Elton Brito Ribeiro - Tese Final

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UNIVERSIDADE DE BRASLIA

INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS


PS-GRADUAO EM NANOCINCIA E NANOBIOTECNOLOGIA

TESE DE DOUTORADO

DESENVOLVIMENTO DE NANOCARREADORES FORMADOS POR


MICELAS DE PLURONIC F127 OU NANOEMULSES PARA VEICULAO DE
INTERFERON GAMMA E AVALIAO DO POTENCIAL IMUNOMODULADOR

ELTON BRITO RIBEIRO

BRASLIA - DF
2016
2

ELTON BRITO RIBEIRO

DESENVOLVIMENTO DE NANOCARREADORES FORMADOS POR


MICELAS DE PLURONIC F127 OU NANOEMULSES PARA VEICULAO DE
INTERFERON GAMMA E AVALIAO DO POTENCIAL IMUNOMODULADOR

ORIENTADORA
Professora MARIA APARECIDA GODOY SOLER

Tese apresentada ao Programa de Ps-


Graduao em Nanocincia e
Nanobiotecnologia da Universidade de
Braslia como requisito parcial para obteno
do ttulo de Doutor em Nanocincia e
Nanobiotecnologia.

BRASLIA - DF
2016
3

UNIVERSIDADE DE BRASLIA
INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS
Programa de Ps-Graduao em Nanocincia e Nanobiotecnologia

Tese de Doutorado

Elton Brito Ribeiro

Ttulo:
DESENVOLVIMENTO DE NANOCARREADORES FORMADOS POR
MICELAS DE PLURONIC F127 OU NANOEMULSES PARA VEICULAO DE
INTERFERON GAMMA E AVALIAO DO POTENCIAL IMUNOMODULADOR

Comisso Examinadora

Professora Maria Aparecida Godoy Soler


Presidente / Orientadora
IF / UNB

Prof. Dr. Joo Paulo Longo Profa. Dra. Tas Gratieri


Membro Titular Interno Vinculado ao Programa Membro Titular Interno No Vinculado ao Programa
IB / UNB FS / UNB

Prof. Dr. Leonardo Giordano Paterno Profa. Dra. Danny Laura G.Fagundes
Membro Titular Interno No Vinculado ao Programa Membro Titular Externo No Vinculado ao Programa
IQ / UNB ICBS / UFMT

Braslia DF, 22 de Junho de 2016.


4

Dediquei, dedico e dedicarei as conquistas da


vida aos meus amores incondicionais:
A DEUS-Jesus-Esprito Santo-, misericordiosos,
pela compaixo e oportunidade da vida.
Ao maior dos homens, Valmiro G. Ribeiro, pela
lio de bondade, honra, honestidade e dignidade!
Ao maior dos tesouros, Nilza Brito Ribeiro, pelo
amor, carinho, afagos, perseverana e f!
A minha amiga, namorada, esposa, mulher e
amante, Patrcia Kelly Dias Lanes, pela pacincia,
dedicao, afeto, companheirismo, amor e por estar
enfrentando o mundo ao meu lado!
Ao meu irmo, Valmiro Jr, pelo companheirismo!
E ao maior presente que recebi, um pedacinho de
cu, Thais, por quem lutarei a vida toda, assim como as
pessoas acima lutam por mim!
5

AGRADECIMENTOS

Agradeo a Deus-Jesus-Esprito Santo pela presena em minha vida, pela


misericrdia, pelo amor incondicional e pela oportunidade de renovao da f a
cada orao e o sentimento de segurana por acreditar que o melhor est por vir.
A minha orientadora, Profa. Maria Aparecida Godoy Soler pelas valiosas
lies, amizade, pacincia, ateno e direcionamento dos trabalhos que foram
realizados. Um exemplo de profissionalismo, competncia, dedicao, pessoa e
companheirismo que levarei comigo com eterna gratido. A confiana dedicada a
mim, mesmo antes de nos conhecermos, pretendo nunca desapontar. A sua
sabedoria, dedicao, espectro de juventude e o pensar cientfico inovador um
exemplo a ser seguido por todo cientista.
Ao Prof. Eduardo Luzia Frana e Prof. Adenilda Cristina Honrio Frana
pelas valiosas orientaes e participao em todo meu amadurecimento cientfico.
Agradeo por receberem to carinhosamente a minha famlia e por no medir
esforos em apoiar nossas decises. A forma de trabalho humanizado,
compreensivo e profissional que vocs adotam um exemplo a ser seguido por
qualquer educador.
Aos companheiros de Braslia Camila Letti, Luiz Miguel, Ana Paula,
Antnia, Deizilene, Luana, Alberto, Ariane e Alexandre. Agradecer a amigos seria
uma misso infinita, porque estiveram comigo nas felicidades, dificuldades e
principalmente nas necessidades, portanto sou muito grato. Ao pessoal de Barra
do Garas que me deu apoio: Aron Carlos, Danny, Patrcia, Aliny, Rubian e Miri.
Ao meu amigo Paulo Leventi que possibilitou o contato com o programa quando j
no havia possibilidade a meu ver. A todos do CNANO e da PPGNANO.
A todos os professores da Universidade de Braslia e da Universidade
Federal de Mato Grosso, em especialmente a todos os professores do PPGNANO
em nome do Prof. Sebastio William da Silva, que dedicam suas vidas a estas
instituies e que a duras penas desenvolvem e estimulam o conhecimento
cientfico. Estes profissionais necessitam de maior reconhecimento de toda
sociedade.
6

Aos companheiros do incio da vida cientfica Fernando Boldrini, Aron


Carlos de Melo Cotrim e Anglica de Jesus Silva.
Aos grandes mestres da infncia e adolescncia escolar, professores e
amigos de Colorado do Oeste-RO, minha cidade natal de que tanto me orgulho. A
oportunidade de receber um conhecimento base sustentvel, passou
irrevogavelmente pelo Instituto Educacional Dimenso e Escola Agrotcnica
Federal EAFCOL, e se estou aqui hoje devo muito ao trabalho dessas
instituies.
A toda minha famlia que sempre acreditou nos meus sonhos e
perspectivas. Especialmente Rosa, Jomar e Talita Lanes, meus pais, minha
esposa, minha filha, pelo amor, compreenso, carinho e dedicao principalmente
nas horas difceis e compartilhando aquelas felizes. Obrigado por estarem sempre
ao meu lado, pois sozinho eu no teria foras.
Obrigado a todos por fazerem parte do desafio!
7

Tudo quanto te vier mo para fazer,

faze-o conforme as tuas foras, porque

na sepultura, para onde tu vais, no h

obra, nem indstria, nem cincia, nem

sabedoria alguma. (Ec 9:10)


8

RESUMO

O objetivo deste estudo foi desenvolver novas formulaes contendo IFN-,


visando sua utilizao como agente imunomodulador. As formulaes foram
produzidas a partir de diferentes sistemas coloidais formados por nanoemulses
ou micelas nanoestruturadas. As nanoemulses base de gua destilada,
triglicerdeo de cido cprico/caprlico, oleoato de sorbitano (SP), polissorbato 80
(TW) e propilenoglicol (PG) ou 1-butanol (BT) foram preparadas por ultra-
homogeneizao. As disperses, formadas pelo copolmero Pluronic F127 em
soluo tampo fosfato (pH 7.4), foram preparadas nas concentraes de 10
mg.mL-1, 50 mg.mL-1 e 250 mg.mL-1. As nanoemulses e disperses
desenvolvidas foram caracterizadas para obter o tamanho hidrodinmico, ndice
de polidisperso, carga superficial, estabilidade fsica preliminar e acelerada e
propriedades reolgicas. As nanoemulses e disperses estveis foram
selecionadas para incorporar nano doses de IFN- (100 ng.mL-1). A influncia do
IFN- incorporado nas formulaes desenvolvidas na atividade funcional das
clulas mononucleares para Escherichia coli enteropatognica foi analisada por
meio da liberao de nion superxido, fagocitose e atividade microbicida. Em
adio, a influncia das formulaes sobre a atividade funcional das clulas
mononucleares, das clulas de cncer de mama humano (MCF-7) e da co-cultura
de ambas, foi estudada por meio do teste de permeabilidade celular ao iodeto de
propdeo e da liberao de clcio intracelular. As formulaes otimizadas
permaneceram estveis em condies extremas durante 90 dias, com valores de
pH biocompatveis, sem alterao significativa dos perfis reolgicos, dimetro
hidrodinmico com dimenses nanomtricas, potencial zeta negativo, e sem
variaes significativas da dose do IFN- (100 ng.mL-1). Os ensaios biolgicos
mostraram que as formulaes desenvolvidas no alteram a taxa de viabilidade
das clulas mononucleares e aumentaram a liberao de superxido, o ndice de
fagocitose e a liberao de clcio intracelular das clulas mononucleares do
sangue humano, quando se comparou ao grupo espontneo. Alm disso, as
nanoemulses so capazes de promover a morte das clulas de cncer de mama
humano MCF-7 ou em co-cultura. Os resultados indicam que as formulaes
produzidas podem melhorar a atividade biolgica do IFN-.

Palavras chaves: Nanoemulso, Pluronic 127, Micelas nanoestruturadas,


Imunomodulao, IFN-, Clulas mononucleares, Clulas de cncer de mama.
9

ABSTRACT

The aim of this study was to design and develop different formulations containing
IFN- to probe their use as an immunomodulating agent. Produced formulations
were based on two different nanoemulsion systems or nanostructured micelles.
The nanoemulsions comprising distilled water, triglycerides of capric/caprylic acid,
sobitan-oleate (SP), polysorbate 80 (TW) and propylene glycol (PG) or 1-butanol
(BT) were prepared through ultra-homogenization. The pluronic 127 dispersions in
phosphate buffer solution (pH 7.4) were prepared at concentrations of 10 mg.mL-1,
50 mg.mL-1 and 250 mg.mL-1. The developed nanoemulsions and dispersions
were characterized regarding droplet size, polydispersity, surface charge,
preliminary and accelerated physical stability, and rheological properties. Stable
products were selected to incorporate nano doses of IFN- (100 ng.mL-1) and
characterized under the same parameters. The influence of IFN- incorporated
formulations on functional activity of mononuclear cell for Escherichia coli
enteropathogenic was analyzed through superoxide release, phagocytosis and
microbicidal activity. By means of cell permeability tests to propidium iodide and
intracellular calcium release were employed to study the formulations influence on
functional activity of mononuclear cell, human breast cancer (MCF-7) and co-
culturing both. The optimized formulations remained stable in extreme conditions
during 90 days, displaying biocompatible pH value, significant maintenance of its
rheological profile, nanometric hydrodynamic diameter, negative zeta potential and
no significant variations of IFN- dose (100 ng.mL-1). Additionaly, developed
formulations did not alter the MN cell viability rates and increased the superoxide
release, phagocytosis index and intracellular calcium release of mononuclear cells
of human blood compared to the spontaneous group. Furthermore, the
nanoemulsions were able to promote the death of MCF-7 human breast cancer or
co-culturing. Our findings indicate that the produced formulations can improve the
biological activity of IFN-.

Keywords: Pluronic F127, Nanoemulsion, Micelles, Immunomodulation, IFN-,


Mononuclear cells, Breast cancer cells.
10

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Ilustrao das estruturas mais comuns de sistemas nanoemulsionados:


A) gua em leo (A/O); B) Bicontnua; e C) leo em gua (O/A). Fonte: Arquivo
pessoal, Adaptado de (LAWRENCE; REES, 2012). ............................................ 27

Figura 2. Estruturas molecularares dos componentes escolhidos para a sntese


das nanoemulses A) Polissorbato 80, B) Oleato de sorbitano, C) 1-butanol, D)
Propilenoglicol e E) triglicrides de cido cprico/caprlico. ................................. 29

Figura 3. Ilustrao de nanoestruturas na forma de micela, nanoesfera e


nanocpsula, conforme indicado. Fonte: Arquivo pessoal, adaptado de (NAMBAM;
PHILIP, 2012; STANISUASKI et al., 2003). ....................................................... 30

Figura 4. Estrutura molecular do copolmero Pluronic F-127............................... 31

Figura 5. Esquema da estrutura cristalina do IFN-. ............................................ 33

Figura 6. Esquema dos experimentos que foram realizados. .............................. 37

Figura 7. Ilustrao das tcnicas e das etapas empregadas para caracterizao


das NEs e MNPs desenvolvidas. (Fonte: Arquivo pessoal). ................................ 39

Figura 8. Curva de fluxo (A) e de viscosidade (B) de um lquido Newtoniano.


Fonte: Arquivo pessoal, adaptado de (SCHRAMM, 2000). .................................. 41

Figura 9. Exemplos de curvas de fluxos de lquidos No-Newtonianos. As curvas


em preto se referem a plstico de Bingham; em azul a pseudoplstico e em
vermleho a dilatante. Fonte: Arquivo pessoal, adaptado de (SCHRAMM, 2000). 42

Figura 10. Ilustrao dos componentes do citmetro de fluxo e do sistema de


leitura. Fonte: http://gic.casaccia.enea.it/images/Citometro.jpg............................ 49

Figura 11. Ilustrao do processo da sntese das NEs por meio do mtodo de
ultrahomogeneizao e definio das propores dos componentes empregando
diagramas pseudoternrios. Cada ponto se refere a uma amostra preparada. A
ilustrao do sistema preparado O/A, bem como a imagem de uma de NE
selecionada se encontram na parte inferior da Figura. (Fonte: Arquivo pessoal). 54
11

Figura 12. Ilustrao do processo da sntese das MNPs por meio do mtodo auto
estruturante. A imagem da direita se refere a uma das amostras preparadas.
(Fonte: Arquivo pessoal). ..................................................................................... 55

Figura 13. Ilustrao das etapas e avaliaes realizadas nos estudos de


estabilidade utilizadas para o desenvolvimento das NEs e NPs. ......................... 62

Figura 14. Diagramas pseudoternrios de classificao dos pontos (a) e de


domnios de regio com as nanoemulses selecionadas (b) do sistema SP/TW/P.
............................................................................................................................. 74

Figura 15. Diagramas pseudoternrios de classificao dos pontos (a) e de


domnios de regio com as nanoemulses selecionadas (b) do sistema SP/TW/B.
............................................................................................................................. 75

Figura 16. Curvas de fluxo obtidas das nanoemulses pr-selecionados do


sistema NEP (25C). ............................................................................................ 76

Figura 17. Curvas de viscosidade obtidas das nanoemulses do sistema NEP


(25C). .................................................................................................................. 77

Figura 18. Curva de viscosidade de nanoemulses do sistema NEP em funo da


temperatura (5 a 45C). ........................................................................................ 79

Figura 19. Curvas de fluxo das formulaes (1, 3 e 5NEPIFN-) selecionadas do


sistema NEP (25C). ............................................................................................ 80

Figura 20. Curvas de viscosidade das formulaes (1, 3 e 5NEPIFN-)


selecionadas do sistema NEP (25C). ................................................................. 81

Figura 21. Curvas de viscosidade das formulaes (1, 3 e 5NEPIFN-)


selecionadas do sistema NEP, em funo da temperatura (5 a 45C). ................ 82

Figura 22. Curva de fluxo das nanoemulses pr-selecionados do sistema NEB


(25C). .................................................................................................................. 83

Figura 23. Curva de viscosidade das nanoemulses pr-selecionadas do sistema


NEB (25C)........................................................................................................... 84
12

Figura 24. Curva de viscosidade das nanoemulses pr-selecionadas do sistema


NEB em funo da temperatura (5 a 45C). ......................................................... 85

Figura 25. Curvas de fluxo das formulaes (3, 4, 5, 6, 8, 8, 10 e 11NEBIFN-) do


sistema NEB (25C). ............................................................................................ 86

Figura 26. Curvas de viscosidade das formulaes (3, 4, 5, 6, 8, 8, 10 e


11NEBIFN-) do sistema NEB (25C). ................................................................. 87

Figura 27. Curvas de viscosidade das formulaes (3, 4, 5, 6, 8, 8, 10 e


11NEBIFN-) do sistema NEB em funo da temperatura (5 a 45C).................. 88

Figura 28. Distribuio de tamanho de gotculas das nanoemulses (1,3, e 5NEP)


e formulaes (1,3,5NEP IFN-) do sistema NEP. ............................................... 90

Figura 29. Distribuio de tamanho de gotculas das formulaes do sistema


NEB. ..................................................................................................................... 92

Figura 30. Curvas de fluxo das disperses pr-selecionadas (127-10 e F127-50)


(25C). .................................................................................................................. 96

Figura 31. Curvas de viscosidade das disperses pr-selecionadas (127-10 e


F127-50) (25C). .................................................................................................. 96

Figura 32. Curvas de viscosidade das disperses pr-selecionadas 127-10, F127-


50 e F127-250 em funo da temperatura (5 a 45C). ......................................... 97

Figura 33. Curva de fluxo das formulaes 127-10IFN- e F127-50IFN- (25C).98

Figura 34. Curvas de viscosidade das formulaes 127-10IFN- e F127-50IFN-


(25C). .................................................................................................................. 98

Figura 35. Curvas de viscosidade das formulaes 127-10IFN-, F127-50IFN- e


F127-250IFN- em funo da temperatura (5 a 45C). ........................................ 99
13

Figura 36. Comportamento dos mdulos de armazenagem G e de perda G em


funo da frequncia da disperso F127-250 bem como as respectivas imagens
em diferentes temperaturas (5, 19 e 25C). ...................................................... 102

Figura 37. Comportamento dos mdulos de armazenagem G e de perda G em


funo da frequncia da formulao F127-250IFN- bem como as respectivas
imagens em diferentes temperaturas (5, 19 e 25C). ........................................ 102

Figura 38. Curvas do ngulo de defasagem em funo da frequncia da


disperso F127-250 para diferentes temperaturas (5, 19 e 25C). .................... 104

Figura 39. ngulo de defasagem em funo da frequncia da formulao F127-


250IFN- para diferentes temperaturas (5, 19 e 25C). ...................................... 104

Figura 40. Distribuies de tamanho das micelas das disperses (F127-10 e


F127-50) e das formulaes (F127-10IFN- e F127-50IFN-). ........................... 106

Figura 41. Curva de fluxo (a) e viscosidade (b) mdio das formulaes durante o
perodo de estabilidade apresentado por cada formulao (25C). ................... 113

Figura 42. Valores de potencial Zeta das formulaes produzidas durante o


perodo de estabilidade acelerada (0, 45 e 90 dias)........................................... 114

Figura 43. Valores mdios de dimetro hidrodinmico das formulaes


produzidas durante o perodo de estabilidade acelerada (0, 45 e 90 dias). ....... 115

Figura 44. Dosagem de interferon gamma nas formulaes durante o perodo de


estabilidade acelerada. ...................................................................................... 116

Figura 45. ndice de viabilidade celular dos fagcitos MN do sangue perifrico


humano com diferentes tratamentos (1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN-, e
como controle o PBS) e tempos de incubao (0; 0,5; e 24 h). ......................... 120

Figura 46. Liberao de nion superxido das clulas MN do sangue perifrico


humano na presena de E. coli em diferentes tratamentos (1NEPIFN-,
11NEBIFN- e F127-50IFN-, e como controles o IFN-, PBS, a disperso F127-
50, e as nanoemulses 1NEP e 11NEB) e tempos de incubao (0; 0,5; 1 e 2 h).
........................................................................................................................... 121
14

Figura 47. ndice de Fagocitose das clulas MN do sangue perifrico humano na


presena de E. coli em diferentes tratamentos (1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-
50IFN-, e como controles o IFN-, PBS, a disperso F127-50, e as
nanoemulses 1NEP e 11NEB) e tempos de incubao (0; 0,5; 1 e 2 h). ......... 123

Figura 48. Atividade bactericida das clulas MN do sangue perifrico humano na


presena de E. coli em diferentes tratamentos (1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-
50IFN-, e como controles o IFN-, PBS, a disperso F127-50, e as
nanoemulses 1NEP e 11NEB) e tempos de incubao (0; 0,5; 1 e 2 h). ......... 124

Figura 49. ndice de viabilidade celular dos fagcitos MN e das clulas MCF-7 de
cncer de mama humano, e sua mistura, indicado pela intensidade de
fluorescncia mdia de permeabilidade celular ao iodeto de propdio, para os
estmulos (1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN-, e como controles o IFN-,
PBS, a disperso F127-50, e as nanoemulses 1NEP e 11NEB)...................... 125

Figura 50. Liberao intracelular de Ca2+ dos fagcitos MN sanguneos e das


clulas MCF-7 de cncer de mama humano indicado pela intensidade de
fluorescncia. ..................................................................................................... 127
15

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Valores calculados de percentagens e EHL obtidos para a mistura de


tensoativos e co-tensoativos. ............................................................................... 72

Tabela 2. Valores de rea de histerese e classificao do fluxo dos pontos pr-


selecionados do sistema NEP, obtidos a partir dos dados da Figura 16. ............. 77

Tabela 3. Valores de viscosidade e caractersticas do fluxo dos pontos do sistema


NEP, obtidos da Figura 17. .................................................................................. 78

Tabela 4. Valores de rea de histerese e classificao do fluxo das formulaes


(1, 3 e 5NEPIFN-) selecionadas do sistema NEP, obtidos a partir dos dados da
Figura 19. ............................................................................................................. 80

Tabela 5. Valores de viscosidade e caractersticas do fluxo das formulaes (1, 3


e 5NEPIFN-) selecionadas do sistema NEP, obtidos da Figura 20. ................... 81

Tabela 6. Valores de rea de histerese e classificao do fluxo das nanoemulses


pr-selecionados do sistema NEB, obtidos a partir dos dados da Figura 22. ...... 83

Tabela 7. Valores de viscosidade e caractersticas do fluxo das nanoemulses do


sistema NEB, obtidos a partir dos dados da Figura 23. ....................................... 84

Tabela 8. Valores rea de histerese e classificao do fluxo das formulaes (3,


4, 5, 6, 8, 8, 10 e 11NEBIFN-) do sistema NEB, obtidos a partir dos dados da
Figura 25. ............................................................................................................. 87

Tabela 9. Valores de viscosidade e caracterstica do fluxo das formulaes (3, 4,


5, 6, 7, 8, 10 e 11NEBIFN-) do sistema NEB, obtidos a partir dos dados da Figura
26. ........................................................................................................................ 88

Tabela 10. Valores de potencial zeta, ndice de polidispersividade e dimetro


hidrodinmico mdios das formulaes do sistema NEP, obtidos a partir dos
dados da Figura 28. ............................................................................................. 89
16

Tabela 11. Valores de potencial zeta, ndice de polidispersividade e dimetro


hidrodinmico mdios das nanoemulses (3,4,5,6,7,8,10 e 11NEB) formulaes
(3 a 11NEBIFN-) do sistema NEB, obtidos dos dados da Figura 29................... 91

Tabela 12. Valores da rea de histerese e classificao do fluxo das disperses


pr-selecionadas 127-10 e F127-50 e das formulaes 127-10IFN- e F127-
50IFN- obtidos a partir dos dados das Figuras 30 e 33. ................................... 100

Tabela 13. Valores de viscosidade e caracterstica do fluxo das disperses pr-


selecionadas (127-10 e F127-50) obtidos a partir dos dados das Figuras 31 e 34.
........................................................................................................................... 100

Tabela 14. Potencial zeta, ndice de polidispersividade e dimetro hidrodinmico


mdios das disperses (F127-10 e F127-50) e formulaes (F127-10IFN- e
F127-50IFN-). O ndice de polidispersividade e dimetro hidrodinmico foram
obtidos a partir da Figura 40............................................................................... 106

Tabela 15. Parmetros obtidos por meio das anlises fsico-qumicas antes e
aps a realizao dos testes de estabilidade preliminar dos sistemas NEP, NEB e
F127, com ou sem incorporao de IFN-.......................................................... 110

Tabela 16. Parmetros obtidos por meio das anlises fsico-qumicas antes (0) e
aps (45 e 90 dias) da realizao dos testes de estabilidade acelerada das
formulaes relativas aos sistemas NEP, NEB e F127. ..................................... 111

Tabela 17. Liberao intracelular de Ca2+ dos fagcitos MN e das clulas MCF-7
de cncer de mama humano indicado pela intensidade de fluorescncia. ........ 128
17

LISTA DE ABREVIAES E SIGLAS

A/O ou O/A gua em leo ou leo em gua


BSA Bovine serum albumin
DH Dimetro hidrodinmico
E. coli - Escherichia coli
EDL Espalhamento dinmico de luz
EG Emulso gel
EHL Equilbrio hidrfilo-lipfico
EL Emulso lquida
EPEC- Escherichia coli enteropatognica
IFN- Interferon gamma
MN - Mononuclear
MNPs Micelas nanoparticuladas
NEBIFN- - Nanoemulso que contm butanol e interferon gamma
NE Nanoemulso
NEB - Nanoemulso que contm butanol
NEP - Nanoemulso que contm propilenoglicol
NEPIFN- - Nanoemulso que contm propilenoglicol e interferon gamma
NK Natural killer cells
PBS - Phosphate buffer saline
F127 Micela nanoparticuladas de Pluronic F127
F127IFN- - Micela nanoparticuladas de Pluronic F127 que contm interferon
gamma
Potencial Potencial zeta
SF Separao de fases
SVFs - sistemas de veiculao de frmacos
SP/TW/B Oletado de sorbitano (Span 80), polissorbato 80 (Tween 80) e 1-
butanol (B)
SP/TW/P Oletado de sorbitano (Span 80), polissorbato 80 (Tween 80) e 1-
propilenoglicol (P)
TSB - Trypic Soy Broth
18

SUMRIO

1 INTRODUO .................................................................................................. 21
1.1 Motivao ........................................................................................... 24
1.1.1 Sistemas de liberao de frmacos ......................................... 24
1.1.2 Interferon gamma (IFN-) ......................................................... 32
1.2 Justificativa ........................................................................................ 34
1.3 Objetivos ............................................................................................ 35
2 TCNICAS DE CARACTERIZAO ............................................................... 39
2.1 Reologia.............................................................................................. 40
2.2 Espalhamento dinmico de luz (EDL) .............................................. 46
2.3 Potencial Zeta .................................................................................... 46
2.4 Citometria de Fluxo ........................................................................... 47
3 SNTESE DOS NANOCARREADORES ........................................................... 51
3.1 Materiais ............................................................................................. 51
3.2 Preparao dos sistemas nanoemulsionados ................................ 51
3.3 Preparao dos sistemas coloidais com micelas nanoestruturadas
............................................................................................................................. 55
3.4 Preparao dos sistemas com a incorporao de IFN- ................ 55
4 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS EMPREGADOS NA
CARACTERIZAO E CONTROLE DE QUALIDADE DOS MATERIAIS
SINTETIZADOS ................................................................................................... 58
4.1 Caracterizaes Reolgica ............................................................... 58
4.2 Caracterizao por espalhamento dinmico de luz ........................ 59
4.3 Controles de qualidade e caracterizaes fsico-qumicas ........... 60
4.4 Estudos de Estabilidade ................................................................... 61
5 ENSAIOS BIOLGICOS .................................................................................. 64
5.1 Sujeitos e tamanho amostral ............................................................ 64
5.2 Obtenes de fagcitos do sangue perifrico ................................ 64
5.3 Cultura de clulas .............................................................................. 65
5.4 Linhagem e Culturas de Escherichia coli Enteropatognica ......... 65
5.5 Incubao dos fagcitos MN, das clulas MCF-7 e fagcitos
MN/clulas MCF-7 com as nanoestruturas desenvolvidas ............................. 65
5.6 Viabilidade celular ............................................................................. 67
5.7 Liberao de nion superxido ........................................................ 67
19

5.8 Avaliao da fagocitose e da atividade bactericida........................ 68


5.9 Teste de Permeabilidade celular ao Iodeto de propdeo ................ 68
5.10 Liberao de clcio intracelular ..................................................... 69
5.11 Aspectos legais................................................................................ 69
5.12 Anlises estatsticas .................................................................................. 70
6 RESULTADOS: NANOEMULSES ................................................................. 72
6.1 Determinao da mistura de tensoativos ........................................ 72
6.2 Preparao dos sistemas nanoemulsionados ................................ 73
6.3 Caracterizao reolgica .................................................................. 76
6.3.1 Nanoemulses do sistema SP/TW/P (NEP) ............................. 76
6.3.2 Nanoemulses do sistema SP/TW/B (NEB) ............................. 82
6.4 Caracterizao por espalhamento dinmico de luz ........................ 89
6.4.1 Nanoemulses do sistema SP/TW/P (NEP) ............................. 89
6.4.2 Nanoemulses do sistema SP/TW/B (NEB) ............................. 90
7. RESULTADOS: MICELAS DE PLURONIC 127 .............................................. 95
7.1 Caracterizao reolgica .................................................................. 95
7.2 Caracterizao por espalhamento dinmico de luz ...................... 105
8 RESULTADOS: CONTROLE DE QUALIDADE DAS FORMULAES
PRODUZIDAS .................................................................................................... 109
8.1 Estabilidade preliminar ................................................................... 109
8.2 Estabilidade Acelerada.................................................................... 111
9 RESULTADOS: ENSAIOS BIOLGICOS...................................................... 119
9.1 Ensaio Biolgico .............................................................................. 119
9.2 ndice de viabilidade ........................................................................ 119
9.3 Liberao de nion superxido ...................................................... 120
9.4 Avaliao da fagocitose .................................................................. 122
9.5 Atividade Microbicida ...................................................................... 123
9.6 Avaliao da permeabilidade celular ao iodeto de propdio ........ 125
9.7 Liberao de clcio intracelular ..................................................... 126
10 DISCUSSO ................................................................................................. 130
11 CONCLUSES ............................................................................................. 154
REFERNCIAS .................................................................................................. 159
APNDICE ......................................................................................................... 176
ANEXO .............................................................................................................. 177
20

CAPTULO 1
21

1 INTRODUO

Nanobiomateriais empregados como sistemas de liberao de frmacos

tm contribudo para melhorar a eficincia do tratamento de muitas doenas,

porm a sua aplicao em grande escala depende do desenvolvimento de novas

alternativas teraputicas, por exemplo, da sntese de novos sistemas carreadores,

de diferentes vias de administrao, e de adequaes bionanotoxicolgicas

(PRIDGEN et al., 2013; SMITH et al., 2013).

