI et al., 2000) a
201 mg/kg de dieta (FU et al., 2012) de MK-7. Doses muito elevadas de MK-7 não
demonstraram toxicidade aguda em ratos, com administração diária de 2000 mg/kg de
peso corporal, ou subcrônica, com administração de 2,5, 5 ou 10 mg/kg de peso corporal
(PUCAJ et al., 2011). No presente estudo, o conteúdo de MK-7 adicionado à dieta foi de

61
12,5 mg/kg de dieta, que resultou em 718 µg/kg de peso do animal/dia ou, considerando
o peso médio dos animais ao longo do experimento, 180 µg/dia, próximo a dosagens já
utilizadas anteriormente (KNAPEN et al., 2015; DALMEIJER et al., 2012).

8.2.5 Grupos experimentais e eutanásia

Após 6 semanas da cirurgia, os animais foram distribuídos, pelo método de
estratificação por peso corporal, em 7 grupos de 10 animais, sendo eles: (1) controle-sham
(incisão abdominal sem retirada dos ovários) não tratado; (2) controle-ovx não tratado;
(3) ovx + Ca; (4) ovx + K2 (5) ovx + Ca + K2 (6) ovx + Ca + D3 (7) ovx + Ca + K2 +
D3.
Após a 4ª semana de tratamento, cinco animais de cada grupo foram eutanasiados.
Os outros cinco animais de cada grupo foram eutanasiados ao final da 8ª semana de
tratamento, a fim de verificar o efeito do tempo de suplementação. A partir da 4ª semana,
as dietas experimentais permaneceram idênticas, exceto para o grupo que recebia Ca+D3
(grupo 6), que passou a receber Ca+K2. Esse procedimento foi realizado para verificar o
efeito da alteração do tratamento convencional para o tratamento com vitamina K2.
As eutanásias ocorreram após jejum de 12 horas, por exsanguinação/punção
cardíaca nos animais anestesiados com Isoflurano (Isoforine, Cristália®). Cerca de 6 mL
de sangue foram coletados usando agulha inserida no ventrículo esquerdo. As amostras
de sangue foram centrifugadas a 3000 rpm, por 10 minutos à 4º C. Foram retirados e
lavados em tampão PBS o coração, fígado, rins, aorta abdominal, aorta torácica, artéria
renal e artéria carótida. O armazenamento foi feito em formalina 10% para histologia ou
congelados a -80ºC para outras análises.

8.2.6 Peso e consumo alimentar

Os pesos dos animais e a ingestão alimentar foram monitorados semanalmente. O
ganho de peso corporal total foi determinado pela diferença entre os pesos no dia da
eutanásia e o do primeiro dia de experimento. Foi calculado o coeficiente de eficiência
alimentar (CEA), de acordo com a fórmula: CEA = ganho de peso (g)/consumo
alimentar (g).

8.2.7 Dosagens sanguíneas

Foram feitas as dosagens séricas da aspartato aminotransferase (AST), alanina
aminotransferase (ALT), proteínas totais, albumina, cálcio, ácido úrico e uréia. As

62
análises foram feitas por colorimetria, usando o equipamento BS200 e kits específicos,
fornecidos pela Bioclin®.

8.2.8 Análises histológicas

Após coleta e lavagem em tampão PBS, a aorta abdominal, fragmentos do coração
(ventrículos), fígado (lobo quadrado) e rim esquerdo foram fixados em formalina 10%
por 24 horas e em seguida, armazenados em álcool 70%.
Para cada amostra, seis seções de 5 µm de cada foram cortadas com micrótomo e
coradas com hematoxilina e eosina. As análises microscópicas das lâminas foram
realizadas com aumento de 40x. As lâminas de aorta, coração, fígado e rim foram
analisadas por médico veterinário com experiência em patologia. Na aorta abdominal
foram analisados degeneração, infiltrado celular, necrose, deposição de gordura
(aterosclerose) e calcificação. No coração foi observada a presença de infiltrado
inflamatório, congestão e hemorragia. No fígado foram analisados vacuolização de
gordura, infiltrado inflamatório, congestão, as porcentagens de núcleo, citoplasma,
gordura, hepatócito e de macrófagos e os volumes nuclear, citoplasmático e celular. Nas
lâminas dos rins foram analisados dilatação glomerular, congestão glomerular, necrose
tubular, dilatação tubular, congestão tubular e infiltrado inflamatório. A avaliação dos
parâmetros foi realizada por sistema de classificação em 0, 1 ou 2, identificando em
ordem crescente o grau de comprometimento do tecido.

