Hats CH 2004

P
THESE
THESE
Présentée pour obtenir le grade de

Docteur de l’Université Louis Pasteur
Strasbourg I
Discipline
Sciences du Vivant – Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie.
Par
Didier HATSCH
Interaction hôte/pathogène : étude du modèle Humulus

lupulus / Fusarium graminearum. Identification,
génomique et transcriptomique du pathogène.
Soutenue publiquement le 14 décembre 2004
Membres du Jury
Directeur de thèse :
M. Jean-Marc JELTSCH, Professeur, Université Louis Pasteur, UMR 7100.
Rapporteur Interne :
M. Jean-Luc SOUCIET, Professeur, Université Louis Pasteur, Institut de Botanique.
Rapporteurs Externes :
Mme. Marie-Thérèse ESQUERRE-TUGAYE, Professeur, Université P. Sabatier, UMR 5546.
M. Keith KLEIN, Professeur, Minnesota State University.
Examinateurs :
Mme. Martine BOCCARA, Professeur, Université Pierre et Marie Curie, PARIS VI.
M. Vincent PHALIP, Maitre de Conférence, Université Louis Pasteur, UMR 7100.
à mes parents, Angèle et Jean-Paul, qui m’ont toujours soutenu
Je tiens à exprimer un très grand
Merci
à tous ceux qui m’ont aidé, guidé et soutenu lors de ma thèse.
Je leur présente ici toute ma gratitude ainsi que mon amitié.
1
TABLES DES MATIERES
LISTE DES FIGURES ................................................................................................... 8
LISTE DES TABLEAUX............................................................................................. 10
LISTE DES ABRÉVIATIONS .................................................................................... 11
INTRODUCTION GENERALE ................................................................................. 12
CHAPITRE I – DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES ET PRESENTATION DU

SUJET ..................................................................................................................................... 14
I. 1. LE MODELE D’ETUDE ............................................................................................ 15

I. 1. 1. La plante modèle : Humulus lupulus, L. .................................................... 15
I. 1. 1. 1. Biologie du houblon ............................................................................ 15
I. 1. 1. 2. Culture du houblon .............................................................................. 18
I. 1. 1. 3. Utilisations du houblon........................................................................ 20
I. 1. 1. 3. 1. Utilisation brassicole ................................................................... 20
I. 1. 1. 3. 2. Utilisation en herboristerie .......................................................... 21
I. 1. 1. 3. 3. Utilisation culinaire ..................................................................... 21
I. 1. 1. 4. Pathologies fongiques du houblon....................................................... 21
I. 1. 1. 4. 1. Mildiou du houblon ..................................................................... 21
I. 1. 1. 4. 2. Oïdium du houblon...................................................................... 23
I. 1. 1. 4. 3. Verticilliose ................................................................................. 24
I. 1. 1. 4. 5. Autres maladies d’origine fongique ............................................ 25
I. 1. 1. 4. 5. 1. Phytophthora citricola......................................................... 25
I. 1. 1. 4. 5. 2. Botrytis cinerea ................................................................... 25
I. 1. 1. 4. 5. 3. Alternaria alternata............................................................. 25
I. 1. 1. 4. 5. 4. Cladosporium ...................................................................... 25
I. 1. 1. 4. 5. 5. Fusarium sambucinum et F. avenaceum ............................. 26
I. 1. 2. Le champignon modèle : Fusarium graminearum ....................................... 26
I. 1. 2. 1. Biologie du champignon...................................................................... 26
I. 1. 2. 1. 1. Position taxonomique .................................................................. 27
I. 1. 2. 1. 2. Cycle sexuel de Gibberella zeae ................................................. 28
2
I. 1. 2. 1. 3. Spores de Fusarium graminearum .............................................. 29
I. 1. 2. 2. Identification........................................................................................ 30
I. 1. 2. 3. Pathogènicité de F. graminearum ....................................................... 31
I. 1. 2. 3. 1. Cycle infectieux de Fusarium graminearum............................... 32
I. 1. 2. 3. 2. Production de toxines .................................................................. 34
I. 1. 2. 3. 3. Pouvoir pathogène de Fusarium graminearum........................... 35
I. 1. 2. 4. Moyens de lutte contre Fusarium........................................................ 36
I. 1. 2. 4. 1. Pratiques culturales...................................................................... 36
I. 1. 2. 4. 2. Utilisation de fongicides.............................................................. 37
I. 1. 2. 4. 3. Moyens de lutte biologique ......................................................... 37
I. 2. INTERACTION HOTE-PATHOGENE : LA DEGRADATION DE LA PAROI VEGETALE ...... 37
I. 2. 1. Paroi végétale.............................................................................................. 38
I. 2. 1. 1. Cellulose .............................................................................................. 38
I. 2. 1. 2. Hémicellulose ...................................................................................... 39
I. 2. 1. 3. Acide pectique et la pectine................................................................. 40
I. 2. 1. 4. Glycoprotéines..................................................................................... 41
I. 2. 1. 5. Lignine................................................................................................. 41
I. 2. 2. CWDE.......................................................................................................... 43
I. 2. 2. 1. Cellulases............................................................................................. 43
I. 2. 2. 2. Pectinases ............................................................................................ 44
I. 2. 2. 3. Xylanases............................................................................................. 44
I. 2. 2. 4. Protéases .............................................................................................. 45
I. 3. X-OMIQUE ............................................................................................................. 46
I. 3. 1. Outils bio-informatiques.............................................................................. 46
I. 3. 1. 1. Logiciels .............................................................................................. 46
I. 3. 1. 1. 1. Alignements de séquences........................................................... 46
I. 3. 1. 1. 2. Traitement de séquences.............................................................. 47
I. 3. 1. 1. 3. Analyses phylogénétiques ........................................................... 47
I. 3. 1. 2. Langages de programmation ............................................................... 48
I. 3. 1. 3. Gestion des ressources bio-informatiques ........................................... 48
I. 3. 1. Génomique................................................................................................... 49
I. 3. 1. 1. Génomes de champignons filamenteux séquencés.............................. 49
I. 3. 1. 2. Génome de F. graminearum................................................................ 50
I. 3. 2. Transcriptomique ........................................................................................ 52
3
I. 3. 2. 1. RT-PCR quantitative ........................................................................... 52
I. 3. 2. 2. Banques d’EST.................................................................................... 52
I. 3. 2. 1. 1. Banques classiques ...................................................................... 52
I. 3. 2. 1. 2. Banques suppressives .................................................................. 53
I. 3. 2. 3. Microarrays.......................................................................................... 54
I. 4. NOTRE PROJET DE RECHERCHE .............................................................................. 55
CHAPITRE II – IDENTIFICATION ET MARQUEURS PHYLOGENETIQUES

DU GENRE FUSARIUM....................................................................................................... 58
II. 1. IDENTIFICATION DES ESPECES DU GENRE FUSARIUM ............................................ 59

II. 1. 1. Problématique ............................................................................................ 59
II. 1. 2. Article 1 - Development of a bipartite method for Fusarium identification
based on cellobiohydrolase-C: CAPS and Western blot analysis, Hatsch D., Phalip V.,
Jeltsch J.-M., FEMS Microbiology Letters, 2002 ............................................................ 60
II. 1. 3. Extension du travail ................................................................................... 66
II. 1. 4. Conclusions et perspetives ......................................................................... 67
II. 2. VALIDATION DE MARQUEURS PHYLOGENETIQUES ............................................... 68
II. 2. 1. Problématique ............................................................................................ 68
II. 2. 2. Article 2 - Use of genes encoding cellobiohydrolase-C and topoisomerase
II as targets for phylogenetic analysis and identification of Fusarium, Hatsch D., Phalip
V., Jeltsch J.-M., Research in Microbiology, 2004 .......................................................... 69
II. 2. 3. Extension du travail ................................................................................... 70
II. 2. 4. Conclusions et perspetives ......................................................................... 70
CHAPITRE III – GENOMIQUE APPLIQUEE DU CHAMPIGNON FUSARIUM

GRAMINEARUM ................................................................................................................... 70
III. 1. PROBLEMATIQUE ................................................................................................ 70

III. 2. PREDICTION DE GENES........................................................................................ 70
III. 2. 1. Mise en place des outils d’analyse ........................................................... 70
III. 2. 2. Application des outils................................................................................ 70
III. 3. VALIDATION DES PREDICTIONS .......................................................................... 70
III. 3. 1. Clonage et séquençage ............................................................................. 70
III. 3. 2. Analyse des séquences .............................................................................. 70
III. 4. PREDICTION DE STRUCTURES.............................................................................. 70
III. 4. 1. Détermination des modèles....................................................................... 70
4
III. 4. 2. Application à l’amélioration enzymatique................................................ 70
III. 5. CONCLUSIONS ET PERSPETIVES .......................................................................... 70
CHAPITRE IV – TRANSCRIPTOMIQUE DU CHAMPIGNON FUSARIUM

GRAMINEARUM ................................................................................................................... 70
IV. 1. SUIVI DE L’EXPRESSION DES XYLANASES ........................................................... 70

IV. 1. 1. Problématique........................................................................................... 70
IV. 1. 2. Détermination du niveau d’expression des xylanases .............................. 70
IV. 1. 2. 1. Méthode de détermination ................................................................ 70
IV. 1. 2. 1. 1. Descriptif de la méthode........................................................... 70
IV. 1. 2. 1. 2. Validation ................................................................................. 70
IV. 1. 2. 2. Quantification par Q-RT-PCR.......................................................... 70
IV. 1. 2. 2. 1. Les xylanases induites par les parois........................................ 70
IV. 1. 2. 2. 2. Les xylanases induites par les parois et le xylane .................... 70
IV. 1. 2. 2. 3. Les xylanases induites par les parois et la CMC ...................... 70
IV. 1. 2. 2. 4. Les xylanases induites par les parois, le xylane et le xylose .... 70
IV. 1. 2. 2. 6. Les xylanases non induites ....................................................... 70
IV. 1. 2. 2. 7. Réinvestigation des résultats obtenus sur M3-parois ............... 70
IV. 1. 3. Discussion ................................................................................................. 70
IV. 1. 4. Conclusions et perspetives ........................................................................ 70
IV. 2. ETUDE SPECIFIQUE DU TRANSCRIPTOME PAR APPROCHE SOUSTRACTIVE............ 70
IV. 2. 1. Problématique........................................................................................... 70
IV. 2. 2. Article 3 - The transcriptome of Fusarium graminearum grown on plant
cell walls reveals several families of pathology-related genes, HATSCH D., PHALIP V.,
PETKOVSKI E., JELTSCH J.M., soumis dans Fungal Genetics and Biology ................ 70
IV. 2. 3. Extension du travail .................................................................................. 70
IV. 2. 4. Conclusions et perspetives ........................................................................ 70
CHAPITRE V – CONCLUSION ET PERSPECTIVES........................................... 70
V. 1. IDENTIFICATION ET MARQUEURS PHYLOGENETIQUES .......................................... 70