Dentre os nanomateriais que tm sido empregados como sistemas de

veiculao de frmacos (SVFs) pode-se citar as nanoemulses (NEs) e as

micelas nanoparticuladas (MNPs), sistemas estes que se destacam por

promoverem alternativas teraputicas eficientes, que possibilitam a administrao

de molculas biologicamente ativas em local especfico, com eficincia

teraputica relevante e efeitos colaterais mnimos (BONIFACIO et al., 2014;

LAWRENCE; REES, 2012).

Os polmeros utilizados na sntese de materiais nanoestruturados tm sido

aplicados para a veiculao de frmacos, vacinas e fotosensibilizadores (FARAJI;

WIPF, 2009; KREUTER, 1996; PY-DANIEL et al., 2016) e como adjuvantes em

imunoterapias (GMEZ et al., 2009; HARA et al., 2013). As NEs tm sido

empregadas para veiculao de anti-inflamatrios como o celecoxib (BABOOTA

et al., 2007) e o aceclofenaco (SHAKEEL et al., 2007), o clotrimazol na

quimioterapia de malria (BORHADE et al., 2012), para veiculao de ftalocianina

para terapia fotodinmica e hipertermia em glioblastomas (DE PAULA et al.,

2012), como adjuvante em vacinas para influenza (HAMOUDA et al., 2011) e em

fitoformulaes (AJAZUDDIN; SARAF, 2010).


22

A NE definida como uma disperso coloidal termodinamicamente instvel

constituda de dois lquidos imiscveis, com um dos lquidos disperso na forma de

pequenas gotculas (normalmente r < 100 nm) no outro lquido, onde a

estabilidade alcanada por meio da combinao de tensoativos (FRYD;

MASON, 2012; MCCLEMENTS, 2012). As MNPs que tm sido muito investigadas

como sistemas de veiculao de frmacos so as polimricas, que so partculas

coloidais esfricas que podem apresentar um ncleo hidrofbico e o exterior

hidroflico sendo constitudas por polmeros copolmeros (TORCHILIN, 2005;

ZHOU et al., 2011). Para a veiculao de frmacos estes sistemas podem ser

apresentados na forma de micelas propriamente ditas, as vesculas e os

complexos polieletrolticos, de modo que o ncleo contenha o frmaco

(VILLANOVA; ORFICE; CUNHA, 2010).

Os complexos nanoestruturados com formulaes adequadas podem

modificar a liberao de estmulos que atuam no sistema imunolgico (MANDAL

et al., 2010; SAJAN et al., 2009) permitindo a sua modulao de forma que

proteja o organismo da atividade pr-inflamatria excessiva e que leve a uma

resposta mais eficiente para determinadas doenas. (PESSOA et al., 2014;

RIBEIRO et al., 2015; RIET; HARTGERS; YAZDANBAKHSH, 2007). A

administrao teraputica de citocinas tem sido empregada com visando

modificar a resposta imunolgica em doenas como o cncer e doenas

autoimunes ou infecciosas. Diversos estudos tm sido conduzidos com o objetivo

de determinar as vias e concentraes ideais para a administrao de citocinas

(BARRATT, 2000; CHRISTIAN; HUNTER, 2013).


23

Entre as citocinas, o interferon- (IFN-) atua no processo de ativao e

modulao das funes das clulas do sistema imunolgico, pode promover a

atividade fagoctica, o aumento da expresso de receptores de superfcie e atuar

na resposta microbicida dos fagcitos (FAGUNDES et al., 2013; SANCHEZ-

MUOZ, 2008). O sucesso limitado das terapias que envolvem os IFNs

atribudo dificuldade de faz-lo atingir alvos especficos com doses adequadas

(DUNN; KOEBEL; SCHREIBER, 2006). Com o objetivo de responder a essa

demanda, biomateriais vm sendo desenvolvidos para atuarem como

transportadores de citocinas, e tambm com o objetivo de reduzir a apoptose em

alguns rgos nos quais elas podem ser consideradas txicas (GUAN et al.,

2012).

Estudos realizados por nossa equipe mostraram que nanodoses de IFN-

(100 ng.mL-1) so suficientes para atuar na atividade funcional dos fagcitos do

sangue quando incubadas com bactrias (FAGUNDES et al., 2013) ou

protozorios (MORAES et al., 2015), sugerindo a necessidade de desenvolver

veculos nos quais nanodoses de IFN- possam ser adequadamente

administradas.

Observa-se na literatura alguns trabalhos de SVF coloidais para citocinas,

tais como, a veiculao de IFN- para aplicaes antitumorais e em vacinas por

meio de lipossomas (KARAU; OETSZULAT; SHMIDT, 1996; VAN SLOOTEN et

al., 2001b), micro e nanopartculas (SANCHEZ et al., 2003) e nanopartculas

(SEGURA et al., 2007). Verifica-se nos resultados dos estudos citados, que o

estudo do efeito da veiculao de citocinas acopladas a sistemas

nanoestruturados na atividade imune de fagcitos do sangue humano no


24

conclusivo. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi o desenvolver e

caracterizar sistemas coloidais base de NEs ou MNPs para veiculao de IFN-,

bem como o estudo da modulao promovida por estes sistemas sobre a

atividade funcional de fagcitos do sangue perifrico e clulas de cncer de

mama humano.

1.1 Motivao

1.1.1 Sistemas de veiculao de frmacos

Um sistema de veiculao de frmacos ideal tem como objetivo maximizar

o efeito teraputico, ao mesmo tempo que minimiza a toxicidade do mesmo. Com

o avano da nanocincia e da nanotecnologia os procedimentos farmacuticos

tm evoludo de convencionais e simples, para sistemas altamente sofisticados,

que permitem o transporte de frmacos em doses mnimas e em locais

especficos, os quais so chamados de sistema de veiculao de frmacos

(ANSEL et al., 2007; HONORIO-FRANA, et al., 2013). Os SVFs mais estudados

que tm se mostrado adequados para melhorar a eficincia teraputica incluem

os sistemas coloidais, tais como os nanoparticulados e as nanoemulses (SOLER

et al., 2011; STANISUASKI et al., 2003).

Disperses coloidais consistem em suspenses formadas por partculas ou

molculas, com pelo menos uma dimenso entre 1 a 1000 nm, dispersas numa

fase contnua e tm despertado muito interesse nas ltimas dcadas. Por

exemplo, as NEs so disperses coloidais transparentes ou translcidas,

termodinamicamente instveis e constitudas de dois lquidos imiscveis, sendo

um deles disperso na forma de pequenas gotculas (normalmente r < 100 nm) no


25

outro, cuja estabilizao ocorre por meio da combinao de tensoativos (CHIME;

KENECHUKWU; ATTAMA, 2014; FRYD; MASON, 2012; GUTIRREZ et al.,

2008; MCCLEMENTS, 2012). Ao contrrio das microemulses que so

termodinamicamente estveis, as NEs apresentam estabilidade cintica e

estabilidade dinmica de longo prazo, sem floculao aparente ou coalescncia

(TADROS et al., 2004). A estabilidade das NEs depende dos tensoativos no-

inicos e/ou polmeros que conferem repulso estrica entre os glbulos,

reduzindo a possibilidade de coalescncia, e de separao das fases (BABOOTA

et al., 2007; FERNANDEZ et al., 2004; MASON et al., 2006).

As NEs no se formam espontaneamente, mas necessitam de energia, a

partir de dispositivos mecnicos ou de caractersticas qumicas dos seus

componentes para a sua sntese. Em adio, a concentrao e a ordem de adio

das fases tensoativas, oleosas e aquosas influenciam diretamente no tipo de

sistema formado (FRYD; MASON, 2012). O filme formado por compostos

tensoativos que compem a interface dos sistemas emulsionados tem a funo

de diminuir a tenso interfacial entre os dois lquidos imiscveis, de modo a reduzir

as foras de atrao entre as suas prprias molculas, facilitar a fragmentao

dos glbulos maiores em menores e diminuir a tendncia natural dos glbulos de

agregarem-se ou de coalescer (FANUN, 2010; PENG et al., 2010). Os compostos

tensoativos e co-tensoativos so formados por molculas anfiflicas com

capacidade para modificar as propriedades fsico-qumicas da superfcie ou

interface dos componentes dos sistemas dos quais participam, propiciando a

combinao de grandes quantidades de dois lquidos imiscveis em uma nica

fase homognea (LAWRENCE; REES, 2012; TSAI et al., 2010).


26

A associao de tensoativos e co-tensoativos que apresentem

compatibilidade qumica e biolgica pode ser muito efetiva no aumento da

estabilidade e organizao de sistemas emulsionados (LAWRENCE; REES,

2012). Por exemplo, agentes tensoativos sintticos apresentam resultados

adequados de emulsificao e conferem maior estabilidade emulso. Entre os

tensoativos pertencentes a esta classe, os no inicos do grupo dos poloxmeros

e polioxietileno-sorbitanos (Spans e Tweens) tm se mostrado promissores, pois

levam formao de filmes interfaciais compactos, conferindo maior estabilidade

formulao (BRUXEL et al., 2012).

Os co-tensoativos so responsveis pela reduo adicional da tenso

interfacial necessria para a formao e estabilidade dos sistemas, alm de

promoverem fluidificao do filme interfacial formado pelo tensoativo, impedindo na

maioria das vezes a elevao da viscosidade do sistema obtido. Geralmente, usa-se

um lcool, embora os glicis, as aminas e cidos orgnicos possam desempenhar o

mesmo papel (LAWRENCE; REES, 2012). Os principais co-tensoativos utilizados

no preparo de emulses so os de massa molecular pequena ou mdia, que

apresentam uma cadeia contendo entre dois e dez carbonos. O lcool mais usado

o 1-butanol e os glicis tm se destacado por apresentarem menores restries

de compatibilidade e toxicolgicas (KREILGAARD, 2002).

Os triglicerdeos de cadeia mdia, principalmente o derivado cprico,

caprlico e glicerina, so aprovados para utilizao parenteral pelo Food and Drug

Administration (FDA) e preferencialmente utilizados em NEs para veiculao de

frmacos por serem 100 vezes mais solveis em gua do que os triglicerdeos de

cadeia longa (BENITA; LEVY, 1993).


27

As NEs so classificadas quanto posio do componente da fase

dispersa ou dispersante. O tipo de sistema formado depender da curvatura

realizada pelo filme interfacial dos compostos tensoativos e co-tensoativos, onde

a camada de tensoativo solvatar at certo ponto entre a fase aquosa (A) e a

oleosa (O), e adotar a configurao que resulte no balano das energias de

interao coesivas das molculas de tensoativo com o leo e com a gua

(PODLOGAR et al., 2004). Quando a fora de solvatao for maior para a fase

oleosa, o filme de tensoativo se curvar em direo fase aquosa formando

sistemas do tipo gua em leo (A/O), conforme ilustrao da Figura 1A. Caso

contrrio, quando a fora de solvatao for maior para a fase aquosa, o filme se

curvar na direo da fase oleosa formando sistemas do tipo leo em gua (O/A),

conforme ilustrao da Figura 1C; enquanto que, em uma situao intermediria e

transitria (Figura 1B) a interface assumir uma configurao bicontnua

(CONSTANTINIDES; YIV, 1995; FERNANDEZ et al., 2004).

Figura 1. Ilustrao das estruturas mais comuns de sistemas nanoemulsionados:


A) gua em leo (A/O); B) Bicontnua; e C) leo em gua (O/A). Fonte: Arquivo
pessoal, Adaptado de (LAWRENCE; REES, 2012).
28

Neste contexto, visando obter nanoemules do tipo leo em gua com alta

estabilidade e compatibilidade para veiculao de interferon gamma, foram

empregados como tensoativos o Polissorbato 80 (Tween 80) e o Oleato de

sorbitano (Span 80), co-tensoativos 1-butanol ou proprilenoglicol e como fase

oleosa o triglicrides de cido cprico/caprlico, cujas estruturas moleculares so

apresentadas na Figura 2. Em A) Polissorbato 80, B) Oleato de sorbitano, C) 1-

butanol, D) Propilenoglicol e E) triglicrides de cido cprico/caprlico.

Em comparao s formulaes convencionais, as nanoestruturas

polimricas, ao serem empregadas para a veiculao de frmacos, podem

aumentar a solubilidade dos componentes, reduzir a dose teraputica e melhorar

a absoro dos componentes ativos (WU; ZHANG; WATANABE, 2011). Estes

sistemas podem ser utilizados para administrao parenteral, pois so estveis,

no-txicos, no trombognicos, ou imunognicos, no ativam diretamente os

neutrfilos e no so detectados rapidamente pelo sistema reticuloendotelial,

podendo permanecer mais tempo em circulao (FARAJI; WIPF, 2009;

KREUTER, 1996; SOLER et al., 2007).

As partculas e micelas nanoestruturadas diferem entre si segundo a

composio e organizao estrutural (Figura 3). As nanocpsulas so

constitudas por um invlucro polimrico disposto ao redor de um ncleo aquoso

ou oleoso, no qual o frmaco dissolvido e/ou adsorvido parede polimrica. Por

outro lado, as nanoesferas, que no apresentam leo em sua composio, so

formadas por uma matriz polimrica, onde o frmaco pode ficar retido ou

adsorvido (KUMARI; YADAV; YADAV, 2010; STANISUASKI et al., 2003; WU;

ZHANG; WATANABE, 2011).


29

A)

B)

C)

D)

E)

Figura 2. Estruturas molecularares dos componentes escolhidos para a sntese


das nanoemulses A) Polissorbato 80, B) Oleato de sorbitano, C) 1-butanol, D)
Propilenoglicol e E) triglicrides de cido cprico/caprlico.
30

As micelas, so chamadas de sistemas autoestruturados ou self-

assemblies, so partculas coloidais esfricas com um ncleo hidrofbico e o

exterior hidroflico, podendo ser caracterizadas como estruturas de copolmeros

em bloco montadas sobre um ncleo contendo o frmaco (BAWARSKI et al.,

2008; MISHRA; PATEL; TIWARI, 2010).

Figura 3. Ilustrao de nanoestruturas na forma de micela, nanoesfera e


nanocpsula, conforme indicado. Fonte: Arquivo pessoal, adaptado de (NAMBAM;
PHILIP, 2012; STANISUASKI et al., 2003).

Existem vrios mtodos empregados para a preparao de nanoestruturas

polimricas, os quais podem ser de uma forma geral, baseados na polimerizao

in situ de monmeros dispersos, ou na precipitao de polmeros pr-formados

(ANTON; BENOIT; SAULNIER, 2008; NAMBAM; PHILIP, 2012).

Independentemente do mtodo de preparao as estruturas so dispersas para

obteno de suspenses coloidais aquosas. Entretanto, durante o tempo de

armazenamento pode ocorrer agregao das partculas no meio, resultando na

formao de precipitados. Alm disso, podem ocorrer problemas de estabilidade

qumica do polmero ou das demais matrias-primas, incluindo o frmaco

(SANCHEZ et al., 2003; ZHOU et al., 2008).


31

Algumas caractersticas das disperses causam dificuldades tcnicas com

relao estabilidade fsico-qumica, principalmente quando esto interagindo

com uma molcula ativa. Quando se desenvolve estes sistemas necessrio

avaliar o tamanho mdio de partcula, distribuio de massa molecular, o

potencial zeta, o pH, a interao polmero-molculas ativas, a concentrao do

frmaco nas partculas e a estabilidade do coloide durante um perodo de tempo

adequado (SOLER; PATERNO, 2015; STANISUASKI et al., 2003).

Micelas polimricas base de copolmeros tm sido investigadas para a

veiculao de frmacos, tais como anti inflamatrios, analgsicos, anestsicos

locais e protenas (YAPAR; INAL, 2012). Os copolmeros em soluo podem

formar micelas de tamanho nanomtrico, dependendo da temperatura e da

concentrao micelar crtica (SARAF et al., 2013). Por exemplo, os poloxmeros

(Pluronics) so tensoativos no-inicos que tm sido muito empregados na forma

de micelas nanomtricas (BASAK; BANDYOPADHYAY, 2013). O Pluronic F127,

um tipo de copolmero tribloco do tipo ABA que consiste em unidades de

Poli(xido de etileno) - PEO (A = 70%) e unidades de Poli(xido de propileno)

PPO (B = 30%) que apresenta baixa toxicidade (Figura 4).

Figura 4. Estrutura molecular do copolmero Pluronic F-127.


32

As propriedades deste polmero dependem da temperatura, e podem ser

exploradas para o desenvolvimento de novos sistemas de veiculao de frmacos

(NAMBAM; PHILIP, 2012; YAPAR; INAL, 2012).

1.1.2 Interferon gamma (IFN-)

Os interferons so citocinas que possuem papel fundamental em

mecanismos de proteo contra vrus, microorganismos e na regulao celular.

Atuam como antivirais, esto envolvidos em efeitos imunomoduladores, e

apresentam participao na citotoxicidade e no controle do crescimento celular

(DUNN; KOEBEL; SCHREIBER, 2006; FARRAR; SCHREIBER, 1993). Os IFNs

so classificados como: os de tipo I incluem o alfa e o beta, o de tipo II mais

conhecido IFN- e os de tipo III, so os IL-29, IL-28A e B.

O IFN-, ou fator de ativao de macrfagos, uma citocina pr-

inflamatria crucial na resistncia a infeces, que est envolvida com: (i) os

mecanismos de defesa; (ii) o estabelecimento de processos inflamatrios e

autoimunidade; (iii) o controle da atividade de fagcitos, bactericidas e tumoricidas

em moncitos/macrfagos; (iv) a expresso de antgenos de histocompatibilidade

(MHC) classe II; (v) a produo de mediadores derivados de macrfagos tais

como o TNF-alfa, IL-1, IL-12 e xido ntrico, e (vi) a regulao negativa da sntese

de mediadores antiinflamatrios tais como a IL-10 (HONRIO-FRANA et al.,

2013; SANCHEZ-MUOZ, 2008).

O IFN- produzido principalmente por clulas T helper ativadas e clulas

NK, e possui receptores em quase todas as clulas, nas quais capaz de ativar

diversas respostas imunolgicas. Nos tecidos, seus alvos so as clulas no


33

infectadas, macrfagos, clulas B em proliferao e as clulas T CD4+.

Considera-se que esta citocina regule a expresso de diversos genes

relacionados com a produo de protenas envolvidas na criao de barreiras

efetivas contra os patgenos (WILLIAMS; JURKOVICH; MAIER, 1993). Em

adio, sabe-se que o IFN- o principal ativador de macrfagos, o que acentua

sua ao microbicida mediante a estimulao da sntese de intermedirios

reativos de oxignio e do xido ntrico como mecanismo de destruio de

patgenos (FARRAR; SCHREIBER, 1993). Neste estudo, o IFN- foi incorporado

a nanosistemas.

O IFN- uma molcula de 17 kD que, na sua forma bioativa existe como

um homodmero firmemente associado por numerosas interaes, principalmente

hidrofbicos inter helicoidais. O IFN- possui um ponto isoeltrico ~ 10, no

contm ligaes dissulfeto, e tem um resduo de triptofano na posio 36 (Figura

5). Alm disso, o IFN- humano uma protena -helicoidal contendo seis hlices

e nenhuma estrutura -folha (VAN SLOOTEN et al., 2000).

Figura 5. Esquema da estrutura cristalina do IFN-.


Adaptado de: https://arginine.chem.cornell.edu/Structures/IFNcomplex.html.
34

1.2 Justificativa

As disperses coloidais se mostram promissoras para a preparao de

nanosistemas no txicos com potenciais aplicaes biolgicas. A utilizao

dessas disperses como sistemas de transporte de frmacos e, ao mesmo tempo,

como adjuvantes na promoo da imunomodulao, representam uma nova

alternativa para os tratamentos imunolgicos de processos inflamatrios, alergias,

infeces, cncer e outras doenas (CHRISTIAN; HUNTER, 2013; SMITH;

SIMON; BAKER, 2013).

A imunomodulao um procedimento que interfere nas funes do

organismo, estimulando ou inibindo o sistema imunolgico, e tem sido alvo de

investigaes visando diferentes terapias. Dentre os agentes imunomodulares

que podem influenciar a imunidade inata e adaptativa, destaca-se o IFN- que tem

sido empregado como agente imunoterpico. Por exemplo, trabalhos

desenvolvidos mostraram que a liberao de citocinas inflamatrias com IFN-

pode ocorrer em reaes cutneas como vasculites e exantemas, requerendo,

portanto, maior investigao para que sua aplicao seja viabilizada (BILLIAU;

MATTHYS, 2009).

O grupo de pesquisa do qual participo, realizou pesquisas cujos resultados

mostraram que o IFN- em doses na faixa de 100 ng.mL-1, quando administrado

diludo em soluo tampo, estimulou a atividade funcional de clulas

mononucleares quando incubadas com bactrias (FAGUNDES et al., 2013), e,

mais recente, para o caso de protozorios (MORAES et al., 2015).

Neste estudo, o IFN- ser veiculado por meio de nanocarreadores,

formados por sistemas coloidais, tais como nanoemulses e micelas polimricas


35

de pluronic F127. Os nanosistemas incorporados com IFN- tm potencial para

reduzir os efeitos adversos e a dose administrada, quando comparados

administrao convencional; modular as clulas sanguneas e promover uma

imunomodulao mais eficaz para o tratamento de doenas infecciosas e

cancergenas, quando comparado com a aplicao de sistemas em escala

macroscpica.

1.3 Objetivos

Geral: Preparao e caracterizao de diferentes sistemas coloidais

formados por nanoemulses ou micelas nanoestruturadas para veiculao de

Interferon gamma visando sua utilizao como agente imunomodulador.

Especficos:

(i) Desenvolvimento de dois tipos de nanoemulses, sendo a primeira

base de gua destilada, triglicrides de cido cprico-caprlico, oletado de

sorbitano, polisorbato 80 e propilenoglicol, enquanto que no procedimento

empregado para a segunda NE, o 1-butanol substitui o propilenoglicol empregado

na primeira;

(ii) Seleo de nanoemulses estveis por meio de diagramas

pseudoternrios;

(iii) Preparao de disperses coloidais do copolmero Pluronic F127 na

forma de micelas nanoestruturadas;

(iv) Caracterizao fsico-qumica das disperses coloidais formadas pelos

dois tipos de nanoemulses e de micelas nanoestruturadas sintetizadas;

(v) Incorporao do IFN- em cada um dos sistemas coloidais preparados;


36

(vi) Estudo da estabilidade das nanoemulses e micelas nanoestruturadas,

com ou sem a incorporao de IFN-;

(vii) Avaliao da viabilidade celular relativa aos sistemas desenvolvidos;

(viii) Avaliao da modulao da atividade funcional de fagcitos do sangue

perifrico humano por meio dos sistemas de nanoemulses ou de micelas

nanopartculadas contendo IFN-;

(ix) Avaliao da atividade funcional de clulas de cncer de mama

humano por meio dos sistemas de nanoemulses ou de micelas nanopartculadas

contendo IFN-;

(x) Avaliao da atividade funcional dos fagcitos sanguneos em clulas

tumorais quando incubados com os sistemas nanoestruturados contendo IFN-

desenvolvidos;

Para atingir os objetivos propostos foram realizados os experimentos

delineados no esquema apresentado na Figura 6.