8.2.9 Atividade antioxidante

Amostras de 150 mg do fígado foram homogeneizadas em tampão fosfato pH 7,4 e
a suspensão centrifugada a 12000 g a 4º C por 10 minutos. A concentração de proteína
total foi determinada segundo Lowry et al. (1951), utilizando-se albumina de soro bovino
como padrão. A atividade da catalase (CAT) foi determinada pela taxa de queda do
peróxido de hidrogênio (H2O2) (10 mmol.L-1) em espectrofotômetro a 240 nm durante 60
segundos (AEBI, 1984). A atividade da CAT foi expressa em U CAT/mg proteína. A
atividade da superóxido dismutase (SOD) foi determinada em leitor de Elisa com leitura
da absorbância em 570 nm, baseada na capacidade desta enzima em catalisar a reação do
superóxido O2- em peróxido de hidrogênio e, assim, diminuir a razão de auto-oxidação
do pirogalol (DIETERICH et al., 2000). A atividade da SOD foi expressa em U SOD/mg
proteína. A atividade da glutationa-S-transferase (GST) foi mensurada por meio da
formação do conjugado glutationa-2,4-dinitrobenzeno e estimada pela variação da
absorbância em 340 nm por 60 segundos. A formação do conjugado ocorre

63
espontaneamente no substrato 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) em reação não-
enzimática, sendo acelerada pela atividade da enzima GST. Uma unidade de GST
equivale à quantidade de enzima que forma 1 mol do conjugado glutationa-2,4-
dinitrobenzeno por minuto. O coeficiente de extinção molar do CDNB 340 = 9,6 mM-
1
.cm-1 foi utilizado para os cálculos (HABIG et al., 1974). A atividade da GST foi
expressa em μmol/min/g proteína.
Para determinação dos metabólitos da ação de espécies oxidantes (indicativo da
peroxidação lipídica) foi feita a mensuração da concentração de malondialdeído (MDA).
Ao sobrenadante foi adicionado solução TBARS (ácido tricloroacético 15% e 0,375% de
ácido tiobarbitúrico, e HCL 0,25 N) em banho-maria por 15 minutos, resfriado,
centrifugado a 10000 g por 10 minutos e o sobrenadante mensurado em espectrofotômetro
com leitura da absorbância em 535 nm (BUEGE; AUST, 1978). Os cálculos foram feitos
utilizando-se o coeficiente de extinção molar 1,56 x 10-5 M.cm-1. A concentração do
MDA foi expressa em nmol/mg proteína.
Para avaliar a concentração de óxido nítrico (NO), o nitrito foi usado como
indicador da síntese de óxido nítrico. O nitrito é detectado pelo Reativo de Griess,
composto por 1 % de sulfanilamida e 0.1 % naftil-etileno-diamina em 2.5 % H3PO4.
Desta forma, 50 μL do sobrenadante das amostras foi adicionado em microplacas com
igual volume do Reativo de Griess e incubado a temperatura ambiente por 15 minutos,
em seguida foi feita a leitura da absorbância em 540nm. A concentração do óxido nítrico
das amostras foi determinada utilizando curva padrão com concentrações conhecidas de
nitrito de sódio e expressas em μM.

