Elton Brito Ribeiro - Tese Final
Elton Brito Ribeiro - Tese Final
Elton Brito Ribeiro - Tese Final
TESE DE DOUTORADO
BRASLIA - DF
2016
2
ORIENTADORA
Professora MARIA APARECIDA GODOY SOLER
BRASLIA - DF
2016
3
UNIVERSIDADE DE BRASLIA
INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS
Programa de Ps-Graduao em Nanocincia e Nanobiotecnologia
Tese de Doutorado
Ttulo:
DESENVOLVIMENTO DE NANOCARREADORES FORMADOS POR
MICELAS DE PLURONIC F127 OU NANOEMULSES PARA VEICULAO DE
INTERFERON GAMMA E AVALIAO DO POTENCIAL IMUNOMODULADOR
Comisso Examinadora
Prof. Dr. Leonardo Giordano Paterno Profa. Dra. Danny Laura G.Fagundes
Membro Titular Interno No Vinculado ao Programa Membro Titular Externo No Vinculado ao Programa
IQ / UNB ICBS / UFMT
AGRADECIMENTOS
RESUMO
ABSTRACT
The aim of this study was to design and develop different formulations containing
IFN- to probe their use as an immunomodulating agent. Produced formulations
were based on two different nanoemulsion systems or nanostructured micelles.
The nanoemulsions comprising distilled water, triglycerides of capric/caprylic acid,
sobitan-oleate (SP), polysorbate 80 (TW) and propylene glycol (PG) or 1-butanol
(BT) were prepared through ultra-homogenization. The pluronic 127 dispersions in
phosphate buffer solution (pH 7.4) were prepared at concentrations of 10 mg.mL-1,
50 mg.mL-1 and 250 mg.mL-1. The developed nanoemulsions and dispersions
were characterized regarding droplet size, polydispersity, surface charge,
preliminary and accelerated physical stability, and rheological properties. Stable
products were selected to incorporate nano doses of IFN- (100 ng.mL-1) and
characterized under the same parameters. The influence of IFN- incorporated
formulations on functional activity of mononuclear cell for Escherichia coli
enteropathogenic was analyzed through superoxide release, phagocytosis and
microbicidal activity. By means of cell permeability tests to propidium iodide and
intracellular calcium release were employed to study the formulations influence on
functional activity of mononuclear cell, human breast cancer (MCF-7) and co-
culturing both. The optimized formulations remained stable in extreme conditions
during 90 days, displaying biocompatible pH value, significant maintenance of its
rheological profile, nanometric hydrodynamic diameter, negative zeta potential and
no significant variations of IFN- dose (100 ng.mL-1). Additionaly, developed
formulations did not alter the MN cell viability rates and increased the superoxide
release, phagocytosis index and intracellular calcium release of mononuclear cells
of human blood compared to the spontaneous group. Furthermore, the
nanoemulsions were able to promote the death of MCF-7 human breast cancer or
co-culturing. Our findings indicate that the produced formulations can improve the
biological activity of IFN-.
LISTA DE FIGURAS
Figura 11. Ilustrao do processo da sntese das NEs por meio do mtodo de
ultrahomogeneizao e definio das propores dos componentes empregando
diagramas pseudoternrios. Cada ponto se refere a uma amostra preparada. A
ilustrao do sistema preparado O/A, bem como a imagem de uma de NE
selecionada se encontram na parte inferior da Figura. (Fonte: Arquivo pessoal). 54
11
Figura 12. Ilustrao do processo da sntese das MNPs por meio do mtodo auto
estruturante. A imagem da direita se refere a uma das amostras preparadas.