Este trabalho est organizado da seguinte forma: o Captulo 2 discute as

tcnicas de caracterizao; o Captulo 3 apresenta os procedimentos utilizados no

desenvolvimento dos nanocarreadores; o Captulo 4 mostra os detalhes dos

procedimentos experimentais relacionados sntese dos sistemas, enquanto os

relativos aos ensaios biolgicos esto no Captulo 5; os resultados e as

discusses so apresentados nos Captulos 6 a 10, e no Captulo 11, as

concluses e as perspectivas. Em anexo o trabalho publicado sobre parte dos

resultados obtidos.
37

Figura 6. Esquema dos experimentos que foram realizados.


38

CAPTULO 2
39

2 TCNICAS DE CARACTERIZAO

O desenvolvimento de disperses coloidais estveis requer a determinao

dos parmetros fsicos para o monitoramento da qualidade dos sistemas que

esto sendo preparados. Neste trabalho, os parmetros fsico-qumicos dos

sistemas coloidais foram obtidos visando adequ-los para veicularem o IFN-.

Dentre as tcnicas que foram utilizadas neste trabalho, esto a de reologia, o

espalhamento dinmico de luz (EDL), e a dosagem via ciometria de fluxo, que

sero descritas a seguir e esto ilustradas na Figura 7.

Figura 7. Ilustrao das tcnicas e das etapas empregadas para caracterizao


das NEs e MNPs desenvolvidas. (Fonte: Arquivo pessoal).
40

2.1 Reologia

A reologia estuda o comportamento deformacional e o fluxo de matria de

um determinado corpo sob influncia de uma tenso, em determinadas condies

termodinmicas, e ao longo de um intervalo de tempo (SCHRAMM, 2000). A

reologia tem sido um dos mtodos aplicados para caracterizao de sistemas

micro e nano estruturados, pois o comportamento de um fluido est diretamente

relacionado com o tipo e o grau de organizao do sistema (PESSOA et al., 2014;

RIBEIRO et al., 2015). Os ensaios reolgicos permitem o estudo das

propriedades de escoamento e deformao de um corpo, este por sua vez pode

ser lquido, slido ou um gs. A maioria dos lquidos apresenta um

comportamento reolgico com perfil de fluxo intermedirio entre os lquidos e os

slidos, podendo ser denominados de viscoeslsticos (ANSEL; POPOVICH;

ALLEN JR, 2007).

A viscosidade a propriedade fsica de um lquido apresentar resistncia

ao fluxo induzido pelo cisalhamento (SCHRAMM, 2000). Quanto maior for a

viscosidade, menor ser a velocidade com que o fluido se movimenta (MARTIN;

SINKO; SINGH, 2011). Newton descreveu o comportamento de fluxo de um

lquido ideal, com base na viscosidade ( ), na tenso de cisalhamento () e na

taxa () de cisalhamento (SCHRAMM, 2000), por meio da equao: = . .

A dependncia da tenso de cisalhamento com a taxa de cisalhamento tpica, que

define o comportamento de fluxo de um lquido e a curva da viscosidade

correspondente, so dadas em funo da taxa de cisalhamento.

O fluxo Newtoniano apresenta uma viscosidade constante, independente

da fora aplicada para uma dada temperatura. Quando o comportamento de um


41

lquido ideal, em determinadas condies de tenso ou taxa de cisalhamento

linear ele denominado fluido Newtonianos (RIBEIRO et al., 2015;

SUBRAMANIAN et al., 2005). Sistemas nanomtricos emulsionados geralmente

apresentam comportamento de fluidos Newtonianos e sua viscosidade

comparada de lquidos ideais, at mesmo em elevadas concentraes de

gotculas, provavelmente devido coalescncia reversvel (MAHDI et al., 2011).

A correlao entre tenso de cisalhamento e taxa de cisalhamento que

define um fluido Newtoniano mostrada na Figura 8, enquanto a curva de

viscosidade correspondente pode ser observada na Figura 8B.

Figura 8. Curva de fluxo (A) e de viscosidade (B) de um lquido Newtoniano.


Fonte: Arquivo pessoal, adaptado de (SCHRAMM, 2000).

Os fluidos que no apresentam linearidade de fluxo, no-Newtonianos, se

caracterizam por apresentar alteraes da viscosidade com o aumento da taxa de

cisalhamento, e se subdividem em trs categorias: lquido pseudoplstico, liquido

dilatante e liquido plstico (de Bingham) ou pseudoplastico com limite de

escoamento (MARTIN; SINKO; SINGH, 2011; SCHRAMM, 2000).


42

Os lquidos pseudoplsticos apresentam diminuio drstica da

viscosidade quando a taxa de cisalhamento aumenta. Por outro lado os lquidos

dilatantes so fluidos nos quais a viscosidade aumenta com a taxa de

cisalhamento (SCHRAMM, 2000). Os lquidos plsticos se comportam como um

slido em condies estticas ou de repouso e aps aplicao de uma certa

tenso de deformao comeam a fluir, e a partir deste ponto podem apresentar

comportamento newtoniano, pseudoplstico ou dilatante. (MARTIN; SINKO;

SINGH, 2011; SCHRAMM, 2000). Os perfis das curvas de fluxo e viscosidade de

fluidos no-Newtonianos podem ser observados na Figura 9.

Plstico de Bingham
Tenso de Cisalhamento (

Pseudoplstico

Dilatante

Taxa de Cisalhamento ( )

Plstico de Bingham
Viscosidade(

Pseudoplstico

Dilatante

Taxa de Cisalhamento ( )

Figura 9. Exemplos de curvas de fluxos de lquidos No-Newtonianos. As curvas


em preto se referem a plstico de Bingham; em azul a pseudoplstico e em
vermleho a dilatante. Fonte: Arquivo pessoal, adaptado de (SCHRAMM, 2000).
43

Quando o sistema apresenta comportamento com caractersticas de slido

aps o aumento da deformao, a estrutura destes sistemas viscoelsticos

complexos pode ser obtida por meio de anlises reolgicas a partir da aplicao

de um teste de solicitao oscilatria. Neste tipo de ensaio, a tenso de

cisalhamento varia como uma frequncia senoidal e a relao entre a tenso de

cisalhamento aplicada e a deformao resultante fornece informaes sobre os

tipos de resposta (elstica ou viscosa) do sistema. A partir da razo destas duas

grandezas, obtm-se o mdulo elstico complexo G*, dado por (SCHRAMM,

2000).

G* = G / iG (1)

Onde G o mdulo de armazenagem, i = -1 (nivelamento numrico

Gaussiano) e G o mdulo de perda.

No ensaio oscilatrio de corte impe-se uma deformao peridica

sinusoidal de baixa amplitude (a), dada por:

(t) = asent (2)

Onde a deformao, a a amplitude da deformao, sen corresponde a


uma velocdade angular e t o tempo.

E observa-se a resposta em funo da tenso de cisalhamento:

(t) = asen(t+) (3)

Onde a tenso, a a amplitude da tenso, sen corresponde a uma

velocdade angular, t o tempo e o ngulo de fase.


44

Quando se considera que as componentes da tenso esto defasadas de

90 ou em fase, em relao deformao imposta, definem-se duas quantidades

proporcionais viscosidade e elasticidade dos fluidos, respectivamente. Assim,

o mdulo de elasticidade (G):

G = a /acos (4)

Onde G o mdulo de armazenagem, a a amplitude da tenso e a a

amplitude da deformao e cos corresponde ao ngulo de fase.

Se refere energia de deformao armazenada reversivelmente, enquanto

que o mdulo de viscosidade (G):

G = a /asen (5)

Onde G o mdulo de perda, a a amplitude da tenso e a a amplitude da


deformao e sen corresponde ao ngulo de fase.

Representa a energia cedida irreversivelemente pela amostra de fluido ao

exterior, constituindo assim uma caracterstica do comportamento viscoso.

O fator de perda tan definido como o quociente entre os dois mdulos:

tan = G / G (6)

Onde G o mdulo de perda e G o mdulo de armazenagem.

Em resumo, a componente real do mdulo elstico, G, denominada de

mdulo de armazenagem, porque representa a energia armazenada durante a

deformao, enquanto a parte imaginria do mdulo, G, se refere ao elemento

viscoso que no pode armazenar energia, porque a tenso aplicada dissipada

na forma de deformao irreversvel (OSTERHOLD, 2000; SHAHRIVAR;


45

VICENTE, 2014). Portanto possvel avaliar a evoluo temporal dos mdulos de

armazenagem (G) e perda (G) em funo da freqncia da tenso de

cisalhamento. Quando se observa a ausncia do termo G e a predominncia de

G as amostras comportam-se praticamente como um sistema lquido viscoso.

Esse comportamento caracterstico de solues lquidas uma vez que G e G

apresentam uma dependncia linear com a freqncia. Por outro lado, quando G

est presente, mas com valores bem inferiores a G, a amostra comporta-se

como um lquido essencialmente viscoso constitudo de uma rede fracamente

estruturada apresentando propriedades viscoelsticas (SCHRAMM, 2000;

SHAHRIVAR; VICENTE, 2014). Quando o nmero de interaes elsticas

aumenta, fazendo com que os valores de G sejam maiores do que os de G, o

sistema caracteriza-se como slido com caracterstica predominantemente

elstica (FORMARIZ et al., 2006). difcil quantificar a viscosidade e a

elasticidade a baixas freqncias e determinar o comportamento reolgico destas

formulaes. Porm, a anlise do ngulo de defasagem, (tan) dado pela razo

entre G e G, possibilita quantificar a viscoelasticidade do sistema

(OSTERHOLD, 2000). Quando tan maior que 1, tem-se G> G e o material tem

um comportamento semelhante a um lquido viscoso e quando tan < 1, G < G e

o comportamento de um slido elstico (XU; KOELLING, 2005).

Neste trabalho todos os sistemas foram avaliados quanto aos parmetros

de fluxo, rea de histerese e viscosidade temperatura de 25C ou em funo da

temperatura. As disperses coloidais que apresentaram caractersticas elsticas

elevadas foram avaliadas quanto viscoelasticidade em funo da frequncia.

Estas anlises foram realizadas empregando-se o equipamento Modular Compact

Rheometer - MCR 102 (Anton Paar).


46

2.2 Espalhamento dinmico de luz (EDL)

A tcnica de espalhamento dinmico de luz, do ingls Dynamic light

scattering (DLS), leva em conta o movimento browniano dos aglomerados e o

relaciona com o tamanho dos mesmos, visto que os agregados sob incidncia de

luz so sistemas que possuem movimentos de rotao, translao e vibrao. A

luz espalhada no detector encontra-se em constante mudana, variando com o

tempo (AGIMELEN et al., 2015).

No procedimento experimental de espalhamento de luz, um feixe de luz

monocromtico incide na amostra sendo espalhada em vrias direes, um

detector ir coletar a luz espalhada em um ngulo , considerando como

referncia o feixe incidente (WASHINHGTON, 1992). A tcnica permite obter o

dimetro hidrodinmico (DH) dos agregados que compem o coloide, o qual leva

em conta a presena da cobertura na sua superfcie, bem como a interao desta

com o meio. As medidas foram obtidas empregando-se o equipamento Zetasizer

Nano Z90 (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido), com excitao em

632.8 nm.

2.3 Potencial Zeta

O potencial zeta () representa o potencial no plano de cisalhamento

resultante da interao das cargas das micro ou nanopartculas com as do meio.

A carga superficial das partculas gera uma bicamada eltrica devido

distribuio dos contra-ons ao redor da partcula. Esta bicamada modelada

considerando-se duas partes: a interna onde os contra-ons encontram-se

fortemente ligados s partculas e a externa onde ocorre uma difuso dos


47

mesmos. Com o movimento dessas partculas, os contra-ons da camada interna

se deslocam juntamente com a partcula, entretanto o mesmo deslocamento no

ocorre com as cargas da camada difusa. O potencial a medida do potencial

que existe entre as duas partes da bicamada (HONARY; ZAHIR, 2013).

A determinao do potencial feita atravs dos efeitos eletrocinticos

provocados pela interao entre a carga superficial das partculas e um campo

eltrico aplicado ao meio, da mesma forma que acontece na eletroforese onde, as

partculas com carga tendem a se mover em direo ao eletrodo de carga oposta,

entretanto, as foras viscosas do meio se opem a esse movimento. Quando o

equilbrio entre essas foras atingido, a velocidade das partculas constante.

Esta velocidade chamada de mobilidade eletrofortica (UE) e relacionada com

o potencial conforme a equao de Henry (EHLERS; HEINMKI; YLIRUUSI,

2012). O potencial , reflete a estabilidade de um coloide, e para que este seja

considerado estvel, o valor absoluto do potencial deve ser maior ou igual 30

mV (PERCORA, 1985). Esta medida foi realizada no mesmo equipamento

empregado para a tcnica EDL.

2.4 Citometria de Fluxo

O citmetro de fluxo muito empregado como ferramenta de anlise

laboratorial de clulas sanguneas e vegetais, culturas microbianas (TIDWELL et

al., 2015), e tambm para a dosagem de protenas (SIMARD; CLOUTIER;

NRON, 2014), avaliao de partculas (SCHERER et al., 2011), bem como

outras aplicaes. O aparelho constitudo basicamente por 5 elementos: fonte

de radiao que pode ser uma lmpada de mercrio ou laser, uma cmara de
48

fluxo, filtros pticos para seleo de um intervalo de comprimento de onda

especfico, fotomultiplicadores para a deteco sensvel e unidade de

processamento dos sinais (SILVA et al., 2004).

A suspenso celular a ser analisada injetada e atravessa uma cmara

onde ocorre a passagem clula por clula. A passagem individual das clulas

obtida a partir do fluxo hidrodinmico da amostra, sendo esta injetada juntamente

com a soluo salina que tambm atravessa a cmara. As modificaes ocorridas

no feixe de luz devido presena das clulas so ento detectadas por sensores,

dessa forma a luz dispersa frontalmente coletada por um sistema ptico que

identifica as clulas pelo seu tamanho e granularidade interna (SILVA et al., 2004;

SIMARD; CLOUTIER; NRON, 2014). A figura 10 apresenta um esquema do

funcionamento do citmetro de fluxo e sistema de leitura.

Quando a luz dispersa lateralmente avalia-se a fluorescncia. Neste

caso, emprega-se os fluorocromos, que so marcadores de antgenos que

absorvem a luz e a emitem num comprimento de onda maior e especfico para

cada antgeno, sendo assim cada fluorocromo possui um padro espectral de

absoro e emisso distinto, de tal maneira que at trs cores de luz podem ser

opticamente separadas por filtros seletivos encontrados no interior dos citmetros

(BERTHO; SANTIAGO; COUTINHO, 2000). Em adio, a emisso de luz gerada

pelas clulas e anticorpos monoclonais associadas aos fluorocromos atingem

detectores especficos e so convertidos em impulsos eltricos. Estes impulsos

so convertidos em sinais digitais que fornecem resultados em diferentes formas

para anlise tais como histogramas, dot-plot, tabelas, entre outros (SILVA et al.,

2004; SIMARD; CLOUTIER; NRON, 2014; TIDWELL et al., 2015).


49

A aquisio e anlise dos dados foram realizadas no Citmetro de Fluxo

FACSCalibur (BD, San Jose, USA).

Figura 10. Ilustrao dos componentes do citmetro de fluxo e do sistema de


leitura. Fonte: http://gic.casaccia.enea.it/images/Citometro.jpg.
50

CAPTULO 3
51

3 SNTESE DOS NANOCARREADORES

Neste captulos esto descritos os procedimentos experimentais

empregados na sntese dos nanocarreados, iniciando com a preparao dos

sistemas nanoemulsionados, e em seguida a sntese das disperses coloidais

formadas por micelas de pluronic, e a incorporao do interferon gamma.

3.1 Materiais

As formulaes foram preparadas com gua destilada, e os reagentes

triglicrides de cido cprico/caprlico - Polymol 812, EHL= 10,8 (Henrifarma),

Oletado de sorbitano - Span 80 (SP), EHL = 4,3 (Sigma), Polissorbato 80 -

Tween 80 (TW) - EHL = 15,0 (Sigma) e Propilenoglicol (Henrifarma) ou 1-

butanol (Vetec), copolmero Pluronic F127 (Sigma), e o Interferon Gamma

Humano (Sigma), foram utilizados sem modificaes.

3.2 Preparao dos sistemas nanoemulsionados

Os sistemas nanoemulsionados foram desenvolvidos por meio da tcnica

de ultra homogeneizao (DONS et al., 2012) com algumas adaptaes,

utilizando-se o equipamento Ultra-Turax (IKA). A avaliao das propores dos

componentes da formulao foi realizada por meio da construo de diagramas

pseudoternrios (CHIME; KENECHUKWU; ATTAMA, 2014). Dois sistemas NEs

foram desenvolvidos empregando-se os co-tensoativos, propilenoglicol (P) ou 1-

butanol (B).
52

A concentrao adequada dos tensoativos para o desenvolvimento dos

sistemas NEs foi determinada por meio do estudo do equilbrio hidrfilo lipfico

(EHL) requerido pela fase oleosa, que no caso o triglicrides de cido

cprico/caprlico - Polymol 812 (EHL igual a 10,8), com o objetivo de obter

sistemas de tensoativos com valores de EHL iguais ao da fase oleosa, o que

resulta numa maior estabilidade da emulso. Os co-tensoativos foram

empregados na razo de 10 % (m/m) da fase de tensoativo (RIBEIRO et al.,

2015), valor este, empregado para a construo dos diagramas.

As propores dos componentes das amostras foram definidas por meio da

construo de diagramas pseudoternrios utilizando-se o programa SigmaPlot

8.0, nos quais o vrtice superior representa 100 % (m/m) da mistura

tensoativo/co-tensoativos, o inferior direito 100 % (m/m) de fase oleosa e o inferior

esquerdo 100 % (m/m) de fase aquosa.

Para o desenvolvimento dos sistemas nanoemulsionados foram utilizadas

quantidades pr-estabelecidas dos componentes, onde a concentrao de cada

fase tensoativa, oleosa e aquosa, respectivamente, variou de 10 a 80 % (m/m),

conforme o diagrama de pontos pr-determinados, onde cada ponto representa

uma mistura preparada (Figura 11). Em seguida, cada uma das misturas, formada

por tensoativos, leo e gua, foi submetida ao processo de ultra homogeneizao

gradual partindo de 5.000 rpm.mim-1 at o mximo de 24.000 rpm.mim-1,

resultando em 36 amostras preparadas para cada um dos sistemas

desenvolvidos.

Em uma primeira etapa, cada um dos lotes com 36 amostras foi

classificado visualmente, aps permanecer 72 h armazenado a 25C e as

amostras correspondentes a cada um dos pontos rotuladas como nanoemulso


53

(NE) no caso dos sistemas translcidos, emulso gel (EG), emulso lquida (EL)

os sistemas opacos dependendo da consistncia, e como separao de fases

(SF) os heterogneos, de forma a confeccionar o diagrama de classificao dos

pontos (Figura 11). Em seguida, amostras foram preparadas para realizao das

titulaes aquosas de razes de massa de mistura de tensoativos/fase oleosa de

1:9 at 9:1 (m/m) sob agitao, com o objetivo de se obter as regies delimitantes

no diagrama, o que permitiu determinar as reas das diferentes regies e a

estabilidade. A titulao foi realizada com acrscimos de gua destilada em

quantidades de 0,05 mL a 0,1 mL at a separao de fases, sendo que durante o

processo as misturas passaram por agitao mecnica e manual. Aps a

homogeneizao de cada volume do titulante as formulaes foram classificadas

visualmente, seguindo o critrio mencionado. Posteriormente foram selecionadas

no diagrama de regies (Figura 11), as formulaes com caractersticas

translcidas. A ilustrao do sistema preparado O/A, bem como a imagem de uma

de NE selecionada se encontram na parte inferior da mesma figura.

A partir da obteno dos respectivos diagramas pseudoternrios, foi

possvel delimitar as regies de domnios e determinar a concentrao dos

componentes dos sistemas que se enquadram na regio corresponde de NE.

Nesta regio foram pr-selecionados pontos distribudos em retas que cortam

todo seguimento da regio translcida, de forma a selecionar amostras

representativas desta regio, as quais apresentam sistemas com caracterstica de

NEs. As formulaes selecionadas foram empregadas para preparar as amostras

com adio de interferon e posterior caracterizao.


54

Figura 11. Ilustrao do processo da sntese das NEs por meio do mtodo de
ultrahomogeneizao e definio das propores dos componentes empregando
diagramas pseudoternrios. Cada ponto se refere a uma amostra preparada. A
ilustrao do sistema preparado O/A, bem como a imagem de uma de NE
selecionada se encontram na parte inferior da Figura. (Fonte: Arquivo pessoal).
55

3.3 Preparao dos sistemas coloidais com micelas nanoestruturadas

Os sistemas coloidais contendo as micelas polimricas foram formulados

com o uso de tampo fosfato 7,4 (PBS) e do copolmero Pluronic F127 (F127) nas

concentraes de 10 mg.mL-1, 50 mg.mL-1 e 250 mg.mL-1, cujas amostras foram

denominadas F127-10, F127-50 e F127-250, respectivamente. As solues foram

preparadas e mantidas overnight a 5C para completa homogeneizao (Figura

12).

Figura 12. Ilustrao do processo da sntese das MNPs por meio do mtodo auto
estruturante. A imagem da direita se refere a uma das amostras preparadas.
(Fonte: Arquivo pessoal).

3.4 Preparao dos sistemas com a incorporao de IFN-

A soluo aquosa de IFN- foi adicionada em volume equivalente da fase

aquosa durante a preparao das nanoemulses e das micelas coloidais, sob

agitao, adicionando-se em seguida as fases de tensoativo e oleosa ou F127,

respectivamente. Cada sistema foi formulado de forma a obter uma disperso

final com concentrao de IFN- da ordem de 100 ng.mL-1.


56

As formulaes NEs aps a incorporao do IFN- foram denominadas

NEPIFN-, para as que contm propilenoglicol e NEBIFN- para as de 1-butanol.

As MNPs de Pluronic, aps a incorporao do IFN- foram denominadas F127-

10IFN-, F127-50IFN- e F127-250IFN-, em funo da concentrao de F127

empregada.

Neste estudo foram preparadas em mdia dez amostras de cada

formulao dos dois lotes de NEs, sendo que, no caso dos dois sistemas de

nanoemulses (NEP e NEB) com ou sem a incorporao de IFN-; as amostras

foram rotuladas de 1 a 9NEP e 1 a 9NEPIFN-; e 1 a 13NEB e 1 a 13NEBIFN-,

respectivamente. No total foram produzidas cerca de 160 e 230 amostras relativas

aos sistemas NEP e NEB, respectivamente. No caso dos carreadores formados

por micelas de F127, (MNPs) tambm foram preparadas 9 amostras, para cada

uma das trs concentraes do copolmero, bem como as correspondentes aps

a incorporao de IFN- (F127-10, F127-50, F127-250, F127-10IFN-, F127-

50IFN- e F127-250IFN-) totalizando cerca de 50 amostras.


57

CAPTULO 4
58

4 PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS EMPREGADOS NA


CARACTERIZAO E CONTROLE DE QUALIDADE DOS MATERIAIS
SINTETIZADOS

A preparao de sistemas nanoestruturados coloidais para veiculao de

frmacos requer que eles, alm das caractersticas necessrias para ancorar o

frmaco, apresentem estabilidade por certo perodo de tempo. Neste captulo, so

introduzidas as tcnicas e procedimentos que foram utilizados para o

desenvolvimento dos sistemas coloidais formados por nanoemulses e micelas

nanopartculadas, bem como as etapas do procedimento nas quais as tcnicas de

caracterizao foram utilizadas como ferramenta para otimizao do preparo e o

estudo da estabilidade.

4.1 Caracterizaes Reolgica

As curvas de fluxo e viscosidade foram obtidas com os parmetros

estabelecidos variando-se a tenso de cisalhamento () de 0 a 5 Pa para a curva

ascendente e de 5 a 0 Pa para a curva descendente. Estes ensaios foram

realizados em condies isotrmicas a 25C, com 75 leituras por anlise.

A partir dos dados da curva de fluxo, tenso de cisalhamento em funo da

taxa de cisalhamento, de cada amostra possvel determinar a rea de histerese,

que representa os nveis de diferena entre a curva ascendente e a descendente

do reograma. Valores obtidos para a rea de histerese entre 0 e 1 Pa.s indicam

fluxo newtoniano, enquanto que valores menores do que -1 Pa.s indicam fluxo

no-newtoniano com tixotropia do tipo reopxico e valores maiores que +1 Pa.s

indicam fluxo no-newtoniano com tixotropia do tipo pseudoplstico.


59

O comportamento da viscosidade em funo da temperatura foi obtido com

os parmetros estabelecidos, para o valor da tenso de cisalhamento () igual a 1

Pa, variando-se a temperatura de 5 0,1 a 45 0,1C, com taxa de aquecimento

de 1C.min-1. Os dados foram registrados a cada 1,0 0,1C totalizando 41

leituras por anlise.

Os ensaios de viscoelasticidade em funo da frequncia da tenso de

cisalhamento () foram realizados com uma amplitude de tenso oscilatria igual

a 0,5 Pa, variando-se a frequncia na faixa de 100 a 0.1Hz.

Os experimentos foram realizados depositando-se 600 L das formulaes

sobre a superfcie da placa de leitura. As leituras foram realizadas com controle

permanente do gap de medida com suporte TruGap em 0,099 mm, clula de

medida Toolmaster CP 50 e controle da temperatura com recurso T-Ready,

utilizando-se o Software Rheoplus V3.61. Os dados obtidos foram tratados

empregando o mesmo Software e as linhas internas dos grficos so apenas

linhas guias para facilitar a visualizao.

4.2 Caracterizao por espalhamento dinmico de luz

As anlises EDL das suspenses coloidais das formulaes preparadas

forneceram os dados do dimetro hidrodinmico do slido disperso, e o ndice de

polidispersividade. As nanoemulses foram preparadas a partir de uma diluio

10:1000 da formulao em gua destilada, enquanto a disperso coloidal micelar

foi utilizada sem diluies, sempre utilizando gua destilada como referncia. As

mesmas amostras foram utilizadas para obter os dados de potencial zeta.