8.2.10 Conteúdo de cálcio nos vasos

A amostra utilizada para a quantificação de cálcio consistiu em um pool formado
pela aorta torácica, aorta abdominal e artéria carótida. As amostras foram secas em estufa
de circulação forçada durante 72h a uma temperatura entre 68-72ºC e, em seguida, foram
pesadas em balança de precisão e moídas. Todas as vidrarias utilizadas foram lavadas e
descontaminadas com solução de HCl 2%. As amostras passaram por digestão com os
ácidos nítrico e perclórico, na proporção 4:1. O conteúdo de cálcio foi determinado com
a utilização de espectrofotômetro de absorção atômica.

8.2.11 Análises estatísticas

Os dados foram expressos em média e desvio padrão. ANOVA one-way e o teste
post-Hoc Duncan foram utilizados para verificar a diferença entre as médias dos

64
diferentes grupos. A diferença nas médias da semana 4 e da semana 8, do mesmo grupo
foi verificada pelo teste t de Student. O nível de significância estabelecido foi de menos
de 5%.

8.2.12 Aspectos éticos

Todos os procedimentos experimentais com os animais foram realizados em
consonância com os princípios éticos na experimentação animal, após a apreciação deste
estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisas com animais da UFV (Protocolo número
068/2016).

8.3 RESULTADOS
8.3.1 Massa corporal e consumo alimentar
Não houve diferença entre os grupos e ao longo do tempo em relação ao ganho de
peso dos animais. Os grupos também não diferiram em relação ao coeficiente de
eficiência alimentar (CEA), entretanto diferença nesse parâmetro foi observada ao longo
do tempo, com redução nos grupos tratados com Ca+K2 e após a mudança de tratamento
de Ca+D3 para Ca+K2, da quarta para a oitava semana (Tabela 1).

Tabela 1: Ganho de peso e coeficiente de eficiência alimentar dos animais dos diferentes grupos
experimentais, nas semanas 4 e 8. Dados expressos em média (desvio padrão).
Tratamento Coeficiente de eficiência
Ganho de peso#
Alimentar*
Semana 4 8 4 8

Ctr-sham 18,8 (13,1) 33,6 (13,8) 1,6 (1,1)1 1,6 (0,9)1

Ctr-ovx 27,4 (9,4) 15,4 (15,6) 1,1 (1,2)1 1,3 (0,7)1
Ca 25,5 (12,8) 14,4 (11,4) 1,1 (0,7)1 1,2 (0,7)1
K2 18,1 (11,2) 11,0 (24,8) 1,3 (0,5)1 0,8 (1,1)1
Ca+K2 1,6 (51,1) 29,6 (16,8) 1,0 (2,1)1 0,9 (2,2)2
Ca+D3/Ca+K2 -13,6 (21,2) 30,6 (41,9) 0,5 (2,1)1 0,4 (2,3)2
Ca+K2+D3 27,3 (13,5) 12,2 (13,5) 1,2 (0,9)1 1,1 (0,9)1
Ctr-sham: Controle não osteoporótico; Ctr-ovx: controle osteoporótico; Ca: cálcio; K2: vitamina K2; D3:
vitamina D3. ANOVA para verificar diferença entre grupos; teste t para diferença no grupo ao longo do
tempo. Números indicam diferença no mesmo grupo, ao longo do tempo. * indica ausência de diferença
entre grupos; #indica ausência de diferença entre grupos e ao longo do tempo.

8.3.2 Análises bioquímicas

Não houve diferença entre os grupos quanto aos níveis de uréia, ácido úrico, AST
e ALT. Na quarta e oitava semanas, os valores de proteína total e albumina foram mais

65
altos no grupo ctr-sham em relação aos demais, que por sua vez não diferiram entre si,
com excessão do grupo Ca+D3, que apresentou proteína total menor do que os grupos
ctr-ovx, Ca e K2. Da quarta para a oitava semana de tratamento, os níveis de albumina
ficaram constantes apenas nos grupos Ca+K2, após troca de tratamento, e Ca+K2+D3,
apresentando redução nos demais grupos; níveis de ácido úrico aumentaram no ctr-sham,
ctr-ovx, K2 e Ca+K2+D3. ALT aumentou nos grupos ctr-ovx, Ca e K2, e AST aumentou
no grupo Ca+K2+D3, que também apresentou aumento de proteína total. Não
observamos nenhuma diferença estatística quanto aos níveis de uréia (Tabela 2).