(Fonte: Arquivo pessoal). ..................................................................................... 55
Figura 41. Curva de fluxo (a) e viscosidade (b) mdio das formulaes durante o
perodo de estabilidade apresentado por cada formulao (25C). ................... 113
Figura 49. ndice de viabilidade celular dos fagcitos MN e das clulas MCF-7 de
cncer de mama humano, e sua mistura, indicado pela intensidade de
fluorescncia mdia de permeabilidade celular ao iodeto de propdio, para os
estmulos (1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN-, e como controles o IFN-,
PBS, a disperso F127-50, e as nanoemulses 1NEP e 11NEB)...................... 125
LISTA DE TABELAS
Tabela 15. Parmetros obtidos por meio das anlises fsico-qumicas antes e
aps a realizao dos testes de estabilidade preliminar dos sistemas NEP, NEB e
F127, com ou sem incorporao de IFN-.......................................................... 110
Tabela 16. Parmetros obtidos por meio das anlises fsico-qumicas antes (0) e
aps (45 e 90 dias) da realizao dos testes de estabilidade acelerada das
formulaes relativas aos sistemas NEP, NEB e F127. ..................................... 111
Tabela 17. Liberao intracelular de Ca2+ dos fagcitos MN e das clulas MCF-7
de cncer de mama humano indicado pela intensidade de fluorescncia. ........ 128
17
SUMRIO
1 INTRODUO .................................................................................................. 21
1.1 Motivao ........................................................................................... 24
1.1.1 Sistemas de liberao de frmacos ......................................... 24
1.1.2 Interferon gamma (IFN-) ......................................................... 32
1.2 Justificativa ........................................................................................ 34
1.3 Objetivos ............................................................................................ 35
2 TCNICAS DE CARACTERIZAO ............................................................... 39
2.1 Reologia.............................................................................................. 40
2.2 Espalhamento dinmico de luz (EDL) .............................................. 46
2.3 Potencial Zeta .................................................................................... 46
2.4 Citometria de Fluxo ........................................................................... 47
3 SNTESE DOS NANOCARREADORES ........................................................... 51
3.1 Materiais ............................................................................................. 51
3.2 Preparao dos sistemas nanoemulsionados ................................ 51
3.3 Preparao dos sistemas coloidais com micelas nanoestruturadas
............................................................................................................................. 55
3.4 Preparao dos sistemas com a incorporao de IFN- ................ 55
4 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS EMPREGADOS NA
CARACTERIZAO E CONTROLE DE QUALIDADE DOS MATERIAIS
SINTETIZADOS ................................................................................................... 58
4.1 Caracterizaes Reolgica ............................................................... 58
4.2 Caracterizao por espalhamento dinmico de luz ........................ 59
4.3 Controles de qualidade e caracterizaes fsico-qumicas ........... 60
4.4 Estudos de Estabilidade ................................................................... 61
5 ENSAIOS BIOLGICOS .................................................................................. 64
5.1 Sujeitos e tamanho amostral ............................................................ 64
5.2 Obtenes de fagcitos do sangue perifrico ................................ 64
5.3 Cultura de clulas .............................................................................. 65
5.4 Linhagem e Culturas de Escherichia coli Enteropatognica ......... 65
5.5 Incubao dos fagcitos MN, das clulas MCF-7 e fagcitos
MN/clulas MCF-7 com as nanoestruturas desenvolvidas ............................. 65
5.6 Viabilidade celular ............................................................................. 67
5.7 Liberao de nion superxido ........................................................ 67
19
CAPTULO 1
21
1 INTRODUO
ZHOU et al., 2011). Para a veiculao de frmacos estes sistemas podem ser
et al., 2010; SAJAN et al., 2009) permitindo a sua modulao de forma que
alguns rgos nos quais elas podem ser consideradas txicas (GUAN et al.,
2012).
administradas.
(SEGURA et al., 2007). Verifica-se nos resultados dos estudos citados, que o
mama humano.
1.1 Motivao
molculas, com pelo menos uma dimenso entre 1 a 1000 nm, dispersas numa
(TADROS et al., 2004). A estabilidade das NEs depende dos tensoativos no-
apresentam uma cadeia contendo entre dois e dez carbonos. O lcool mais usado
caprlico e glicerina, so aprovados para utilizao parenteral pelo Food and Drug
frmacos por serem 100 vezes mais solveis em gua do que os triglicerdeos de
(PODLOGAR et al., 2004). Quando a fora de solvatao for maior para a fase
sistemas do tipo gua em leo (A/O), conforme ilustrao da Figura 1A. Caso
contrrio, quando a fora de solvatao for maior para a fase aquosa, o filme se
curvar na direo da fase oleosa formando sistemas do tipo leo em gua (O/A),
Neste contexto, visando obter nanoemules do tipo leo em gua com alta
formadas por uma matriz polimrica, onde o frmaco pode ficar retido ou
A)
B)
C)
D)
E)
como o TNF-alfa, IL-1, IL-12 e xido ntrico, e (vi) a regulao negativa da sntese
NK, e possui receptores em quase todas as clulas, nas quais capaz de ativar
a nanosistemas.
5). Alm disso, o IFN- humano uma protena -helicoidal contendo seis hlices
1.2 Justificativa
que podem influenciar a imunidade inata e adaptativa, destaca-se o IFN- que tem
portanto, maior investigao para que sua aplicao seja viabilizada (BILLIAU;
MATTHYS, 2009).
macroscpica.
1.3 Objetivos
Especficos:
na primeira;
pseudoternrios;
contendo IFN-;
desenvolvidos;
resultados obtidos.
