L/O/G/O

UJI EFEKTIVITAS PENGAWET

Pengawet Antimikroba
❑ Pengawet antimikroba adalah zat yang ditambahkan ke
bentuk sediaan steril untuk melindungi dari
pertumbuhan mikrobiologi atau dari mikroorganisme
yang masuk secara tidak sengaja selama atau setelah
proses manufaktur

❑ Setiap zat antimikroba dapat bersifat pengawet,

meskipun semua zat antimikrob adalah zat beracun.

❑ Pengawet antimikroba diperlukan untuk menekan

perkembangbiakan mirkroba pada sediaan.
Kategori Produk
Pengujian efektivitas antimikroba dalam
kompendia diabagi menjadi 4 kategori
Kategori Keterangan Produk

1 Injeksi, parenteral lainnya termasuk emulsi, produk

untuk telinga, produk steril untuk hidung, produk mata
yang dibuat dengan basis air.
2 Produk Topikal yang dibuat dengan basis air, produk
non steril untuk hidung dan emulsi, termasuk yang
diaplikasikan pada membran mukosa.
3 Produk Oral selain antasida, dibuat dengan basis air.
4 Antasida dibuat dengan basis berair.
Organisme Uji
Mikroorganisme sebagai berikut:
▪ Candida albicans (ATCC No 10231),
▪ Aspergillus niger (ATCC No 16404)
▪ Escherichia coli (ATCC No 8739)
▪ Pseudomonas aeruginosa (ATCC No
9027)
▪ Staphylococcus aureus (ATCC No 6538).
Kondisi Kultur Pada Persiapan Inokulum

Temperatur Waktu Inkubasi Waktu Inkubasi

Organisme Media yang sesuai
Inkubasi Inokulum Recoveri microba

Escherichia coli Soybean-Casein 32,5 ± 2,5 18 sampai 24 jam 3 sampai 5 hari

(ATCC No 8739) Digest Broth;
Soebean-Casein
Digest Agar
Pseudomonas aeruginosa Soybean-Casein 32,5 ± 2,5 18 sampai 24 jam 3 sampai 5 hari
(ATCC No 9027 Digest Broth;
Soebean-Casein
Digest Agar
Staphylococcus aureus Soybean-Casein 32,5 ± 2,5 18 sampai 24 jam 3 sampai 5 hari
(ATCC No 6538) Digest Broth;
Soebean-Casein
Digest Agar
Candida albicans Sabouraud Dextrose 22,5 ± 2,5 44-52 jam 3 sampai 5 hari
(ATCC No 10231) Agar;
Sabouraud Dextrose
Broth
Aspergillus niger Sabouraud Dextrose 22,5 ± 2,5 6 sampai 10 hari 3 sampai 7 hari
(ATCC No 16404) Agar;
Sabouraud Dextrose
Broth
 Uji Pengawet Antimikroba

❑ Studi kesesuaian Metode harus dilakukan

sebelum pemeriksaan suatu produk untuk
konten mikroba
❑ metode yang diusulkan mampu merecovery
mikroba yang layak yang mungkin hadir
dalam sampel produk
❑ kontrol tes negatif dilakukan bersama ketika
tes untuk memverifikasi adanya kontaminasi
pada media dan bahan yang digunakan
dalam penelitian
Desain tes untuk mengevaluasi neutralizer efficacy dan neutralizer
toxicity melibatkan tiga kelompok perlakuan antara lain :

Uji Group (kelompok evaluasi efikasi)

Produk diuji dengan metode pengujian dan kemudian diinokulasi dengan
organisme uji tertentu. Tes ini akan mengevaluasi recoveri mikroorganisme
yang representatif dari sampel matriks serta efektivitas metode netralisasi yang
yang digunakan.

Uji Peptone (evaluasi toksisitas kelompok / kontrol positif)

Dalam kelompok ini, perlakuan tanpa produk, air pepton atau larutan buffer
merupakan bagian persiapan sampel yang sama dan inokulasi organisme yang
digunakan pada uji kelompok. Tes ini pada dasarnya merupakan kontrol positif
yang mengevaluasi recoveri uji organisme tanpa produk.