Tabela 2: Marcadores bioquímicos plasmáticos dos animais dos diferentes grupos experimentais, nas
semanas 4 e 8. Dados expressos em média (desvio padrão).
Tratamento/ Ácido úrico Uréia AST ALT Proteína total Albumina
Semana (mg.dL-1) (mg.dL-1) (U.L-1) (U.L-1) (g.dL-1) (g.dL-1)
Ctr-sham
4 0.4 (0.2)2 27.1 (4.31 141.4 (25.3)1 39.2 (9.7)1 6.9 (0.1)a,1 3.7 (0.1)a,1
8 1.2 (0.4) 1
32.7 (7.9) 189.8 (66.1)
1 1
43.0 (11.8) 1
6.8 (0.1) a,1
3.3 (0.2)a,2
Ctr-ovx
4 0.5 (0.2)2 27.9 (6.5)1 150.0 (45.6)1 36.8 (5.1)2 6.3 (0.2)b,1 3.1 (0.2)b,1
8 0.9 (0.3)1 29.4 (3.3)1 169.7 (41.4)1 44.2 (7.1)1 6.2 (0.1)b,1 2.7 (0.1)b,2
Ca
4 0.6 (0.2)1 29.7 (4.7)1 123.0 (28.9)1 30.4 (4.9)2 6.3 (0.3)b,1 3.2 (0.1)b,1
8 0.8 (0.2) 1
25.8 (6.0) 168.4 (39.0)
1 1
40.8 (5.0) 1
6.1 (0.3) b,1
2.8 (0.1)b,2
K2
4 0.5 (0.1)2 28.7 (1.9)1 147.2 (48.5)1 34.0 (6.5)2 6.1 (0.4)b,1 3.2 (0.2)b,1
8 1.0 (0.5) 1
25.6 (3.7) 208.4 (69.9)
1 1
46.7 (7.4) 1
6.2 (0.3) b,1
2.8 (0.1)b,2
Ca+K2
4 0.7 (0.3)1 33.9 (6.7)1 150.2 (40.8)1 40.2 (9.1)1 5.9 (0.4)b,c,1 3.2 (0.3)b,1
8 0.9 (0.1)1 29.6 (5.9)1 156.2 (16.1)1 38.8 (4.8)1 6.2 (0.2)b,1 2.6 (0.2)b,2
Ca+D3/Ca+K2
4 0.6 (0.2)2 29.1 (5.8)1 125.6 (20.8)2 33.2 (2.9)2 5.6 (0.6)b,c,1 3.1 (0.3)b,1
8 0.8 (0.2) 1
32.0 (6.5) 169.0 (42.3)
1 1
43.6 (11.0) 1
6.2 (0.3) b,1
2.8 (0.1)b,1
Ca+K2+D3
4 0.5 (0.1)2 27.0 (6.1)1 124.2 (15.6)2 35.0 (9.1)1 5.9(0.2)b,c,2 3.0 (0.3)b,1
8 1.1 (0.4) 1
26.4 (3.5) 163.0 (25.7)
1 1
36.7 (7.5) 1
6.3 (0.2) b,1
2.8 (0.1)b,1
Ctr-sham: Controle não osteoporótico; Ctr-ovx: controle osteoporótico; Ca: cálcio; K2: vitamina K2; D3:
vitamina D3. AST: aspartato aminotransferase; ALT: alanina aminotransferase. ANOVA post-Hoc
Newman-Keuls para diferença entre grupos; teste t para diferença no grupo ao longo do tempo. Números
indicam diferença no mesmo grupo, ao longo do tempo. Letras indicam diferenças entre grupos. * indica
ausência de diferença entre grupos; # indica ausência de diferença entre grupos e ao longo do tempo.