37
CAPTULO 2
39
2 TCNICAS DE CARACTERIZAO
2.1 Reologia
Plstico de Bingham
Tenso de Cisalhamento (
Pseudoplstico
Dilatante
Taxa de Cisalhamento ( )
Plstico de Bingham
Viscosidade(
Pseudoplstico
Dilatante
Taxa de Cisalhamento ( )
complexos pode ser obtida por meio de anlises reolgicas a partir da aplicao
2000).
G* = G / iG (1)
G = a /acos (4)
G = a /asen (5)
tan = G / G (6)
apresentam uma dependncia linear com a freqncia. Por outro lado, quando G
(OSTERHOLD, 2000). Quando tan maior que 1, tem-se G> G e o material tem
relaciona com o tamanho dos mesmos, visto que os agregados sob incidncia de
dimetro hidrodinmico (DH) dos agregados que compem o coloide, o qual leva
632.8 nm.
de radiao que pode ser uma lmpada de mercrio ou laser, uma cmara de
48
onde ocorre a passagem clula por clula. A passagem individual das clulas
no feixe de luz devido presena das clulas so ento detectadas por sensores,
dessa forma a luz dispersa frontalmente coletada por um sistema ptico que
identifica as clulas pelo seu tamanho e granularidade interna (SILVA et al., 2004;
absoro e emisso distinto, de tal maneira que at trs cores de luz podem ser
para anlise tais como histogramas, dot-plot, tabelas, entre outros (SILVA et al.,
CAPTULO 3
51
3.1 Materiais
butanol (B).
52
sistemas NEs foi determinada por meio do estudo do equilbrio hidrfilo lipfico
uma mistura preparada (Figura 11). Em seguida, cada uma das misturas, formada
desenvolvidos.
(NE) no caso dos sistemas translcidos, emulso gel (EG), emulso lquida (EL)
pontos (Figura 11). Em seguida, amostras foram preparadas para realizao das
1:9 at 9:1 (m/m) sob agitao, com o objetivo de se obter as regies delimitantes
Figura 11. Ilustrao do processo da sntese das NEs por meio do mtodo de
ultrahomogeneizao e definio das propores dos componentes empregando
diagramas pseudoternrios. Cada ponto se refere a uma amostra preparada. A
ilustrao do sistema preparado O/A, bem como a imagem de uma de NE
selecionada se encontram na parte inferior da Figura. (Fonte: Arquivo pessoal).
55
com o uso de tampo fosfato 7,4 (PBS) e do copolmero Pluronic F127 (F127) nas
12).
Figura 12. Ilustrao do processo da sntese das MNPs por meio do mtodo auto
estruturante. A imagem da direita se refere a uma das amostras preparadas.
(Fonte: Arquivo pessoal).
empregada.
formulao dos dois lotes de NEs, sendo que, no caso dos dois sistemas de
por micelas de F127, (MNPs) tambm foram preparadas 9 amostras, para cada
CAPTULO 4
58
frmacos requer que eles, alm das caractersticas necessrias para ancorar o
estudo da estabilidade.
fluxo newtoniano, enquanto que valores menores do que -1 Pa.s indicam fluxo
foi utilizada sem diluies, sempre utilizando gua destilada como referncia. As
triplicatas.
diretamente na amostra.
identificar o tipo de sistema (gua em leo, A/O, ou leo em gua, O/A) e possvel
sistemas homogneos.
estudos de estabilidade.
Citmetria de fluxo por meio do kit Cytometric Bead Array (CBA BD) e
CAPTULO 5
64
5 ENSAIOS BIOLGICOS
material biolgico e o sigilo das informaes, sendo que o material somente foi
clulas mononucleares foram lavadas duas vezes em PBS. A seguir foi realizada
soro bovino fetal (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA), penicilina (20 U.mL-1) e
eaf+, bfp+ foi utilizada nos experimentos realizados. A partir da cultura estoque,
foram feitos repiques em tubos contendo 8 mL de TSB (Trypic Soy Broth - Difco),
previamente com 50 L dos controles PBS, IFN-, 1NEP, 11NEB, F127-50 e com
intracelular de clcio dos fagcitos MN, das clulas MCF-7 e fagcitos MN/clulas
com clulas MCF-7 v/v, foram tratados com 50 L dos controles PBS, IFN-,
cadeia dupla, emite cor verde, ortocromtica, e quando em contato com o DNA
a 160 x g). O sobrenadante foi desprezado e o boto celular pellet foi corado
(10 min a 160 x g). A seguir as lminas foram preparadas e analisadas por meio
foi calculada por meio da seguinte relao: Concentrao de O2- (nmol) =DO x
100 / 6,3.
min a 160 x g sob refrigerao a 4C. O "pellet" foi corado com 200 L de laranja
usadas como controle. A fluorescncia das clulas foi analisada por citometria de
de Ca2+ foi expressa por meio dos valores mdios (%) de intensidade de
fluorescncia de Fluo-3.