V. 2. GENOMIQUE DU CHAMPIGNON FUSARIUM GRAMINEARUM .................................... 70
V. 3. TRANSCRIPTOMIQUE DU CHAMPIGNON FUSARIUM GRAMINEARUM ....................... 70
V. 4. MODELE D’ETUDE HUMULUS LUPULUS / FUSARIUM GRAMINEARUM ...................... 70
CHAPITRE VI – MATERIELS ET METHODES ................................................... 70
5
VI. 1. MATERIEL BIOLOGIQUE ..................................................................................... 70
VI. 1. 1. Souche de F. graminearum........................................................................ 70
VI . 1. 1. 1. Description de la souche.................................................................. 70
VI. 1. 1. 2. Conditions de culture........................................................................ 70
VI. 1. 1. 3. Conservation des spores ................................................................... 70
VI. 1. 2. Souche bactérienne ................................................................................... 70
VI. 2. TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE .......................................................... 70
VI. 2. 1. Extraction d’acides nucléiques ................................................................. 70
VI. 2. 1. 1. Extraction d’ADN plasmidique ........................................................ 70
VI. 2. 1. 2. Extraction d’ARN total..................................................................... 70
VI. 2. 1. 3. Extraction d’ARN polyA+................................................................ 70
VI. 2. 2. Southern blot ............................................................................................. 70
VI. 2. 2. 1. Préparation de la membrane ............................................................. 70
VI. 2. 2. 2. Préparation de la sonde..................................................................... 70
VI. 2. 2. 3. Hybridation et détection ................................................................... 70
VI. 2. 3. Rétrotranscription et synthèse d’ADN complémentaire ........................... 70
VI. 2. 4. Amplification d’acides nucléiques ............................................................ 70
VI. 2. 4. 1. PCR................................................................................................... 70
VI. 2. 4. 2. Q-RT-PCR ........................................................................................ 70
VI. 2. 5. Clonage ..................................................................................................... 70
VI. 2. 5. 1. Clonage rapide.................................................................................. 70
VI. 2. 5. 2. Clonage des EST .............................................................................. 70
VI. 2. 6. Mise en évidence de protéines .................................................................. 70
VI. 3. BIO-INFORMATIQUE ........................................................................................... 70
VI. 3. 1. Analyses de séquences .............................................................................. 70
VI. 3. 2. Analyses phylogénétiques ......................................................................... 70
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................... 70
ANNEXES ..................................................................................................................... 70
ANNEXE 1 – MILIEUX DE CULTURE ................................................................... 70
ANNEXE 2 – FAMILLE DE FONGICIDES ET LEUR CIBLES........................... 70
ANNEXE 3 - LISTE DES AMORCES ....................................................................... 70
6
ANNEXE 4 – DIAGRAMME DE RAMACHANDRAN........................................... 70
ANNEXE 5 - CALCUL DE Q-RT-PCR RELATIVE ............................................... 70
ANNEXE 6 – LISTE DES 537 EST DE LA BANQUE SUPPRESSIVE

SOUSTRACTIVE .................................................................................................................. 70
POSTER 1 : Identification et caractérisation des Fusarium isolés sur des plants de

Houblon en dépérissement – IVème rencontres de phytopathologie / mycologie , Aussois
(FR) 2002............................................................................................................................... 188
POSTER 2 : Data mining : finding specific genes in a phytopathogenic fungus.A
case study : Fusarium graminearum’s xylanases – 4th Colmar scientific symposium :
Biology in the post genomic era, Colmar (FR) 2003. ........................................................ 189
COMMUNICATION ORALE : The genes encoding cellobiohydrolase-C and
topoisomerase II used as targets for phylogenetic analysis and identification of Fusarium
at a species level. Journée du Réseau de Mycologie, Nancy (FR) 2003 ........................... 190
7
Liste des figures
Fig. 1. Liane de Houblon.......................................................................................................... 16

Fig. 2. Fleur mâle du houblon. ................................................................................................. 16
Fig. 3. Fleur femelle du houblon. ............................................................................................. 17
Fig. 4. Exemplaire hermaphrodite............................................................................................ 18
Fig. 5. La culture du houblon en Alsace. ................................................................................. 19
Fig. 6. Houblonnières alsaciennes............................................................................................ 20
Fig. 7. Feuille de houblon infectée par Pseudoperonospora humuli. ...................................... 22
Fig. 8. Feuille de houblon infectée par Sphaerotheca humuli.................................................. 23
Fig. 9. Feuille de houblon infectée par Verticillium albo-atrum.............................................. 24
Fig. 10. Apparence de Fusarium graminearum en culture in vitro......................................... 27
Fig. 11. Différentes lignées de Gibberella zeae, leur localisation et migration géographique.28
Fig. 12. Différents type de spore de Fusarium graminearum. ................................................. 29
Fig. 13. Représentation d’une unité d’ADN ribosomique. ...................................................... 31
Fig. 14. Cycle infectieux de Fusarium graminearum sur les céréales.................................... 32
Fig. 15. Fusarioses provoquées par Fusarium graminearum sur différents hôtes. ................. 33
Fig. 16. Grains infectés par Fusarium graminearum. .............................................................. 33
Fig. 17. Structure chimique des principales mycotoxines de Fusarium graminearum............ 35
Fig. 18. Mode d’entrée du champignon dans la plante. ........................................................... 35
Fig . 19. Structure de la cellulose et formation de pont hydrogène.......................................... 39
Fig. 20. Structure du xylan et site d’attaque des xylanases...................................................... 40
Fig. 21. Structure de l’acide pectique avec la formation de ponts ioniques et acide
galacturonique méthylé. ........................................................................................................... 41
Fig. 22. Synthèse de monolignols. ........................................................................................... 42
Fig. 23. Polymère de lignine : différentes liaisons possibles entre les différents monolignols.43
Fig. 24. Structure des différentes familles de Xylanases. ........................................................ 45
Fig. 25. Schéma explicatif de la méthode d’hybridation suppressive soustractive.................. 54
Fig. 26. Principe de l’analyse du transcriptome par microarray. ............................................. 55
Fig. 27. Différents symptômes observés sur le houblon. ......................................................... 56
Fig. 28. Southern blot révélant la présence des gènes de la topoisomérase II (topII) et
cellobiohydrolase-C (cbh-C) en copie unique.......................................................................... 77
8
Fig. 29. Alignement des séquences de xylanases 15 et 24 avec leur plus proche homologue. 87
Fig. 30. Diagramme de Ramachandran pour la xylanase 15 et sa matrice 1XND................... 89
Fig. 31. Diagramme de Ramachandran pour la xylanase 24 et sa matrice 1TUX ................... 90
Fig. 32. Modèle de structure de la xylanase 15........................................................................ 91
Fig. 33. Modèle de structure de la xylanase 24........................................................................ 92
Fig . 34. Modèle de structure de la xylanase 15 et de la xylanase 15 - N81D ......................... 93
Fig. 35. Validation de l’efficacité d’amplification pour les amorces de la xylanase 16 .......... 98
Fig. 36. Profil du niveau d’expression des gènes des xylanases 9, 14 et 25 ............................ 99
Fig. 37. Profil du niveau d’expression du gène de la xylanase 13 ......................................... 100
Fig. 38. Profil du niveau d’expression des gènes des xylanases 7, 18, 26 et 28 .................... 100
Fig. 39. Profil du niveau d’expression des gènes des xylanases 2, 15, 17, 24, 32, 33, 34, 35101
Fig. 40. Profil du niveau d’expression des gènes des xylanases 19, 21, et 27 ....................... 102
Fig. 41. Profil du niveau d’expression des gènes des xylanases 1 et 3 .................................. 103
Fig. 42. Quantification de l’expression des xylanases sur milieu paroi par rapport au niveau du
transcrit de la xylanase 01 ...................................................................................................... 104
Fig. 43. Structure chimique de la Digoxigénine et de DIG-Dutp .......................................... 143
Fig. 44. Déroulement de la synthèse d’ADNc par la technique SMART™........................... 145
Fig. 45. Principe du vecteur activité du kit TOPO TA cloning.............................................. 147
9
Liste des Tableaux
Tableau. 1. Liste des champignons dont le génome est séquencé............................................ 50

Tableau. 2. Répartition des pourcentages de genes, introns, exons et séquences non-géniques
en fonction de leur taille........................................................................................................... 51
Tableau 3. Taille des fragments obtenus par l’analyse CAPS ................................................. 66
Tableau 4. Prédiction des xylanases dans le génome............................................................... 83
Tableau 5. Liste des xylanases putatives dont les séquences codantes des cDNA ont été
clonées et séquencées ............................................................................................................... 84
Tableau 6. Détermination de l’appartenance aux familles de glycoside hydrolases................ 85
Tableau 7. Caractéristiques des xylanases 15 et 24 ................................................................. 87
Tableau 8. Différentes sources de carbone ajoutées au milieu minimum M3 pour le suivi de la
transcription des gènes prédits ................................................................................................. 96
Tableau 9. Profil d’expression des xylanases prédites sur les différents milieux de culture . 105
10
Liste des abréviations
BLAST : Basic Local Alignement Sequence Tool

CAPS : Cleaved Amplified Polymorphic Sequence
CMC : CarboxyMéthyl-Cellulose
CWDE : Cell Wall Degrading Enzymes
DACS : Discriminative Analysis of Clone Signatures
DIG : DIGoxigénine
DON : DeOxyNivalenol
ELISA : Enzymes Linked Immonosorbent Assay
EMBOSS : European Molecular Biology Open Software Suit
EST : Expressed Sequence Tag
ETS : Externally Transcribed Spacer
IGS : InterGenic Spacer
ITS : Internally Transcribed Spacer
MIPS : Munich Information center for Protein Sequences
MMLV-RT : Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase
NIV : NIValenol
ORF : Open Reading Frame
PERL : Pratical Extraction and Report Language
PG : PolyGalacturonase
PHRAP : PHRagment Assembly Program
PHYLIP : PHYLogeny Inference Package
PL : Pectate Lyase
Q-RT-PCR : Quantitative – Retro Transcription – Polymerase Chain Reaction
RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism
SSH : Suppressive Subtractive Hybridisation
ZEN : Zéaralénone
11
Introduction générale
12
Fusarium graminearum (téléomorphe Gibberella zeae) est un ascomycète de l’ordre des

Hypocréales. Ce champignon filamenteux est réputé pour provoquer de nombreuses
pathologies notamment dans les grandes cultures céréalières (blé, orge). En plus des pertes
occasionnées par une diminution de rendement, la production de mycotoxines rend certaines
récoltes impropres à la consommation humaine ou animale. Deux types de toxines majeures
sont produits : le DeOxyNivalenol (DON ou Vomitoxine) et les Trichothecenes.
Le houblon, Humulus lupulus L., est une plante dioïque de la famille des Cannabinacées
comportant deux genres : Cannabis et Humulus. Le plant femelle est cultivé pour ses
inflorescences (cônes), qui sont l’épice par excellence des brasseurs. 80% de la production
française est localisée en Alsace, où une variété locale, le Strisselspalt, est cultivée en
majorité. La culture du houblon est une activité traditionnelle soutenue par les instances
politiques régionales.
Les cultures de houblons présentent régulièrement des épisodes pathologiques. Ces
évènements se traduisent en particulier par un dépérissement des lianes. Des prélèvements
sont réalisés par le laboratoire de Phytopathologie de l’UMR 7100 depuis 1997 et les
champignons filamenteux présents sont identifiés. Le genre Fusarium est régulièrement
retrouvé parmi les différents isolats. Certaines espèces de Fusarium ont été reconnues comme
pathogène du houblon, mais on retrouve également l’espèce graminearum connue comme
pathogène des céréales.
Le premier chapitre sera consacré à la description des données bibliographiques
relatives à F. graminearum et H. lupulus permettant d’appréhender le thème de recherche. Le
deuxième chapitre se focalisera sur le développement d’une méthode d’identification des
membres du genre Fusarium ainsi qu’à la validation de marqueurs moléculaires menant à
l’étude phylogénique du genre. Le troisième chapitre traitera de la génomique du champignon
au travers de la mise en place d’une analyse du génome puis de son application aux xylanases.
Le quatrième chapitre relatera l’étude transciptomique du champignon par le suivi
d’expression des xylanases ainsi que par l’analyse d’une banque différentielle d’EST
(Expressed Sequence Tag). Le cinquième chapitre rassemblera les conclusions et mettra en
évidence les perspectives de recherche. Le dernier chapitre exposera le matériel et les
méthodes employés dans la réalisation du travail.
13
Chapitre I – Données bibliographiques et présentation du sujet
Chapitre I – Données bibliographiques et présentation du