7.3.3 Estresse oxidativo do fígado

O grupo sham apresentou, na quarta semana, níveis reduzidos de catalase em relação
aos demais grupos, entretanto, com o aumento desse marcador no grupo sham, essa
diferença desapareceu na oitava semana. O grupo sham também apresentou, da quarta
para a oitava semana, aumento de SOD, o que fez com os animais desse grupo
apresentassem níveis aumentados desse marcador, assim como o grupo ctr-ovx, em
relação aos demais grupos.

66
 O grupo que recebia Ca+D3 até a quarta semana apresentou o menor valor de
GST. Após a troca de tratamento (de Ca+D3 para Ca+K2), foi verificado aumento da
GST. Aumento da GST também foi verificado da quarta para a oitava semana nos
demais grupos, exceto os controles. Aumento de MDA foi verificado em todos os
grupos que não foram tratados com vitamina K2, de forma isolada ou conjunta com
vitamina D3 e cálcio, de forma que diferença entre os grupos K2 e Ca+K2 em relação
ao grupo ctr-ovx foi verificada na oitava semana. Ausência de diferença entre os
grupos foi verificada quanto aos níveis de óxido nítrico, sendo verificado aumento
desse marcador apenas ao longo do tempo no grupo que recebeu Ca+K2 (Figura 1)

Figura 1 Marcadores de atividade antioxidante no fígado dos animais dos diferentes grupos experimentais,
nas semanas 4 e 8. SOD: Superóxido dismutase; CAT: catalase; GST: glutationa-S-transferase; MDA:
Malondialdeído; ON: óxido nítrico. Ca: cálcio; D3: vitamina D3; K2: vitamina K2. ANOVA e post-Hoc
Duncan. Letras indicam diferença entre os grupos. Números indicam diferença no mesmo grupo, ao longo
do tempo. MDA e ON na semana 4, e CAT, GST e ON na semana 8 não apresentaram diferença entre
grupos.

67
 8.3.4 Histomorfometria do fígado, coração, rins e vasos
Na análise histomorfométrica do fígado (Figura 2), assim como na do coração,
rins e vasos, não foram observadas diferenças entre grupos e ao longo do tempo, em
nenhum dos parâmetros analisados.

Figura 2 A) Exemplos de lâminas histológicas do fígado de animais dos diferentes grupos experimentais
B) Análise da quantificação de componentes celulares do tecido hepático dos animais dos diferentes grupos
experimentais. Ctr-sham: Controle não osteoporótico; Ctr-ovx: controle osteoporótico; Ca: cálcio; K2:
vitamina K2; D3: vitamina D3.

8.3.5 Conteúdo de cálcio dos vasos

Apenas a suplementação isolada de vitamina K2 promoveu a diminuição do
conteúdo de cálcio em relação ao grupo sham e Ca+K2 (após troca de tratamento) (Figura
3).

68
Figura 3. Quantificação de cálcio nos vasos por espectrofotometria de absorção atômica, dos animais dos
diferentes grupos experimentais, nas semanas 4 e 8. Ca: cálcio; D3: vitamina D3; K2: vitamina K2; dag:
decagrama. ANOVA e post-Hoc Duncan. Letras indicam diferença entre os grupos. Números indicam
diferença no mesmo grupo, ao longo do tempo. *indica ausência de diferença entre grupos.