CAPTULO 6
72
6 RESULTADOS: NANOEMULSES
Mistura de
SP (%) TW (%) P (%) B (%) EHLr
Tensoativos
SP/TW/P 35 55 10 - 10,80
SP/TW/B 35 55 - 10 10,80
Onde: EHLr = EHL Resultante da mistura de tensoativos.
73
(a)
(3,5 : 5,5 : 1,0)
SP / TW / P
0
100
10
90
20
8-NE 80
30
7-EG 15-NE 70
40
6-EG 14-EG 21-NE 60
50
5-EG 13-EG 20-EG 26-NE 50
60
4-EG 12-EG 19-EG 25-EG 30-NE 40
70
3-SF 11-SF 18-EG 24-EG 29-SF 33-SF 30
80
2-SF 10-SF 17-EL 23-EL 28-EG 32-SF 35-SF 20
90
1-SF 9-SF 16-EL 22-EL 27-EL 31-EL 34-EG 36-EL 10
100
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
gua Destilada (%) Triglicrides de cido cprico/caprlico (%)
(b)
(3,5 : 5,5 : 1,0)
SP / TW / P
0
100
10
90
20
NE
1NEP 80
30 2NEP
3NEP 70
40 4NEP
5NEP 60
50 6NEP
EG 7NEP 50
60 8NEP
9NEP 40
70
30
SF
80 SF 20
90 EL
10
100
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
gua Destilada (%) Triglicrides de cido cprico/caprlico (%)
(a)
(3,5 : 5,5 : 1,0)
SP / TW / B
0
100
10
90
20
8-NE 80
30
7-NE 15-NE 70
40
6-SF 14-NE 21-NE 60
50
5-EG 13-EG 20-EG 26-NE 50
60
4-EG 12-SF 19-SF 25-SF 30-SF 40
70
3-SF 11-SF 18-EG 24-EG 29-SF 33-SF 30
80
2-SF 10-SF 17-SF 23-EL 28-EL 32-SF 35-SF 20
90
1-SF 9-SF 16-SF 22-SF 27-EL 31-SF 34-SF 36-SF 10
100
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
gua Destilada (%) Triglicrides de cido cprico/caprlico (%)
(b)
(3,5 : 5,5 : 1,0)
SP / TW / B
0
100
10
90
20
NE
1NEB 80
2;3NEB
30 4;5NEB 70
6;7NEB
40 8;9NEB 60
10;
11NEB
50 12;
13NEB 50
60
EG 40
70
30
80 EL 20
90
10
SF
100
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
gua Destilada (%) Triglicrides de cido cprico/caprlico (%)
na Tabela 3.
5.00
4.50
Pa
4.00
3.50
3.00
2.50
Tenso
Shear de
Stress
Cisalhamento 2.00
(Pa)
1.50
1.00
0.50
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1/s 50
.
Taxa Rate
Shear de
Cisalhamento (1/s)
rea de Histerese
NE Classificao do Fluxo
(Pa/(sml))
1NEP + 0,01 Newtoniano
2NEP + 0,60 Newtoniano
3NEP + 0,31 Newtoniano
4NEP + 1,18 No-newtoniano: Tixotrpico Pseudoplstivo
5NEP + 0,21 Newtoniano
6NEP + 1,57 No-newtoniano: Tixotrpico Pseudoplstivo
7NEP + 0,64 Newtoniano
8NEP - 1,00 No-newtoniano: Tixotrpico Reopxico
9NEP + 22,62 No-newtoniano: Tixotrpico Pseudoplstivo
0.900
Pas
0.80
0.700
0.60
0.50
Viscosity
Viscosidade 0.40
(Pa.s)
0.30
0.20
0.10
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1/s
20 22
.
TaxaRate
Shear de
Cisalhamento (1/s)
2
10
Pas
1
10
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s)
0
10
-1
10
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 C
45.0 50.0
Temperature
Temperatura T
(C)
4 e 5.
5.00
Pa
4.50
4.00
3.50
3.00
2.50
Tenso
Shear de
Stress
Cisalhamento
2.00
(Pa)
1.50
1.00
0.50
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1/s 20
.
Taxa Rate
Shear de
Cisalhamento (1/s)
comportamento similar ao das NEs, com valores na faixa de 0,25 a 0,50 Pa.s
0.500
Pas
0.450
0.400
0.350
0.300
0.250
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s) 0.200
0.150
0.100
0.050
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1/s 20
.