sujet
14
I. 1. Le modèle d’étude
Les plantes chlorophylliennes sont des eucaryotes supérieurs. Elles tirent leur énergie de
la lumière et sont donc dites phototrophes. Elles sont capables de synthétiser leurs propres
composés organiques à partir du dioxyde de carbone atmosphérique et sont de ce fait
qualifiées d’autotrophes. Cette aptitude les place tout naturellement au début de la chaîne
alimentaire.
De nombreuses maladies, certaines létales, affectent les plantes. Les agents pathogènes
qui en sont responsables se caractérisent non seulement par leur nature (virus, bactérie,
champignon), leur mode d’action mais aussi par les effets qu’ils provoquent. Les
champignons filamenteux sont les pathogènes les plus importants des plantes devant les virus
et bactéries (Lepoivre, 2003).
Le laboratoire de phytopathologie de l’UMR 7100 étudie comme modèle les deux
partenaires du couple Humulus lupulus et Fusarium graminearum.
I. 1. 1. La plante modèle : Humulus lupulus, L.
I. 1. 1. 1. Biologie du houblon
Le houblon, Humulus lupulus L., fait partie de la famille des Cannabinacées, laquelle
comporte deux genres : Cannabis et Humulus. Les membres de cette famille sont des plantes
dioïques. Plants mâles et des plants femelles sont donc nécessaires à la fécondation et à la
production de graines. Le genre Cannabis comporte une seule espèce C. sativa. Le genre
Humulus compte trois espèces : lupulus, japonicus et scandens. H. japonicus, plus connu sous
le nom de houblon doré et H. scandens sont commercialisés à des fins ornementales. H.
lupulus est cultivé pour ses inflorescences femelles considérées comme l’épice des brasseurs.
Le houblon fait partie de la flore spontanée européenne. Cette plante est pérenne, elle
est constituée d’une souche souterraine formant un rhizome ayant une durée de vie entre 20 et
30 ans. La partie aérienne de la plante constituée par des lianes dotées de crochets, est
annuelle. Ces lianes s’enroulent sur les supports disponibles et peuvent atteindre des hauteurs
de 7 à 10m (Fig. 1). Seuls les plants femelles sont cultivés pour leurs fleurs. Contrairement
aux plantes de grande culture, aucune lignée de houblon n’est disponible. La création variétale
vise à sélectionner des plantes F1 issues de la fécondation de fleurs femelles de variétés
répertoriées et déjà cultivées par des pollens de mâles choisis principalement dans des
15
collections de plants sauvages. La multiplication par propagation végétative s’applique

ensuite aux variétés sélectionnées pour générer les milliers de plantes nécessaires à la création
des houblonnières.
Fig. 1. Liane de Houblon.

Source : Laboratoire de Phytopathologie – UMR 7100.
Les plants mâles présentent des inflorescences comportant chacune quelques dizaines de
fleurs (Fig. 2). La production de pollen est conséquente et sa dissémination est
majoritairement effectuée par le vent (Neve, 1991). Les plants mâles sont indésirables à
Fig. 2. Fleur mâle du houblon.

16
proximité des houblonnières car la présence de graines dans les fleurs femelles pénalise
fortement la valeur de la production.
Les fleurs femelles matures sont appelées cônes ou strobiles. Elles sont formées d’un
rachis sur lequel sont liées des bractées (Fig. 3). Elles sont le siège d’un métabolisme
secondaire intense. Plus précisément, ce métabolisme est actif dans les glandes à lupuline
situées en majorité à la base des bractées. Ces glandes produisent une poudre dorée, appelée
lupuline. La lupuline est un ensemble d’huiles et de résines. Parmi les résines, on distingue les
résines dures et les résines molles. Les résines molles se composent des α–acides et des β–
acides qui contiennent respectivement de l’humulone et de la lupulone. Ce sont les α–acides
qui sont recherchés dans le processus brassicole pour donner l’amertume et les arômes à la
bière.
Fig. 3. Fleur femelle du houblon.

Des plants hermaphrodites sont rarement décrits dans le milieu naturel (Neve, 1991).
Ces plants présentent alors aussi bien des inflorescences mâles que femelles. De tels plants
peuvent apparaître spontanément (Fig. 4).
17
Fig. 4. Exemplaire hermaphrodite présentant les deux types d’inflorescences sur

la même liane.A fleurs femelles B fleurs mâles.
I. 1. 1. 2. Culture du houblon
En 2003, environ 54 000 hectares sont cultivés à travers le monde. L’Allemagne se
place comme le premier producteur mondial avec 18 000 ha suivi par les Etats-Unis, 12 000
ha. La France avec 817 ha cultivés se place comme onzième producteur en surface. Les
surfaces cultivées en France sont réparties entre le Nord (31 ha) et l’Alsace (786 ha). La
culture du houblon se trouve majoritairement concentrée dans le Bas-Rhin (Fig. 5). Les 110
planteurs alsaciens se sont regroupé en une coopérative : la coopérative des houblonniers
d’Alsace (COPHOUDAL). Il existe deux caractéristiques majeures des variétés cultivées : les
houblons amers et les houblons aromatiques. Parmi les houblons aromatiques, une variété
spécifique au terroir alsacien est cultivée : le Strisselspalt, qui tire son nom de la forme en
bouquet de ses inflorescences. Le Strisselspalt est une variété aromatique étudiée
préférentiellement au laboratoire.
18
Fig. 5. La culture du houblon en Alsace.
La culture de houblon est effectuée dans des houblonnières. Elles sont composées d’un
échafaudage de poteaux et de fils d’aciers supportant les fils de tuteurage. Environs 3000
pieds de houblon sont plantés à l’hectare. La mise en place d’une houblonnière a un coût
élevé (13 720 € . ha–1), après trois ans la houblonnière arrive à sa pleine production et est
maintenue en exploitation pendant 15 à 20 ans.
Dans l’hémisphère Nord, c’est lors du mois de mars que les pousses de houblon sortent
du sol à partir de la souche pérenne. La mise au fil manuelle des jeunes lianes (en général 3
par fil de tuteurage) assure l’enroulement dextre naturel des pousses. La croissance de la
plante est vigoureuse jusqu’à la floraison, le plant atteignant alors le haut de l’échafaudage à
7m de hauteur (Fig. 6).
19
La récolte du houblon s’étale de mi-août à mi-septembre en fonction des variétés

cultivées. De nos jours des cueilleuses mécaniques découpent la liane au ras du sol et les
chargent sur une remorque pour les emporter à la ferme où les fleurs seront séparées
mécaniquement de la liane. Les fleurs seront ensuite séchées par insufflation d’air chaud
pendant environ 5h. Les cônes perdent alors près de 80% de leur humidité.
Fig. 6. Houblonnières alsaciennes.

I. 1. 1. 3. Utilisations du houblon
I. 1. 1. 3. 1. Utilisation brassicole
95% de la production de houblon est destinée à l’industrie brassicole. Environs 70% de
la production alsacienne de Strisselspalt est exportée vers les Etats-Unis, vers des clients
comme Anheuser-Busch. Une partie de la récolte est utilisée dans les brasseries locales :
Kronenbourg (groupe Scottish & Newcastle, Strasbourg-Obernai), Météor (brasserie
indépendante, Hochfelden) et Fischer (groupe Heinecken, Schiltigheim). Des micro-brasseries
alsaciennes produisent également des bières avec le houblon local. La variété phare
alsacienne, le Strisselspalt, a donné lieu à un brassin exclusif « 1664 Fleur de Houblon ». Le
houblon apporte l’amertume mais aussi des arômes à la bière en fonction de la technique
brassicole employée.
20
I. 1. 1. 3. 2. Utilisation en herboristerie
Le houblon est réputé en herboristerie depuis des siècles. On retrouve des traces
indiquant sa présence dans les jardins à plantes médicinales dès le VIIème siècle. Il entre dans
la composition de nombreux remèdes destinés à soigner différents maux. Les propriétés
bactériostatiques des composés du houblon sont aujourd’hui bien connues et un brevet a été
déposé sur l’utilisation des extraits de houblon pour l’inhibition de pathogènes alimentaires.
Le caractère sédatif des huiles essentielles du houblon trouvait une application dans la
médecine traditionnelle amérindienne. Les grands-mères alsaciennes garantissaient un
sommeil profond sur des oreillers remplis de cônes de houblon. De nos jours les oreillers sont
encore commercialisés en plus de cônes séchés à consommer en infusion.
Lors des récoltes de houblon, il n’était pas rare que le cycle menstruel des cueilleuses
soit perturbé. Il s’agissait des effets de phytooestrogènes présents dans les cônes. Des crèmes
destinées à l’accroissement de la poitrine chez les femmes intègrent des extraits de houblon.
Les effets endocriniens ont été confirmés, d’où un usage contrôlé recommandé (Milligan et
al., 2000).
I. 1. 1. 3. 3. Utilisation culinaire
En dehors de la présence sous forme de bière sur nos tables, le houblon est également à
la base d’une spécialité culinaire : les hopfespetzle. Il s’agit des jets de houblon blanchis dans
l’eau bouillante et consommés comme des asperges. La production des jets de houblon se fait
par culture des racines nettoyées sous couvert de terre à 15°C. Les pousses se développent en
20 jours et seule la partie croquante est récoltée. Le houblon se retrouve également dans bon
nombre d’alcools forts européens comme la « Hopfenliquör » (liqueur de houblon allemande).
I. 1. 1. 4. Pathologies fongiques du houblon

De nombreuses pathologies ont été décrites sur le houblon (Neve, 1991). Parmi les
différents agents pathogènes nous nous sommes focalisés sur les champignons filamenteux.
I. 1. 1. 4. 1. Mildiou du houblon
Cette maladie est provoquée par l’agent pathogène Pseudoperonospora humuli. Le
mildiou est la maladie la plus redoutable pour le houblon comme en témoigne l’épisode
pathologique de 1920 pendant lequel la maladie s’est rapidement répandue dans tout
l’hémisphère Nord puis en Amérique du sud.
21
La maladie se déclare au printemps, lorsque les premiers jets de houblons sortent du sol.
Infectés, ils produisent des petites feuilles pâles dont le dessous vire au noir laissant apparaître
des masses denses de sporangia, devenant ainsi la première source d’infection de l’année et
lors de la dispersion des spores du pathogène. Les feuilles des plants voisins peuvent être
infectées et présentent alors des tâches anguleuses noires caractéristiques (Fig. 7). Les cônes
peuvent également être infectés, causant le brunissement des bractées. Les sporanges produits
sous les feuilles malades servent de source d’infection secondaire. Chaque sporange libère 4 à
8 zoospores qui nagent en direction des stomates où ils produisent des tubes germinatifs qui
pénètrent dans la plante par le stomate voisin.
Pseudoperonospora humuli est un parasite obligatoire du houblon. Il passe l’hiver sous