60

4.3 Controles de qualidade e caracterizaes fsico-qumicas

Com a obteno de parmetros fsico-qumicos foi possvel testar a

adequao dos sistemas formulados, e realizar a caracterizao dos mesmos. Os

resultados para os parmetros de qualidade das formulaes foram obtidos 24 h

aps a preparao, e ao final dos ciclos de tratamentos, em amostras em

triplicatas.

Centrifugao: Quando os sistemas so centrifugados o estresse

gravitacional aumenta a coliso entre as partculas e altera o equilbrio dinmico,

sendo possvel obter informaes sobre a estabilidade dos sistemas formulados.

As alquotas foram centrifugadas a 384 x g durante 30 minutos, em centrfuga

comum mantida em ambiente a 25C e em centrfuga refrigerada a 5C. As

amostras que apresentaram pontos com heterogeneidade visual foram excludas.

Determinao do pH: As disperses tiveram o pH medido com o objetivo

de avaliar possveis decomposies. Foi utilizado o pHmetro (DEL Lab) aferido

com soluo padro de pH = 7 e pH = 4, por meio da insero do eletrodo

diretamente na amostra.

Determinao da condutividade eltrica: A condutividade eltrica foi

avaliada inserindo-se o eletrodo diretamente na amostra com o objetivo de

identificar o tipo de sistema (gua em leo, A/O, ou leo em gua, O/A) e possvel

tendncia inverso de fases. O equipamento utilizado foi um condutivmetro

(LIDA) calibrado com soluo de KCl 0,1 mol.L-1.


61

4.4 Estudos de Estabilidade

Os estudos de estabilidade preliminar e acelerada foram adaptados da

metodologia de (RIBEIRO et al., 2015).

Estabilidade Preliminar: Os sistemas foram divididos em 2 grupos, sendo

que, um dos quais foi aquecido a 40 1C e o outro resfriado a 5 1C. Os

sistemas passaram por ciclos alternados de 5 1C ou 40 1C por 24 h

completando os ciclos ao 14 dia. Aps os tratamentos foi possvel identificar os

sistemas homogneos.

Estabilidade Acelerada: Este estudo avaliou os sistemas selecionados

aps os tratamentos de estabilidade preliminares visando o desenvolvimento de

formulaes estveis. Os sistemas foram submetidos a condies extremas por

um perodo maior do que o do primeiro teste. Foram divididos em trs grupos e

submetidos a tratamentos trmicos com temperaturas de: 40 1C, 25 1C ou 5

1C, continuamente por um perodo de 90 dias com a mesma temperatura. As

formulaes foram submetidas s anlises fsico-qumicas, aferio dos perfis

reolgicos, do potencial zeta e do dimetro hidrodinmico a cada 45 dias. A

Figura 13 apresenta uma ilustrao das etapas e avaliaes realizadas nos

estudos de estabilidade.

Dosagem do IFN- nas formulaes: As concentraes de IFN- nas

formulaes durante o estudo de estabilidade acelerada foram determinadas por

Citmetria de fluxo por meio do kit Cytometric Bead Array (CBA BD) e

quantificadas por meio de curva padro.


62

Figura 13. Ilustrao das etapas e avaliaes realizadas nos estudos de


estabilidade utilizadas para o desenvolvimento das NEs e NPs.
63

CAPTULO 5
64

5 ENSAIOS BIOLGICOS

Neste captulo so descritos os procedimentos experimentais relativos aos

ensaios biolgicos realizados visando aplicao imunolgica.

5.1 Sujeitos e tamanho amostral

As amostras de sangue perifrico foram coletadas por puno venosa de

15 indivduos de ambos os sexos, na faixa etria compreendida entre 18 a 40

anos. Os participantes foram esclarecidos quanto pesquisa, a finalidade do

material biolgico e o sigilo das informaes, sendo que o material somente foi

coletado sob expresso consentimento e assinatura do Termo de Consentimento

Livre e Esclarecido (Apndice).

5.2 Obteno de fagcitos do sangue perifrico

Foi coletado um volume de 8 a 15 mL de sangue perifrico de cada doador

em tubos de coleta contendo anticoagulante cido etilenodiaminotetractico

(EDTA a 25 U.mL1). Em seguida foi realizada a separao das populaes

celulares por meio de gradiente de densidade com a adio de Ficoll-Paque

(Pharmacia), onde o sangue foi centrifugado durante 40 min a 160 x g

temperatura ambiente. O anel enriquecido de fagcitos MN foi reservado. As

clulas mononucleares foram lavadas duas vezes em PBS. A seguir foi realizada

a contagem em cmara de Neubauer, e as concentraes celulares foram

ajustadas para 2x106 clulas.mL-1 para anlises posteriores.


65

5.3 Cultura de clulas

Clulas de cncer de mama humano (MCF-7) foram adquiridas de

American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). As

monocamadas de clulas foram mantidas em culturas em frascos de 75 cm3 em

meio RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute) suplementado com 10% de

soro bovino fetal (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, EUA), penicilina (20 U.mL-1) e

estreptomicina (20 ug.mL-1) (Sigma-Aldrich Co.) a 37C em atmosfera hmida

contendo 5% CO2. As clulas foram sub-cultivadas a cada 5 2 dias.

5.4 Linhagem e Culturas de Escherichia coli Enteropatognica

A Escherichia coli enteropatognica (EPEC) sorotipo 0111:H- AL-, eae+,

eaf+, bfp+ foi utilizada nos experimentos realizados. A partir da cultura estoque,

foram feitos repiques em tubos contendo 8 mL de TSB (Trypic Soy Broth - Difco),

os quais foram incubados em estufa a 37C durante 18 horas. Aps o

crescimento, as bactrias foram lavadas duas vezes em soluo PBS e a

concentrao foi ajustada para 1x107 bactrias.mL-1, medida com

espectrofotmetro (540 nm, DO= 0,1), conforme foi descrito previamente

(HONORIO-FRANA et al., 1997).

5.5 Incubao dos fagcitos MN, das clulas MCF-7 e fagcitos


MN/clulas MCF-7 com as nanoestruturas desenvolvidas

As clulas MCF-7 foram previamente incubadas, dependendo do ensaio

especfico, com as nanoestruturas desenvolvidas e seus respectivos controles em

diferentes tempos. A concentrao final de IFN- foi de 100 ng.mL-1, de acordo


66

com protocolo previamente estabelecido (FAGUNDES et al., 2013; HONRIO-

FRANA et al., 2016; MORAES et al., 2015). Todos os experimentos foram

realizados com n = 5 amostras.

Para avaliao da viabilidade, os fagcitos MN foram incubados com as

formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN- durante perodos iguais a

zero, 0,5 e 24 horas de em banho-maria a 37C. Como controle dos

experimentos, os fagcitos MN foram incubados em PBS pelo mesmo perodo.

Para avaliao da liberao de nion superxido, atividade fagoctica e

bactericida, suspenses v/v de bactria e fagcitos MN foram incubadas

previamente com 50 L dos controles PBS, IFN-, 1NEP, 11NEB, F127-50 e com

as formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN- durante perodos iguais

a zero, 0,5 h 1,0 h e 2 h, sob agitao a 37C.

Para avaliao por citometria da viabilidade celular e da liberao

intracelular de clcio dos fagcitos MN, das clulas MCF-7 e fagcitos MN/clulas

MCF-7, 500 L da suspenso de fagcitos MN, clulas MCF-7 e fagcitos MN

com clulas MCF-7 v/v, foram tratados com 50 L dos controles PBS, IFN-,

1NEP, 11NEB, F127-50 e as formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-

50IFN-, e pr-incubados durante 24 horas a 37C em atmosfera mida contendo

5 % CO2. Em seguida, as suspenses foram submetidas tripsinao. Aps este

procedimento, as clulas foram centrifugadas duas vezes com PBS e avaliadas

empregando-se protocolos especficos que sero descritos a seguir.


67

5.6 Viabilidade celular

A viabilidade dos fagcitos do sangue perifrico humano foi avaliada por

meio da tcnica de alaranjado de acridina. O Alaranjado de acridina um corante

fluorocromo vital, metacromtico, que se liga ao DNA ou RNA celular. Quando

examinado sob um microscpio com luz ultravioleta, em contato com DNA de

cadeia dupla, emite cor verde, ortocromtica, e quando em contato com o DNA

desnaturado ou despolarizado, ou RNA de cadeia simples, na forma

metacromtica, emite cor alaranjado ou avermelhado.

Decorrido o tempo de incubao as amostras foram centrifugadas (10 min

a 160 x g). O sobrenadante foi desprezado e o boto celular pellet foi corado

com 200 l de alaranjado de acridina (concentrao 14,4 mg.mL -1).

Posteriormente as amostras foram lavadas 3 vezes em PBS sob centrifugao

(10 min a 160 x g). A seguir as lminas foram preparadas e analisadas por meio

de microscopia de fluorescncia (Nikon Eclipese E-200, Japan).

O ndice de viabilidade celular foi obtido por meio da contagem de 100

clulas, contabilizando-se as clulas vivas, as que possuam colorao verde, e

as clulas mortas, com colorao alaranjada.

5.7 Liberao de nion superxido

A liberao de nion superxido pelos fagcitos MN do sangue perifrico

humano foi realizada visando estudar a ativao celular, empregando-se o

cromgeno citocromo C (Sigma, 2 mg.mL-1). Na presena do nion superxido o

ferricitocromo C sofre oxidao transformando-se em ferrocitocromo C.


68

A leitura foi feita no espectrofotmetro com leitor de microplacas (TP-

Reader ThermoPlate) com filtro de 630 nm. A concentrao do nion superxido

foi calculada por meio da seguinte relao: Concentrao de O2- (nmol) =DO x

100 / 6,3.

5.8 Avaliao da fagocitose e da atividade bactericida

A atividade microbicida dos fagcitos MN do sangue perifrico humano foi

avaliada por meio da tcnica de alaranjado de acridina (Acros organics)

(FRANA et al., 2011a). Aps cada perodo de incubao a fagocitose foi

interrompida por meio da adio de PBS e a suspenso foi centrifugada por 10

min a 160 x g sob refrigerao a 4C. O "pellet" foi corado com 200 L de laranja

de acridina (concentrao 14,4 mg.mL-1) por 1 min e a seguir foi ressuspendido

em meio 199, centrifugado e lavado com PBS. A seguir as lminas foram

montadas e as clulas contadas.

5.9 Teste de Permeabilidade celular ao Iodeto de propdeo

O teste de permeabilidade foi realizado utilizando-se o ensaio de

fluorescncia de Iodeto de Propdeo (PI) adaptado por (HONRIO-FRANA et

al., 2016). Aps incubao, as clulas foram coradas com 10 L de PI (1 mg.mL-


1
), Triton X-100 (5,5%), e cido etilenodiaminotetractico (110 mM) e incubadas

durante 10 minutos temperatura ambiente. As clulas no coradas foram

usadas como controle. A fluorescncia das clulas foi analisada por citometria de

fluxo. A percentagem de clulas viveis foi inversamente proporcional

intensidade de fluorescncia mdia geomtrica de PI.


69

5.10 Liberao de clcio intracelular

Para avaliar a liberao de Ca2+ intracelular foi utilizado o cromgeno

Fluo3-acetoximetil (Sigma). A suspenso de clulas foi centrifugada duas vezes

(160 x g, 10 min. a 4C) e ressuspendida em PBS contendo BSA (5mg.mL -1).

Aps a incubao as clulas foram lavadas 2 vezes em PBS contendo BSA (5

mg.mL-1; a 160 x g, por 10 min a 4C).

A leitura foi realizada por citmetria de Fluxo. O Fluo-3 foi detectado

empregando-se o filtro 530/30 nm para Ca2+ intracelular. A proporo de liberao

de Ca2+ foi expressa por meio dos valores mdios (%) de intensidade de

fluorescncia de Fluo-3.

5.11 Aspectos legais

Este estudo como um todo, mas principalmente as avaliaes biolgicas,

foram viabilizados por meio de uma parceria entre a Universidade de Braslia e a

Universidade Federal de Mato Grosso por meio da associao das linhas de

pesquisa em sntese e caracterizao de complexos nanoestruturados e a de

bioensaios e processos biolgicos. O Projeto (Parecer favorvel 1.018.274 / 2015)

foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa da Universidade Federal do Mato

Grosso. Os voluntrios foram esclarecidos sobre os procedimentos da pesquisa e

depois assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido, de acordo com os

moldes da lei 466/12 que regulamenta a pesquisa em seres humanos.


70

5.12 Anlises estatsticas

As anlises estatsticas foram realizadas empregando-se o programa

BioEstat 5.0. Diferenas estatsticas significantes nas curvas de fluxo, ndice de

viscosidade e parmetros fsico-qumicos da estabilidade acelerada e para os

ensaios biolgicos, foram avaliados por meio de anlise de varincia (ANOVA)

seguida de comparaes mltiplas por meio do teste de Tukey. A significncia

estatstica foi considerada para valores de p menores que 0,05.


71

CAPTULO 6
72

6 RESULTADOS: NANOEMULSES

Neste captulo so apresentados os resultados da caracterizao e

otimizao obtidos no desenvolvimento dos dois sistemas nanoemulsionados,

base de gua destilada, triglicrides de cido cprico-caprlico, oletado de

sorbitano, polisorbato 80 e como co-tensoativos o propilenoglicol (P) ou o 1-

butanol (B). Inicialmente ser descrito o roteiro empregado para a determinao

da proporo mais adequada da fase tensoativa, seguido dos diagramas de fase

pseudoternrios e da caracterizao reolgica e por espalhamento dinmico de

luz das formulaes pr-selecionadas contendo ou no IFN-.

6.1 Determinao da mistura de tensoativos

As concentraes dos co-tensoativos P e B para as a sntese de cada uma

das nanoemulses foram definidas como 10 % e as porcentagens dos tensoativos

SP e TW foram calculadas de forma a atingir o EHL requerido pelo triglicerdeo de

cido cprico/caprlico (Tabela 1). A frao da mistura de tensoativos/co-

tensoativo na frao de 3,5:5,5:1,0 resultou no EHL requerido pela fase oleosa.

Tabela 1. Valores calculados de percentagens e EHL obtidos para a mistura de


tensoativos e co-tensoativos.

Mistura de
SP (%) TW (%) P (%) B (%) EHLr
Tensoativos

SP/TW/P 35 55 10 - 10,80

SP/TW/B 35 55 - 10 10,80
Onde: EHLr = EHL Resultante da mistura de tensoativos.
73

6.2 Preparao dos sistemas nanoemulsionados

Os diagramas de fase pseudoternrios para a classificao dos pontos e

domnios de regio para o sistema SP/TW/P e SP/TW/B esto apresentados nas

Figura 14 e 15, respectivamente.

A mistura de tensoativos, independentemente do co-tensoativo, na

proporo 3,5:5,5:1,0 associado ao triglicerdeo de cido cprico/caprlico e

gua destilada em propores pr-estabelecidas pelo diagrama, resultou em 36

pontos com caractersticas de equilbrio divergentes. Observa-se nos diagramas

correspondestes que propores de tensoativo acima de 35 % para o sistema

SP/TW/P e de 45 % para o SP/TW/B promoveram pontos com equilbrio

termodinmico em virtude do predomnio de sistemas homogneos e translcidos

(Figuras 14a e 15a, respectivamente).

As Figuras 14b e 15b apresentam as delimitaes das regies de domnios

no diagrama pseudoternrio a partir do diagrama de pontos e das titulaes. Os

pontos do sistema SP/TW/P (NEP) de 1 a 9NEP e de 1 a 13NEB do SP/TW/B

(NEB) foram selecionados como domnios com caractersticas de NE para o

estudo das regies.

Analisando-se o comportamento das fases (Figuras 14b e 15b) observa-se

que o sistema SP/TW/B resultou em uma regio mais ampla de sistemas

nanoemulsionados quando comparado ao sistema SP/TW/P. O co-tensoativo B

promoveu a formao de NE at 20 % de fase aquosa, j o co-tensoativo P

limitou a formao a 15 %. Contudo para ambos os sistemas, assim como nos

diagramas de pontos, os domnios de regio abaixo de 40 % de tensoativos

indicaram instabilidade e separao de fases.


74

(a)
(3,5 : 5,5 : 1,0)
SP / TW / P
0
100
10
90
20
8-NE 80
30
7-EG 15-NE 70
40
6-EG 14-EG 21-NE 60
50
5-EG 13-EG 20-EG 26-NE 50
60
4-EG 12-EG 19-EG 25-EG 30-NE 40
70
3-SF 11-SF 18-EG 24-EG 29-SF 33-SF 30
80
2-SF 10-SF 17-EL 23-EL 28-EG 32-SF 35-SF 20
90
1-SF 9-SF 16-EL 22-EL 27-EL 31-EL 34-EG 36-EL 10
100
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
gua Destilada (%) Triglicrides de cido cprico/caprlico (%)

(b)
(3,5 : 5,5 : 1,0)
SP / TW / P
0
100
10
90
20
NE
1NEP 80
30 2NEP
3NEP 70
40 4NEP
5NEP 60
50 6NEP
EG 7NEP 50
60 8NEP
9NEP 40
70
30
SF
80 SF 20
90 EL
10
100
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
gua Destilada (%) Triglicrides de cido cprico/caprlico (%)

Figura 14. Diagramas pseudoternrios de classificao dos pontos (a) e de


domnios de regio com as nanoemulses selecionadas (b) do sistema SP/TW/P.
*Nanoemulso (NE), Emulso gel (EG), Emulso lquida (EL), Separao de Fases (SF).
75

(a)
(3,5 : 5,5 : 1,0)
SP / TW / B
0
100
10
90
20
8-NE 80
30
7-NE 15-NE 70
40
6-SF 14-NE 21-NE 60
50
5-EG 13-EG 20-EG 26-NE 50
60
4-EG 12-SF 19-SF 25-SF 30-SF 40
70
3-SF 11-SF 18-EG 24-EG 29-SF 33-SF 30
80
2-SF 10-SF 17-SF 23-EL 28-EL 32-SF 35-SF 20
90
1-SF 9-SF 16-SF 22-SF 27-EL 31-SF 34-SF 36-SF 10
100
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
gua Destilada (%) Triglicrides de cido cprico/caprlico (%)

(b)
(3,5 : 5,5 : 1,0)
SP / TW / B
0
100
10
90
20
NE
1NEB 80
2;3NEB
30 4;5NEB 70
6;7NEB
40 8;9NEB 60
10;
11NEB
50 12;
13NEB 50
60
EG 40
70
30
80 EL 20
90
10
SF
100
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
gua Destilada (%) Triglicrides de cido cprico/caprlico (%)

Figura 15. Diagramas pseudoternrios de classificao dos pontos (a) e de


domnios de regio com as nanoemulses selecionadas (b) do sistema SP/TW/B.
*Nanoemulso (NE), Emulso gel (EG), Emulso lquida (EL), Separao de Fases (SF).
76

6.3 Caracterizao reolgica

6.3.1 Nanoemulses do sistema SP/TW/P (NEP)

As Figuras 16 e 17 mostram as curvas de fluxo e de viscosidade dos

pontos pr-selecionados para o estudo do sistema NEP. As reas de histerese

promovida pelos fluxos foram resumidas na Tabela 2 e as mdias de viscosidade

na Tabela 3.

As curvas de fluxo dos pontos relativos regio de nanoemulso (NEP)

apresentam incio na origem e comportamento linear ascendente e descendente,

exceto para os sistemas relativos s amostras 4, 6, 8 e 9NEP que apresentam

fluxo no linear. A avaliao da curva e da rea de histerese do fluxo indicou

predomnio de fluidos Newtonianos (Figura 16 e Tabela 2). As nanoemulses no-

Newtonianas foram eliminadas do estudo (4,6,8 e 9NEP).

5.00

4.50
Pa

4.00

3.50

3.00

2.50
Tenso
Shear de
Stress
Cisalhamento 2.00
(Pa)
1.50

1.00

0.50

0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 1/s 50
.
Taxa Rate
Shear de
Cisalhamento (1/s)

Figura 16. Curvas de fluxo obtidas das nanoemulses pr-selecionados do


sistema NEP (25C).
77

Tabela 2. Valores de rea de histerese e classificao do fluxo dos pontos pr-


selecionados do sistema NEP, obtidos a partir dos dados da Figura 16.

rea de Histerese
NE Classificao do Fluxo
(Pa/(sml))
1NEP + 0,01 Newtoniano
2NEP + 0,60 Newtoniano
3NEP + 0,31 Newtoniano
4NEP + 1,18 No-newtoniano: Tixotrpico Pseudoplstivo
5NEP + 0,21 Newtoniano
6NEP + 1,57 No-newtoniano: Tixotrpico Pseudoplstivo
7NEP + 0,64 Newtoniano
8NEP - 1,00 No-newtoniano: Tixotrpico Reopxico
9NEP + 22,62 No-newtoniano: Tixotrpico Pseudoplstivo

0.900
Pas
0.80

0.700

0.60

0.50

Viscosity
Viscosidade 0.40
(Pa.s)
0.30

0.20

0.10

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1/s
20 22
.
TaxaRate
Shear de
Cisalhamento (1/s)

Figura 17. Curvas de viscosidade obtidas das nanoemulses do sistema NEP


(25C).
78

Tabela 3. Valores de viscosidade e caractersticas do fluxo dos pontos do sistema


NEP, obtidos da Figura 17.

NE Viscosidade Mdia (Pa . s) Caracterstica


1NEP 0,5319 0,0032 Linear
2NEP 0,5813 0,0566 No linear
3NEP 0,3975 0,0029 Linear
5NEP 0,2979 0,0016 Linear
7NEP 0,2358 0,0019 Linear

Observa-se na Figura 17 e Tabela 3, que os valores da viscosidade so

similares para os sistemas relativos aos pontos referentes NEs Newtonianas, na

faixa entre 0,20 e 0,60 Pa.s, e no se alteraram com o aumento da taxa de

cisalhamento. No caso da nanoemulso 2NEP, a viscosidade se reduz com o

aumento da taxa de cisalhamento e, por isso foi descartada.

Os resultados das anlises da variao da viscosidade dos pontos pr-

selecionados para o estudo do sistema NEP em funo da programao e

controle de temperatura so mostrados na Figura 18. Observa-se que para as

NEs 1, 3 e 5NEP ocorre uma reduo gradual e homognea da viscosidade, cujos

valores variam pouco com a temperatura, o que um indicativo de que

apresentam boa estabilidade. A viscosidade do ponto 7NEP sofreu variaes nas

temperaturas de 5 a 25C, sendo um indicativo de menor resistncia a flutuaes

trmicas e foi descartada.


79

2
10

Pas

1
10

Viscosity
Viscosidade
(Pa.s)
0
10

-1
10
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 C
45.0 50.0
Temperature
Temperatura T
(C)

Figura 18. Curva de viscosidade de nanoemulses do sistema NEP em funo da


temperatura (5 a 45C).

As NEs com caractersticas de fluxo e viscosidade adequados do sistema

NEP (1, 3 e 5NEP) foram formulados com a adio de nanodoses de interferon

gamma (NEPIFN-) e foram reavaliados quanto manuteno das caractersticas

reolgicas, cujos resultados so apresentados nas Figuras 19, 20 e 21 e Tabelas

4 e 5.

Observa-se na Figura 19 e na Tabela 4, que as curvas de fluxo das

formulaes (1, 3 e 5NEPIFN-) mantiveram as mesmas caractersticas das NEs

correspondentes antes da incorporao do IFN-, apresentando incio na origem e

comportamento linear ascendente e descendente. A avaliao da curva e da rea

de histerese indicou comportamento de fluidos Newtonianos.


80

5.00

Pa
4.50

4.00

3.50

3.00

2.50
Tenso
Shear de
Stress
Cisalhamento
2.00
(Pa)
1.50

1.00

0.50

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1/s 20
.
Taxa Rate
Shear de
Cisalhamento (1/s)

Figura 19. Curvas de fluxo das formulaes (1, 3 e 5NEPIFN-) selecionadas do


sistema NEP (25C).

Tabela 4. Valores de rea de histerese e classificao do fluxo das formulaes


(1, 3 e 5NEPIFN-) selecionadas do sistema NEP, obtidos a partir dos dados da
Figura 19.

rea de Histerese Classificao do


Formulao
(Pa/(sml)) Fluxo
1NEPIFN- - 0,12 Newtoniano
3NEPIFN- + 0,76 Newtoniano
5NEPIFN- - 0,22 Newtoniano

As curvas de viscosidade das formulaes (Figura 20) apresentaram

comportamento similar ao das NEs, com valores na faixa de 0,25 a 0,50 Pa.s

(Tabela 5), que no se alteraram com o aumento da taxa de cisalhamento.


81

0.500

Pas
0.450

0.400

0.350

0.300

0.250
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s) 0.200

0.150

0.100

0.050

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 1/s 20
.
Taxa Rate
Shear de
Cisalhamento (1/s)

Figura 20. Curvas de viscosidade das formulaes (1, 3 e 5NEPIFN-)


selecionadas do sistema NEP (25C).

Tabela 5. Valores de viscosidade e caractersticas do fluxo das formulaes (1, 3


e 5NEPIFN-) selecionadas do sistema NEP, obtidos da Figura 20.

Formulao Viscosidade Mdia (Pa . s) Caracterstica


1NEPIFN- 0,4673 0,0029 Linear
3NEPIFN- 0,3446 0,0023 Linear
5NEPIFN- 0,2825 0,0022 Linear

As curvas de viscosidade em funo da temperatura aps a incorporao

do IFN- (Figura 21) apresentaram mesmo comportamento das NEs (Figura 18),

indicando que a estabilidade fsica foi mantida.


82

1
10

Pas

0
10
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s)

-1
10
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 C
45.0 50.0
Temperature T
Temperatura (C)

Figura 21. Curvas de viscosidade das formulaes (1, 3 e 5NEPIFN-)


selecionadas do sistema NEP, em funo da temperatura (5 a 45C).

6.3.2 Nanoemulses do sistema SP/TW/B (NEB)

As Figuras 22 e 23 apresentam as curvas de fluxo e de viscosidade das

nanoemulses pr-selecionadas (Figura 15) para o estudo do sistema NEB. As

reas de histerese listadas na Tabela 6 e as mdias dos valores obtidos para a

viscosidade na Tabela 7 foram obtidas a partir dos dados das Figuras 22 e 23,

respectivamente.