8.4 DISCUSSÃO
A presença de cristais de cálcio nas análises histológicas do vaso, esperada devido
à mobilização de cálcio em animais ovariectomizados deficiência de estrogênio que o
direciona para o osso, especialmente nos animais suplementados com cálcio, devido à
maior presença desse mineral associada à, não foi observada nesse estudo. Ainda que não
tenha sido observado aumento do conteúdo de cálcio nos vasos dos animais em relação
ao grupo ctr-sham, verificamos que o menor conteúdo de cálcio nos vasos foi encontrado
nos animais tratados com vitamina K2. O grupo tratado com vitamina K2 apresentou
diferença apenas com o ctr-sham, entretanto, os animais do grupo K2 apresentam
conteúdo de cálcio nos vasos em média 2,5 vezes inferior a todos os outros grupos. Tal
diferença não foi observada nas análises histológicas, mas sim na quantificação de cálcio
nos vasos. Além disso, a vitamina K2 melhorou, de forma geral, o estado antioxidante no
fígado dos animais.
Estudos anteriores verificaram a ação da vitamina K2 em prevenir e tratar a
calcificação vascular, em humanos e animais (LUO et al., 1997; PRICE; FAUS;
WILLIAMSON, 1998; ABEDIN; TINTUT; DEMER, 2004; SCHURGERS et al., 2007;
SHEA; HOLDEN, 2012; MCCABE et al., 2013; BRANDENBURG et al., 2015). Não
encontramos estudos anteriores com animais que tentassem induzir a calcificação
vascular com suplementos de cálcio. A maioria dos estudos comprova a ação da vitamina
K2 em reverter a calcificação vascular induzida por medicamentos antagonistas da
vitamina K, como a varfarina, um anticoagulante comumente utilizado em pacientes em
diálise, que inibe a reciclagem da vitamina K. A vitamina K atua como substrato da γ-
glutamil carboxilase, essencial na ativação de várias proteínas da matriz extracelular que

69
inibem a calcificação, como a proteína Gla de matriz (MGP). A vitamina K2 inibiu a
deposição de cálcio nas artérias dos animais, que foi aumentada em até 20x devido ao
tratamento com varfarina (MCCABE et al., 2013).
Não observamos o aumento da deposição de cálcio nos vasos associada à
suplementação de cálcio nos animais. Entrentanto, sabe-se que, em humanos, o
envelhecimento e a osteoporose estão associados à deposição de cálcio nos vasos, devido
à migração de cálcio dos ossos para os tecidos moles (ABEDIN; TINTUT; DEMER,
2004; SCHINKE; MCKEE; KARSENTY, 1999). Além disso, os efeitos potencialmente
nocivos da suplementação excessiva de cálcio na saúde cardiovascular são recentemente
sugeridos. Suplementos de cálcio estão associados ao maior risco de calcificação dos
vasos e infarto do miocárdio (MICHAËLSSON et al., 2013; BOLLAND et al., 2010;
BOLLAND et al., 2008), uma vez que mulheres após a menopausa possuem diminuição
dos níveis de estrogênio e, portanto, comprometida sinalização para deposição de cálcio
no osso, propiciando o acúmulo de cálcio nos tecidos moles, como os vasos. Além disso,
dados do Auckland Calcium Study indicam um aumento de 17% nos cálculos renais e de
20-40% no risco de infarto do miocárdio em mulheres que utilizam suplementos de cálcio,
o que neutraliza qualquer possível benefício na prevenção de fraturas (REID; BRISTOW,
BOLLAND et al., 2015).
No presente estudo não foram verificadas alterações, como deposição de cristais
de cálcio, nas análises histológicas dos rins e coração. Suplementos de cálcio estão
associados à maior incidência de pedras no trato urinário em humanos (WALLACE et
al., 2011). Entretanto, não encontramos estudos com animais que verificassem tal efeito
devido à suplementação de cálcio. Estudos com maior tempo de intervenção ou que usem
dosagens maiores são necessários para verificar a ocorrência de depósitos de cristais de
cálcio em tecidos moles.
Verificamos que a suplementação de vitamina K2, bem como a ovariectomia não
promoveram alteração no acúmulo de gordura hepática dos animais. Também não
observamos alterações na integridade hepática nos ratos associada ao tratamento com
vitamina K2, assim como com as demais suplementações. Ausência de alteração em
parâmetros semelhantes aos do presente estudo, como ALT, AST e análises histológicas
de vacuolização hepática, inflamação no fígado e no coração e vacuolização, cálculo e
inflamação no rim, foi observada em estudo com animais submetidos à administração de
dose oral única de 2000 mg/kg de peso corporal bem como dosagens de 2,5, 5 e 10 mg/kg
de peso corporal/dia, administradas por gavagem, durante 90 dias (PUCAJ et al., 2011).