Viabilitas kelompok (verifikasi perhitungan inokulum)

Populasi inokulum pada test organisme yang digunakan uji kelompok 1 dan 2
yang diverifikasi dengan metode plate count tanpa adanya metode netralisasi
dan produk yang diuji. Tes ini dilakukan untuk memastikan bahwa uji dilakukan
dengan menggunakan tingkat inokulum yang sesuai.
Validasi Metode

Validasi metoda analisis adalah suatu tindakan

penilaian terhadap parameter tertentu,
berdasarkan percobaan laboratorium, untuk
membuktikan bahwa parameter tersebut
memenuhi persyaratan untuk penggunaannya
Validasi Metode
❑ Validasi Netralisasi Antimikroba
(pengawet)
❑ Validasi perhitungan jumlah mikroba
Parameter Analisa
Kecermatan (accuracy)
❑ Akurasi didefinisikan seberapa kedekatan hasil yang
diperoleh pada metode alternatif dengan yang dihasilkan
dengan metode kompendia.

❑ Parameter Tes ini biasanya dinyatakan dalam persen

recoveri dari total inokulum yang digunakan sebagai
sampel uji dan harus dibuktikan pada berbagai metode
pengujian
PRESISI
Keseksamaan (precision)
❑ Presisi, biasanya dinyatakan sebagai standar deviasi (SD) atau
persen standar relatif deviasi (RSD persen), didefinisikan sebagai
tingkat kesepakatan antara individu beberapa hasil tes.

❑ Prosedur perhitungan mikroba dikenal memiliki variabilitas yang

sangat besar dibandingkan dengan metode kimia. Oleh karena itu,
semakin banyak replikasi uji akan lebih presisi jumlah mikroba.
Untuk tes ini, setidaknya 10 replikasi pada masing-masing dari
lima tingkat inokulum. ).
LINIERITAS
❑ linearitas didefinisikan sebagai kemampuan
metode untuk menghasilkan hasil yang
sebanding dengan konsentrasi organisme
dalam rentang operasi dari pengujian tersebut.

❑ Analisis regresi linear dilakukan untuk

mengetahui koefisien korelasi (r2) nilai
kecocokan kurva. Menurut USP, alternatif
metode menunjukkan linearitas yang dapat
diterima jika dihitung r2 lebih besar dari 0.95.
KETANGGUHAN

Ketahanan mengukur derajat hingga metode

yang tidak terpengaruh oleh adanya perubahan
kecil dalam parameter metode.
Limit of Quantitation
❑ Parameter batas perhitungan mendefinisikan
tingkat terendah mikroorganisme yang dapat
dihitung dengan presisi dan akurasi yang dapat
diterima.

❑ Untuk melakukan tes ini, setidaknya dilakukan 5

replikasi dari lima tingkat yang berbeda pada
inokulum, dari setiap jenis uji organisme
Limit of Detection
❑ Parameter uji batas deteksi dapat menentukan jumlah
terendah mikroorganisme yang dapat terdeteksi dalam
sampel, tetapi tidak harus disebutkan dengan akurasi
atau presisi, ini merupakan ukuran kepekaan tes.

❑ Untuk menguji parameter tes kuantitatif, mikrobiologi

yang diinikulasi setidaknya lima replikasi dari produk
dan kontrol dengan tingkat inokulum yang sangat
rendah dari uji organisme (tidak lebih dari 5 CFU).
Reggudness/ kekasaran

❑ Kekasaran adalah parameter validasi yang

mengukur tingkat reproduktifitas metode dalam
berbagai kondisi operasional dan lingkungan.

❑ variabel yang diuji untuk memverifikasi

parameter ini mencakup analis yang berbeda;
instrumen yang berbeda; dan perbedaan lots
dari reagen, uji persediaan dan media.
REVIEW JURNAL