Todas as curvas de fluxo das NEs do sistema NEB (Figura 22) apresentam

incio na origem e comportamento linear ascendente e descendente. A avaliao

da rea de histerese indicou caractersticas de fluxos Newtonianos (Tabela 6).


83

5.00

Pa
4.50
4.00

3.50

3.00

2.50
Shear Stress
Tenso de
Cisalhamento 2.00
(Pa)
1.50

1.00

0.50

0
0 5 10 15 20 25 30 35 1/s 40
.
TaxaRate
Shear de
Cisalhamento (1/s)

Figura 22. Curva de fluxo das nanoemulses pr-selecionados do sistema NEB


(25C).

Tabela 6. Valores de rea de histerese e classificao do fluxo das nanoemulses


pr-selecionados do sistema NEB, obtidos a partir dos dados da Figura 22.

rea de Histerese Classificao do


NE
(Pa/(sml)) Fluxo
1NEB - 0,01 Newtoniano
2NEB - 0,32 Newtoniano
3NEB - 0,15 Newtoniano
4NEB - 0,04 Newtoniano
5NEB - 0,08 Newtoniano
6NEB - 0,14 Newtoniano
7NEB + 0,01 Newtoniano
8NEB - 0,23 Newtoniano
9NEB + 0,01 Newtoniano
10NEB - 0,17 Newtoniano
11NEB - 0,04 Newtoniano
12NEB - 0,08 Newtoniano
13NEB - 0,03 Newtoniano
84

0.200

Pas
0.180

0.160

0.140

0.120

0.100
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s) 0.080

0.060

0.040

0.020

0
0 5 10 15 20 25 30 35 1/s 40
.
Taxa de
Shear Rate
Cisalhamento (1/s)

Figura 23. Curva de viscosidade das nanoemulses pr-selecionadas do sistema


NEB (25C).

Tabela 7. Valores de viscosidade e caractersticas do fluxo das nanoemulses do


sistema NEB, obtidos a partir dos dados da Figura 23.

NE Viscosidade Mdia (Pa . s) Caracterstica


1NEB 0,1938 0,0007 Linear
2NEB 0,1714 0,0008 Linear
3NEB 0,1614 0,0011 Linear
4NEB 0,1823 0,0005 Linear
5NEB 0,1651 0,0027 Linear
6NEB 0,1660 0,0002 Linear
7NEB 0,1479 0,0004 Linear
8NEB 0,1625 0,0008 Linear
9NEB 0,1378 0,0006 Linear
10NEB 0,1347 0,0006 Linear
11NEB 0,1356 0,0006 Linear
12NEB 0,1352 0,0005 Linear
13NEB 0,1262 0,0006 Linear
85

As curvas de viscosidade para o sistema NEB mostrou comportamento

similar ao das NEs, cujos valores de viscosidade foram obtidos na faixa entre 0,12

e 0,20 Pa.s, e permanecem praticamente constantes com o aumento da taxa de

cisalhamento (Figura 23 e Tabela 7).

Os resultados das anlises da variao da viscosidade dos pontos das

nanoemulses pr-selecionadas para o estudo do sistema NEB em funo da

temperatura esto registrados na Figura 24.

0
10

Pas

-1
10
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s)

-2
10
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 C
45.0 50.0
Temperature T
Temperatura (C)

Figura 24. Curva de viscosidade das nanoemulses pr-selecionadas do sistema


NEB em funo da temperatura (5 a 45C).

Observa-se na Figura 24, que todas as amostras do sistema NEB

apresentaram uma reduo gradual e homognea da viscosidade com a

temperatura o que um indicativo de boa estabilidade. As formulaes 1, 2, 9, 12

e 13NEB apresentaram modificao de cor quando expostas luz ambiente, o

que no foi observado nas outras formulaes, e por este motivo foram rejeitadas.
86

As NEs com caractersticas de fluxo e viscosidade adequados pr-

selecionadas do sistema NEB foram formulados com a adio de nanodoses de

interferon gamma (NEBIFN-) e foram re-avaliadas quanto s caractersticas

reolgicas, cujos resultados so apresentados nas Figuras 25, 26 e 27 e Tabelas

8 e 9.

5.00

Pa
4.50

4.00

3.50

3.00

2.50
Tenso
Shear de
Stress
Cisalhamento 2.00
(Pa)
1.50

1.00

0.50

0
0 5 10 15 20 25 30 35 1/s 40
Taxa de .
Shear Rate
Cisalhamento (1/s)

Figura 25. Curvas de fluxo das formulaes (3, 4, 5, 6, 8, 8, 10 e 11NEBIFN-) do


sistema NEB (25C).

As curvas de fluxo das formulaes (Figura 25) mantiveram as

caractersticas das NEs correspondentes. A avaliao da curva e da rea de

histerese (Tabela 8) indica que o comportamento de fluidos Newtonianos foi

mantido aps a incorporao de IFN-.


87

Tabela 8. Valores rea de histerese e classificao do fluxo das formulaes (3,


4, 5, 6, 8, 8, 10 e 11NEBIFN-) do sistema NEB, obtidos a partir dos dados da
Figura 25.

rea de Histerese Classificao do


Formulao
(Pa/(sml)) Fluxo
3NEBIFN- - 0,19 Newtoniano
4NEBIFN- - 0,16 Newtoniano
5NEBIFN- - 0,09 Newtoniano
6NEBIFN- - 0,19 Newtoniano
7NEBIFN- + 0,03 Newtoniano
8NEBIFN- + 0,02 Newtoniano
10NEBIFN- - 0,14 Newtoniano
11NEBIFN- - 0,07 Newtoniano

A viscosidade das formulaes foi similar das NEs correspondentes, mas

esteve entre 0,14 e 0,20 Pa.s, e no se alteraram com o aumento da taxa de

cisalhamento (Figura 26 e Tabela 9).

0.200

Pas
0.180
0.160

0.140

0.120

0.100
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s) 0.080

0.060

0.040

0.020

0
0 5 10 15 20 25 30 35 1/s 40
.
Taxa Rate
Shear de
Cisalhamento (1/s)

Figura 26. Curvas de viscosidade das formulaes (3, 4, 5, 6, 8, 8, 10 e


11NEBIFN-) do sistema NEB (25C).
88

Tabela 9. Valores de viscosidade e caracterstica do fluxo das formulaes (3, 4,


5, 6, 7, 8, 10 e 11NEBIFN-) do sistema NEB, obtidos a partir dos dados da Figura
26.

Formulao Viscosidade Mdia (Pa . s) Caracterstica


3NEBIFN- 0,1674 0,0020 Linear
4NEBIFN- 0,1868 0,0007 Linear
5NEBIFN- 0,1661 0,0007 Linear
6NEBIFN- 0,1865 0,0006 Linear
7NEBIFN- 0,1650 0,0003 Linear
8NEBIFN- 0,1816 0,0007 Linear
10NEBIFN- 0,1549 0,0005 Linear
11NEBIFN- 0,1438 0,0005 Linear

O comportamento das curvas de viscosidade em funo da temperatura

(Figura 27) foi mantido, quando comparado com o das NEs correspondentes

antes da incorporao do IFN- (Figura 24), indicando que a estabilidade foi

mantida.

0
10

Pas

-1
10
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s)

-2
10
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 C
45.0 50.0
Temperature T
Temperatura (C)

Figura 27. Curvas de viscosidade das formulaes (3, 4, 5, 6, 8, 8, 10 e


11NEBIFN-) do sistema NEB em funo da temperatura (5 a 45C).
89

6.4 Caracterizao por espalhamento dinmico de luz

6.4.1 Nanoemulses do sistema SP/TW/P (NEP)

A Tabela 10 apresenta os valores obtidos da medida de potencial zeta ( ),

do ndice de polidispersividade (Pdi) e do dimetro hidrodinmico (DH) das

nanoemulses pr-selecionadas e formulaes correspondentes do sistema NEP.

Tabela 10. Valores de potencial zeta, ndice de polidispersividade e dimetro


hidrodinmico mdios das formulaes do sistema NEP, obtidos a partir dos
dados da Figura 28.

Ensaio
NE ou
Potencial ndice de Dimetro
Formulao
Zeta (mV) polidispersividade Hidrodinmico (nm)

1NEP -37,96 0.33 251,05


3NEP - 41,27 0.31 316,83
5NEP -32,30 0.16 429,03
1NEPIFN- -34,43 0,41 204,95
3NEPIFN- -38,00 0,37 183,07
5NEPIFN- 0,00 0,19 1074,45

O potencial do sistema NEP contendo ou no IFN- apresenta valores

negativos e em torno de 40 mV, exceto para a formulao 5NEP que apresentou

valor nulo aps a incorporao da citocina, indicando desestabilizao inica ou

inverso de fase para A/O. A polidispersividade do sistema NEP esteve entre 0,16

e 0,41 (Tabela 10).

Os valores obtidos para o tamanho hidrodinmico (DH) das gotculas dos

colides do sistema NEP apresentaram tendncia de reduo aps o processo de

incorporao do IFN-, com valores de 205 e 183 nm para as amostras 1NEPIFN-


90

e 3NEPIFN-, respectivamente. Enquanto a formulao 5NEP- teve o valor do

DH muito aumentado e foi descartada (Figura 28 e Tabela 10).

30
1NEP
3NEP
25
5NEP
1NEPINF-
Nmero (%)

20
3NEPINF-
5NEPINF-
15

10

0
0 200 400 600 1000 1500 2000 2500 3000
Tamanho (nm)

Figura 28. Distribuio de tamanho de gotculas das nanoemulses (1,3, e 5NEP)


e formulaes (1,3,5NEP IFN-) do sistema NEP.

6.4.2 Nanoemulses do sistema SP/TW/B (NEB)

A Tabela 11 apresenta os valores de potencial zeta, ndice de Pdi e DH

mdios das formulaes do sistema NEB, antes e aps a incorporao de IFN- ,

obtidos a partir dos dados da Figura 29.

O valor mdio do tamanho hidrodinmico das gotculas para a maioria das

formulaes do sistema NEB apresentou tendncia de aumento aps a

incorporao do IFN-, sendo que as formulaes 10NEBIFN- e 11NEBIFN-

apresentaram DH de 97e 76 nm, respectivamente. As formulaes 3, 4, 5, 6, 7 e

8NEBIFN- mantiveram DH entre 170 e 200 nm e em virtude do maior dimetro


91

hidrodinmico e Pdi, quando comparados com as selecionadas, optou-se por

exclu-las do grupo.

Tabela 11. Valores de potencial zeta, ndice de polidispersividade e dimetro


hidrodinmico mdios das nanoemulses (3,4,5,6,7,8,10 e 11NEB) formulaes
(3 a 11NEBIFN-) do sistema NEB, obtidos dos dados da Figura 29.

Ensaio
NE ou
Potencial ndice de Dimetro
Formulao
Zeta (mV) polidispersividade Hidrodinmico (nm)

3NEB -37,70 0.31 291,10


4NEB - 39,90 0.39 186,83
5NEB -34,10 0.46 147,90
6NEB - 31,50 0.41 132,05
7NEB -31,70 0.42 108,60
8NEB - 29,00 0.44 65,05
10NEB -32,30 0.26 44,32
11NEB - 28,30 0.16 73,79
3NEBIFN- -38,40 0.42 173,41
4NEBIFN- -38,10 0,35 185,19
5NEBIFN- -36,90 0,35 199,50
6NEBIFN- -36,00 0,33 175,93
7NEBIFN- -37,10 0,37 139,80
8NEBIFN- -35,30 0,31 241,47
10NEBIFN- -33,70 0,24 97,42
11NEBIFN- -30,30 0,23 75,55

Em geral, das formulaes selecionadas, as NEPIFN- apresentaram

valores de potencial e Pdi superior aos apresentados pelas formulaes

NEBIFN-, j DH inferiores a 100 nm foram observados apenas para as

formulaes contendo 1-butanol como co-tensoativo.


92

30
3NEB
4NEB
5NEB
25 6NEB
7NEB
8NEB
Nmero (%)

20 10NEB
11NEB
3NEBINF-
15 4NEBINF-
5NEBINF-
6NEBINF-
7NEBINF-
10
8NEBINF-
10NEBINF-
11NEBINF-
5

0
0 50 100 150 200 300 400 500 600 700
Tamanho (nm)

Figura 29. Distribuio de tamanho de gotculas das formulaes do sistema


NEB.

Quando se comparou as NEs (n = 3) e suas respectivas formulaes no

mesmo sistema (1NEPIFN- e 3NEPIFN- ou 10NEBIFN- e 11NEBIFN-) a

veiculao do IFN- no alterou estatisticamente o DH (p = 0,5483 e 0,6012,

respectivamente). Ao comparar estes mesmos grupos o potencial tambm no

foi significativamente modificado (p = 0,2100 e 0,6012, respectivamente).

Portanto, a frao da mistura de tensoativos/co-tensoativo de 3,5:5,5:1,0

resultou no EHL requerido pela fase oleosa, mas observa-se que o sistema

SP/TW/B promoveu uma regio mais ampla de sistemas nanoemulsionados

quando comparado ao sistema SP/TW/P. Os pontos de 1 a 9NEP do sistema

SP/TW/P e de 1 a 13NEB do SP/TW/B foram selecionados para o estudo das

regies. Os estudos reolgicos indicaram que as NE desenvolvidas apresentam

predominantemente perfil Newtoniano e viscosidade linear. A avaliao das

curvas, da rea de histerese e resistncia da viscosidade em funo de variaes


93

de temperatura indicaram estabilidade fsica para as formulaes 1, 3 e 5NEPIFN-

e 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 e 11NEBIFN-. Posteriormente, quando avaliadas por

meio da tcnica de espalhamento de luz dinmico os dados indicaram que a

formulao 5NEPIFN- apresenta potencial nulo e DH elevado quando comprado

a 5NEP, indicando perda de estabilidade. Apesar das formulaes 3, 4, 5, 6, 7, 8

e 9NEBIFN- no sofrerem modificaes abruptas com a incorporao do IFN-,

os valores de DH e Pdi mais elevados podem indicar possibilidade de uma

desestabilizao posterior. Por estes indcios e para otimizao do nmero de

formulaes a serem avaliadas estas amostras foram excludas. A partir desta

triagem, as formulaes 1NEPIFN-, 3NEPIFN-, 10NEBIFN- e 11NEBIFN-

foram selecionadas para estudos posteriores de avaliao de estabilidade.


94

CAPTULO 7
95

7. RESULTADOS: MICELAS DE PLURONIC 127

Neste captulo so apresentados os resultados obtidos para o

desenvolvimento das micelas nanoestruturadas de pluronic F127. Inicialmente

sero relatados os dados da caracterizao reolgica e, em seguida os das

anlises de espalhamento dinmico de luz das nanoemulses e das formulaes

contendo IFN-.

7.1 Caracterizao reolgica

As Figuras 30 e 31 apresentam as curvas de fluxo e de viscosidade das

disperses em concentraes pr-selecionados para o estudo do sistema F127.

Os valores das reas de histerese e de viscosidade foram listados nas Tabelas 12

e 13, respectivamente, a partir dos dados obtidos das Figuras 30 e 31.

As curvas de fluxo das disperses apresentam incio na origem e

comportamento no linear ascendente e descendente, sendo classificados como

no-Newtonianos (Figura 30). A disperso de F127 em 250 mg.mL-1 (F127-250)

no apresentou capacidade de fluxo a 25 C. Em adio, o perfil das curvas

apresentadas na Figura 30 indica que com incio do cisalhamento a disperso que

flui no apresenta limite de escoamento, mas pode-se observar uma rea de

histerese expressiva (Tabela 12), com curva descendente inferior ascendente.

Este tipo de perfil descreve fluidos do tipo pseudoplsticos com tixotropia.

Observa-se na Figura 31 que o comportamento das curvas de viscosidade

das disperses do sistema F127 similar, mas depende da taxa de cisalhamento,

apresentando perfil no linear, enquanto os valores obtidos para a viscosidade

listados na Tabela 13 esto entre 0,002 e 0,003 Pa.s.


96

5.00

Pa
4.50

4.00

3.50

3.00

2.50
Tenso de
Shear Stress
Cisalhamento 2.00
(Pa)
1.50

1.00

0.50

0
0 500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 1/s 4,000
.
Taxa
Shearde
Rate
Cisalhamento (1/s)

Figura 30. Curvas de fluxo das disperses pr-selecionadas (127-10 e F127-50)


(25C).

0.0200

Pas
0.0180

0.0160

0.0140

0.0120

0.0100
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s) 0.0080

0.0060

0.0040

0.0020

0
0 500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 1/s 4,000
de .
Taxa Rate
Shear
Cisalhamento (1/s)

Figura 31. Curvas de viscosidade das disperses pr-selecionadas (127-10 e


F127-50) (25C).
97

Os resultados das anlises da variao da viscosidade das disperses do

sistema F127 em funo da temperatura so apresentados na Figura 32.

6
10
5
Pas
10
4
10
3
10
2
10
1
10
Viscosity
Viscosidade
0
(Pa.s) 10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 C 50.0
Temperature
Temperatura T
(C)

Figura 32. Curvas de viscosidade das disperses pr-selecionadas 127-10, F127-


50 e F127-250 em funo da temperatura (5 a 45C).

As curvas de viscosidade das disperses F127-10 e F127-50 permanecem

praticamente constantes com a temperatura. No caso da amostra F127-250 o

valor da viscosidade aumentou gradativamente at nveis extremos a partir de

19C, sendo um indicativo de alterao do estado fsico (Figura 32).

As disperses com caractersticas de fluxo e viscosidade mais adequados

do sistema F127 (F127-10 e F127-50) foram formuladas com a adio do

interferon gamma (F127IFN-) e foram reavaliadas quanto s caractersticas

reolgicas, cujos resultados so apresentados nas Figuras 33, 34 e 35, a partir

dos quais foram obtidos os valores listados nas Tabelas 12 e 13.


98

5.00

Pa
4.50

4.00

3.50

3.00

2.50
TensoStress
Shear de
Cisalhamento 2.00
(Pa)
1.50

1.00

0.50

0
0 500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 1/s 4,000
.
Taxa de
Shear Rate
Cisalhamento (1/s)

Figura 33. Curva de fluxo das formulaes 127-10IFN- e F127-50IFN- (25C).

0.0200

Pas
0.0180
0.0160

0.0140

0.0120

0.0100
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s) 0.0080

0.0060

0.0040

0.0020

0
0 500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500 1/s 4,000
Taxa de .
Shear Rate
Cisalhamento (1/s)

Figura 34. Curvas de viscosidade das formulaes 127-10IFN- e F127-50IFN-


(25C).
99

10
10

Pas
10
5

6
10

4
10

Viscosity
Viscosidade 2
(Pa.s) 10

0
10

-2
10

-4
10
0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 C 50.0
Temperature
Temperatura (C)T

Figura 35. Curvas de viscosidade das formulaes 127-10IFN-, F127-50IFN- e


F127-250IFN- em funo da temperatura (5 a 45C).

Comparando-se as curvas de fluxo das formulaes (Figura 33) com as

das disperses (Figura 30) observa-se comportamento similar. Apresentam incio

na origem e comportamento no linear ascendente e descendente,

correspondendo s caractersticas de fluidos No-newtonianos, pseudoplsticos

com tixotropia (Figura 33 e Tabela 12).

O comportamento das curvas de viscosidade das formulaes (Figura 34)

foi similar ao das disperses (Figura 31), obtendo-se valores de viscosidade entre

0,002 e 0,003 Pa.s, os quais tambm variam com o aumento da taxa de

cisalhamento, apresentando perfil no linear (Figura 34 e Tabela 13).

Observa-se na Figura 35 que as curvas de viscosidade em funo da

temperatura para as formulaes F127-10IFN- e F127-50IFN- variam pouco em

funo da temperatura, comportamento similar ao das disperses sem IFN-.


100

No caso da amostra F127-250IFN-, o valor da viscosidade foi aumentando

gradativamente at nveis extremos a partir de 19C, sendo um indicativo de

alterao do estado fsico (Figura 35), mesmo comportamento da disperso

correspondente.

Tabela 12. Valores da rea de histerese e classificao do fluxo das disperses


pr-selecionadas 127-10 e F127-50 e das formulaes 127-10IFN- e F127-
50IFN- obtidos a partir dos dados das Figuras 30 e 33.

Disperso ou rea de Histerese


Classificao do Fluxo
formulao (Pa/(sml))
No-newtoniano:
F127-10 + 10.010,19
Tixotrpico Pseudoplstivo
F127-50 + 3.105,70 No-newtoniano:
Tixotrpico Pseudoplstivo
F127-10IFN- + 9.107,07 No-newtoniano:
Tixotrpico Pseudoplstivo
F127-50IFN- + 2.943,86 No-newtoniano:
Tixotrpico Pseudoplstivo

Tabela 13. Valores de viscosidade e caracterstica do fluxo das disperses pr-


selecionadas (127-10 e F127-50) obtidos a partir dos dados das Figuras 31 e 34.

Disperso ou
Viscosidade Mdia (Pa . s) Caracterstica
formulao

F127-10 0,0021 0,0023 No linear

F127-50 0,0030 0,0024 No linear

F127-10IFN- 0,0022 0,0024 No linear

F127-50IFN- 0,0034 0,0027 No linear

No caso da amostra F127-250IFN- tambm foram realizadas anlises

reolgicas em funo da frequncia, visando obter informaes sobre a estrutura

deste sistema.
101

A evoluo dos mdulos de armazenagem G (mdulo elstico/slido

elstico) e de perda G (mdulo viscoso/lquido viscoso) em funo da frequncia

para a disperso F127-250, em diferentes temperaturas (5, 19 e 25C) mostrada

na Figura 36, enquanto que para a formulao F127-250IFN- na Figura 37.

Observa-se na Figura 37 que as curvas obtidas temperatura de 5C para

a disperso F127-250 mostram um predomnio de G, mas G est presente com

valores em uma ordem de grandeza inferior, sugerindo que, nesta temperatura a

disperso comporta-se como um lquido. Enquanto que temperatura de 19C,

para frequncias, os valores de G e G so muito prximos, mas com os de G

levemente maiores, situao que se inverte com aumento da frequncia indicando

que exatamente a esta temperatura ocorre a transio de estado lquido/slido do

sistema. As curvas obtidas para a temperatura de 25C indicam que o nmero de

interaes aumentam, fazendo com que os valores de G sejam maiores que G, e

o sistema caracterizado como slido com caracterstica predominantemente

elstica, com caractersticas de gel slido (Figura 36).

O comportamento dos mdulos de armazenagem G e de perda G em

funo da frequncia da formulao F127-250IFN- em diferentes temperaturas

(5, 19 e 25C) apresentado na Figura 37. Observa-se que na temperatura de

5C h um predomnio de G e ausncia de G indicando que a amostra

comporta-se praticamente como um sistema lquido viscoso, caracterstico de

solues lquidas. Para maiores temperaturas 19 e 25 C, as caractersticas de

transio de estado lquido/slido, e de slido respectivamente foram mantidas.


5
10
102
Pa

3
10 5
10 G' F127-250 5C
2
10 4
G' 10Pa G' F127-250 19C
1
10
10
3
G' F127-250 25C
G''
10
0
2 G'' F127-250
G' F127-2505C
5C
10
G'' F127-250 19C
G' G'
-1 F127-250 19C
1
10 10 G' F127-250 25C
G''
G'' F127-250 25C
-2
10 10
0 25C F127-250
G'' 19C 5C
5C

(Pa) -1
-3
G'' F127-250 19C
10 10
-1 0 1 2 G'' F127-250 25C
10 -2 10 10 1/s 10
10 Angular Frequency
-3 Lquido Lquido Gel
10
-1 0 1 2
10 10 10 1/s 10
Angular angular
Frequncia Frequency

Figura4 36. Comportamento dos mdulos de armazenagem G e de perda G em


10
funo da frequncia da disperso F127-250 bem como as respectivas imagens
diferentes temperaturas (5, 19 e 25C).
em Pa

2
10 4
10
1
G' F127-250IFN-y 5C
10 3
G' 10Pa G' F127-250IFN-y 19C
0
10 2
10 G' F127-250IFN-y 25C
G''
-1 F127-250IFN-y
G''G' F127-250IFN-y 5C
5C
10 1
10
G'
-2
F127-250IFN-y
G''G' F127-250IFN-y 19C
19C
10 0
10 F127-250IFN-y
G''G' F127-250IFN-y 25C
25C
G'' -3
10 -1 25C
G'' F127-250IFN-y
19C 5C 5C
10
-4
(Pa)
10 -2 G'' F127-250IFN-y 19C
10 -1 0 1 2
10 10 10 1/s 10 G'' F127-250IFN-y 25C
-3 Angular Frequency
10
Lquido Lquido Gel
-4
10
-1 0 1 2
10 10 10 1/s 10
Angular Frequency
Frequncia angular

Figura 37. Comportamento dos mdulos de armazenagem G e de perda G em


funo da frequncia da formulao F127-250IFN- bem como as respectivas
imagens em diferentes temperaturas (5, 19 e 25C).
103

O mesmo comportamento observado para as formulaes

correspondentes (Figura 37) indicando que a incorporao do IFN- no

influenciou nas caractersticas das disperses. Em adio so apresentadas

imagens das disperses e formulaes (Figuras 36 e 37) nas respectivas

temperaturas de realizao das anlises. Observa-se que, para a temperatura de

5 C o gel mantido na parte superior do frasco.

As Figuras 38 e 39 apresentam a anlise do ngulo de defasagem, (tan )

dado pela razo entre G e G para a disperso F127-250, e para a formulao

correspondente F127-250IFN- em diferentes temperaturas (5, 19 e 25C), com o

objetivo de verificar a viscoelasticidade dos sistemas, conforme foi discutido no

captulo 2.

Observa-se na Figura 38 valores de tan >> 1 para a temperatura de 5C,

indicando que a disperso F127-250 essencialmente um lquido viscoso,

enquanto que, para a temperatura de 19C ocorre a transio slido

elstico/lquido viscoso. O perfil apresentado pela curva obtida temperatura de

25C se refere ao comportamento de um slido elstico, pois tan << 1 (Figura

38).