70
No citado estudo, a dose utilizada foi de 3,5 a 14 vezes maior do que a utilizada no
presente estudo (PUCAJ et al., 2011).
Além de não afetar a integridade hepática, observamos que vitamina K2
demonstrou melhorar a função antioxidante dos animais. Todos os grupos que receberam
vitamina K2, de forma isolada ou combinada com outros suplementos, apresentaram, da
4ª para a 8ª semana, redução do MDA, produto final da peroxidação lipídica gerada pelo
estresse oxidativo, e aumento da enzima detoxificante GST. Além disso, o grupo que
recebia Ca+D3 apresentou até a 4ª semana valores reduzidos de GST em comparação
com a maioria dos grupos e, ao trocar o tratamento para Ca+K2, da 4ª até a 8ª semana,
essa diferença foi anulada. Embora a vitamina K não seja um antioxidante clássico, outros
estudos também relataram essa função. Em estudo em culturas de células primárias
precursoras de oligodendrócitos, as vitaminas K1 e K2 (MK-4) inibiram potencialmente
o acúmulo de radicais livres e a morte celular oxidativa mediada pela depleção de
glutationa, por mecanismo independente de sua conhecida função biológica como cofator
para a gama-glutamilcarboxilase.
Assim como no presente estudo, em outros trabalhos também não foi observada
diferença entre os grupos quanto à ocorrência de cálculos nos rins (GRANT et al., 2005;
PRINCE et al., 2006; REID et al., 2006). No Women’s Health Initiative CaD trial (WHI
CaD), realizado com 36.282 mulheres na pós-menopasa, seguidas por 7 anos, os cálculos
renais ocorreram em 2,3% dos participantes e suplementos de Ca+D aumentaram o risco
de cálculos em 17% (JACKSON et al., 2006).
Neste estudo, a ausência de deposição de cálcio nos vasos dos animais
osteoporóticos suplementados ou não com cálcio pode estar associada ao curto período
de intervenção, não suficiente para observar os efeitos também encontrados em humanos,
e/ou a suplementação de cálcio e a saída de cálcio dos ossos não foram suficientes para
induzir a calcificação vascular. Estudos de longo prazo devem ser realizados para
responder esta questão, bem como para confirmar se o modelo animal é adequado para
verificar a ação do cálcio e da vitamina K2 na vasculatura.
Concluímos que os animais suplementados com vitamina K2 apresentaram menor
quantidade de cálcio nos vasos comparados ao grupo controle, mostrando um possível
benefício da vitamina na calcificação vascular. A saída de cálcio dos ossos devido à
ovariectomia, associada a suplementação de cálcio não foram suficientes para induzir a
deposição de cálcio nas artérias dos animais. De forma geral, a vitamina K2 melhorou o
perfil antioxidante dos animais. Nenhum tratamento causou alterações na integridade
hepática e renal dos animais.