Taxa Rate
Shear de
Cisalhamento (1/s)
do IFN- (Figura 21) apresentaram mesmo comportamento das NEs (Figura 18),
1
10
Pas
0
10
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s)
-1
10
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 C
45.0 50.0
Temperature T
Temperatura (C)
viscosidade na Tabela 7 foram obtidas a partir dos dados das Figuras 22 e 23,
respectivamente.
Todas as curvas de fluxo das NEs do sistema NEB (Figura 22) apresentam
5.00
Pa
4.50
4.00
3.50
3.00
2.50
Shear Stress
Tenso de
Cisalhamento 2.00
(Pa)
1.50
1.00
0.50
0
0 5 10 15 20 25 30 35 1/s 40
.
TaxaRate
Shear de
Cisalhamento (1/s)
0.200
Pas
0.180
0.160
0.140
0.120
0.100
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s) 0.080
0.060
0.040
0.020
0
0 5 10 15 20 25 30 35 1/s 40
.
Taxa de
Shear Rate
Cisalhamento (1/s)
similar ao das NEs, cujos valores de viscosidade foram obtidos na faixa entre 0,12
0
10
Pas
-1
10
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s)
-2
10
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 C
45.0 50.0
Temperature T
Temperatura (C)
que no foi observado nas outras formulaes, e por este motivo foram rejeitadas.
86
8 e 9.
5.00
Pa
4.50
4.00
3.50
3.00
2.50
Tenso
Shear de
Stress
Cisalhamento 2.00
(Pa)
1.50
1.00
0.50
0
0 5 10 15 20 25 30 35 1/s 40
Taxa de .
Shear Rate
Cisalhamento (1/s)
0.200
Pas
0.180
0.160
0.140
0.120
0.100
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s) 0.080
0.060
0.040
0.020
0
0 5 10 15 20 25 30 35 1/s 40
.
Taxa Rate
Shear de
Cisalhamento (1/s)
(Figura 27) foi mantido, quando comparado com o das NEs correspondentes
mantida.
0
10
Pas
-1
10
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s)
-2
10
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 C
45.0 50.0
Temperature T
Temperatura (C)
Ensaio
NE ou
Potencial ndice de Dimetro
Formulao
Zeta (mV) polidispersividade Hidrodinmico (nm)
inverso de fase para A/O. A polidispersividade do sistema NEP esteve entre 0,16
30
1NEP
3NEP
25
5NEP
1NEPINF-
Nmero (%)
20
3NEPINF-
5NEPINF-
15
10
0
0 200 400 600 1000 1500 2000 2500 3000
Tamanho (nm)
exclu-las do grupo.
Ensaio
NE ou
Potencial ndice de Dimetro
Formulao
Zeta (mV) polidispersividade Hidrodinmico (nm)
30
3NEB
4NEB
5NEB
25 6NEB
7NEB
8NEB
Nmero (%)
20 10NEB
11NEB
3NEBINF-
15 4NEBINF-
5NEBINF-
6NEBINF-
7NEBINF-
10
8NEBINF-
10NEBINF-
11NEBINF-
5
0
0 50 100 150 200 300 400 500 600 700
Tamanho (nm)
resultou no EHL requerido pela fase oleosa, mas observa-se que o sistema
CAPTULO 7
95
contendo IFN-.
5.00
Pa
4.50
4.00
3.50
3.00
2.50
Tenso de
Shear Stress
Cisalhamento 2.00
(Pa)
1.50
1.00
0.50
0
0 500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 1/s 4,000
.
Taxa
Shearde
Rate
Cisalhamento (1/s)
0.0200
Pas
0.0180
0.0160
0.0140
0.0120
0.0100
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s) 0.0080
0.0060
0.0040
0.0020
0
0 500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 1/s 4,000
de .
Taxa Rate
Shear
Cisalhamento (1/s)
6
10
5
Pas
10
4
10
3
10
2
10
1
10
Viscosity
Viscosidade
0
(Pa.s) 10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 C 50.0
Temperature
Temperatura T
(C)
5.00
Pa
4.50
4.00
3.50
3.00
2.50
TensoStress
Shear de
Cisalhamento 2.00
(Pa)
1.50
1.00
0.50
0
0 500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 1/s 4,000
.
Taxa de
Shear Rate
Cisalhamento (1/s)
0.0200
Pas
0.0180
0.0160
0.0140
0.0120
0.0100
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s) 0.0080
0.0060
0.0040
0.0020
0
0 500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 1/s 4,000
Taxa de .