Dilakukan penelitian terhadap sediaan suspensi oral

mebendazole 20 mg/mL untuk menjamin kualitas
mikrobiologis sediaan dengan penghitungan jumlah
mikroba dan netralisasi dengan pengawet. Uji ini sesuai
dengan petunjuk Farmakope Brazil edisi IV dan USP 30.
BAHAN
Untuk memvalidasi metode penghitungan mikroba : polisorbat 80
(Oxiteno ® - Lot 16 506), lesitin kedelai (Inlab ® - Lot 832490),
larutan natrium klorida, 0,9% (Fresenius Kabi ® - Lot 040 702
059), Soybean – Casein Broth (Difco ® - Lot 8150627), Soybean
– Casein Agar (Difco ® - Lot 9.160.882, Merck ®-Lot
VM803358714 dan Oxoid ® - lot 463341), Sabouraud dextrose
agar (Difco ® - Lot 6.319.541, Merck ® - Lot VM804238723 dan
Oxoid ® - Lot 476969), dan Sabouraud dextrose broth (Difco ® -
Lot 6.269.292, Merck® - Lot VM462926 dan Oxoid ® - Lot
455812).

Sediaan yang digunakan adalah mebendazole (oral suspensi 20

mg / mL - Lot 09120754) LAFEPE ®.
MIKROBA UJI
Uji mikrobiologi mikroba dijelaskan dalam kompendia
resmi Farmakope Brazil IV dan USP 30 (2007) antara
lain :
❑ Aspergillus niger ATCC 16404 (Cefar ® - Lot
CBC295),
❑ Candida albicans ATCC 10231 (Cefar ® - Lot
CBH360),
❑ Escherichia coli ATCC 8739 (Cefar ® - Lot CBI370),
❑ Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (Cefar ® - Lot
CBE322),
❑ Staphylococcus aureus ATCC 6538 (Cefar ® - Lot
CBJ383) .
MIKROBA UJI
Candida albicans :
mikroorganisme fungi
golongan ragi (yeast)

Dapat bersifat opurtinistik

menyebabkan infeksi oral dan
infeksi vagina pada manusia.
Hidup sebagai mikroorganisme
comensal dalam tubuh
manusia
Candida albicans

ATCC No. 10231

MIKROBA UJI
Aspergillus niger adalah fungi
berfilamen

Bila sejumlah spora terhirup

masuk keparu-paru, dapat
menyebabkan penyakit
paru-paru aspergillosis

Aspergillus niger

ATCC No. 16404

MIKROBA UJI
Bakteri yang hidup dalam usus
mamalia bakteri aerob dan
facultative anaerobic, non
spore-forming, Gram-negative.
Fermentasi dengan laktose
menghasilkan gas dalam
waktu 48 jam pada 35 °C

Menyebabkan Infeksi saluran

kemih dan diare
Escherichia coli

ATCC No. 8739

MIKROBA UJI
Pseudomonas aeruginosa
adalah bakteri Gram negative,
aerob, dan bergerak uni polar

P.Aeruginosa biasanya
menginfeksi saluran
pernapasan, salurankemih,
luka bakar, dan luka lainnya

Pseudomonas aeruginosa

ATCC No. 9027

MIKROBA UJI
Staphylococcus Aureus
Bakteri gram positif yang
menghasilkan pigmen
kuning, bersifat aerob
fakultatif, tidak
menghasilkan spora.

Bateri patogen pada

Staphylococcus Aureus
saluran nafas.
ATCC No. 6538
Persiapan suspensi mikroba dan
standarisasi inokulum

Kultur dari soybean-casein agar

Bakteri dipindahkan dengan bantuan loop platinum yang

telah dikalibrasi.

Pengambilan 10 μL ke dalam 5 mL media soybean-casein

broth

Kultur diinkubasi selama 18-24 jam pada 32 ± 2 ° C.

Pengenceran dengan 0,9% larutan natrium klorida dan

diinkubasi selama 24 jam pada 32 ± 2 ° C untuk
memperoleh suspensi mikroba standar 10² CFU/mL.
 Untuk yeast metode yang digunakan
sama dengan bekteri

Media cair dan padat yang digunakan Sabouraud-

dekstrosa.

Pemindahan kultur Aspergillus niger dengan 2 ml

suspensi spora dalam 0,9% larutan natrium klorida

ditambahkan 0,05% polisorbat 80.

Kultur ini diinkubasi pada 22 ± 2 ° C selama 48 jam

atau 96 jam untuk Candida albicans dan Aspergillus
niger.
Validasi Netralisasi Pengawet

Netralisasi kimia menggunakan 0,4% polisorbat 80 (Tween

® 80) (b/v) dan 0,5% soybean-lecitin (w/v)
direkomendasikan oleh kompendium resmi Farmakope
Brazil edisi IV dan USP 2007 dengan pengenceran 01:10
(v/v) digunakan untuk produk larut dalam air.