forme de mycélium à l’intérieur du pied mère. Il a été montré que des pieds infectés
consomment plus de réserves durant l’hiver que des pieds sains.
Fig. 7. Feuille de houblon infectée par Pseudoperonospora humuli.
Différents traitements de la maladie ont été utilisés au fil des années. Les traitements
basés sur le cuivre comme l’application de bouillie bordelaise présentent une efficacité de
prévention mais ne peuvent enrayer une pathologie établie, de plus les jeunes pousses de
houblon sont sensibles au cuivre. Les traitements à base de Metalaxyl sont très efficaces
même sur des infections établies. Cette molécule inhibe spécifiquement l’ARN polymérase I
des oomycètes. Ces traitements peuvent permettre d’enrayer complètement la maladie et faire
disparaître le pathogène d’une plantation de houblon. Cependant l’utilisation non optimale par
les planteurs n’a jamais permis de faire complètement disparaître cette maladie.
22
I. 1. 1. 4. 2. Oïdium du houblon
Sphaerotheca humuli est responsable de l’oïdium du houblon. Il pose de sérieux
problèmes en Angleterre et en Belgique. En Allemagne, seules les épidémies du type de celle
qui a suivi la plantation massive de la variété Nothern Brewer , sensible au pathogène, sont à
craindre.
Les premiers symptômes de la maladie apparaissent lors de l’infection de jeune feuille
et se présentent par des cloques à la surface des feuilles (Fig. 8). Un mycélium blanc
cotonneux apparaît alors à la surface des cloques. La couleur blanche provient de la formation
de conidies asexuelles alors qu’en milieu de saison des cleistocarpes apparaissent de couleur
sombre. Les cleistocarpes contiennent 8 ascospores. Le cône est également sensible à
l’infection par Sphaerotheca humuli. En fonction de l’état de développement du cône la
maladie pourra s’établir plus ou moins facilement. Les cônes non fécondés sont par exemple
plus sensibles à l’infection. Il peut apparaître une coloration rouge sur les cônes causée par la
présence de cleistocarpes. Ces derniers permettent au champignon d’hiverner. Au printemps
ces structures vont relâcher les ascospores qui réinfecteront à nouveau des feuilles de
houblon. L’infection secondaire se produit majoritairement par les conidies asexuelles. En
effet les ascospores ont besoin d’eau pour germer alors que les conidies peuvent se
développer sur la surface sèche des feuilles.
Fig. 8. Feuille de houblon infectée par Sphaerotheca humuli.
23
Différents produits phytosanitaires sont disponibles pour lutter contre ces infections. La
croissance du champignon s’effectue entièrement à la surface de la feuille, il est ainsi plus
facile à contrôler qu’un pathogène qui se développe à l’intérieur de la plante. Le composé
triforine de la famille des formamides agit sur la déméthylation des stérols. Il est efficace pour
enrayer les infections dues à Sphaerotheca humuli cependant il montre un effet phytotoxique
sur le houblon. Il est recommandé de limiter son utilisation à quatre applications sur l’année.
Fig. 9. Feuille de houblon infectée par Verticillium albo-atrum.
I. 1. 1. 4. 3. Verticilliose
La verticilliose est provoquée par le champignon filamenteux Verticillium albo-atrum.
Ce dernier se caractérise par l’infection des feuilles, qui développent des tâches jaunes suivies
de zones irrégulières de nécrose entre les vaisseaux majeurs (Fig. 9).
Deux types de symptômes peuvent apparaître causés par différentes souches du
pathogène. Les symptômes dit progressifs apparaissent très tôt dans la saison et se
caractérisent par la mort des plants ainsi qu’une dissémination rapide dans toute la plantation.
Les symptômes dit fluctuants se traduisent par un épaississement des lianes et une coloration
marron du bois limité au centre de la plante.
Verticillium dahliae est un pathogène de la pomme de terre, des tomates et des fraises. Il
peut également infecter le houblon lors de saisons chaudes en provoquant des symptômes
équivalents à ceux trouvés avec Verticillium albo-atrum. Il est par conséquent recommandé de
24
ne pas planter de houblon après avoir cultivé des pommes de terre ou des tomates pour éviter
une contamination.
Les traitements des verticillioses du houblon par des produits phytosanitaire sont très
délicats. De nombreuses molécules ont été testées et bien qu’elles aient montré une efficacité
lors de test en laboratoire, elles n’ont pas eu d’effet en plein champ. La difficulté réside dans
l’élimination du pathogène dans les racines. Les traitements systémiques remontent dans la
plante avec la sève mais ne diffusent pas dans les racines les plus profondes.
I. 1. 1. 4. 5. Autres maladies d’origine fongique

L’oïdium, le mildiou et la verticilliose du houblon sont les principales pathologies de
cette plante. Cependant, il existe un nombre de pathogènes secondaires qui provoquent plus
rarement des pathologies.
I. 1. 1. 4. 5. 1. Phytophthora citricola
Phytophthora citricola est responsable de la pourriture noire des racines. Il a posé des
problèmes majeurs en Nouvelle Zélande jusqu’au développement de souches résistantes. Ce
pathogène infecte la plante en pénétrant la souche près du collet où il envahit les vaisseaux du
xylème. Les tissus avoisinant sont alors gorgés d’eau et pourrissent. Les traitements
phytosanitaires en Europe permettent d’éviter ce type d’infection.
I. 1. 1. 4. 5. 2. Botrytis cinerea
La maladie provoquée par Botrytis cinerea se caractérise par la formation d’un
mycélium cotonneux sur les cônes qui changent de couleur pour devenir bruns. Cette maladie
est généralement retrouvée au Japon. Des cas en Europe ont été décrits mais restent rares car
le champignon nécessite des conditions optimales pour développer la maladie.
I. 1. 1. 4. 5. 3. Alternaria alternata
Alternaria alternata n’est pas un pathogène du houblon cependant un épisode
pathologique lui est attribué en Angleterre. Les cônes présentaient une décoloration
caractéristique d’une infection par un Oïdium, cependant même les cultivars résistants étaient
infectés. Le seul pathogène retrouvé sur ces cônes était Alternaria alternata. Des inoculations
sur des cônes sains avec ce champignon aboutissent aux mêmes symptômes.
I. 1. 1. 4. 5. 4. Cladosporium
Cladosporium n’est pas non plus un pathogène du houblon mais il peut infecter les
cônes de houblon si les conditions lui sont favorables. L’infection des cônes par
Cladosporium se caractérise par la coloration brune des bractées.
25
I. 1. 1. 4. 5. 5. Fusarium sambucinum et F. avenaceum

Fusarium sambucinum provoque un chancre du houblon localisé à la base de la liane où
apparaît une nécrose du liber (phloème secondaire). La liane peut ainsi facilement être cassée
à cet endroit, les feuilles sur la liane deviennent alors flasques. L’infection par ce pathogène
se produit à l’endroit d’une blessure de la plante. Le collet est particulièrement sensible, car il
subit les contraintes entre la liane et la souche. Dans certains cas de plantation il peut
également frotter contre le piquet qui retient le fil de tuteurage. Les tissus au-dessus du
chancre gonflent à cause du stockage des matières carbonées car les flux vers la souche par le
phloème sont interrompus.
F. sambucinum et F. avenaceum ont été isolés à partir de cônes nécrosés en Oregon. Ils
ont été inoculés sur des cônes sains et ont montré un pouvoir pathogène reproduisant les
même symptômes de nécrose (Bienapfl MS thesis).
Les maladies provoquées par Fusarium sambucinum peuvent être facilement évitées en
préservant les lianes de dommages physiques. Le thiabendazole, qui se combine avec les
microtubules, a montré une efficacité dans le contrôle de la maladie.
I. 1. 2. Le champignon modèle : Fusarium graminearum
I. 1. 2. 1. Biologie du champignon
Les champignons se caractérisent par une croissance sous forme de mycélium. Ces
eucaryotes sont hétérotrophes vis à vis des sources de carbone.
Les champignons peuvent se classer dans différentes familles. Les Chytridiomycètes
sont caractérisés par la présence d’un flagelle unique au niveau de la zoospore. Parmi les
Chytridiomycètes, on retrouve les champignons de la flore du rumen. Ces derniers sont
caractérisés par une croissance anaérobie. Les Zygomycètes sont définis par leur aptitude à
fusionner leur mycélium pour former une gametangia qui donnera des zygospores. Les
Ascomycètes tirent leur nom des spores haploïdes produites lors de la reproduction sexuelle.
Ils ont également un mode de reproduction asexué, qui implique la production de
conidiospores. Les Basidiomycètes produisent des spores haploïdes nommées basidiospores.
La présence de « clamp connections », qui permettent de maintenir l’état dicaryotique à
l’extrémité de l’hyphe est également une des caractéristiques de ce groupe. Les autres
champignons qui ne montrent pas de phase sexuelle sont habituellement classés parmi les
champignons mitosporiques.
26
F. graminearum se cultive facilement sur milieu PDA (Potato Dextrose Agar, Annexe
1) à une température de 25°C. Il présente alors un aspect duveteux ainsi qu’une coloration
caractéristique rose (Fig. 10).
A B
Fig. 10. Apparence de Fusarium graminearum en culture in vitro.

A culture sur milieu PDA B culture sur mileu SNA induisant la production de spores.
I. 1. 2. 1. 1. Position taxonomique
Gibberella zeae est la forme téléomorphe ou sexuelle du champignon. Il appartient à la
division des Ascomycètes, classe des Sordariaceae, ordre des Hypocréales, et famille des
Nectriaceae. Fusarium graminearum est le nom de la forme anamorphe ou asexuelle, il est
classé dans la famille des Hypocréales mitosporiques dans l’ordre des Hypocréales.
Le genre Fusarium comporte une cinquantaine d’espèces dont certaines sont connues
pour engendrer des pathologies. Dans le complexe d’espèces F. oxysporum, les noms attribués
aux différentes formes spéciales sont directement dérivés de l’hôte sur lequel le champignon a
été isolé. F. sambucinum est un pathogène reconnu des solanacées (Lynch et al., 2003). F.
avenaceum (téléomorphe Gibberella avenacea) a été décrit comme pathogène de la pomme
de terre mais aussi d’autres plantes comme la gentiane ou encore le pin (Desjardins, 2003).
Au contraire de ses cousins pathogènes, F. venenatum est utilisé pour la production de Quorn.
Le Quorn est un assemblage des filaments du mycélium du champignon, traité avec des
arômes pour imiter la viande et servir de source de protéine de substitution.
Parmi l’espèce biologique G. zeae, 7 lignées phylogénétiques ont été mises en évidence
(O’Donnell et al., 2000). Les auteurs ont réalisé un arbre phylogénétique à partir de la
27
combinaison des données de 6 gènes (Fig. 11.). Les origines des différentes lignées ainsi que
leur migration sont représentées dans la figure 8. La lignée numéro 4 est majoritairement
présente en Europe et provient d’Amérique du sud. L’Amérique du sud semble d’ailleurs être
le berceau de la plupart des lignées de Fusarium graminearum.
Fig. 11. Différentes lignées de Gibberella zeae, leur localisation et migration géographique.
Source : O’Donnel et al. 2000 et Cereal Disease Laboratory.
I. 1. 2. 1. 2. Cycle sexuel de Gibberella zeae

Les champignons capables de reproduction sexuée utilisent deux types de stratégie. La
première appelée reproduction hétérothallique est caractérisée par la présence d’un locus
MAT avec deux formes alternatives. La reproduction ne peut se produire qu’entre individus
ayant des loci de différents types. La majorité des Ascomycètes utilisent cette stratégie de
reproduction. G. zeae utilise un mode de reproduction homothallique, il est caractérisé par la
présence simultanée des deux formes du locus. Il est auto fertile et peut donc réaliser une
reproduction sexuée avec lui-même ou avec d’autres individus (Yun et al., 2000). Ce type de
mode reproductif peut être modifié génétiquement. La délétion de l’une ou l’autre forme du
locus MAT peut transformer G. zeae en champignon à mode de reproduction hétérothallique
(Lee et al, 2003).
28
I. 1. 2. 1. 3. Spores de Fusarium graminearum

F. graminearum produit deux types de spores : les ascospores et les macroconidies
(Fig. 12).
A B
Fig. 12. Différents types de spores de Fusarium graminearum.