Observa-se na Figura 39 que o perfil da curva obtida a 5C valores de tan

> 10, o que indica que a formulao F127-250IFN- a essencialmente uma

soluo lquida, porm com menor viscosidade do aquela verificada para a

disperso. Para a curva obtida a 19C observa-se tambm a ocorrncia da

transio slido elstico/lquido viscoso, enquanto que, o perfil da curva a 25C,

indica que o comportamento slido elstico foi mantido, visto que tan << 1.
104

2
10

1
10

Damping Factor
ngulo de tan( )
Defasagem
0
10

-1
10
-1 0 1
10 10 1/s 10
Angular
Frequncia Frequency
angular (1/s)

Figura 38. Curvas do ngulo de defasagem em funo da frequncia da


disperso F127-250 para diferentes temperaturas (5, 19 e 25C).

2
10

1
10

Damping Factor
ngulo de tan( )
Defasagem
0
10

-1
10
-1 0 1
10 10 1/s 10
Angular
Frequncia Frequency
angular (1/s)

Figura 39. ngulo de defasagem em funo da frequncia da formulao F127-


250IFN- para diferentes temperaturas (5, 19 e 25C).
105

O potencial deste sistema no foi negligenciado pois, apesar de reconhecer

que sistemas com transio lquido/slido tenham uma aplicao especial,

considerou-se que este sistema no seria interessante para as aplicaes

biolgicas que buscamos com este trabalho, e a formulao no foi descartada,

apenas no foi considerada para avaliaes posteriores.

7.2 Caracterizao por espalhamento dinmico de luz

A Figura 40 mostra as distribuies de tamanho das micelas das

disperses (F127-10 E F127-50) e das formulaes (F127-10IFN- e F127-50IFN-

), cujos dados esto listados na Tabela 14. A tabela apresenta os valores do

potencial zeta ( ), ndice de polidispersividade (Pdi) e do dimetro hidrodinmico

(DH) mdios das disperses e formulaes do sistema F127.

Observa-se na Tabela 14, que o potencial das disperses ou formulaes

do sistema F127 contendo ou no o IFN-, independente da concentrao,

praticamente nulo, esperado para este sistema. Os valores de polidispersividade

das disperses so 0,8 e 0,48, enquanto, aps a incorporao de IFN-, observa-

se que o valor foi reduzido para a amostra de menor concentrao de F127, e

ficou praticamente constante para a de maior concentrao (Tabela 14).

O tamanho hidrodinmico das micelas ficou praticamente constante aps a

incorporao do IFN-, sendo que as partculas F127-10IFN- e F127-50IFN-

apresentaram DH=26,42 e 4,53 nm, respectivamente (Tabela 14).

Os resultados obtidos da incorporao de IFN- em copolmeros que

formam micelas indicaram que os sistemas micelares nanoestruturados

apresentam comportamento no-Newtonianos, rea de histerese expressiva, no


106

apresentam limite de escoamento e viscosidade no linear. Este tipo de perfil

descreve os fluidos como do tipo pseudoplsticos com tixotropia, independente da

presena de IFN-.

35

F127-10
30
F127-50
25
F127-10INF-
F127-50INF-
Nmero (%)

20

15

10

0
0 20 40 60 80

Tamanho (nm)

Figura 40. Distribuies de tamanho das micelas das disperses (F127-10 e


F127-50) e das formulaes (F127-10IFN- e F127-50IFN-).

Tabela 14. Potencial zeta, ndice de polidispersividade e dimetro hidrodinmico


mdios das disperses (F127-10 e F127-50) e formulaes (F127-10IFN- e
F127-50IFN-). O ndice de polidispersividade e dimetro hidrodinmico foram
obtidos a partir da Figura 40.

Ensaio
Formulao Potencial ndice de Dimetro
Zeta (mV) polidispersividade Hidrodinmico (nm)
-1,86 0.80 21,07
F127-10
F127-50 - 2,17 0.48 4,24
F127-10IFN- -1,54 0,33 26,42
F127-50IFN- +2,95 0,54 4,53
107

A disperso de F127 em 250 mg.mL-1 no apresentou capacidade de fluxo

a 25 C. As anlises oscilatrias indicam que este sistema apresenta

comportamento de um slido elstico. As formulaes F127-10IFN- e F127-

50IFN- apresentaram potencial neutro e DH de 26 e 5 nm, respectivamente.

Quando se comparou as disperses (n = 3) e suas respectivas formulaes

(F127-10IFN- e F127-50IFN-) a veiculao do IFN- no alterou estatisticamente

o DH (p > 0,05), mas indicou a significativa diferena do DH entre ambas as

formulaes (p < 0.0001). Ao comparar estes mesmos grupos o potencial no foi

significativamente modificado (p = 0,1700).

A partir destas avaliaes, as formulaes com perfis reolgicos de lquido

foram selecionadas para a realizao de estudos posteriores de avaliao de

estabilidade.
108

CAPTULO 8
109

8 RESULTADOS: CONTROLE DE QUALIDADE DAS FORMULAES


PRODUZIDAS

Neste captulo sero apresentados os resultados obtidos para o estudo de

estabilidade das nanoemulses 1NEP, 3NEP, 10NEB, 11NEB, disperses

polimricas F127-10, F127-50, e formulaes 1NEPIFN-, 3NEPIFN-, 10NEBIFN-

, 11NEBIFN-, F127-10IFN- e F127-50IFN- desenvolvidas. Inicialmente sero

relatados os dados fsico-qumicos de estabilidade preliminar e, posteriormente,

os de estabilidade acelerada adicionados do monitoramento reolgico, potencial

zeta, dimetro hidrodinmico e dosagem de IFN-.

8.1 Estabilidade preliminar

Os resultados das anlises fsico-qumicas dos sistemas NEP, NEB e F127

sob ciclos alternados de centrifugao em diferentes temperaturas (5 e 25 oC) so

apresentados na Tabela 15. Cada um dos aspectos foram avaliados aps a

centrifugao a 25C e posteriormente a 5C, e ao iniciar e encerrar os 14 ciclos

de 24 h cada alternados com temperatura de 5 e de 45C. Os dados de

condutividade e de pH tambm foram registrados.

Os resultados apresentados na Tabela 15 indicam que,

independentemente do sistema, e do tratamento trmico, houve manuteno da

estabilidade macroscpica independente da temperatura de centrifugao, assim

como, a apresentao de aspecto translcido e homogneo durante todo o

perodo do teste.
110

Tabela 15. Parmetros obtidos por meio das anlises fsico-qumicas antes e
aps a realizao dos testes de estabilidade preliminar dos sistemas NEP, NEB e
F127, com ou sem incorporao de IFN-.

NE, Centrifugao Aspecto Condutividade pH


-1
(S.cm )
Disperso
ou ~ 25C ~ 5C Antes Depois Antes Depois Antes Depois
Formulao

1NEP N N TL TL 2,39 3,01 7,20 7,22

3NEP N N TL TL 2,26 2,52 7,40 7,50

1NEPIFN- N N TL TL 7,61 8,08 7,10 7,00

3NEPIFN- N N TL TL 7,20 7,25 7,20 7,00

10NEB N N TL TL 11,73 11,70 7,43 7,44

11NEB N N TL TL 9,32 8,84 7,48 7,45

10NEBIFN- N N TL TL 57,70 54,60 7,00 6,85

11NEBIFN- N N TL TL 11,31 13,04 7,15 6,80

F127-10 N N TL TL 10,88 12,06 7,32 7,18

F127-50 N N TL TL 10,02 10,25 7,27 7,18

F127-10IFN- N N TL TL 8,30 11,30 7,32 7,17

F127-50IFN- N N TL TL 10,75 11,16 7,28 7,19


Onde: N = Normal; TL = translcido lquido; TG = translcido gel; SF = separao de fases.

As nanoemulses e formulaes correspondentes aps a incorporao de

IFN- apresentaram valores de condutividade eltrica >1,3 S.cm -1 o que as

classifica como nanoemulses do tipo O/A. Enquanto as micelas mantiveram

condutividade em torno de 11,0 S.cm-1. Os valores de pH obtidos antes e ao final

do teste de estabilidade, independente do sistema, permaneceram em torno de

7,0 (Tabela 15).


111

8.2 Estabilidade Acelerada

Os resultados das anlises fsico-qumicas dos sistemas NEP, NEB e F127

sob condies extremas de temperatura esto apresentados na Tabela 16.

Tabela 16. Parmetros obtidos por meio das anlises fsico-qumicas antes (0) e
aps (45 e 90 dias) da realizao dos testes de estabilidade acelerada das
formulaes relativas aos sistemas NEP, NEB e F127.

pH
Formulao Tempo (dias)
0 45 90

1NEPIFN- 7,10 0,01 6,51 0,16 6,00 0,10


3NEPIFN- 7,00 0,05 6,22 0,49 6,68 0,36
10NEBIFN- 7,00 0,10 6,80 0,17 6,10 0,05
11NEBIFN- 7,20 0,10 6,40 0,35 5,84 0,35
F127-10IFN- 7,70 0,20 4,26 2,91 5,00 1,29
F127-50IFN- 7,80 0,10 5,94 0,91 5,50 0,12

Condutividade (S cm-1)
Formulao
Tempo (dias)
0 45 90

1NEPIFN- 6,74 0,10 7,72 0,54 7,81 0,18


3NEPIFN- 4,84 0,10 7,13 2,23 6,20 3,20
10NEBIFN- 37,80 0,20 42,37 1,24 41,63 2,32
11NEBIFN- 6,44 0,50 7,20 0,56 6,99 0,61
F127-10IFN- 10,10 0,30 11,23 0,45 10,92 1,72
F127-50IFN- 9,50 0,15 9,37 2,07 9,87 1,10

As formulaes, independentemente do sistema, apresentaram

translucidez e homogeneidade visual durante todo o perodo do teste, exceto a

formulao F127-10IFN- que deixou de ser translcida a partir de 30 dias.


112

Os valores obtidos para o pH das formulaes apresentaram reduo com

o decorrer do estudo, mas mantiveram-se em torno de 6 aps 90 dias, enquanto a

condutividade eltrica manteve-se superior a 1,3 S.cm-1. Os dados para a

formulao F127-10IFN- mostraram maior variao de pH e para a formulao

10NEPIFN- o valor da condutividade em torno de 40 S.cm-1 indica

hidrofilicidade bem superior das outras formulaes (Tabela 16).

A Figura 41 apresenta os dados de perfil mdio das curvas de fluxo e de

viscosidade das formulaes desenvolvidas durante o perodo em que

apresentaram mantiveram os seus respectivos perfis, quando se considera a

anlise estatstica. Os dados foram obtidos a cada 45 dias seguindo-se as

mesmas condies dos testes de caracterizao reolgica apresentados no

captulo 4.

Observa-se na Figura 41a por meio das mdias de fluxo estatisticamente

similares, que as formulaes nanoemulsionadas apresentaram fluxo ascendente

e descendente linear e sem variao significativa de perfil Newtoniano durante

todo perodo avaliado (90 dias - 1NEPIFN-, 3NEPIFN-, 10NEBIFN- e

11NEBIFN-, p > 0.05), assim como a micela F127-50IFN- (90 dias, p > 0.9874),

que tambm manteve perfil no-newtoniano. O perfil da formulao F127-10IFN-

variou significativamente durante o perodo avaliado, porm estabilidade pelo

perodo de 45 dias (p = 0.9141).

O perfil de viscosidade de cada formulao, apresentado por meio das

mdias no perodo de manuteno estatisticamente significativo, est registrado

na Figura 40b, onde se observa que os perfis das formulaes 3NEPIFN- e

10NEBIFN- variaram significativamente durante o perodo de estabilidade


113

acelerada, as quais apresentam estabilidade limitada a 45 dias (p = 0.0654 e

0.9921 respectivamente).

1
10
(a)
Pa

0
10
Shear
TensoStress
de
Cisalhamento
(Pa)

-1
10
-1 0 1 2 3 4
10 10 10 10 10 1/s 10
.
Taxa de
Shear Rate
Cisalhamento (1/s)
0
10
(b)
Pas

-1
10

-2
10
Viscosity
Viscosidade
(Pa.s)
-3
10

-4
10
-1 0 1 2 3 4
10 10 10 10 10 1/s 10
Taxa de .
Shear Rate
Cisalhamento (1/s)

Figura 41. Curva de fluxo (a) e viscosidade (b) mdia das formulaes durante o
perodo de estabilidade apresentado por cada formulao (25C).
*(a) 1NEPIFN-y (90 dias; p = 0.9880); 3NEPIFN-y (90 dias; p = 0.5583); 10NEBIFN-y (90 dias; p =
0.6723); 11NEBIFN-y (90 dias; p = 0.9727); F127-10IFN-y (< 45 dias; p = 0.9141); F127-50IFN-y
(90 dias; p = 0.9874); (b) 1NEPIFN-y (90 dias; p = 0.1773); 3NEPIFN-y (< 45 dias; p = 0.0654);
10NEBIFN-y (< 45 dias; p = 0.9921); 11NEBIFN-y (90 dias; p = 0.0791); F127-10IFN-y (90 dias; p
= 0.9999); F127-50IFN-y (90 dias; p = 0.9998).
114

As formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN-, F127-10IFN- e F127-50IFN-

apresentaram perfil de viscosidade significativamente semelhante durante os 90

dias (p > 0.05).

Os valores registrados para as medidas de potencial zeta das formulaes

durante o perodo de estabilidade acelerada (0, 45 e 90 dias) so apresentados

na Figura 42. Observa-se que os valores de potencial das NEs mantiveram-se

negativos e entre -30 e -40 mV e, praticamente, nulo para as micelares no

apresentando variao significativa durante todo o perodo de estudo (p > 0,05).

Em virtude das instabilidades nas medidas a formulao F127-10IFN- no foi

avaliada em funo do tempo (Figura 42).

10

0
#
Potencial Zeta (mV)

-10
1NEPINF-
3NEPINF-
-20 10NEBINF-
11NEBINF-
F127-10INF-
-30
F127-50INF-

-40

-50
0 45 90
Tempo (Dias)

Figura 42. Valores de potencial Zeta das formulaes produzidas durante o


perodo de estabilidade acelerada (0, 45 e 90 dias).
*Comparando os tempos do teste, considerando o mesmo grupo. F = 0.0015, p = 0.9985; F =
4.1834, p = 0.0727; F = 1.0515, p = 0.4077; F = 2.7495, p = 0.1418; #Separao fases; F =
3.8278, p = 0.0983 (ANOVA).
115

A Figura 43 apresenta os valores mdios do dimetro hidrodinmico das

formulaes produzidas obtidos durante o perodo de estabilidade acelerada (0,

45 e 90 dias).

Os dimetros mdios hidrodinmicos das formulaes 1NEPIFN-,

11NEBIFN- e F127-50IFN- no apresentaram variao significativa durante todo

o perodo de estudo (p > 0,05) e mdias de 301,56; 97,97 e 13,97 nm,

respectivamente. Ao contrrio, as formulaes 3NEPIFN- e 10NEBIFN-

apresentaram variaes nos valores durante o perodo do estudo.

500
* *
Dimetro hidrodinmico (nm)

400

300 1NEPINF-
* 3NEPINF-
10NEBINF-
200 11NEBINF-
F127-10INF-
F127-50INF-
100

#
0
0 45 90
Tempo (Dias)

Figura 43. Valores mdios de dimetro hidrodinmico das formulaes


produzidas durante o perodo de estabilidade acelerada (0, 45 e 90 dias).
*Comparando os tempos do teste, considerando o mesmo grupo. F = 4.600, (p) = 0.0600; F =
27.4829, p < 0.01; F = 17.5779, p = 0.0038; F = 0.5340, p = 0.6151; #Separao de fases; F =
4.9425, p = 0.0538 (ANOVA).
116

A avaliao da dosagem de interferon gamma incorporado s formulaes

durante o perodo de estabilidade acelerada apresentada na Figura 44. Os

dados da figura indicam que a concentrao de interferon gamma apresentou

tendncia de reduo ao longo do perodo do estudo em todas as formulaes,

contudo a formulao 1NEPIFN-, variou pouco em relao ao valor inicial (para

0), e as amostras 11NEBIFN- e F127-50IFN- no apresentaram variao

significativa durante o perodo avaliado (p > 0,05) e mdias de 90,87, 91,95 e

85,13 ng.mL-1, respectivamente. A formulao 10NEBIFN- no manteve a

dosagem adequada da citocina a partir de 45 dias.

180

160
Interferon gamma (ng.mL -1)

140

120
# *
1NEPINF-
100
3NEPINF-
80
10NEBINF-
11NEBINF-
60 F127-10INF-
F127-50INF-
40

20

0
0 45 90
Tempo (Dias)

Figura 44. Dosagem de interferon gamma nas formulaes durante o perodo de


estabilidade acelerada.
*Comparando os tempos do teste, considerando o mesmo grupo. F = 0.7956, p = 0.5035; F =
0.2675, p = 0.7768; F= 6.4788, p = 0.0414; F= 2.837, p = 0.1502; Separao de fases; F = 0.9336,
p = 0.5334 (ANOVA).
117

Das formulaes avaliadas, 1NEPIFN-, 3NEPIFN-, 10NEBIFN-,

11NEBIFN-, F127-10IFN- e F127-50IFN- foram aprovados nos testes de

estabilidade preliminar. As formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN-

apresentaram estabilidade em condies extremas durante 90 dias, apresentando

pH biocompatvel, manuteno significativa do perfil reolgico, D H, potencial e

dosagem do IFN-, apresentando-se adequadas para aplicaes biolgicas, ao

considerarmos a possibilidade de administrao parenteral, e foram empregadas

para os ensaios biolgicos.


118

CAPTULO 9
119

9 RESULTADOS: ENSAIOS BIOLGICOS

9.1 Ensaio Biolgico

Neste captulo sero apresentados os resultados obtidos dos ensaios

biolgicos realizados empregando-se as formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e

F127-50IFN-. Os ensaios realizados foram: (i) avaliao de viabilidade celular; (ii)

liberao de nion superxido; (iii) fagocitose; (iv) atividade microbicida; (v)

avaliao da permeabilidade celular ao iodeto de propdio e (vi) de liberao de

clcio intracelular.

9.2 ndice de viabilidade

Os testes de ndice de viabilidade celular dos fagcitos MN do sangue

perifrico humano tratados com diferentes formulaes (1NEPIFN-, 11NEBIFN-

e F127-50IFN-, e com controle PBS) e tempos de incubao (0; 0,5; e 24 h), so

apresentados na Figura 45. Os fagcitos tratados com as formulaes

nanoemulsionadas apresentaram ndice de viabilidade celular significativamente

superior nos tempos de 0.5 e 24 h quando comparados aos outros grupos.

A viabilidade celular do grupo controle mostrou reduo significativa aps

24h de incubao, mesmo perfil apresentado pelo tratamento com NEPIFN- (p <

0.05). Enquanto que os grupos 11NEBIFN- e F127-50IFN- no apresentaram

alterao da viabilidade celular em virtude do tempo de incubao.


120

* *
100 *# *
#
Viabilidade celular (%)

80

60
PBS
1NEPINF-
40 11NEBINF-
F127-50INF-

20

0
0,0 0,5 24,0
Tempo (h)

Figura 45. ndice de viabilidade celular dos fagcitos MN do sangue perifrico


humano com diferentes tratamentos (1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN-, e
como controle o PBS) e tempos de incubao (0; 0,5; e 24 h).
*comparando o grupo controle (sem tratamento) com os grupos tratados considerando o mesmo
tempo de incubao. F = 12.8818 e p < 0.0003; F = 9.217 e p < 0.0012 (ANOVA).
#
comparando os tempos de incubao, considerando o mesmo tratamento. F = 15.0661, p<
0.0001 e F = 4.5191, p < 0.0338 (ANOVA).

9.3 Liberao de nion superxido

As avaliaes da liberao do nion superxido pelas clulas do sangue

perifrico humano na presena bactria e dos diferentes estmulos (1NEPIFN-,

11NEBIFN- e F127-50IFN-, e como controles o IFN-, PBS, a disperso F127-

50, e as nanoemulses 1NEP e 11NEB) e tempos de incubao (0; 0,5; 1 e 2 h)

so apresentadas na Figura 46.


121

Quando os fagcitos MN foram tratados com as nanoemulses contendo

ou no o ativo, a liberao de nion foi significativamente superior espontnea

(PBS) para todos os tempos. A liberao do nion demonstrou no ser

influenciada pela disperso e formulao correspondente (F127-50INF-)

desenvolvidas e pelo tempo de incubao (Figura 46).

50 PBS
Liberao de nion superxido (nmol)

INF-
1NEP
40
11NEB
* * *
* * F127-50
* *
1NEPINF-
** * * *
* * * 11NEBINF-
30
*
F127-50INF-

20

10

0
0,0 0,5 1,0 2,0

Tempo (h)

Figura 46. Liberao de nion superxido das clulas MN do sangue perifrico


humano na presena de E. coli em diferentes tratamentos (1NEPIFN-,
11NEBIFN- e F127-50IFN-, e como controles o IFN-, PBS, a disperso F127-
50, e as nanoemulses 1NEP e 11NEB) e tempos de incubao (0; 0,5; 1 e 2 h).
*comparando o grupo controle com os grupos tratados considerando o mesmo tempo de
incubao. F = 226,4885, (p) < 0.0001; F = 242,7824, (p) < 0.0001; F = 259,3968, (p) < 0.0001; F
= 235,3631 e (p) < 0.0001. Comparando os tempos de incubao, considerando o mesmo
tratamento. F> 0,1 e (p) > 0,05 (ANOVA).
122

9.4 Avaliao da fagocitose

As avaliaes da fagocitose da E. coli pelas clulas do sangue perifrico

humano na presena de diferentes estmulos (1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-

50IFN-, e como controles o IFN-, PBS, a disperso F127-50, e as

nanoemulses 1NEP e 11NEB) e tempos de incubao (0; 0,5; 1 e 2 h) so

apresentadas na Figura 47.

O IFN- estimulou significativamente a fagocitose nos instantes inicial

(zero) e 0.5h de incubao, quando comparados aos ndices observados para o

grupo espontneo (PBS). As clulas na presena da formulao 1NEP

demonstraram aumento significativo na fagocitose apenas no tempo zero e a

F127-50 no influenciou a fagocitose. J a nanoemulso 11NEB reduziu os

ndices de fagocitose, significativamente em 0.5h e 2h, comparando-se com os

mesmos tempos do grupo espontneo. As clulas tratadas com a formulao

1NEPIFN- foram significativamente estimuladas aumentando a fagocitose em

todos os tempos de incubao. Para as formulaes F127-50IFN- e 11NEBIFN-

a fagocitose foi superior observada para a espontnea exclusivamente nos

tempos de incubao de 30 mim e 1h, respectivamente.

Quando se compara os tempos de incubao para o mesmo tratamento, o

IFN- estimulou a fagocitose significativamente com 0,5 h de incubao, enquanto

que com as formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN- apresentaram

aumento significativo da fagocitose, para os tempos maiores do que 0,5 h, quando

se compara ao grupo controle PBS (Figura 47).


123

100 PBS
*
* ## INF-
* ## * 1NEP
# #
* 11NEB
80 *
# # F127-50
ndice de fagocitose (%)

#
# 1NEPINF-
# 11NEBINF-
60 ** F127-50INF-
#

40



20

0
0,0 0,5 1,0 2,0

Tempo (h)

Figura 47. ndice de Fagocitose das clulas MN do sangue perifrico humano na


presena de E. coli em diferentes tratamentos (1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-
50IFN-, e como controles o IFN-, PBS, a disperso F127-50, e as
nanoemulses 1NEP e 11NEB) e tempos de incubao (0; 0,5; 1 e 2 h).
*comparando o grupo controle (sem tratamento) com os grupos tratados considerando o mesmo
tempo de incubao. F = 15.4535 e p < 0.0001; F = 33.0145 e p < 0.0001; F = 8.4092 e p <
0.0001; F = 16.3312 e p < 0.0001 (ANOVA).
#
comparando os tempos de incubao, considerando o mesmo tratamento. F = 3.5475, p< 0.0379; F=
8.9250, p< 0.0013; F = 33.7026, p< 0.0001; F = 28.6823, p< 0.0013 e F = 5.4204, p < 0.0092 (ANOVA).

9.5 Atividade Microbicida

A atividade microbicida dos fagcitos do sangue perifrico humano

incubados com diferentes estmulos (1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN-, e

como controles o IFN-, PBS, a disperso F127-50, e as nanoemulses 1NEP e

11NEB) e tempos de incubao (0; 0,5; 1 e 2 h) na presena de E. coli esto

apresentados na Figura 48.


124

100 PBS
INF-
1NEP
11NEB
80
Atividade bactericida (%)

F127-50
1NEPINF-
11NEBINF-
60 F127-50INF-

#
40



20


0
0,0 0,5 1,0 2,0

Tempo (h)

Figura 48. Atividade bactericida das clulas MN do sangue perifrico humano na


presena de E. coli em diferentes tratamentos (1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-
50IFN-, e como controles o IFN-, PBS, a disperso F127-50, e as
nanoemulses 1NEP e 11NEB) e tempos de incubao (0; 0,5; 1 e 2 h).
comparando o grupo controle (sem tratamento) com os grupos tratados considerando o mesmo
tempo de incubao. F = 10.6760 e p < 0.0001; F = 4.7691 e p = 0.0012; F = 9.1092 e p < 0.0001;
F = 10.4002 e p < 0.0001 (ANOVA).
#
comparando os tempos de incubao, considerando o mesmo tratamento. F = 4.8064, p =
0.0142; (ANOVA).

O as clulas tratadas com nanoemulso, independentemente da presena

do IFN-, reduziram a atividade microbicida em praticamente todos os tempos de

incubao quando comparados aos fagcitos no tratados. J a disperso F127-

50, bem como sua formulao, no influenciaram a atividade microbicida.

Os ndices microbicidas no demonstraram diferena quando comparado

os tempos de incubao, considerando o mesmo tratamento, exceto para o IFN-

em 0.5 h (Figura 48).


125

9.6 Avaliao da permeabilidade celular ao iodeto de propdio

Os resultados da viabilidade por meio da permeabilidade celular ao iodeto

de propdio dos fagcitos MN, de clulas MCF-7 de cncer de mama humano e

da mistura dos mesmos, com os respectivos estmulos (1NEPIFN-, 11NEBIFN-

e F127-50IFN-, e como controles o IFN-, PBS, a disperso F127-50, e as

nanoemulses 1NEP e 11NEB) so apresentados na Figura 49.