Shear Rate
Cisalhamento (1/s)
10
10
Pas
10
5
6
10
4
10
Viscosity
Viscosidade 2
(Pa.s) 10
0
10
-2
10
-4
10
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 C 50.0
Temperature
Temperatura (C)T
foi similar ao das disperses (Figura 31), obtendo-se valores de viscosidade entre
correspondente.
Disperso ou
Viscosidade Mdia (Pa . s) Caracterstica
formulao
deste sistema.
101
3
10 5
10 G' F127-250 5C
2
10 4
G' 10Pa G' F127-250 19C
1
10
10
3
G' F127-250 25C
G''
10
0
2 G'' F127-250
G' F127-2505C
5C
10
G'' F127-250 19C
G' G'
-1 F127-250 19C
1
10 10 G' F127-250 25C
G''
G'' F127-250 25C
-2
10 10
0 25C F127-250
G'' 19C 5C
5C
(Pa) -1
-3
G'' F127-250 19C
10 10
-1 0 1 2 G'' F127-250 25C
10 -2 10 10 1/s 10
10 Angular Frequency
-3 Lquido Lquido Gel
10
-1 0 1 2
10 10 10 1/s 10
Angular angular
Frequncia Frequency
2
10 4
10
1
G' F127-250IFN-y 5C
10 3
G' 10Pa G' F127-250IFN-y 19C
0
10 2
10 G' F127-250IFN-y 25C
G''
-1 F127-250IFN-y
G''G' F127-250IFN-y 5C
5C
10 1
10
G'
-2
F127-250IFN-y
G''G' F127-250IFN-y 19C
19C
10 0
10 F127-250IFN-y
G''G' F127-250IFN-y 25C
25C
G'' -3
10 -1 25C
G'' F127-250IFN-y
19C 5C 5C
10
-4
(Pa)
10 -2 G'' F127-250IFN-y 19C
10 -1 0 1 2
10 10 10 1/s 10 G'' F127-250IFN-y 25C
-3 Angular Frequency
10
Lquido Lquido Gel
-4
10
-1 0 1 2
10 10 10 1/s 10
Angular Frequency
Frequncia angular
captulo 2.
38).
indica que o comportamento slido elstico foi mantido, visto que tan << 1.
104
2
10
1
10
Damping Factor
ngulo de tan( )
Defasagem
0
10
-1
10
-1 0 1
10 10 1/s 10
Angular
Frequncia Frequency
angular (1/s)
2
10
1
10
Damping Factor
ngulo de tan( )
Defasagem
0
10
-1
10
-1 0 1
10 10 1/s 10
Angular
Frequncia Frequency
angular (1/s)
presena de IFN-.
35
F127-10
30
F127-50
25
F127-10INF-
F127-50INF-
Nmero (%)
20
15
10
0
0 20 40 60 80
Tamanho (nm)
Ensaio
Formulao Potencial ndice de Dimetro
Zeta (mV) polidispersividade Hidrodinmico (nm)
-1,86 0.80 21,07
F127-10
F127-50 - 2,17 0.48 4,24
F127-10IFN- -1,54 0,33 26,42
F127-50IFN- +2,95 0,54 4,53
107
estabilidade.
108
CAPTULO 8
109
perodo do teste.
110
Tabela 15. Parmetros obtidos por meio das anlises fsico-qumicas antes e
aps a realizao dos testes de estabilidade preliminar dos sistemas NEP, NEB e
F127, com ou sem incorporao de IFN-.
Tabela 16. Parmetros obtidos por meio das anlises fsico-qumicas antes (0) e
aps (45 e 90 dias) da realizao dos testes de estabilidade acelerada das
formulaes relativas aos sistemas NEP, NEB e F127.
pH
Formulao Tempo (dias)
0 45 90
Condutividade (S cm-1)
Formulao
Tempo (dias)
0 45 90
captulo 4.
11NEBIFN-, p > 0.05), assim como a micela F127-50IFN- (90 dias, p > 0.9874),
0.9921 respectivamente).
1
10
(a)
Pa
0
10
Shear
TensoStress
de
Cisalhamento
(Pa)
-1
10
-1 0 1 2 3 4
10 10 10 10 10 1/s 10
.
Taxa de
Shear Rate
Cisalhamento (1/s)
0
10
(b)
Pas
-1
10
-2
10
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s)
-3
10
-4
10
-1 0 1 2 3 4
10 10 10 10 10 1/s 10
Taxa de .
Shear Rate
Cisalhamento (1/s)
Figura 41. Curva de fluxo (a) e viscosidade (b) mdia das formulaes durante o
perodo de estabilidade apresentado por cada formulao (25C).