A Périthécium contenant les ascospores (a) (Source Trail 2002) B Macroconidie isolée
Les ascopspores sont produites lors de la reproduction sexuée dans des asques contenus
dans le périthécium. Cette structure sert de canon à spores : des recherches récentes ont
montré que le mécanisme d’expulsion dans les asques serait lié à une augmentation de
pression interne lié à un influx d’ion et de mannitol (Trail et al., 2002). Ces auteurs ont
également montré que la décharge de spores se réalisait préférentiellement en présence de
lumière.
Les macroconidies sont des spores issues de phénomènes mitotiques. L’induction de la
production de macroconidies peut être faite par la culture du champignon sur le milieu SNA
(Syntheticher Nährstof Agar, Fig. 10, Annexe 1). Cette forme de spore est la plus couramment
utilisée au laboratoire pour inoculer des milieux de culture, de par la facilité à les produire en
grande quantité (Stack, 1989). Ces spores sont particulièrement résistantes aux cycles de
congélation/décongélation mais perdent rapidement leur viabilité lors d’exposition à des
conditions où l’humidité relative est inférieure à 53% (Beyer et al., 2004). Les macroconidies
sont les spores observées pour l’identification du genre Fusarium.
29
I. 1. 2. 2. Identification
L’étude d’un organisme pathogène implique de maîtriser son identification. De plus,

dans un souci d’exactitude, il faut pouvoir vérifier l’identité du champignon utilisé tout au
long des expériences. L’identification correcte d’un pathogène est également un élément clé
dans le suivi des épidémies sur le terrain.
La classification des champignons est historiquement basée sur de nombreux caractères

morphologiques et biologiques observables. L’identification des champignons filamenteux est
alors effectuée par la comparaison d’un grand nombre de critères (Guarro et al. 1999). Dans le
cas des Fusarium, l’examen des macroconidies permet d’identifier rapidement le genre et, en
fonction de la forme et de la septation, donner une indication quant à l’espèce.
Etant donné que les champignons montrent rarement tous les aspects morphologiques
nécessaires à leur identification, il est nécessaire de les cultiver. La culture des champignons
inconnus sur différents milieux de culture sert alors à induire des phénotypes recherchés.
L’observation des septations, de la forme et du branchement des hyphes, des structures de
sporulation et des spores sont une partie des caractères observés pour identifier correctement
le champignon. Des méthodes d’analyse biochimiques peuvent également apporter des
informations sur le champignon. La détermination du contenu en acide gras, de la
composition de la paroi cellulaire, de la composition en protéines ou encore des métabolites
secondaires font partie des critères étudiés.
Outre le temps considérable de culture après isolement du champignon de telles
méthodes d’identification requièrent l’œil d’un expert pour les observations microscopique
ainsi qu’une expérience conséquente.
Depuis quelques années des méthodes d’identification basées sur des techniques de
biologie moléculaire ont fait leurs preuves et se sont imposées par leur fiabilité. Ces
techniques sont majoritairement basées sur l’ADN.
L’amplification par PCR de régions spécifiques est une méthode puissante pour
l’analyse ciblée d’un type de champignon (Hsu et al., 2003). Le polymorphisme
d’amplification d’ADN aléatoire (Random Amplified Polymorphic DNA : RAPD, Hadrys et
al., 1992) est une méthode consistant à amplifier à l’aide d’amorces dégénérées des cibles
aléatoires. Le profil de bandes obtenu peut être caractéristique et permettre la distinction
d’espèce de champignons (Carnegie et al., 2001) mais aussi de races du même champignon
(Mar Jimenez-Gasco et al., 2003). Les méthodes basées sur l’analyse du polymorphisme de
taille de fragments de restriction (Restriction Length Fragment Polymorphism : RFLP
30
(Botstein et al., 1980) et la combinaison PCR et RFLP : analyse du polymorphisme de

fragments amplifiés (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences : CAPS) sont également des
méthodes robustes (Kamiya et al., 2004).
Ces méthodes de biologie moléculaire reposent sur des séquences cibles spécifiques à
l’exception de l’analyse RAPD. Parmi les cibles classiquement utilisées pour les
identifications, on retrouve l’ADN ribosomique (ADNr), l’ADN mitochondrial et parfois des
séquences répétées de type microsatellites. Actuellement près de 700 000 séquences d’ADNr
fongiques sont disponibles dans Genbank. Pour l’identification des champignons filamenteux,
la cible prépondérante est l’ADNr (Guarro et al., 1999). L’avantage de cette cible est multiple.
Il s’agit de séquences répétées dans le génome et retrouvées dans tous les organismes vivants.
L’unité minimale se compose de plusieurs parties, des séquences très conservées (18S, 5.8S et
28S) alternant avec des séquences beaucoup plus variables (ETS, ITS1 & 2 et IGS) (Fig. 13).
ETS 18S ITS1 5.8S ITS2 28S IGS

5’ 3’
Fig. 13. Représentation d’une unité d’ADN ribosomique. ETS: externally transcribed spacer,
ITS: internally transcribed spacer et IGS: intergenic spacer.
Des techniques d’identification basées sur la détection de molécules ont également été
développées. Dans ce cas les caractéristiques recherchées sont des exoantigenes qui
caractérisent les champignons. Les techniques d’immuno-chimie et notamment la méthode
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) sont couramment utilisées dans ce but. Cette
méthode de détection a montré son efficacité dans la détection de champignons filamenteux
(Li et al., 2000).
I. 1. 2. 3. Pathogènicité de F. graminearum
F. graminearum peut se comporter comme saprophyte sur des déchets végétaux. Il peut
également provoquer diverses pathologies sur de nombreuses céréales (blé, orge, maïs, riz)
mais aussi sur d’autres plantes de grande culture comme le soja ou encore le coton
(Desjardins, 2003).
31
Fig. 14. Cycle infectieux de Fusarium graminearum sur les céréales.

Source : The American Phytopathology Society http://www.apsnet.org
I. 1. 2. 3. 1. Cycle infectieux de Fusarium graminearum

Le cycle infectieux classique sur céréales est présenté sur la Fig. 14. Au début de la
saison Fusarium graminearum se développe sur les déchets végétaux présents dans les
champs. Des périthécia sont rapidement formés dans le but de produire des ascospores. Des
macroconidies apparaissent également. Les ascospores sont préférentiellement éjectées du
périthécium entre 16h et 18h à une concentration de 600 à 9000 ascospores.m-3 créant une
première vague de spores responsables de l’infection initiale (Paulitz, 1996). Il y a
approximativement deux fois plus d’ascospores dispersées par l’air que de macroconidies
(Markell et Francl, 2003). Les spores vont se fixer sur les épis et germer en fonction des
conditions de température et d’humidité. Les symptômes alors provoqués sont un
dessèchement précoce de certaines parties de l’épi, ainsi qu’un moindre remplissage des
grains. Les champignons se développent également à la surface de l’épi qui présente après une
période humide la coloration rose caractéristique du genre Fusarium. Cette maladie est
appelée fusariose de l’épi (Fig. 15.). Lors de l’infection, de nouvelles spores vont être
produites pouvant mener à une infection secondaire d’autres plants mais aussi au relargage de
spores dans le sol qui seront responsables de l’épidémie de l’année suivante. Les grains de
l’épi seront contaminés par les spores du champignon (Fig. 16).
32
Fig. 15. Fusarioses provoquées par Fusarium graminearum sur différents hôtes.
A Fusaroise de l’épi de maïs B Fusariose de l’épi de blé.
Source : Kent Evans
La plantation de grains contaminés par F. graminearum mène à la dissémination du

pathogène. De plus lors de la plantation de grains infectés, les jeunes pousses présentent des
tâches brunes et des nécroses le plus souvent sur le système racinaire. La plante ne pouvant
plus se nourrir correctement meurt rapidement. Ces symptômes décrivent la fonte des semis.
A B
Fig. 16. Grains infectés par Fusarium graminearum. A grains d’orge B grains de blé
Source : Berstrom
33
I. 1. 2. 3. 2. Production de toxines
Les mycotoxines sont des métabolites secondaires retrouvés sur des lieux d’infection
(Munkvold et al., 2003). F. graminearum produit deux types de toxines.
Dans la famille des trichothecènes, les deux types de mycotoxines les plus importantes
économiquement sont le nivalenol (NIV) et le deoxynivalenol (DON) (Fig. 17). F.
graminearum produit majoritairement le DON. Cette toxine a des effets variés (Rotter et al.,
1996). Elle provoque des vomissements chez les animaux aussi bien que chez l’homme, d’où
son nom de vomitoxine, ce qui conduit à une anorexie des animaux. Les cochons sont
beaucoup plus sensibles à cette toxine que les souris ou encore les bovins. Au niveau
cellulaire cette toxine inhibe la synthèse de protéines en se fixant sur les ribosomes. Le DON
possède également des effets sur le système nerveux ainsi que sur le système immunitaire. Il a
été montré une influence de la toxine sur un facteur de transcription critique dans les réactions
immunitaire de type inflammatoire (Ouyang et al., 1996). Une étude a montré une interaction
de différents Fusarium sur la production de DON chez F. graminearum. En présence de F.
moniliforme ou F. proliferatum la production de DON est très fortement stimulée chez F.
graminearum (Velluti et al., 2001). Une telle induction pourrait souligner un aspect coopératif
dans le processus infectieux. En plus de l’action sur l’hôte, le DON a une action protectrice,
en inhibant la production d’une chitinase chez l’agent de bio-contrôle Trichoderma atroviride
(Lutz et al., 2003).
La toxine zéaralénone (ZEN) est également produite par F. graminearum et contamine
les céréales récoltées avec des taux qui peuvent monter à 2mg.kg –1
(Bottalico, 1998) (Fig.
17). Cette toxine a des homologies structurales avec les hormones oestrogéniques des
mammifères. Elle provoque des vulvo-vaginites chez les truies prépubères et pendant les
gestations, elle réduit le nombre d’embryons viables (Etienne et Dourmad, 1994). Cette toxine
provoque également des effets hépatotoxiques, qui ne sont pas encore élucidés mais doivent
résulter de produits de détoxification créés lors des réactions de conjugaisons pour éliminer la
toxine. De part sa proximité structurale avec les œstrogènes, des dérivés de ZEN sont utilisés
comme anabolisants. Au niveau cellulaire, la ZEN inhibe la synthèse d’ADN et de protéines
et perturbe le cycle cellulaire (Abid-Essefi et al., 2004). Les effets coopératifs de la
production de DON ne sont cependant pas retrouvés pour la production de ZEN, dont le taux
de production reste inchangé malgré la présence de F. moniliforme ou F. proliferatum (Velluti
et al., 2000).
34
Fig. 17. Structure chimique des principales mycotoxines de Fusarium graminearum.
I. 1. 2. 3. 3. Pouvoir pathogène de Fusarium graminearum