Hal ini diamati melalui recoveri mikroorganisme dalam

kelompok-kelompok yang berbeda untuk analisis: uji
kelompok(T), pepton (P) dan viabilitas (V) (USP, 2007).
Persiapan Kelompok Analisis
Uji kelompok(T) dan pepton (P) terdiri dari
90 mL Soy bean – Casein broth

ditambah dengan 0,4% polisorbat 80 (b / v) dan 0,5%

soybean-lecitin(w/v)

ditambah 10 mL obat atau 10 mL natrium klorida 0,9%.

Viability (V) terdiri dari soybean-casein broth (100 mL).

Dari kelompok analisis diambil 1,0 mL aliquot dan disimpan

dalam cawan petri steril bersamaan dengan 0,3 atau 1,0 mL
suspensi standar uji mikroorganisme.
 Sekitar 17 ± 2 mL soy casein atau Sabouraud dekstrosa
media dituangkan dan dihomogenisasi.

Plate diinkubasi pada 32 ± 2 ° C selama 48 jam untuk bakteri

dan 22 ± 2 ° C selama 48 jam atau 96 jam untuk Candida
albicans dan Aspergillus niger

dihitung jumlah koloni menggunakan counter digital

(Quimis®) dan hasilnya dinyatakan dalam koloni unit/plate.
Pengembangan dan validasi metode
penghitungan mikroba

Metode penghitungan mikroba divalidasi sesuai dengan parameter:

presisi, akurasi, linearitas dan ketahanan

Presisi dievaluasi pada dua tingkatan: pengulangan (intra-run presisi, n

= 5) dan presisi menengah (inter-run presisi, n = 5 per analis).

Pengulangan dan presisi menengah dievaluasi dalam tiga kelompok

untuk analisis (uji, pepton dan viabiliti) dengan dua tingkat mikroba,
10-30 CFU/ plate dan 30-300 CFU/ plate.

menentukan koefisien variasi maksimum dari 25% atau 15% ketika

kelompok-kelompok yang dicurigai dengan 10-30 CFU / plate atau
30-300 CFU / plate.

Data yang diperoleh untuk presisi menengah secara statistik dianalisis

dengan ANOVA.
Akurasi dinilai dengan membandingkan nilai yang diperoleh
untuk recoveri uji mikroorganisme dalam uji kelompok (T),
pepton (P) viabiliti (V)

Untuk mencapai hal ini, volume tetap 0,3 mL dan 1,0 mL

suspensi mikroorganisme standar dalam 10² CFU / mL

digunakan untuk menganalisis kelompok sehingga

mencapai tingkat 10-30 CFU/ plate dan 30 - 300 CFU /
plate.
Penghitungan Mikroba pada obat.

10,0 mL suspensi oral mebendazole dalam 90,0 mLsoyben casein broth

ditambahankan agen penetralisasi 0,4% natrium polisorbat 80 (b / v)

dan 0,5% soybean-lecitin (w / v) (1:10).

Kemudian 1,0 mL aliquot ini ditempatkan dalam cawan petri dan

kemudian 17 ± 2.0 mL agar kasein kedelai dan agar Sabouraud
dextrose dituangkan.

Plate yang homogen dipadatkan dan kemudian diinkubasi pada 32 ± 2 °

C selama 48 jam untuk bakteri dan 22 ± 2 ° C selama 48 jam sampai 96
jam untuk yeast dan yang lainnya.