*(a) 1NEPIFN-y (90 dias; p = 0.9880); 3NEPIFN-y (90 dias; p = 0.5583); 10NEBIFN-y (90 dias; p =
0.6723); 11NEBIFN-y (90 dias; p = 0.9727); F127-10IFN-y (< 45 dias; p = 0.9141); F127-50IFN-y
(90 dias; p = 0.9874); (b) 1NEPIFN-y (90 dias; p = 0.1773); 3NEPIFN-y (< 45 dias; p = 0.0654);
10NEBIFN-y (< 45 dias; p = 0.9921); 11NEBIFN-y (90 dias; p = 0.0791); F127-10IFN-y (90 dias; p
= 0.9999); F127-50IFN-y (90 dias; p = 0.9998).
114
10
0
#
Potencial Zeta (mV)
-10
1NEPINF-
3NEPINF-
-20 10NEBINF-
11NEBINF-
F127-10INF-
-30
F127-50INF-
-40
-50
0 45 90
Tempo (Dias)
45 e 90 dias).
500
* *
Dimetro hidrodinmico (nm)
400
300 1NEPINF-
* 3NEPINF-
10NEBINF-
200 11NEBINF-
F127-10INF-
F127-50INF-
100
#
0
0 45 90
Tempo (Dias)
180
160
Interferon gamma (ng.mL -1)
140
120
# *
1NEPINF-
100
3NEPINF-
80
10NEBINF-
11NEBINF-
60 F127-10INF-
F127-50INF-
40
20
0
0 45 90
Tempo (Dias)
CAPTULO 9
119
clcio intracelular.
24h de incubao, mesmo perfil apresentado pelo tratamento com NEPIFN- (p <
* *
100 *# *
#
Viabilidade celular (%)
80
60
PBS
1NEPINF-
40 11NEBINF-
F127-50INF-
20
0
0,0 0,5 24,0
Tempo (h)
50 PBS
Liberao de nion superxido (nmol)
INF-
1NEP
40
11NEB
* * *
* * F127-50
* *
1NEPINF-
** * * *
* * * 11NEBINF-
30
*
F127-50INF-
20
10
0
0,0 0,5 1,0 2,0
Tempo (h)
100 PBS
*
* ## INF-
* ## * 1NEP
# #
* 11NEB
80 *
# # F127-50
ndice de fagocitose (%)
#
# 1NEPINF-
# 11NEBINF-
60 ** F127-50INF-
#
40
20
0
0,0 0,5 1,0 2,0
Tempo (h)
100 PBS
INF-
1NEP
11NEB
80
Atividade bactericida (%)
F127-50
1NEPINF-
11NEBINF-
60 F127-50INF-
#
40
20
0
0,0 0,5 1,0 2,0
Tempo (h)
PBS
INF-
100
# 1NEP
*
* 11NEB
F127-50
Viabilidade celular (%)
80 1NEPINF-
* 11NEBINF-
F127-50INF-
60
#
40 *
* #
*
*
20
0
MN MCF-7 MN + MCF-7
Clulas
Figura 49. ndice de viabilidade celular dos fagcitos MN e das clulas MCF-7 de
cncer de mama humano, e sua mistura, indicado pela intensidade de
fluorescncia mdia de permeabilidade celular ao iodeto de propdio, para os
estmulos (1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN-, e como controles o IFN-,
PBS, a disperso F127-50, e as nanoemulses 1NEP e 11NEB).
*comparando o grupo controle (sem tratamento) com os grupos tratados considerando o mesmo
tipo de clulas. F = 31.5700, F = 25.5800 e F = 55.6670 respectivamente e p < 0.0001 (ANOVA).
#
comparando os diferentes tipos de clulas, considerando o mesmo tratamento. F = 13.3320, p<
0.0019; F = 10.2033, p< 0.0042 respectivamente (ANOVA).
126
tratados.
Tabela 17. Liberao intracelular de Ca2+ dos fagcitos MN e das clulas MCF-7
de cncer de mama humano indicado pela intensidade de fluorescncia.
CAPTULO 10
130
10 DISCUSSO
e lipoflicos por meio do clculo de EHL, tem levado a resultados consistentes que
2012; KABRI et al., 2011; LAWRENCE; REES, 2012). Neste trabalho empregou-
indicadas para formulaes dedicadas a esta via de administrao, uma vez que
menos, mil vezes inferiores aos das nanoemulses. Em adio elas tambm
2012).
adequados para a aplicao das mesmas, uma vez que a transio sol-gel
referida como temperatura de transio sol-gel, Tsol-gel. Alm disso, quanto maior a
grupos constituintes das micelas (BOHORQUEZ et al., 1999; SONG et al., 2000).
a TMC para a formao de micelas de 12C (JEON et al., 2002; SONG et al.,
entre -30 e -40 mV, polidispersividade entre 0,20 e 0,45. Diferentemente do que
molcula de IFN- interface, devido atrao eletrosttica, uma vez que o IFN-
2001).