L’entrée dans la plante peut se faire par différents moyens (Fig. 18.). Certains
champignons disposent de structures leur permettant de percer la paroi de la plante. Ces
structures sont appelées appressorium. Certaines spores germent à la surface des plantes et
pénètrent par le stomate le plus proche. D’autres champignons s’introduisent par des lésions
déjà présentes à la surface des plantes. Enfin il a été montré la pénétration de Pyrenpeziza
brassicae dans Brassica napus sans formation d’appressorium, mais avec une forte
production de cutinase (Davies et al., 2000). Cette enzyme permet l’hydrolyse de la cutine,
cire hydrophobe présente à la surface des feuilles.
A C
Fig. 18. Mode d’entrée du champignon dans la plante. A Entrée du champignon par un stomate B
Formation d’un appressorium(*) par Magnaporthe grisea C Formation d’un appressorium(*) par
Phytophtera infestans.
Fusarium graminearum n’est pas capable de former des structures de type appressorium
comme Phytophthora infestans. Il est par conséquent obligé de trouver d’autres voies d’entrée
dans la plante. Fusarium graminearum trouve facilement des sites propices à infection au
niveau des plumeaux des jeunes épis des céréales ou sur des blessures. F. graminearum
35
dispose également de cutinases (8 protéines prédites) mais leur rôle dans le processus
infectieux n’a pas encore été clairement démontré.
Les parois végétales sont composées de différents polymères, cellulose, xylane, pectine
ainsi que de lignine. F. graminearum dispose d’un grand nombre d’enzymes lytiques qui lui
permettent de dégrader la paroi cellulaire de la plante. Ces enzymes sont appelées enzymes de
dégradation de paroi cellulaire (Cell Wall Degrading Enzymes : CWDE). Parmi les CWDE,
on retrouve les enzymes capables de lyser chaque couche de la paroi végétale : cellulases,
xylanases et pectinases.
Il a été montré que les spores de Fusarium graminearum germaient à la surface des épis
en produisant des tubes germinatifs. Ces derniers forment un mycélium dense colonisant
préférentiellement les cavités de l’épi. Ensuite le mycélium forme des hyphes infectieux qui
colonisent l’ovaire. L’analyse des zones infectées montre une réduction des différents
composants de la paroi végétale, indiquant clairement que les CWDE sont des facteurs
importants de pathogénicité (Wanjiru et al., 2002).
Outre les enzymes lytiques capables de digérer les tissus végétaux, les mycotoxines de
Fusarium graminearum jouent un rôle important lors de l’infection des plantes. La disruption
de l’enzyme trichodiène synthase désactive la voie de biosynthèse des trichothecènes. Un
mutant disrupté a été créé et son aptitude à infecter des épis et grains de maïs a été testée. Le
mutant reste pathogène vis à vis du maïs cependant son pourvoir pathogène est réduit (Harris
et al., 1999). Il a été également montré que l’implication du DON dans les pathologies
végétales est proportionnelle à sa concentration (Asran et al., 2003).
I. 1. 2. 4. Moyens de lutte contre Fusarium

Différents moyens de lutte existent, cependant la prévention reste la meilleure arme
contre les épidémies de fusariose en champ.
I. 1. 2. 4. 1. Pratiques culturales
La production de spores infectieuses à partir des déchets végétaux présents dans les
champs est la première étape du cycle infectieux de F. graminearum. Il convient donc de ne
pas réutiliser les déchets végétaux pour fumer les cultures.
Au niveau du semis, il est recommandé de semer les céréales dans un sol bien travaillé.
Idéalement le sol doit favoriser une germination et une levée rapide. De cette manière la jeune
plante peut être plus robuste pour faire face à une infection.
36
Une pratique d’alternance de culture apporte des effets bénéfiques compte tenu de la
préservation nécessaire des ressources du sol. De plus, elle induit une variation naturelle de la
flore favorable à la résistance aux pathogènes. De plus la culture de variétés résistantes est à
privilégier.
I. 1. 2. 4. 2. Utilisation de fongicides
De nombreux fongicides sont disponibles pour lutter contre les champignons (Annexe
2).
Pour empêcher la fonte des semis des céréales, les semenciers enrobent, lors du
conditionnement, les graines de fongicide (captane ou thirame). La graine bénéficie alors
d’une protection lors de la germination ainsi que lors du début de la croissance de la plantule.
I. 1. 2. 4. 3. Moyens de lutte biologique

De nombreux agents de bio-contrôle sont actuellement disponibles dans le commerce.
Le principe repose sur l’hyper-parasitisme. Certains champignons sont des parasites d’autres
champignons. C’est le cas pour de nombreuses espèces du genre Trichoderma.
T. harzianum a été décrit comme capable de contrôler les pathologies induites par F.
oxysporum sur le bananier (Thangavelu et al., 2004).
I. 2. Interaction hôte-pathogène : la dégradation de la paroi végétale

Les interactions entre hôte et pathogène peuvent être nombreuses. F. graminearum ne
dispose pas de structure lui permettant de franchir la paroi végétale. Il doit trouver d’autres
moyens pour pénétrer à l’intérieur de la plante. Dans le cas des céréales il pénètre au niveau
des plumeaux des jeunes épis. Cette zone de la plante n’est pas totalement développée et la
paroi végétale en ce point est peu épaisse. Plus tard dans le processus infectieux il a été
montré que l’épaisseur de la paroi végétale au niveau du site d’infection est diminuée
(Wanjiru et al. 2002). Ainsi les CWDE (enzymes de dégradation de paroi cellulaire) jouent un
rôle important dans le processus infectieux.
L’interaction entre les deux organismes est donc examinée au niveau de la dégradation
de la paroi cellulaire de la plante par le champignon.
37
I. 2. 1. Paroi végétale
Une des caractéristiques essentielles des cellules végétales est la présence d’une paroi
cellulaire. Cette paroi est formée de différents polysaccharides et joue plusieurs rôles. Elle
assure une structure qui évite l’explosion des cellules due à la pression vacuolaire. Elle permet
à la plante de s’isoler de l’extérieur et d’éviter les pertes d’eau notamment par l’adjonction
d’une couche de cutine. Enfin elle protège la plante de stress physiques et est une barrière
efficace contre les insectes et les pathogènes.
La paroi est une structure dynamique avec différents stades de développement. La

couche intercellulaire : il s’agit de la première couche formée durant la division cellulaire et
est partagée avec la cellule adjacente. Elle est majoritairement formée de pectine et de
glycoprotéines. La paroi primaire : elle est formée après la couche intercellulaire. Elle est
constituée d’un squelette rigide de microfibrilles dans une matrice de pectine, d’hémicellulose
et de glycoprotéines. La paroi secondaire : sa synthèse est réalisée lorsque la cellule a atteint
sa taille finale. Elle est extrêmement rigide car composée de cellulose, hémicellulose et
lignine.
I. 2. 1. 1. Cellulose
La cellulose est un polymère formé de 1 000 à 10 000 résidus de D-glucose en liaison β.
Ces polymères ont la capacité de s’associer par des liaisons hydrogènes formant des
microfibres (Fig. 19). Ces microfibres peuvent s’associer en fibres plus grandes. Les fibres de
cellulose sont constituées d’environ 500 000 molécules de cellulose, elles-mêmes formées de
5 000 résidus glucoses. Une telle structure peut donc renfermer environ 2,5 milliards de ponts
hydrogènes. Même si un pont hydrogène est dix fois moins fort qu’une liaison covalente, 2,5
milliards de ponts expliquent largement la robustesse de la cellulose.
38
Fig . 19. Structure de la cellulose et formation de ponts hydrogènes.

Source : T. A. Newton
I. 2. 1. 2. Hémicellulose
L’hémicellulose est une couche formée de différents polymères contenant une variété de
sucres : xylose, arabinose, mannose. La particularité de l’hémicellulose est le mélange de
monomère ainsi que de nombreuses ramifications. Le xyloglucan est un composant majeur de
l’hémicellulose chez les dicotylédones.
La proportion de xylane par rapport à la paroi cellulaire est de 15-30% et 7-10%
respectivement pour les angiospermes et les gymnospermes. Ce polymère est formé de xylose
avec des liaisons β-1-4. Les monomères peuvent être substitués par différents composés : α-L-
arabinofuranoside, glucuronopyranosyl, 4-O-methyl-D-glucuronopyranosyl, acetyl, feruloyl
et/ou p-coumaroyl (Fig. 20). Le xylane réalise l’interface entre la cellulose et le la lignine. Il
constitue donc une couche importante de la paroi cellulaire secondaire, lui assurant une
meilleure cohésion (Beg et al., 2001).
Compte tenu de la complexité du xylane, un large panel d’enzymes doit être mis en
œuvre afin d’arriver à sa dégradation complète. Les différentes activités enzymatiques ainsi
que leurs cibles sont représentées en Fig 20. Des organismes capables de dégrader le xylane
sont effectivement équipés d’une batterie enzymatique, Trichoderma viride et Aspergillus
niger produisent respectivement treize et quinze xylanases différentes (Biely et al., 1985).
39
Fig. 20. Structure du xylane et site d’attaque des xylanases. a polymère de xylane, Ac., Acetyl
group; a-araf., a-arabinofuranose; a-4-O-Me-GlcUA, a-4-O-methylglucuronic acid; pcou., p-
coumaric acid; fer., ferulic acid.b hydrolyse de xylo-oligosaccharides.
Source : Collins et al. 2004.
I. 2. 1. 3. Acide pectique et la pectine

L’acide pectique est formé d’une centaine de monomère d’acide galacturonique liés par
des liaisons α-1-4. La présence d’une fonction acide carboxylique rend la molécule très
soluble et permet la formation de ponts ioniques entre les polymères (Fig. 21). La pectine est
un polymère d’acide galacturonique plus grand, on compte environ 200 résidus par molécule.
De plus, la plupart des groupements carboxyles sont méthylés, rendant la molécule moins
soluble (Fig. 21).
40
A B
Fig. 21. Structure de l’acide pectique avec la formation de ponts ioniques avec le calcium (A) et
acide galacturonique méthylé (B).
Source : Biologie et multimédia - Université Pierre et Marie Curie, Paris
I. 2. 1. 4. Glycoprotéines
La paroi cellulaire des plantes contient de nombreuses protéines. Ces protéines se
caractérisent par de nombreuses glycosylations mais aussi par une richesse en hydroxyproline.
Les résidus hydroxyproline sont souvent glycosylés. De plus, les protéines de la paroi sont
également riches en lysine qui par sa fonction NH3+ peut établir de nombreuses liaisons, dont
des liaisons avec les fonctions acide-carboxylique des acides pectiques.
L’extensine fait partie des protéines de la paroi cellulaire. Cette protéine a la
particularité de pouvoir former des liaisons covalentes avec d’autres extensines par leurs
résidus tyrosine. L’extensine a une structure en hélice du fait de sa forte proportion
d’hydroxyproline. Cette structure ainsi que les nombreux ponts formés avec la cellulose
renforce la cohésion de la paroi.
I. 2. 1. 5. Lignine
La lignine est un polymère formé de résidus phénoliques. La phénylalanine ammonia
lyase (PAL) permet de synthétiser le cinnamate à partir de phénylalanine. L’acide cinnamique
est alors le point de départ de la synthèse de nombreux monolignols (Fig 22).
41
Fig. 22. Synthèse de monolignols.