71
Financiamento: O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) – Código de
Financiamento 001.

8.5 REFERÊNCIAS

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75
9. CONCLUSÕES GERAIS
Esse trabalho colabora para o entendimento da função da vitamina K2 na saúde
óssea, bem como para elucidação do efeito de suplementos de cálcio e vitamina D3,
comumente usados no tratamento da perda óssea, em modelo experimental de
osteoporose.
A retirada dos ovários promoveu aumento do peso das ratas, comparado ao grupo
não ovariectomizado (sham), bem como a perda de massa óssea e a diminuição do
conteúdo de cálcio no sangue e nos ossos. Os animais suplementados apenas com
vitamina K2 apresentaram nível de cálcio sérico semelhante aos suplementados com
cálcio e aos do grupo sham e superior ao dos demais grupos. Nas análises histológicas e
de microtomografia do osso, a administração isolada de K2 evitou a perda óssea
promovida pela ovx, de forma com que o volume trabecular desses animais se assemelhou
ao das ratas não osteoporóticas. Um importante resultado encontrado nesse estudo foi que
a substituição do tratamento convencional com Ca+ vitamina D3 para Ca + vitamina K2,
na quarta semana, promoveu o aumento do volume trabecular, confirmado nas análises
de histologia, radiogradia e microtomografia do fêmur. Também observamos que todos
os grupos que receberam cálcio apresentaram redução do volume trabecular. Esse
resultado pode estar relacionado à competição pela absorção intestinal do cálcio com o
magnésio, mineral que também é importante no processo de mineralização óssea.
A ação da vitamina K2 na saúde vascular também foi observada. Não houve
diferença nas análises histológicas dos vasos no que diz respeito à deposição de cristais
cálcio, entretanto a administração isolada de vitamina K2 promoveu redução do conteúdo
de cálcio dos vasos em relação ao grupo controle não osteoporótico. Vale ressaltar que o
grupo que recebeu K2 apresentou conteúdo de cálcio nos vasos pelo menos 50% inferior
a todos os grupos. A saúde dos vasos também está associada à função antioxidante,
importante para a prevenção de doenças cardiovasculares. A vitamina K2, administrada
de forma isolada ou conjunta com cálcio e vitamina D3, promoveu, no fígado, aumento
da atividade da enzima antioxidante GST e diminuição do MDA, produto da peroxidação
lipídica. A troca do tratamento Ca+D3 para Ca+K2 também aumentou os níveis de GST,
que estavam reduzidos antes da troca.
Assim, a vitamina K2 promoveu melhorias na saúde óssea e vascular em modelo
experimental de osteoporose, de forma superior aos tratamentos com cálcio e vitamina
D3, comumente utilizados na prática clínica. Esses resultados se somam aos recentemente
encontrados na literatura e corroboram com a afirmação de que a vitamina K2 pode ser

76
uma importante e segura opção de tratamento no abrangente problema de saúde pública:
a osteoporose e suas complicações.

77
ANEXO 1. Cálculo amostral
Estudo: Efeito da vitamina K2 (menaquinona) e seu sinergismo com a vitamina D3 na
saúde óssea e vascular de ratas Wistar com perda óssea induzida e suplementadas com
cálcio

Para o cálculo do número de animais por grupo foi utilizada a fórmula apresentada
abaixo, seguida do cálculo para inclusão da margem de perda

n= 1 + [2C*(s/d)2 ], onde

C é dependente dos valores escolhidos e apresentados abaixo para a força ou poder

do teste e nível de significância; s é o desvio padrão aceitável; d é a diferença esperada
entre os grupos. Para calcular o C, aplicou-se a fórmula:

C= (zα + zβ)2 , onde z corresponde a valores encontrados em livros de estatística.

Para determinar o valor de zα dividiu-se o valor do intervalo de confiança por 2 (IC=0,95/
2), sendo portanto 0,475 o valor a ser procurado na tabela, obtendo-se z=1,96. Em
experimentos na área de saúde, o poder do teste é comumente 90% para o qual o valor de
zβ é 1,282.

C = (1,96 + 1,282)2 =10,51

Considerando ainda um desvio máximo (s) de 0,2 (20%) e uma diferença esperada
entre os grupos (d) de 0,35 (35%), ao aplicarmos a fórmula

n=1+[2*10,51*(0,2/0,35)2]

n= 7,86 animais, arrendondando: 8 animais por grupo.

Considerando os 7 grupos experimentais, sem considerar o cálculo da margem de

perda apresentado abaixo, seriam necessários 56 animais.

Cálculo do número de animais, incluindo a margem de perda

O cálculo considerando a margem de perda estimada (20%) foi realizado com base no
material em anexo, obtido com o professor Laércio dos Anjos Benjamim do departamento
de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Viçosa.

N = n + N x f, sendo n o número de animais calculado e f a perda estimada

N = 56 + N X 0,2
N – N x 0,2 = 56
N (1 – 0,2) = 56
N = 56/0,8 = 70 animais.

Dessa forma, para a realização deste estudo serão necessários 70 animais, que
distribuídos nos seis grupos (tratamentos), irão compor dez animais por grupo.

78
ANEXO 2. Aprovação do projeto pelo Comitê de Ética no Uso de Animais –
CEUA/UFV

79