137
infeces causada por Brucella sp. (SEGURA et al., 2007) e do IFN- veiculado
pois reflete o potencial superficial das gotculas. Este potencial depende do grau
regio polar das molculas dos tensoativos tween e span 80, uma vez que a
valores do potencial .
3NEP pode ter sido mais eficaz. Os valores do potencial das nanoemulses
sistemas F127, os resultados indicaram que pode ter ocorrido algum tipo de
das pores polares (MANIASSO, 2001; ROSEN, 2004; ZHOU et al., 2011). As
acima de 0,3 apresentados pelas disperses F127-10 e F127-50, bem como para
Gibbs menor do que zero o que permite a estabilidade termodinmica das micelas
superior aos das micelas nanoestruturadas, o que est de acordo com dados da
literatura (BONIFCIO et al., 2014; KIM et al., 2014; ONOUE; YAMADA; CHAN,
al., 2014; RIBEIRO et al., 2015). Por exemplo, o teste de centrifugao permite
assim como, aspecto translcido e homogneo durante todo o perodo dos testes,
organismo humano encontra-se valores que oscilam entre 4,5 a 7,0, dependendo
emulses, mas no deve ser considerado como fator determinante, pois a relao
pode ser observado nas amostras de NEs e formulaes sintetizadas com base
trabalho. A alta estabilidade coloidal das NEs pode ser tambm entendida a partir
perfil de viscosidade.
3NEPIFN-. Este determinao especfica de IFN- por citometria indica que nas
dos novos sistemas desenvolvidos, mesmo que, quando em suas formas bulk
grupo controle.
efeitos citotxicos.
sistema imunolgico.
HARA et al., 2013; POSSAMAI et al., 2013; REINAQUE et al., 2012; SCHERER et
al., 2014; RIBEIRO et al., 2015). Neste estudo observou-se que nanodoses de
146
para vrias infeces bacterianas (FRANA et al., 2010; MORCELI et al., 2011)
que o IFN- teve atividade superior ao grupo espontneo no incio e aos 30 mim.
com destaque para 1NEPIFN- que foi efetiva nos tempos de 30, 60 e 120 mim.
al., 2010; DALE; BOXER; LILES, 2008). Elas produzem NADPH oxidase
2013; POSSAMAI et al., 2013; REINAQUE et al., 2012; SCHERER et al., 2011).
al., 2012; RASSIAS et al., 1999), e a melatonina (FRANA et al., 2009; FRANA-
BOTELHO et al., 2011; HARA et al., 2013), nano fraes de Momordica charantia
neste estudo foram capazes de ativar a atividade fagoctica, porm este aumento
(FAGUNDES et al., 2013). Estudos indicam que estas clulas apresentam baixa
tem sido o foco de diversos estudos e a literatura tem revelado que o IFN-
fagcitos MN, das clulas MCF-7 e da co-cultura formada por ambas. Esta
inibio do crescimento celular foi mais evidente quando as clulas foram tratadas
com IFN- puro em soluo para todos os grupos celulares. Estes resultados
um fator essencial para a obteno dos efeitos clnicos desejados. Para a maior
parte dos frmacos, a estratgia utilizada visa a reduo dos efeitos adversos,
1997).
de PI. Apesar disso, este sistema foi capaz de aumentar a liberao do clcio
intracelular nas clulas MCF-7 e na co-cultura, fato este que pode estar
Neste estudo, a ativao dos fagcitos MN foi evidenciada pela atuao dos
(LEE et al., 2000). O controle da sua liberao relevante visto que o clcio
causar dano ao hospedeiro (MANDAL et al., 2010; SAJAN et al., 2009), portanto,
IFN-.
153
CAPTULO 11
154
11 CONCLUSES
72 preparados;
selecionadas apenas 2;
155
selecionadas apenas 2;
do IFN-;
nm respectivamente.
alteraes;
controle (PBS);
superxido;
significativamente a fagocitose;
Com relao s clulas cancergenas, o efeito foi observado por meio da reduo
desencadeados pelo Ca2+ neste grupo celular e nos fagcitos MN. Estes
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APNDICE
Projeto:
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAO DE
NANOEMULSES E NANOPARTCULAS PARA
VEICULAO DE INTERFERON GAMMA E AVALIAO DE
SEU POTENCIAL IMUNOMODULADOR
ANEXO
Ribeiro, E. B.; Honorio-Frana, A. C.; Frana, E. L.; Soler, M. A. G.. Design and