PBS
INF-
100
# 1NEP
*
* 11NEB
F127-50
Viabilidade celular (%)

80 1NEPINF-
* 11NEBINF-
F127-50INF-
60

#
40 *
* #
*
*
20

0
MN MCF-7 MN + MCF-7
Clulas

Figura 49. ndice de viabilidade celular dos fagcitos MN e das clulas MCF-7 de
cncer de mama humano, e sua mistura, indicado pela intensidade de
fluorescncia mdia de permeabilidade celular ao iodeto de propdio, para os
estmulos (1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN-, e como controles o IFN-,
PBS, a disperso F127-50, e as nanoemulses 1NEP e 11NEB).
*comparando o grupo controle (sem tratamento) com os grupos tratados considerando o mesmo
tipo de clulas. F = 31.5700, F = 25.5800 e F = 55.6670 respectivamente e p < 0.0001 (ANOVA).
#
comparando os diferentes tipos de clulas, considerando o mesmo tratamento. F = 13.3320, p<
0.0019; F = 10.2033, p< 0.0042 respectivamente (ANOVA).
126

O IFN- em soluo foi capaz de promover a morte significativa dos

fagcitos MN e das clulas MCF-7 de cncer de mama humano isoladas ou em

associao com MN, quando comparados a todos os grupos. Alm disso,

comparando-se os diferentes grupos de clulas, a soluo de IFN- foi especfica

na reduo da viabilidade das clulas MCF-7 e da co-cultura comparando-se aos

fagcitos MN (Figura 49).

As clulas MCF-7 de cncer de mama humano quando foram tratadas com

a nanoemulso 1NEPIFN-, sofreram uma reduo de viabilidade, quando se

compara com os outros grupos. Na comparao dos diferentes grupos de clulas,

a nanoemulso 1NEPIFN- foi especfica na reduo da viabilidade das clulas

MCF-7 e na co-cultura quando se compara aos fagcitos MN. Em resumo, a

formulao nanoemulsionada 11NEBIFN- foi capaz de promover a morte das

clulas MCF-7 de cncer de mama humano e quando em co-cultura, quando

comparada aos diferentes grupos celulares e tambm aos grupos controle

tratados.

9.7 Liberao de clcio intracelular

Os resultados de liberao de Ca2+ intracelular dos fagcitos MN e de

clulas MCF-7 de cncer de mama humano, quando encubados com os

respectivos estmulos (1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN-, e como

controles o IFN-, PBS, a disperso F127-50, e as nanoemulses 1NEP e 11NEB)

so apresentados na Figura 50 e Tabela 17.


127

Figura 50. Liberao intracelular de Ca2+ dos fagcitos MN sanguneos e das


clulas MCF-7 de cncer de mama humano indicado pela intensidade de
fluorescncia.

Os fagcitos MN do sangue perifrico humano quando tratados com as

nanoemulses 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e a micela F127-50IFN-, aumentaram a

liberao de Ca2+ intracelular.


128

Tabela 17. Liberao intracelular de Ca2+ dos fagcitos MN e das clulas MCF-7
de cncer de mama humano indicado pela intensidade de fluorescncia.

Intensidade de Fluorescncia (%)


Formulao e
controles Fagcitos MN
Fagcitos MN Clulas MCF-7 +
Clulas MCF-7

PBS + BSA 8.90 3.5 5.93 0.64 4.24 0.30#
IFN- 11.73 3.9 3.29 0.88 3.40 0.36
1NEP 5.11 1.9 1.48 0.11 1.40 0.10
11NEB 3.64 1.5 1.48 0.17 1.70 0.38

F127-50 10.65 3.5 5.94 0.16 4.76 0.52#
1NEPIFN- 27.67 15.4* 1.48 0.15 1.38 0.07
11NEBIFN- 15.48 7.4* 1.44 0.08 1.39 0.06

F127-50IFN- 63.16 18.0** 6.94 0.96 5.11 0.85##
Comparando o grupo controle (sem tratamento) com os grupos tratados. *F=10.2130, F= 61.9800 e
#
F=42.8830, respectivamente e p < 0. 0001 (ANOVA).

Houve reduo na liberao de Ca2+ intracelular pelas clulas MCF-7

quando tratadas com as nanoemulses, comparada liberao dos grupos

controle. Quando estas clulas foram tratadas pela micela F127-50IFN- se

observou aumento de liberao de Ca2+ intracelular, quando se compara com os

grupos controle PBS + BSA e IFN-.

A co-cultura de fagcitos MN com as clulas MCF-7 de cncer de mama

tratadas com F127-50IFN- apresentaram o perfil de liberao de Ca2+ simular ao

das clulas MCF-7 isoladas.


129

CAPTULO 10
130

10 DISCUSSO

No presente estudo foram desenvolvidas trs novas formulaes para

veiculao de nanodoses da citocina interferon gamma com o objetivo de

investigar a sua utilizao como agente imunomodulador da atividade funcional

dos fagcitos do sangue perifrico e de clulas de cncer de mama humano.

Foram produzidos dois tipos de sistemas nanoemulsionados (NEBIFN- e

NEPIFN-) e o terceiro com micelas nanoestruturadas (F127-IFN-).

Conforme foi mencionado, apesar de as nanoemulses, serem sistemas

termodinamicamente instveis, a otimizao da mistura de tensoativos hidroflicos

e lipoflicos por meio do clculo de EHL, tem levado a resultados consistentes que

indicam a produo de NEs estveis, apesar do valor de EHL ser um parmetro

emprico (BERNARDI et al., 2011; FERNANDES et al., 2014; FRYD; MASON,

2012; KABRI et al., 2011; LAWRENCE; REES, 2012). Neste trabalho empregou-

se esta metodologia para obter nanoemulses estveis por no mnimo 90 dias.

A frao da mistura de tensoativos utilizada para o desenvolvimento das

nanoemulses, independentemente do co-tensoativo, na razo 3,5:5,5:1,0,

proporcionou um valor de EHL igual ao requerido pelo triglicrides de cido

cprico/caprlico. O ajuste do EHL requerido pela fase oleosa permitiu a

diminuio do tamanho final da gotcula e resulta em sistemas com maior

tendncia a estabilidade, conforme se espera (HOUSAINDOKHT; POUR, 2012).

Foi possvel verificar que o emprego desta tcnica possibilitou a obteno de

diagramas pseudoternrios com amplas reas relativas a sistemas estveis, pois

eles representam uma ferramenta para determinar em quais condies os

sistemas translcidos so formados e as propores dos componentes relativos a


131

outros tipos de estruturas que tambm poderiam ser sintetizados (ABOOFAZELI

et al., 1995; FRYD; MASON, 2012).

Neste trabalho, foram observadas grandes reas de domnios de sistemas

translcidos na parte superior dos diagramas. Os resultados mostraram que

propores de tensoativo acima de 35 % para o sistema SP/TW/P e de 45 % para

o SP/TW/B resultaram em NEs homogneas e translcidas, em acordo com os

resultados encontrados na literatura (BERNARDI et al., 2011; PENG et al., 2010).

Nos diagramas obtidos para o sistema SP/TW/B observa-se uma regio

maior relativa aos sistemas nanoemulsionados quando se compara ao sistema

SP/TW/P. O co-tensoativo B promoveu a formao de NEs com at 20 % de fase

aquosa, j o co-tensoativo P limitou a formao a 15 %. A presena do co-

tensoativo na formulao da nanoemulso importante para reduzir a

concentrao de tensoativos, melhorar a mobilidade das cadeias de

hidrocarbonetos e permitir maior penetrao do leo na camada interfacial,

consequentemente melhorando a eficincia de emulsificao (CHIME;

KENECHUKWU; ATTAMA, 2014; LI et al., 2010).

Segundo dados da literatura, os diagramas pseudoternrios so

ferramentas importantes para a obteno de sistemas translcidos, no entanto,

eles no garantem a estabilidade destes sistemas ao longo do tempo ou sob

condies especiais, sendo necessria a realizao de outros tipos de testes

(RIBEIRO et al., 2015). Por exemplo, anlises reolgicas fornecem informaes

sobre os parmetros relativos estabilidade fsico-qumica das nanoemulses,

obtendo-se dados relativos estrutura do produto que permitem o

acompanhamento de modificaes decorrentes de processos de desestabilizao

(CHIME; KENECHUKWU; ATTAMA, 2014).


132

As propriedades reolgicas de disperses coloidais dependem do tipo,

forma, densidade e nmero de componentes presentes na formulao, bem como

das interaes entre eles (FRYD; MASON, 2012). Assim, mudanas

microestruturais interferem nas propriedades reolgicas do sistema (ACHARYA;

HARTLEY, 2012). No caso dos sistemas emulsionados translcidos lquidos, eles

exibem normalmente um comportamento newtoniano com viscosidade constante

para uma grande faixa de taxa de cisalhamento (ACHARYA; HARTLEY, 2012;

ROJAS et al., 2009) e, nos casos de gis, apresentam comportamento no-

newtoniano com variao de viscosidade (PESTANA et al., 2008). Nesta

investigao, os resultados obtidos da caracterizao reolgica das NEs

indicaram que a maioria delas, bem como das formulaes correspondentes,

apresentaram perfil Newtoniano, sendo portanto adequadas para uma possvel

veiculao oral ou parental (SHARMA et al., 2010), que so as vias de

administrao mais indicadas para agentes imunomoduladores. Estas

formulaes tambm no apresentaram variaes de viscosidade numa faixa de

cisalhamento de no mnimo 0 a 20 1/s.

Para a otimizao das formulaes nanoemulsionadas considerou-se o

comportamento Newtoniano com baixa viscosidade como condio para a

seleo, visando possvel aplicao parenteral, estas caractersticas so

indicadas para formulaes dedicadas a esta via de administrao, uma vez que

a administrao de emulses de alta viscosidade pode ser muito dolorosa para o

paciente (BRUXEL et al., 2012).

As caractersticas reolgicas das micelas nanonanoestruturadas (MNPs), e

das formulaes correspondentes, se mostraram diferentes daquelas obtidas para

as NEs. As disperses e formulaes nanoestruturadas apresentaram perfil no-


133

newtoniano pseudoplstico com tixotropia. Por exemplo, os valores de

viscosidade obtidos para as formulaes F127-10IFN- e F127-50IFN- so pelo

menos, mil vezes inferiores aos das nanoemulses. Em adio elas tambm

tiveram uma reduo gradual e homognea da viscosidade em funo da

temperatura para a faixa investigada.

Em resumo, as MNPs caracterizam-se como lquidos de viscosidade

reduzida, mesmo apresentando comportamento no-newtonianas, so

perfeitamente adequadas para a administrao parental (SHARMA et al., 2010).

Com exceo da formulao F127-250IFN- que apresentou variao grande de

viscosidade a partir de 19C, sendo um indicativo de alterao do estado fsico.

Adicionalmente, as avaliaes oscilatrias e a anlise do ngulo de defasagem

mostraram que a amostra F127-250 caracterizada como slido com

caractersticas predominantemente elsticas temperatura ambiente, conforme

se espera para sistemas base de pluronic (NAMBAM; PHILIP, 2012;

SHAHRIVAR; VICENTE, 2014; SOGA et al., 2005). Esta caracterstica termo

sensitiva do Pluronic-F127, foi empregada para otimizar a liberao sustentada de

IL-1Ra com o objetivo de prolongar o seu potencial teraputico (AKASH et al.,

2012).

O estudo do comportamento de gelificao das formulaes contendo os

copolmeros carreadores de drogas interessante para estabelecer parmetros

adequados para a aplicao das mesmas, uma vez que a transio sol-gel

depende da temperatura. A temperatura na qual o gel formado costuma ser

referida como temperatura de transio sol-gel, Tsol-gel. Alm disso, quanto maior a

concentrao de F127 presente na formulao menor a temperatura relativa

gelificao (SHAHRIVAR; VICENTE, 2014). Neste trabalho observou-se para a


134

formulao F127-250IFN- Tsol-gel de 19C, em acordo com a literatura onde os

valores de Tsol-gel esto na faixa de 25 e 19C considerando-se diferentes

concentrao (JONES et al., 2009; SHARMA et al., 2008).

Outro parmetro importante a temperatura micelar crtica (TMC) do

copolmero, que a temperatura a partir da qual, numa dada concentrao, as

molculas comeam a se agregar em micelas. O empacotamento micelar e a

frao de volume devem estar relacionados ao mecanismo de formao do gel.

medida que a temperatura aumenta acima da temperatura micelar crtica, micelas

so formadas, inevitavelmente aumentando a frao de volume ocupada pelos

grupos constituintes das micelas (BOHORQUEZ et al., 1999; SONG et al., 2000).

O aumento de temperatura implica em um aumento da frao de volume micelar,

at que se atinja um valor crtico. A gelificao pode ser atribuda desidratao

dos grupos hidrofbicos do copolmero no ncleo micelar, variao do volume

micelar (SONG et al., 2000) ou a um aumento no nmero de agregados

(BOHORQUEZ et al., 1999). De acordo com a literatura, para o copolmero F127,

a TMC para a formao de micelas de 12C (JEON et al., 2002; SONG et al.,

2000). Portanto, em determinadas concentraes do copolmero, o aumento da

temperatura promove um maior entrelaamento das cadeias polimricas

contribuindo para a formao de gis (MARTINS et al., 2009).

O potencial do sistema F127-250 para veiculao de citocinas no foi

negligenciado, no entanto, considera-se que sistemas com transio lquido/slido

tenham aplicao especficas, os quais no momento no foram contempladas nos

objetivos deste trabalho.

A disperso de luz uma tcnica de rotina para determinao do dimetro

hidrodinmico (DH), e a polispersividade de sistemas coloidais nanoestruturados


135

(FRYD; MASON, 2012). Em adio, o potencial zeta tambm obtido no mesmo

equipamento empregado para as anlises EDL. Nossos resultaram mostraram

que o sistema NEP, independente da incorporao do ativo ou no, apresentou

potencial em torno de - 40 mV, polidispersividade entre 0,30 e 0,45, mas com

tendncia reduo do dimetro das gotculas nas formulaes com a

incorporao do IFN-. A formulao 5NEP apresentou indicativo de

desestabilizao, pois apresentou DH elevado e variao do potencial , tendendo

a zero para a formulao correspondente aps a ultra homogeneizao e

incorporao do IFN-. Para as formulaes selecionadas deste sistema, a

1NEPIFN- e a 3NEPIFN-, obteve-se valores de DH iguais a 205 nm e 183 nm,

com Pdi de 0,41 e 0,38, respectivamente.

As NEs e formulaes do sistema NEB apresentaram valores de potencial

entre -30 e -40 mV, polidispersividade entre 0,20 e 0,45. Diferentemente do que

ocorreu para o sistema NEP, com a incorporao do IFN- houve tendncia a de

aumento do valor do DH. As formulaes seleciondas 10NEBIFN- e 11NEBIFN-

apresentaram DH de 97,42 e 75,55 nm, respectivamente, ambas com Pdi 0,22,

tendo sido escolhidas em virtude das menores variaes de dimetro

hidrodinmico, Pdi e perfil reolgico satisfatrio.

A pesar destas tendncias de variao do DH, aps a incorporao de

nanodoses do IFN- no houve modificaes significativas e nem indicativo de

clara relao com aumento ou diminuio do DH para os sistemas

nanoemulsionados, podendo as variaes dos dimetros hidrodinmicos estar

relacionadas com as foras inicas de superfcie indicadas pelo potencial .


136

O potencial negativo das formulaes NEs poderia facilitar o acesso da

molcula de IFN- interface, devido atrao eletrosttica, uma vez que o IFN-

em pH neutro tende a apresentar carga positiva. Contudo, houve dificuldades de

determinar sua presena na regio dispersa, dispersante e /ou na interface em

virtude da baixa concentrao de IFN-.

Resultados de trabalhos realizados apontam que a interao entre a

formulao e a protena no deve conduzir a mudanas conformacionais ou

permanentes para no causar efeitos biolgicos indesejados, tais como a perda

de atividade ou toxicidade. A adio de agentes tensoativos, tais como Tweens e

Pluronics, resultou em um aumento da capacidade do IFN- permanecer bioativo

(BAM; RANDOLPH; CLELAND, 1995). A interao entre o IFN- e os agentes

tensoativos pode ser principalmente eletrosttica, no entanto, a protena pode ser

parcialmente incorporada poro hidrofbica em funo da presena de regies

hidrofbicas na estrutura do IFN- (VAN SLOOTEN et al., 2000). Ambos

mecanismos, podem desempenhar um papel importante na interao entre o IFN-

, os tensoativos, a fase oleosa e aquosa e/ou copolmero F-127. Portanto, em

funo das caractersticas anfiflicas e da conformao tridimensional de

molculas proteicas, como o IFN-, o IFN- poderia estar disperso na fase

tensoativa, tambm anfiflica, das nanoemulses. Esta hiptese de interao

protena-tensoativo por meio de resduos hidrofbicos de ambas as molculas,

inclusive para micelas de F-127, j foi relatada na literatura (ENGLAND, 1999;

PEC; WOUT; JOHNSTON, 1992) e acredita-se que em vrios casos, a interao

hidrofbica seja mais importante do que a interao eletrosttica (MANIASSO,

2001).
137

A grande quantidade de tensoativos, quando comparado do IFN- poderia

explicar o fato de que mesmo se o IFN-, carregado positivamente em pH 7, se

associasse com a fase tensoativa por meio de interaes eletrostticas, no

afetaria de forma significativa o potencial zeta negativo das nanoemulses. Alm

disso, em virtude da baixa presena de IFN- na superfcie das nanoestruturas se

esperaria uma pequena influncia da sua adio sobre o dimetro hidrodinmico,

conforme foi observado para algumas das formulaes.

interessante mencionar resultados de IFN- encapsulado na matriz de

nanopartculas de albumina resultando em formulaes que visaram o controlo de

infeces causada por Brucella sp. (SEGURA et al., 2007) e do IFN- veiculado

em lipossomas para atuao como adjuvante com vacinas antivirais (SLOOTEN

et al., 2001) e anti-tumorais (SLOOTEN et al., 2000).

O sistema F127 independente da concentrao do ativo formado por

micelas com tamanhos hidrodinmicos de 26 e 5 nm, para os sistemas F127-

10IFN- e F127-50IFN-, respectivamente. Estes dados esto de acordo com

resultados descritos da literatura, mostrando micelas de F127 da ordem de 6 nm,

e que a adio de substncia ativa eleva de forma moderada o tamanho da

micela (PY-DANIEL et al., 2016).

O potencial desempenha um papel importante na estabilizao de NEs,

pois reflete o potencial superficial das gotculas. Este potencial depende do grau

de ionizao dos tensoativos e, portanto, do pH (BENITA; LEVY, 1993), tornando-

se mais negativo com o aumento do pH. Os elevados valores de potencial

obtidos para as formulaes nanoemulsionadas indicam que foram produzidas

disperses coloidais com caractersticas inicas que impedem a coalescncia


138

entre as gotculas, indicando estabilidade adequada (HONARY; ZAHIR, 2013;

LAWRENCE; REES, 2012).

O valor negativo de pode ser atribudo possvel presena de cargas

superficiais negativas oriundas de grupos carboxilas e hidroxilas presentes na

regio polar das molculas dos tensoativos tween e span 80, uma vez que a

dissociao destas colaboram para o aumento do pH e consequentemente dos

valores do potencial .

Para as formulaes NEPIFN- a interao eletrosttica do IFN-,

positivamente carregado a pH 7, com os sistemas nanoemulsionados 1NEP e

3NEP pode ter sido mais eficaz. Os valores do potencial das nanoemulses

1NEP e 3NEP iguais a -37,96 e - 41,27 mV, respectivamente diminuiram aps a

incorporao do IFN-, obtendo-se valores de -34,43 e -38,00 mV para as

formulaes 1NEPIFN- e 3NEPIFN-, respectivamente. Porm, no caso das

formulaes NEBIFN- os resultados no indicaram o mesmo tipo de interao,

obtendo-se para as NEs 10NEB e 11NEB, valores de iguais a -32,30 e - 28,30

mV, respectivamente, os quais aps a incorporao de IFN- tiveram uma

variao menor, aumentando para -33,70 e -30,30 mV para as formulaes

10NEBIFN- e 11NEBIFN-, respectivamente. Adicionalmente, no caso dos

sistemas F127, os resultados indicaram que pode ter ocorrido algum tipo de

interao eletrosttica do IFN- com as disperses F127-10 e F127-50 pois os

valores do potencial iguais -1,86 e -2,17 mV, obtidos antes da incorporao de

IFN- diminuiu para a formulao F127-10IFN- e ficou positivo para a F127-

50IFN- (-1,54 e +2,95 mV, respectivamente).


139

Os copolmeros em bloco, apresentam carter anfiflico em soluo aquosa

e tendem a se concentrar nas interfaces do sistema por adsoro visando reduzir

a energia livre do sistema onde se encontram. medida que a concentrao do

copolmero aumenta em uma soluo, as interfaces do sistema comeam a se

saturar, e a estabilizao do sistema pode continuar por meio da formao de

micelas. Conforme foi mencionado, os copolmeros em bloco possuem a

capacidade de se organizar em soluo, para certas faixas de concentrao e

temperatura, formando estruturas micelares. A concentrao em que h formao

de micelas denominada concentrao micelar crtica (CMC). Portanto, a

formao das micelas estveis em soluo aquosa impulsionada pela

hidrofobicidade das pores apolares de suas molculas, e pela hidrofilicidade

das pores polares (MANIASSO, 2001; ROSEN, 2004; ZHOU et al., 2011). As

micelas no so estticas, elas existem dentro de uma dinmica de equilbrio,

simplesmente como um agregado dinmico (MANIASSO, 2001). Este

comportamento poderia explicar os valores dos ndices de polidispersividade

acima de 0,3 apresentados pelas disperses F127-10 e F127-50, bem como para

as formulaes F127-10IFN- e F127-50IFN-. Em adio, no caso disperso

F127-10, a concentrao do copolmero (10 mg.mL-1), prxima dos limites da

concentrao micelar crtica (CMC), podendo influenciar no aumento da

polidispersividade. Na formao micelar a diminuio da tenso superficial

ocasiona uma diminuio da entropia, neste caso considera-se a energia livre de

Gibbs menor do que zero o que permite a estabilidade termodinmica das micelas

nanoestruturadas preparadas em solues aquosas como as de PBS (WANG et

al., 2014). Portanto, as formas micelares e livres das molculas do copolmero


140

Pluronic esto organizadas em um equilbrio dinmico para formar micelas

estericamente estabilizadas com reduzido potencial zeta (AGARWAL et al., 2007).

A reduo do ndice de polidispersividade a partir da homogeneizao do

meio um processo esperado durante a sntese de nanoemulses, visto que elas

dependem do tipo de agitao empregado e da ordem de adio dos

componentes (GHOSH et al., 2013), o que tambm se reflete no tamanho das

gotculas. As nanoemulses preparadas apresentaram dimetro hidrodinmico

superior aos das micelas nanoestruturadas, o que est de acordo com dados da

literatura (BONIFCIO et al., 2014; KIM et al., 2014; ONOUE; YAMADA; CHAN,

2014; SMITH et al., 2013). Observa-se na literatura resultados sobre o

desenvolvimento de nanoemulses com gotculas da ordem de 100 nm ou inferior

(BERNARDI et al., 2011; CHIME; KENECHUKWU; ATTAMA, 2014; PRATAP et

al., 2012) e micelas com tamanhos na faixa de 5 nm (NAMBAM; PHILIP, 2012).

Alm dos aspectos reolgicos, das tcnicas de espalhamento de luz, as

avaliaes fsico-qumicas de estabilidade fornecem informaes que indicam o

grau de estabilidade relativa de um produto em diversas condies (PESSOA et

al., 2014; RIBEIRO et al., 2015). Por exemplo, o teste de centrifugao permite

avaliar a estabilidade de formulaes, mas deve ser considerado como teste de

triagem, pois permite a observao de separao de fase que ocorre quando um

sistema submetido a diferentes condies gravitacionais (RIBEIRO et al., 2015).

Todas as formulaes, independente do sistema e da temperatura,

preliminarmente mostraram estabilidade macroscpica aps a centrifugao,

assim como, aspecto translcido e homogneo durante todo o perodo dos testes,

o mesmo ocorreu com as formulaes incorporadas com IFN- resultando em

NEs e disperses estveis (TADROS et al., 2004).


141

As propriedades fsico qumicas das disperses coloidais tais como a o pH

e a condutividade eltrica, os quais fornecem informaes sobre a estabilidade de

disperses coloidais, podem variar com tratamentos trmicos (MARTIN; SINKO;

SINGH, 2011; RIBEIRO et al., 2015). As formulaes sintetizadas foram

consideradas estveis aps testes de resfriamento e/ou aquecimento. Os

resultados no mostraram grandes variaes de valores de pH e condutividade

eltrica aps o estresse trmico e as formulaes, independente do sistema,

apresentaram translucidez e homogeneidade visual durante todo o perodo de

realizao dos testes de estabilidade acelerada. O pH das formulaes

apresentaram reduo com o decorrer do estudo, mas mantiveram-se na faixa 5,5

e 7,5. A condutividade eltrica manteve-se superior a 1,3 S.cm-1. As alteraes

de pH observadas no foram suficientes para alterar a integridade das

nanoemulses, as quais mostraram-se biocompatveis, uma vez que no

organismo humano encontra-se valores que oscilam entre 4,5 a 7,0, dependendo

da regio anatmica do tecido (ANSARI, 2009). Adicionalmente, as alteraes na

condutividade no foram significativas e no afetaram o dimetro das gotculas

das nanoemulses estveis (BERNARDI et al., 2011). Porm, pode-se afirmar

que a manuteno da condutividade eltrica um indcio da estabilidade de

emulses, mas no deve ser considerado como fator determinante, pois a relao

entre a variao da condutividade e a instabilidade das mesmas no linear

(BERNARDI et al., 2011; MASMOUDI et al., 2005).

Os principais processos envolvidos com a estabilidade das NEs so a

cremeao, floculao e coalescncia. A estabilidade destes sistemas pode ser

alcanada por meio de dois mecanismos principais, a estabilizao estrica e a

eletrosttica. A estabilizao eletrosttica ocorre devido s foras de repulso


142

entre as gotculas, o que promove uma maior estabilidade frente s foras de

atrao, tendo em vista que por apresentarem mesma constituio elas

apresentam cargas superficiais semelhantes (CAPEK, 2002). Este mecanismo

pode ser observado nas amostras de NEs e formulaes sintetizadas com base

no potencial zeta elevado durante todo perodo de estabilidade acelerada.