Penghitungan koloni dilakukan dengan menggunakan digital counter

(Quimis ®) dan hasilnya dinyatakan dalam CFU / mL.
Evaluasi pertumbuhan mikroba dan
sterilitas media kultur

Media padat cair soy bean -casein dan media

padat Sabouraud dextrose

Media ini diinokulasi dengan 10 ² CFU / mL dan

diinkubasi pada 32 ± 2 ° C selama 48 jam untuk
bakteri dan 22 ± 2 ° C selama 48 jam untuk
yeast
HASIL
Validasi netralisasi pengawet
Evaluasi netralisasi
pengawet pada suspensi
oral mebendazol 20 mg /
mL (LAFEPE ®) dengan
tiga analisis kelompok:
viabilitas (V), pepton (P)
dan uji (T), dan nilai-nilai
masing-masing untuk t
tabel dan t hitung dengan
akurasi 95%

USP : ≥ 70%

Validasi metode netralisasi pengawet dianggap efektif

karena tidak signifikan.
HASIL
Pengembangan dan validasi metode penghitungan mikroba

Nilai pengulangan yang

diperoleh dari metode
penghitungan mikroba untuk
mebendazole suspensi oral
20 mg / mL LAFEPE ®
dengan dua tingkat yang
memberatkan antara tiga
kelompok analisis:
kelangsungan hidup (V),
pepton (P) dan uji (T)

Validasi metode perhitungan mikroba akurat pada kedua parameter level

inkriminasi 10-30 CFU/ml dan 30-300 CFU/ml.
HASIL

Nilai yang diperoleh dari

penetapan presisi metode
penghitungan mikroba
dilakukan dengan dua
perbedaan analisa untuk
suspensi oral mebendazol 20
mg / mL LAFEPE ® dengan
dua tingkat yang melibatkan
tiga kelompok analisis:
viabilitas (V), pepton (P) dan uji
(T) dan nilai-nilai
masing-masing untuk Ftabel
dan Fhitung dengan akurasi
95%.

Validasi metode perhitungan mikroba menunjukkan presisi yang baik

dengan membandingkan pada uji (T), (P) dan (V) pada kedua level
inkriminasi 10-30 CFU/ml dan 30-300 CFU/ml .
HASIL
Nilai yang diperoleh
untuk akurasi metode
penghitungan mikroba
pada suspensi oral
Mebendazol 20 mg / mL
LAFEPE ® dengan dua
tingkat yang melibatkan
tiga kelompok analisis:
viabiliti (V), pepton (P)
dan uji (T), dan nilai-nilai
masing-masing untuk t
tabel dan t hitung
dengan akurasi 95%.

Validasi metode perhitungan mikroba menunjukkan hasil akurat karena

tidak ada perbedaan signifikan antara uji (T), (P) dan (V) pada kedua level
inkriminasi 10-30 CFU/ml dan 30-300 CFU/ml .
HASIL

Nilai Linearitas diperoleh

dari metode
penghitungan mikroba
pada suspensi oral
mebendazol 20 mg / mL
LAFEPE ® - antara
kelompok-kelompok
analisis: Viabiliti (V),
pepton (P) dan uji (T),
dan nilai-nilai
masing-masing untuk
Ftabel dan Fhitung
dengan akurasi 95%

USP : R ≥ 95%
Validasi metode perhitungan mikroba menunjukkan linieritas yang
ditunjukkan oleh hubungan proporsional jumlah koloni yang terdeteksi dan
tidak ada korelasi signifikan dari 3 kelompok analisis.
HASIL
Nilai yang diperoleh pada
robustness penetapan
metodologi untuk
suspensi oral mebendazol
20mg/ml LAFEPE ®,
berdasarkan rata-rata dari
tiga replikasi CFU dengan
variasi suhu, polisorbat 80
dan media kultur dengan
nilai F tabel dan F hitung
pada akurasi 95%.

Validasi metode perhitungan mikroba menunjukkan robustness/ kuat karena

memberikan hasil yang tidak berubah ketika mengalami perubahan.
KESIMPULAN
❑ Dalam analisa rutin mikrobiologi terhadap obat, metode
analisis harus divalidasi untuk memungkinkan hasil
yang memuaskan agar mampu memberikan
variabilitas yang luas dari mikroorganisme yang terlibat
dalam analisa mikroba pada sediaan obat.

❑ Validasi metode perhitungan jumlah mikroba pada

suspensi oral mebendazol terbukti akurat,
menunjukkan linieritas yang baik dan metode validasi
yang kuat. Dengan demikian, metode ini sesuai
dengan standar resmi yang ditetapkan untuk validasi
metode mikrobiologi dan untuk menyediakan
reproduktifitas dalam industri farmasi.
TERIMA KASIH
Semoga Bermanfaat..