Source : Stephen C Fry , Plant Cell Wall Biosynthesis,
Le monolignols sont sécrétés par la cellule. C’est dans la paroi cellulaire que se
produisent des réactions de polymérisation des différents monolignols. Ces derniers forment
des radicaux libres intermédiaires qui leur permettent de se polymériser entre eux mais aussi
avec les sucres des autres polymères de la paroi. La lignine présente alors une rigidité du fait
des nombreuses liaisons covalentes (Fig. 23).
42
Fig. 23. Polymère de lignine : différentes liaisons possibles entre les différents monolignols.
Source : Weissenböck, 1976
I. 2. 2. CWDE
Les CWDE (Cell Wall Degrading Enzymes, enzymes de dégradation de la paroi
cellulaire) sont l’ensemble des enzymes qui permettent de dégrader les différentes couches de
la paroi cellulaire. Les différentes enzymes retrouvées dans cette famille sont : les cellulases,
les pectinases, les xylanases et les protéases.
I. 2. 2. 1. Cellulases
La famille des cellulases est composée des cellobiohydrolases (EC 3.2.1.91), des
endoglucanases (EC 3.2.1.4) qui hydrolysent la cellulose et des β-glucosidases (EC 3.2.1.21)
qui hydrolysent le cellobiose. Les endoglucanases coupent les liaisons β–glucosidiques à
l’intérieur du polymère de glucose, elles forment de plus petits polymères et libèrent ainsi un
grand nombre d’extrémités. Les cellobiohydrolases réalisent une coupure à l’extrémité des
molécules du polymère en libérant du cellobiose. Ce dernier est hydrolysé en deux molécules
de glucose par les β-glucosidases. Ces enzymes agissent donc d’une manière synergique dans
la dégradation de la cellulose (Lynd et al. 2002).
43
Les applications biotechnologiques des cellulases sont diverses, dont le traitement des
pulpes de bois dans l’industrie du papier.
I. 2. 2. 2. Pectinases
Les pectinases regroupent différentes familles d’enzymes ayant pour substrat la pectine
ou l’acide pectique. Les pectine méthyle estérases (EC 3.1.1.11) catalysent la desestérification
du groupement méthyle présent dans la pectine pour la transformer en acide pectique.
D’autres enzymes sont responsables de la dépolymérisation. Les polygalacturonases (PG) et
les pectate lyases (PL) ont pour substrat l’acide pectique et se subdivisent chacune en deux
familles respectivement : les exo-PG (EC 3.2.1.67) et les endo-PG (EC 3.2.1.15) et les exo-PL
(EC 4.2.2.9) et endo-PL (EC 4.2.2.2). Les PG et les PL se distinguent par leur mécanisme de
rupture de liaison, respectivement par hydrolyse et β-élimination. Les pectine lyases (endo-
PNL, EC 3.2.2.10) ont pour substrat la pectine. Elles réalisent toutes des coupures internes
dans la chaîne d’acide galacturonique méthylé.
Les pectinases sont utilisées dans l’industrie alimentaire pour réaliser la clarification des
jus de fruits et représentent donc un important marché.
I. 2. 2. 3. Xylanases
Les xylanases sont des glucosidases (EC 3.2.1.x) qui catalysent l’hydrolyse du xylane.
Ces enzymes sont produites par une grande diversité d’êtres vivants : des bactéries, des
champignons, des protozaires, des gastéropodes et des arthropodes.
Les xylanases peuvent ont été classifiées de différentes manières. Diverses xylanases
ont été décrites, mais il n’est pas possible de classifier correctement les enzymes par leur
spécificité de substrat vu la complexité de ce dernier. La classification initiale avait rangé les
cellulases et xylanase en 6 familles (A-F). En 1999, ce système a été mis à jour et 77 familles
sont maintenant décrites (1-77). En 2004 la classification compte 96 familles, leur nombre
augmente en fonction des nouvelles séquences présentes dans les bases de données. La
différenciation de ces familles est basée sur la comparaison de séquences des sites
catalytiques.
De part leur activité les xylanases font partie des glycosidases, plus précisément des
endo-1,4-β-xylanases (EC 3.2.1.8). Les enzymes correspondantes sont décrites dans les
familles 5, 7, 8, 10, 11, 16, 26, 43, 52 et 62 (Collins et al., 2004). Les auteurs ont effectué des
recherches bibliographiques et seulement les enzymes appartenant aux familles 5, 7, 8, 10, 11
44
et 43, possèdent des domaines dont l’activité endo-1,4-β-xylanase a été confirmée par des
tests biochimiques. Les séquences relatives aux familles 16, 52 et 62, se rapportent à des
enzymes bifonctionnelles contenant des domaines catalytiques des familles 10 et 11. Par
conséquent les enzymes à considérer comme xylanases appartiennent aux familles 5, 7, 8, 10,
11 et 43. Les structures de nombreuses xylanases sont connues (Fig. 24). Les six familles
montrent des structures très différentes. L’analyse des structures est un facteur dans la
compréhension du fonctionnement mais aussi de la stabilité des enzymes dans certaines
conditions extrêmes.
Fig. 24. Structure des différentes familles de Xylanases. a XynA, Erwinia chrysanthemi. La
structure en tonneau (β/α)8 du site catalytique et le tonneau β 9 sont montrés. b pXyl,
Pseudoalteromonas haloplanktis TAH3a. La structure du tonneau (α /α) est présentée. c
Xylanase de Streptomyces lividans montrant la structure caractéristique de la famille 10. d
Xylanase de Trichoderma reesei montrant la structure caractéristique de la famille 11. e ED1,
Trichoderma reesei. f a-L-arabinanase de Cellvibrio japonicus.
Source : Collins et al. 2004.
I. 2. 2. 4. Protéases
Ces enzymes s’attaquent aux glycoprotéines de la paroi. La sécrétion de protéases lors
d’infection est fortement augmentée et une relation a été établie entre la taille des lésions et
les activités protéasiques sur des pommes de terre (Olivieri et al., 2004). Les protéases (EC
45
3.4.24.x) sont des enzymes hydrolysant les liaisons peptidiques, elles sont classées selon leur
mode d’action et leurs sites préférentiels de coupure.
I. 3. X-omique
I. 3. 1. Outils bio-informatiques
Les développements rapides des techniques de biologie moléculaire durant les deux
dernières décennies, se sont accompagnés de la génération croissante d’informations. Le
traitement de ces informations a pu être réalisé grâce aux progrès de l’informatique, en
particulier des outils logiciels. Les gains de temps engendrés par des outils puissants sont
considérables : par exemple, l’assemblage d’un millier de séquences peut être réalisé en
quelques secondes.
I. 3. 1. 1. Logiciels
De nombreux logiciels ont été développés pour subvenir à la demande des chercheurs.
Nous ne parlerons pas des solutions commerciales intégrées car elles se remplacent facilement
par l’utilisation de multiples solutions gratuites.
I. 3. 1. 1. 1. Alignements de séquences
Deux types d’alignements sont très souvent utilisés : les alignements multiples et les
recherches d’homologie.
Les alignements multiples permettent de réaliser un alignement entre plusieurs données
par l’utilisateur. Cet alignement peut alors donner divers renseignements lors de la
comparaison directe des séquences. Il peut également servir de base pour le calcul de
distances génétiques. Différents programmes existent un programme est cependant
communément utilisé : ClustalW. Ce programme réalise l’alignement par plusieurs étapes en
faisant varier les matrices de substitution, les pénalités de gap pour obtenir le meilleur
alignement (Thompson et al., 1994).
Les recherches d’homologies ont pour but d’identifier dans une banque de séquences, la
ou les séquences présentant le plus d’homologie avec la séquence de requête. Différents
algorithmes existent, l’algorithme BLAST (Basic Local Alignement Search Tool) étant
majoritairement utilisé dans le programme du même nom, BLAST (Altschul et al., 1997).
BLAST se décline en plusieurs programmes qui permettent de réaliser les recherches avec des
séquences nucléotidiques (BLASTN), des séquences protéiques (BLASTP) mais aussi de
46
lancer une recherche sur une banque protéique en utilisant la traduction dans les six cadres de
lecture d’une séquence nucléotidique (BLASTX). Les résultats de recherche sont évalués par
un score et par un indice de probabilité : l’expectation. Cet indice indique la probabilité de
trouver une séquence présentant les mêmes homologies en tenant compte de la taille de la
banque dans laquelle la recherche a été effectuée. Les banques de données de séquences
représentent un point clé dans le cadre des recherches d’homologies. Leur choix ou alors leur
création spécifique permet des analyses très fines d’homologies.
I. 3. 1. 1. 2. Traitement de séquences
L’analyse de séquences nécessite très souvent plusieurs manipulations comme la
détermination de la séquence complémentaire réverse, la recherche de sites de restriction, le
formatage et des opérations plus compliquées comme la détermination du site de clivage d’un
peptide signal ou encore la détermination des sites antigéniques potentiels d’une protéine.
Historiquement, le package de programme GCG (Oxford molecular) était largement
distribué dans les centres de bio-informatique. Le développement d’EMBOSS (European
Molecular Biology Open Software Suit) a été initié pour offrir une solution libre d’accès.
Depuis 2000, le package de programme est distribué gratuitement et prend de plus en plus
d’importance. Cet ensemble de programmes souscrit à la philosophie « Open source » qui
laisse le code source des applications et bibliothèque d’accès libre à l’utilisateur. Le package
de programme est complet et recouvre tous les champs de la biologie moléculaire.
Traditionnellement ces programmes s’utilisent à la ligne de commande ce qui permet
d’automatiser les traitements pour de grandes séries d’analyses. Différentes interfaces
graphiques permettent d’utiliser facilement les logiciels existant et sont régulièrement
développées.
Le programme PHRAP (PHRagment Assembly Program) est un logiciel sous licence
qui permet de réaliser l’assemblage automatique de fragments de séquences en une séquence
unique. Ce logiciel est destiné à l’assemblage de produits de séquençage massif. Dans le cas
de banques d’EST (Expressed Sequence Tag), il permet d’éliminer les séquences redondantes
et d’assembler les séquences contiguës.
I. 3. 1. 1. 3. Analyses phylogénétiques
Les analyses phylogénétiques ont pu être réalisées de plus en plus facilement grâce à
l’augmentation de la puissance de calcul des ordinateurs mais aussi par les solutions logiciel
disponibles.
47
Le package de logiciel PHYLIP (PHYLogeny Inference Package) est distribué

gratuitement et contient une trentaine de logiciels pour réaliser les analyses phylogénétiques
et créer les arbres qui résultent de l’analyse. Le logiciel PAUP* destiné à réaliser les mêmes
analyses, est devenu un standard dans l’analyse phylogénétique des champignons
filamenteux. Elle est basée sur l’alignement multiple de séquences que l’on fournit au
programme. Il est par conséquent capital d’avoir un alignement de séquences sans erreurs ou
incertitudes.
I. 3. 1. 2. Langages de programmation
Les langages de programmation sont devenus de plus en plus adaptés pour le traitement
et l’analyse des séquences. Les langages de scripts sont relativement simples et permettent
d’automatiser des tâches répétitives. Des langages plus évolués comme le langage PERL ou le
langage python permettent facilement d’exploiter des fichiers textes. Des communautés de
développeurs ont réalisé des modules pour ces langages : Bioperl, Biopython et Biojava. Les
modules sont, pour ces langages, des bibliothèques de procédures et d’outils additionnels.
Le module Bioperl contient différents sous-ensembles de programmes qui permettent de
réaliser différentes tâches. Ainsi Bio::SeqIO va permettre d’avoir des procédures pour
manipuler les fichiers de séquences en tenant compte de leurs formats. Bio::SearchIO permet
d’analyser les résultats du programme BLAST. Bio::Graphics permet de générer facilement
des représentations de position sur des séquences par exemple. D’autres sous-ensembles
interfacent l’utilisation de programmes externes au script PERL comme le lancement d’une
recherche BLAST ou encore un alignement avec CLUSTALW par exemple.
I. 3. 1. 3. Gestion des ressources bio-informatiques