Adicionalmente, a estabilidade estrica se torna importante quando so

empregados tensoativos no inicos na superfcie, como os utilizados neste

trabalho. A alta estabilidade coloidal das NEs pode ser tambm entendida a partir

de sua estabilizao estrica, por meio da reduo dos efeitos de coalescncia

sobre o sistema. Alm disso, o movimento browniano presente nessas

formulaes supera os efeitos da fora de gravidade atuantes nessas gotculas

(TADROS et al., 2004). O tamanho reduzido dos glbulos dificulta a deformao

destes, diminuindo ainda mais a instabilidade por coalescncia. A pequena

espessura do filme interfacial, em comparao ao tamanho dos glbulos, dificulta

o rompimento desses glbulos por reduo natural deste filme (FERNANDEZ et

al., 2004; SOLANS et al., 2005).

Considerando-se os resultados que disponveis na literatura, este estudo

pioneiro na realizao de estudos de estabilidade de micelas. Os resultados

mostraram que a formulao F127-10IFN- teve sua translucidez reduzida a partir

de 30 dias de tratamentos trmicos, instabilidade esta, confirmada posteriormente

pela variao dos perfis reolgicos.

O monitoramento das caractersticas reolgicas, em funo do tempo, tem

se mostrado uma ferramenta importante para a determinao da estabilidade de

sistemas emulsionados (COTRIM; HONORIO-FRANA; FRANA, 2016;

RIBEIRO et al., 2015). Formulaes emulsionadas que mantm o perfil de fluxo e


143

viscosidade constantes durante o estudado de estabilidade tm sido consideradas

estveis, mesmo em condies extremas (COTRIM; HONORIO-FRANA;

FRANA, 2016; PESSOA et al., 2014). Neste trabalho, as nanoemulses

apresentaram fluxos sem variao do perfil Newtoniano durante todo o perodo

avaliado, assim como a formulao F127-50IFN- manteve o seu perfil no-

newtoniano. As formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN- no

apresentaram variaes em seus perfis de viscosidade durante os 90 dias de

avaliao. Enquanto que, a variao do perfil de viscosidade das formulaes

3NEPIFN- e 10NEBIFN- limitaram a estabilidade delas a um perodo inferior a

45 dias. Os resultados indicam que o perfil de fluxo o agente limitante da

estabilidade de sistemas nanoemulsionados, enquanto que para os sistemas

micelares os limites de estabilidade podem ser indicados por meio de variao do

perfil de viscosidade.

Os valores registrados para o DH das formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN-

e F127-50IFN- se mantiveram praticamente constantes em funo dos

tratamentos trmicos. Adicionalmente, os valores de potencial das

nanoemulses mantiveram-se em valores negativos elevados indicando as

caractersticas inicas por longo perodo, no havendo coalescncia entre as

gotculas (HONARY; ZAHIR, 2013). A reduo da carga resultante, em mdulo,

da ordem de 40 mV para valores inferiores a 25 mV tende a provocar um aumento

na taxa de floculao e coalescncia das formulaes (ROLAND et al., 2003),

conforme ocorreu no caso da amostra 5NEP quando o IFN- foi incorporado.

Os dados de tamanho hidrodinmico so um bom indicativo de estabilidade

de formulaes, pois um rpido aumento no tamanho do glbulo indica baixa


144

estabilidade do sistema (BERNARDI et al., 2011). Portanto, a manuteno do DH,

em todas as condies de temperatura, observados para os sistemas

desenvolvidos, so indicativos de alta estabilidade.

Com relao aos valores obtidos para a concentrao de IFN- nas

formulaes preparadas, apesar da tendncia de reduo ao longo do perodo do

estudo, eles foram mantidos constantes para 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-

50IFN-, mesmo em temperaturas extremas, o que no foi verificado para a

3NEPIFN-. Este determinao especfica de IFN- por citometria indica que nas

formulaes estveis o mesmo permanece com sua estrutura conformacional

ntegra e a literatura relata que a ausncia da manuteno da integridade da

estrutura das protenas uma das desvantagens encontradas durante o

desenvolvimento de sistemas de veiculao de citocinas (SEGURA et al., 2005).

As avaliaes fsico-qumicas, reolgicas, por espalhamento de luz e

dosagem do ativo, em conjunto, indicam que as formulaes otimizadas so as:

1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN-, pois apesentaram estabilidade por

longo perodo, o que as credenciaram para os estudos biolgicos.

Um aspecto relevante na utilizao de nanomateriais o aspecto citotxico

dos novos sistemas desenvolvidos, mesmo que, quando em suas formas bulk

tenham dados toxicolgicos conhecidos (NEL et al., 2006). A viabilidade dos

fagcitos foi investigada por meio do protocolo que emprega o alaranjado de

acridina e microscopia de fluorescncia. Verificou-se que a viabilidade dos

fagcitos no sofreu danos aps a incubao com as nanoestruturas

desenvolvidas. Independentemente do tempo de incubao, os dados de


145

viabilidade celular dos grupos tratados mantiveram-se iguais ou superiores a do

grupo controle.

A avaliao de danos ao DNA e RNA de formulaes encubadas com

1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN- por meio mtodo do alaranjado de

acridina e corante fluorocromo vital metacromtico (FRENSTER, 1971; SMITH;

ROMMEL, 1977) permitiu concluir que os nanosistemas produzidos no causam

morte s clulas MN do sangue e, por conseguinte, no apresentam indcios de

efeitos citotxicos.

Os resultados obtidos por meio dos testes citotxicos confirmam a

biocompatibilidade das formulaes produzidas, as quais favorecem a aplicao

do IFN- sem agredir o meio biolgico, com chances de melhorar a eficincia

teraputica, facilitar a administrao e possibilitar uma vetorizao do mesmo ao

sistema imunolgico.

A imunomodulao um procedimento que interfere nas funes do

organismo, pois altera o sistema imunolgico que pode ser estimulado ou

suprimido (MAKARE; BODHANKAR; RANGARI, 2001). A atuao de interferons

na terapia imunolgica depende da capacidade de se atingir os alvos especficos

em dose e local adequados (DUNN; KOEBEL; SCHREIBER, 2006). Investigaes

importantes tm sido conduzidas visando a aplicao de sistemas de veiculao

de interferons, com diferentes substncias orgnicas, para modular clulas MN

potencializando a fagocitose e a atividade microbicida (FAGUNDES et al., 2012;

HARA et al., 2013; POSSAMAI et al., 2013; REINAQUE et al., 2012; SCHERER et

al., 2011), inclusive com a utilizao de sistemas nanoestruturados (PESSOA et

al., 2014; RIBEIRO et al., 2015). Neste estudo observou-se que nanodoses de
146

IFN- incorporados em nanoemulses e micelas nanoestruturadas apresentam

efeitos moduladores diretamente sobre as funes e atividades dos fagcitos MN

do sangue humano. Resultados semelhantes referentes influncia de citocinas

na atividade funcional de fagcitos em bactrias (FAGUNDES et al., 2013) e

protozorios (MORAES et al., 2015) foram relatados, em acordo com os

resultados aqui registrados.

A liberao de nion, fagocitose e atividade microbicida, associados com a

resposta intracelular de Ca2+, seja por fagcitos do colostro humano ou do sangue

tm sido considerados como importante indicadores do mecanismo de defesa

para vrias infeces bacterianas (FRANA et al., 2010; MORCELI et al., 2011)

fngicas (KUHLWEIN; IRWIN, 2001), e por protozorios (FRANCA-BOTELHO et

al., 2011). Quando os fagcitos MN foram tratados com as formulaes 1NEPIFN-

e 11NEBIFN-, a liberao de nion foi significativamente superior espontnea

e independente do tempo de incubao. Adicionalmente, apesar do IFN- ser um

mediador da estimulao da sntese de intermedirios reativos de oxignio e de

xido ntrico (FARRAR; SCHREIBER, 1993), quando ele foi incubado na

concentrao em estudo isoladamente, no promoveu a estimulao, apenas

quando foi veiculado por meio das formulaes nanoemulsionadas.

A gerao de radicais livres um importante mecanismo de defesa do

organismo durante processos infecciosos, sobretudo em infeces intestinais

(FRANA et al., 2011b; FRANA-BOTELHO et al., 2011; HONORIO-FRANA et

al., 1997). As clulas so capazes de produzir grandes quantidades de radicais

superxido durante um estresse oxidativo, mas o mesmo pode ser

consideravelmente estimulado por compostos endgenos ou exgenos


147

(NASCIMENTO et al., 2006; ROBERTSON, 2004), como a melatonina

(HONORIO-FRANA et al., 2013a; PAWLAK et al., 2005) e extratos vegetais

(FRANA et al., 2010, 2012), respectivamente. Neste estudo, comparando-se o

mesmo tratamento com as formulaes desenvolvidas em funo do tempo (de 0

a 2h), os moncitos sanguneos apresentaram eficincia fagoctica superior aos

controles (PBS, 1NEP e 11NEB) apenas depois de 30 mim de incubao, sendo

que o IFN- teve atividade superior ao grupo espontneo no incio e aos 30 mim.

Os sistemas 1NEPIFN- e 11NEBIFN- apresentaram estimulao em todo o

perodo do estudo, assim como F127-50IFN-, com exceo para 60 mim. As

nanoestruturas prologaram em 1,5 h o tempo de atuao do estmulo promovido

pelo IFN- nas clulas fagocticas, quando se compara ao resultado da mesma

dose de IFN- puro. Estes resultados podem decorrer da interao do sistema

desenvolvido com as clulas. A interao nanosistemas e clulas sanguneas

um aspecto importante, pois o processo de internalizao depende da

concentrao da nanoestrutura e do dimetro hidrodinmico (SANTANA et al.,

2005; SOLER et al., 2007). Estas caractersticas podem estar diretamente

relacionadas com a estimulao da fagocitose.

A melhora do desempenho de molculas ativas em sistemas

nanoestruturados de veiculao podem ser relacionadas melhoria dos

parmetro farmacocinticos, estabilidade metablica, a alta permeabilidade nas

membranas (ONOUE; YAMADA; CHAN, 2014) e tambm, conforme foi observado

para as formulaes desenvolvidas, o aumento do tempo de atuao.

Adicionalmente, verificou-se que todas as nanoestruturas desenvolvidas para

veiculao do IFN- estimularam a fagocitose, em algum tempo de incubao,


148

com destaque para 1NEPIFN- que foi efetiva nos tempos de 30, 60 e 120 mim.

Os nanosistemas aqui desenvolvidos mostraram resultados de destaque quanto

ao tempo e ao potencial de estimulao dos fagcitos, quando comparados com

experimentos relativos estimulao da atividade funcional dos leuccitos e

bactrias (FRANA et al., 2009, 2011b; FRANCA-BOTELHO et al., 2011;

HONORIO-FRANA et al., 2013a; RASSIAS et al., 1999).

Clulas mononucleares desempenham um papel importante na defesa do

hospedeiro. Os moncitos no tecido conjuntivo ou parnquima de rgos do

origem a macrfagos e clulas dendrticas mieloides. Os moncitos e macrfagos

so fagcitos eficientes, engolfando patgenos e debris celulares (CRUVINEL et

al., 2010; DALE; BOXER; LILES, 2008). Elas produzem NADPH oxidase

fagoctica, que forma o superxido ativo para fagocitar bactrias e indispensvel

para o sucesso das respostas imunes e reaes inflamatrias (DIZDAROGLU et

al., 2002). Neste estudo, onde as clulas e as formulaes estavam em soluo e

no dispostas em monocamadas celulares, nestas condies e tempos de

incubao, a atividade fagcitica est relacionada possivelmente atividade dos

moncitos por no haver estmulos suficientes para sua diferenciao em

macrfagos. Alguns estudos com base em sistemas nanoestruturados destinados

a estimular a atividade fagoctica e microbicida so encontrados na literatura, mas

nenhum para veiculao de interferon (FAGUNDES et al., 2012; HARA et al.,

2013; POSSAMAI et al., 2013; REINAQUE et al., 2012; SCHERER et al., 2011).

Por exemplo, nanosistemas contendo hormnios como o cortisol (FAGUNDES et

al., 2012; RASSIAS et al., 1999), e a melatonina (FRANA et al., 2009; FRANA-

BOTELHO et al., 2011; HARA et al., 2013), nano fraes de Momordica charantia

(SCHERER et al., 2011), e prpolis (POSSAMAI et al., 2013), apresentaram


149

propriedades capazes de estimular a fagocitose. As formulaes desenvolvidas

neste estudo foram capazes de ativar a atividade fagoctica, porm este aumento

no se refletiu sobre os mecanismos microbicidas celulares. Apesar das

nanoestruturas estimularem a fagocitose, provavelmente a interao entre os

componentes dos sistemas pode ter desencadeado outros mecanismos de

eliminao da bactria em relao aos mecanismos microbicidadas intracelulares.

Estes resultados confirmam dados da literatura que relatam que fagcitos do

sangue de cordo umbilical expostos a EPEC e estimuladas por IFN- tambm

mostram um aumento na fagocitose, mas no da atividade microbicida

(FAGUNDES et al., 2013). Estudos indicam que estas clulas apresentam baixa

atividade microbicida porque elas no possuem receptores de superfcie

especficos (FRANA; HONORIO-FRANA, 2012).

A estimulao imunolgica, no diretamente ligada atuao microbicida,

tem sido o foco de diversos estudos e a literatura tem revelado que o IFN-

desempenha um papel crtico e fisiologicamente relevante na promoo dos

mecanismos de resistncia do hospedeiro a infeces microbianas (IKEDA; OLD;

SCHREIBER, 2002). Os processos de imunizao tambm tm sido foco deste

tipo de estudo e lipossomas contendo IFN- tm se mostrado eficazes (VAN

SLOOTEN et al., 2001a). Adicionalmente, o papel do IFN- na proteo contra o

desenvolvimento de clulas tumorais, no processo dinmico de vigilncia imune e

na progresso tumoral tem sido relatado, mas ainda no esclarecido

(SCHRODER et al., 2004). Neste estudo, em experimentos in vitro, as

formulaes 1NEPIFN- e 11NEBIFN- mostraram atividade antitumoral contra

clulas MCF-7 de cncer da mama humano e em co-cultura com fagcitos MN,


150

respectivamente, conforme foi observado por meio das redues na viabilidade

celular e na liberao de clcio intracelular.

Neste projeto, o ensaio de fluorescncia de PI (DENGLER et al., 1995) foi

empregado para investigar a capacidade do IFN- de diminuir o crescimento dos

fagcitos MN, das clulas MCF-7 e da co-cultura formada por ambas. Esta

inibio do crescimento celular foi mais evidente quando as clulas foram tratadas

com IFN- puro em soluo para todos os grupos celulares. Estes resultados

esto de acordo com a literatura quando foi estudada a ao de IFN- em clulas

tumorais (MILLER; MAHER; YOUNG, 2009) e, ao encontrarmos indcios de

reduo da viabilidade dos fagcitos MN, confirmando a hiptese de que o

emprego desta citocina deve ser modulada de forma a no prejudicar a ao do

sistema imunolgico (ZAIDI; MERLINO, 2011). Este comportamento foi

confirmado com os dados que indicam que as formulaes 1NEPIFN- e

11NEBIFN- foram capazes de veicular de forma eficiente o IFN-, mantendo as

propriedades antitumorais e modulando sua ao nos fagcitos MN.

A literatura indica que quando os frmacos so administrados na forma de

NEs, podem apresentar maior atividade e menor toxicidade em relao forma

de soluo, visto que se acumulam principalmente nos tumores, onde o endotlio

dos capilares fenestrado, permitindo a passagem de gotculas de at 400 nm

(BRUXEL et al., 2012). Alm disso, os relados indicam que o desenvolvimento de

uma NE no apenas um meio adequado de solubilizar uma molcula, mas sim

um fator essencial para a obteno dos efeitos clnicos desejados. Para a maior

parte dos frmacos, a estratgia utilizada visa a reduo dos efeitos adversos,

mantendo um efeito farmacolgico alto ou superior, possibilitando a utilizao de


151

menores doses e melhorando a farmacocintica da molcula (DUTTA; EBLING,

1997).

Para a formulao F127-50IFN- no se observou a capacidade de diminuir

o crescimento celular em nenhum dos grupos por meio do ensaio de fluorescncia

de PI. Apesar disso, este sistema foi capaz de aumentar a liberao do clcio

intracelular nas clulas MCF-7 e na co-cultura, fato este que pode estar

relacionado a um gatilho apopttico posterior (ORRENIUS; ZHIVOTOVSKY;

NICOTERA, 2003), o que indica a necessidade de um ensaio especfico para

estes grupos celulares.

O on clcio um segundo mensageiro que tem papel fundamental na

regulao de vrios processos biolgicos. Um aumento na concentrao de Ca 2+

citoplasmtico representa um passo crucial para a liberao de neutrasmissores e

para a modulao da excitabilidade de membranas celulares (PRADO, 2001).

Neste estudo, a ativao dos fagcitos MN foi evidenciada pela atuao dos

estmulos na liberao do clcio. As formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e

F127-50IFN- apresentaram efeitos diretos sobre os fagcitos do sangue, sendo

capazes de aumentar significativamente a liberao de clcio intracelular.

Consequentemente, pode-se verificar que os mecanismos celulares foram

ativados pelos estmulos nanoestruturados aqui desenvolvidos. Contudo,

importante ressaltar, que embora o Ca2+ seja fundamental manuteno da vida,

um aumento prolongado na concentrao deste on pode levar a clula morte

(LEE et al., 2000). O controle da sua liberao relevante visto que o clcio

intracelular interfere diretamente nos processos celulares incluindo a proliferao,

diferenciao e morte celular (FERRARI et al., 2002).


152

A imunomodulao como um todo, e no apenas na liberao de clcio,

deve ser controlada e eficiente para promover a erradicao da patologia sem

causar dano ao hospedeiro (MANDAL et al., 2010; SAJAN et al., 2009), portanto,

a utilizao de sistemas de liberao nanoestruturados, como os aqui

desenvolvidos, efetiva e vivel para a veiculao e estimulao promovida pelo

IFN-.
153

CAPTULO 11
154

11 CONCLUSES

Os resultados obtidos mostraram a viabilidade de sntese de sistemas

nanoestruturados para liberao de interferon gamma (IFN-) com o objetivo de

sua utilizao como agente imunomodulador. Foram desenvolvidas trs

formulaes, sendo duas delas na forma de nanoemulses, a partir dos sistemas

SP/TW/P ou SP/TW/B) e a terceira com base no copolmero Pluronic F127.

As investigaes que levaram otimizao das formulaes foram

baseadas nos diagramas pseudoternrios, caracterizao reolgica e por

espalhamento de luz dinmica, estudo de estabilidade preliminar e acelerada. Em

adio, foram realizados ensaios biolgicos como a avaliao de viabilidade

celular, liberao de nion superxido, fagocitose, atividade microbicida,

avaliao da permeabilidade celular ao iodeto de propdio e de liberao de clcio

intracelular. Os resultados obtidos podem ser resumidos em:

A proporo dos componentes dos sistemas SP/TW/P e SP/TW/B igual

a 3,5:5,5:1,0 foi obtida considerando-se o EHL requerido pela fase

oleosa e produziu diagramas para cada tipo com grande nmero de

sistema nanoemulsionados (9 SP/TW/P e 13 SP/TW/B) de um total de

72 preparados;

Os resultados obtidos a partir da caracterizao reolgica indicaram

que das 9 nanoemules pr-selecionadas para o sistema NEP, 3

apresentaram fluxo Newtoniano e viscosidade linear, mesmo no caso

das formulaes correspondentes com a incorporao de IFN-, sendo

selecionadas apenas 2;
155

Enquanto que, dos 13 pontos pr-selecionados para o sistema NEB, 8

apresentaram fluxo Newtoniano e viscosidade linear, bem como para

as formulaes correspondentes, aps a incorporao do IFN-, sendo

selecionadas apenas 2;

No caso das disperses e formulaes micelares, as amostras F127 a

10 e 50 mg.mL-1 apresentaram fluxo No-Newtoniano, pseudoplstico

com tixotropia e viscosidade no linear;

A disperso F127 a 250 mg.mL-1 comporta-se como um slido elstico

temperatura de 25C, com mudana de estado fsico a 19C,

apresentado caractersticas lquidas viscosas abaixo desta

temperatura, o mesmo ocorre para as formulaes com a incorporao

do IFN-;

As formulaes nanoemulsionadas selecionadas 1NEPIFN-,

3NEPIFN-, 10NEBIFN- e 11NEBIFN- apresentaram potencial em

torno de - 40 mV e tamanho hidrodinmico igual a 205, 183, 97 e 76

nm respectivamente.

Enquanto as formulaes F127-10IFN- e F127-50IFN- apresentaram

potencial neutro e DH de 26 e 5 nm, respectivamente.

Das formulaes avaliadas, 1NEPIFN-, 3NEPIFN-, 10NEBIFN-,

11NEBIFN-, F127-10IFN- e F127-50IFN- foram aprovados nos

testes de estabilidade preliminar;

As formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN- apresentaram

estabilidade em condies extremas durante 90 dias, apresentando pH


156

biocompatvel, perfil reolgico, DH, potencial e dosagem de IFN- sem

alteraes;

As formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN- mantiveram

os ndices de viabilidade celular elevados comparados com o grupo

controle (PBS);

As nanoemulses 1NEP, 11NEB, e as formulaes 1NEPIFN- e

11NEBIFN- estimularam significativamente a liberao de nion

superxido;

As formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN- estimularam

significativamente a fagocitose;

As formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN- no

estimularam diretamente a atividade microbicida;

O IFN- em soluo promoveu a morte dos fagcitos MN, de clulas

MCF-7 de cncer de mama humano e da co-cultura destes;

A nanoemulso 11NEBIFN- induziu a morte das clulas MCF-7 de

cncer de mama humano;

A nanoemulso 1NEPIFN- promoveu a morte de clulas MCF-7 de

cncer de mama humano quando em co-cultura com os fagcitos MN;

As formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN- estimularam

a liberao de clcio intracelular nos fagcitos MN;

A formulao F127-50IFN- estimulou a liberao de clcio intracelular

nas clulas MCF-7 de cncer de mama humano;


157

Em resumo, as nanoemulses estveis do tipo leo-em-gua, 1NEPIFN- e

11NEBIFN- contendo nano doses de IFN- foram preparadas por ultra-

homogeneizao empregando gua destilada, triglicerdeo de cido

cprico/caprlico, oleoato de sorbitano (SP), polissorbato 80 (TW) e propilenoglicol

(PG) ou 1-butanol (BT). Estas formulaes, 1NEPIFN- e 11NEBIFN-,

apresentam fluxo Newtoniano, viscosidade linear, potencial em torno de - 40 mV

e tamanho hidrodinmico de 205 e 76 nm, respectivamente. A disperso formada

por micelas do copolmero Pluronic F127 (F127-50IFN-) em soluo tampo

fosfato (pH 7.4) na concentrao de 50 mg.mL-1 contendo nano doses de IFN-,

se mostrou-se estvel durante o perodo em estudo. A formulao F127-50IFN-

apresenta fluxo no-Newtoniano, pseudoplstico com tixotropia, viscosidade no

linear, potencial neutro e tamanho hidrodinmico de 4,5 nm. Em condies

extremas durante 90 dias as formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN-

apresentam pH biocompatvel, enquanto o perfil reolgico, DH, potencial e a

dosagem de IFN- permanecem sem alteraes. Os resultados obtidos com o

IFN- veiculado nas formulaes desenvolvidas mostraram a possibilidade de

otimizar a atividade imunomoduladora em infeces intestinais, indicada pelo

aumento da liberao de nion superxido, da fagocitose e da liberao de Ca2+

intracelular em fagcitos do sangue humano quando se compara aos controles.

Com relao s clulas cancergenas, o efeito foi observado por meio da reduo

do crescimento das clulas MCF-7 e associados aos mecanismos

desencadeados pelo Ca2+ neste grupo celular e nos fagcitos MN. Estes

resultados indicam que as formulaes sintetizadas so promissoras para a


158

modulao do sistema imunolgico mediado por clulas, abrindo novas

perspectivas para melhorar a eficincia de terapias base de IFN-.

Finalmente, como perspectiva de trabalhos futuros, sugere-se investigar as

formulaes 1NEPIFN-, 11NEBIFN- e F127-50IFN- por meio de outras

vias/testes especficos de modulao celular, como por exemplo, a apoptose dos

fagcitos MN e das clulas MFC-7, alm de testar as nanoestruturas

desenvolvidas em outras linhagens de clulas cancergenas. Em adio, o

potencial termoresponsivo da formulao F127-250IFN- poderia ser explorado

em outras aplicaes biolgicas.


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176

APNDICE

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Projeto:
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAO DE
NANOEMULSES E NANOPARTCULAS PARA
VEICULAO DE INTERFERON GAMMA E AVALIAO DE
SEU POTENCIAL IMUNOMODULADOR

Pesquisadores e instituies envolvidas: Prof. Dr. Maria Aparecida


Godoy Soler, Prof. Dr. Adenilda Cristina Honrio Frana, Prof. Dr. Eduardo Luzia
Frana e discente doutorando em Nanocincia e Nanobiotecnologia ELTON
BRITO RIBEIRO Universidade de Braslia (UNB) / Universidade Federal de
Mato Grosso (UFMT).
Eu............................................................................................, fui informado
dos objetivos, procedimentos, riscos e benefcios desta pesquisa, descritos acima.
Entendo que terei garantia de confidencialidade, ou seja, que apenas os
resultados dos exames realizados com o sangue sero divulgados e ningum,
alm dos pesquisadores, ter acesso aos nomes dos participantes desta
pesquisa. Entendo tambm, que tenho direito de receber, sempre que desejar,
outras informaes sobre o estudo, entrando em contato com a pesquisador
(Elton Brito Ribeiro) e qualquer dvida adicional, voc poder entrar em contato
com o Comit de tica em Pesquisa, atravs do fone: (66) 34055317.
Compreendendo tudo o que me foi explicado sobre o estudo e, estando de acordo
em participar, assino embaixo.
Assinatura do participante (ou do responsvel, se menor):
..........................................................................................................
Assinatura do pesquisador principal:
.........................................................................................................
Doutorando: ELTON BRITO RIBEIRO
Fone: (66) 9218-1802 E-mail: [email protected]
Orientadora: Prof. Dr. Maria Aparecida Godoy Soler
Fone: (61) 81346201 E-mail: [email protected]
177

ANEXO

Ribeiro, E. B.; Honorio-Frana, A. C.; Frana, E. L.; Soler, M. A. G.. Design and

development of nanoemulsion systems containing interferon gamma. Protein

& Peptide Letters, v. 23, 2016. doi: 10.2174/0929866523666160502155249.

Upcoming Articles 2016. (E-pub ahead of print).

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