De nos jours de nombreux centres de bio-informatique donnent libre accès à leurs
ressources par l’intermédiaire de portails : www.ncbi.nih.gov, www.infobiogen.fr ou
www.ebi.ac.uk par exemple. L’avantage de ces centres est la mise à disposition de grosses
capacités de calcul. Cependant ces ressources ne sont pas « stables » et dépendent souvent de
la connexion réseau mais aussi de la charge de travail instantané du serveur.
La mise en place d’un serveur de bio-informatique à l’échelle d’un laboratoire ou d’une
unité de recherche est envisageable dans le cadre d’un investissement raisonnable. Les temps
de réalisation des analyses peuvent rester très compétitifs à cause d’une charge d’utilisateur
48
moindre. De plus la connectivité réseau en interne est excellente et permet dans de nombreux
cas d’obtenir des résultats instantanés.
L’utilisation combinée de ressources internes et externes permet d’optimiser le temps de
travail et d’obtenir plus rapidement les résultats d’analyses.
I. 3. 1. Génomique
Le premier génome complet à avoir été séquencé est celui de Haemophilus influenzae
(1.8 Mb) en 1995. Le génome de la levure Saccharomyces cerevisiae (14 Mb) a été rendu
public en 1996. Dès lors la course au séquençage a été ouverte. Les technologies de
séquençage ont fait des progrès énormes : amélioration des chromophores et développement
de l’électrophorèse capillaire. Des entreprises privées comme Celera ont été crées afin de
séquencer le génome humain plus rapidement, pour breveter les séquences et ainsi maintenir
un monopole sur les informations. Les instituts publics ont soutenu leurs efforts dans la course
de vitesse les opposant aux entreprises privées, dans le but de garantir le libre accès au
génome. La séquence du génome humain a été publiée en 2001. D’autres génomes ont été
séquencés depuis. Une priorité particulière a été mise sur les organismes pathogènes et les
organismes modèles. L’analyse du génome des organismes modèles comme la levure S.
cerevisiae, permet de comprendre des mécanismes moléculaires présents chez tous les
eucaryotes (Dujon et al., 2004). L’étude des génomes des pathogènes permet quant à elle
d’obtenir une meilleure compréhension des phénomènes liés aux pathologies dans le but de
les enrayer ou de les contrôler.
La mise à disposition des données de séquences a créé une nouvelle discipline : la
génomique. Elle peut être définie comme l'étude exhaustive des génomes et en particulier de
l'ensemble des gènes, de leur disposition sur les chromosomes, de leur séquence, de leur
fonction et de leur rôle.
I. 3. 1. 1. Génomes de champignons filamenteux séquencés

A la date de rédaction de la thèse, 24 génomes de champignons sont disponibles dans la
banque de données publique Genbank (Tab. 1).
49
Ascomycota
Pezizomycotina
Aspergillus fumigatus Aspergillus nidulans FGSC A4
Aspergillus terreus Coccidioides posadasii C735
Gibberella zeae PH-1 Magnaporthe grisea 70-15
Neurospora crassa strain OR74A
Saccharomycotina
Candida albicans Eremothecium gossypii
Kluyveromyces waltii NCYC 2644 Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces bayanus 623-6C Saccharomyces bayanus MCYC 623
Naumovia castellii NRRL Y-12630 Saccharomyces kluyveri NRRL Y-12651
Saccharomyces kudriavzevii IFO 1802 Saccharomyces mikatae IFO 1815
Saccharomyces paradoxus
Schizosaccharomycetes
Schizosaccharomyces pombe
Basidiomycota
Coprinopsis cinerea okayama7#130 Cryptococcus neoformans var. grubii H99
Phanerochaete chrysosporium Ustilago maydis 521
Microsporidia
Encephalitozoon cuniculi
Tab. 1. Liste des champignons dont le génome est complètement ou partiellement séquencé.
Source : NCBI
Ces génomes correspondent principalement à des champignons d’importance sur le plan

économique, pathologique ou de l’évolution. Candida albicans est un pathogène des humains,
hôte dans lequel il occasionne des mycoses des couches superficielles de la peau ou des
muqueuses (muguet buccal, vulvo-vaginite, périonyxis, onychomycose, intertrigo). S.
cerevisiae est une levure modèle. Il s’agit du premier eucaryote à avoir été séquencé. Son
étude a permis de comprendre de nombreux mécanismes cellulaires. Neurospora crassa,
Magnaporthe grisea, F. graminearum sont des pathogènes réputés de nombreuses plantes.
L’étude de leur génome promet une meilleure compréhension des mécanismes de l’infection.
I. 3. 1. 2. Génome de F. graminearum
Le génome de F. graminearum est évalué à 40 Mb repartis sur 4 chromosomes. Le
nombre de gènes présents dans le génome est estimé à 12 000.
Le projet de séquençage a été initié par le Whitehead Institute et soutenu financièrement
par le département d’agriculture des Etats-Unis (USDA). La souche de F. graminearum
retenue pour le séquençage fait partie de la lignée 7 qui est largement répandue à l’échelle
50
mondiale et impliquée dans les cas de pathologie. Cette souche a pour dénomination PH-1
(NRRL 31084).
Le séquençage du génome a été effectué avec la technique du « whole-genome shotgun
sequencing » avec un taux de couverture de dix fois le génome. Cette technique consiste à
découper le génome en morceaux et les séquencer aléatoirement. L’assemblage des différents
morceaux de séquence donne lieu à la création de « contig ».
La séquence du génome a été mise à la disposition de la communauté scientifique le 1er
mars 2003 sous le numéro d’accession AACM00000000. Il est composé de 511 contigs de
plus de 2kb qui représentent 36 Mb soit 90% du génome. Les séquences hautement répétées
ainsi que les gènes des ARN ribosomaux ont été exclus.
Le 1er septembre 2003, le laboratoire de phytopathologie a ouvert son serveur de bio-
informatique au public. Les résultats de BLAST des ORF (Open Reading Frame) de plus de
20aa et de plus de 100aa ont été rendus publics. Une recherche par mot clé dans les résultats
de BLAST ainsi que des recherches instantanées par BLAST dans le génome et dans les ORF
ont été mises à disposition.
Le 1er octobre 2003, la première annotation du génome a été mise en ligne au
Whitehead Institute. Elle se composait d’un jeu de 11 640 gènes prédits. La quantité d’ADN
codant est évaluée à 49,6%, l’ADN génique à 56, 2% avec une densité de un gène pour
3101pb. 45% des gènes ont une longueur comprise entre 1001 et 2000pb. La majorité des
introns trouvés dans les gènes prédits sont de petite taille, 78% inférieurs à 100pb (Tab. 2).
Taille Genes Introns Exons Non géniques
1-50 0,00 25,70 13,86 0,59
51-100 0,01 52,64 12,74 1,52
101-200 0,06 12,57 18,29 5,16
201-300 0,47 4,66 11,09 6,38
301-500 4,44 3,37 14,31 15,38
501-1000 22,10 1,04 16,41 29,26
1001-2000 45,11 0,02 10,12 23,44
2001+ 27,80 0,00 3,18 18,28
Tab. 2. Répartition des pourcentages de gene, introns, exons et séquences non-géniques en
fonction de leur taille.
La publication de l’annotation du génome s’est accompagnée de la mise en place sur le

site internet du Whitehead institut de nombreux outils de recherche et d’accès aux
annotations.
51
I. 3. 2. Transcriptomique
Le transcriptome correspond à la population d’ARN messagers (ARNm) présents dans
une cellule à un moment et dans une condition donnée. Le transcriptome varie en fonction de
l’état des cellules, de leur stade de développement et des conditions extérieures. L’étude de
cette population de molécules est appelée transcriptomique.
La transcriptomique permet d’obtenir une image instantanée des ARNm dans une
cellule. Il est ainsi possible de déterminer quels gènes sont activés dans certaines conditions.
Différentes techniques ont été développées depuis le début des années 1990 permettant
l’étude rapide des ces populations de molécules.
I. 3. 2. 1. RT-PCR quantitative
La PCR quantitative s’est beaucoup développée grâce à la chimie du Sybr® green.

Cette molécule a la particularité de s’intercaler entre les plateaux de bases. Elle acquiert ainsi
la possibilité d’émettre un signal de fluorescence. A la fin de chaque cycle de PCR, il est alors
possible de mesurer la fluorescence qui est proportionnelle à la quantité d’ADN double brin
présent dans la réaction. Il est donc possible de quantifier l’ADN présent initialement. La
quantification peut être absolue, déterminée alors par rapport à une gamme de concentration
connue. Elle peut être relative et se réfère dans ce cas à la quantité d’une autre cible interne à
l’échantillon. La méthode de quantification relative peut facilement être employée en utilisant
un gène domestique.
En réalisant une reverse transcription d’ARN et une PCR quantitative (Q-RT-PCR), il
est possible d’évaluer la quantité d’un messager présent dans une population et de suivre son
évolution pour différentes conditions (Freeman et al., 1999).
Cette méthode se focalise sur un gène cible en particulier, voire une famille de gènes
mais s’applique difficilement à une population entière.
I. 3. 2. 2. Banques d’EST
I. 3. 2. 1. 1. Banques classiques
Les banques d’EST (Expressed Sequence Tag) correspondent à la stabilisation dans des
vecteurs de clonage de fragments d’ADNc correspondant à une population d’ARNm. Ainsi
52
chaque clone qui correspond à un ARNm. La population de clones est donc une image de la
population d’ARNm à un moment donné de la vie de la cellule.
Classiquement de telles banques ont été utilisées pour découvrir de nouveaux gènes.
Mais elles permettent également de donner une information quant à la présence ou à l’absence
d’un ARNm.
L’analyse de ces banques peut être réalisée de plusieurs manières. Des techniques
d’hybridation avec des sondes permettent de se focaliser sur des clones en particulier. Le
séquençage massif de nombreux clones, suivi de l’identification des séquences, peut amener à
dresser le portrait du transciptome d’une cellule à un moment donné.
L’avantage d’une approche par banque d’EST est la génération d’une grande quantité de
données en un temps très court. Les séquences des EST représentent une sous-catégorie de
Genbank : dbEST (Boguski et al., 1993). Le nombre total d’EST disponibles dans la base de
donnée au 1er octobre 2004 est de 23 970 155 dont 19 140 proviennent de F. graminearum.
I. 3. 2. 1. 2. Banques suppressives
Il existe dans les banques d’EST un grand nombre de molécules redondantes. Elles
correspondent souvent à des gènes domestiques constitutivement exprimés à des taux élevés.
Dans un certain nombre de cas, il est préférable de se focaliser sur une partie de la population
d’ARNm.
La technique d’hybridation suppressive soustractive permet de réaliser l’enrichissement
d’une population d’ARNm en séquences différentiellement exprimées entre deux conditions
(Diatchenko et al., 1996). La technique repose sur la double hybridation de la population
d’ARNm à enrichir (Tester) possédant différents adaptateurs avec la population d’ARNm qui
servira de référence (Driver) (Fig. 25). L’application des deux hybridations suppressives
soustractives abouti à l’obtention de différentes populations de molécules hybrides entre les
populations Tester et Driver. Seules les molécules dont chacun des brins proviennent des deux
différents pools de la population Tester seront amplifiées d’une manière exponentielle (cas e
fig. 25).
Il est ainsi possible d’obtenir des populations enrichies en séquences spécifiques
présentant un nombre réduit de répétition.
53
Fig. 25. Schéma explicatif de la méthode d’hybridation suppressive soustractive.

Source : BD Biosciences - Clontech
I. 3. 2. 3. Microarrays
Les microarray permettent de suivre le niveau d’expression de milliers de gènes
simultanément (Park et al., 2004). Leur principe de base repose sur celui du Dot blot. La haute
densité des dépôts sur des lames de verres impose le travail avec un robot. Les molécules
déposées sur les puces peuvent être de différentes natures. Il peut s’agir d’ADNc obtenus par
PCR ou alors d’oligonucléotides de synthèse. Une autre technique consiste à synthétiser
directement les oligonucléotides sur la puce en utilisant des masques photolithographiques
(Affymetrix Inc.). L’hybridation peut se faire avec plusieurs populations d’ARNm marqués
avec des chromophores, qui servent à la lecture par leur excitation (Fig. 26).
54
Fig. 26. Principe de l’analyse du transcriptome par microarray.

Source : Dianna Magliano
I. 4. Notre projet de recherche

Le laboratoire de phytopathologie de l’ESBS effectue chaque année depuis 1997 des
prélèvements sur les plants de houblon qui présentent des pathologies. Différents symptômes
peuvent être observés (Fig. 27).
55
Une centaine de champignons filamenteux ont été isolés. Un représentant de chaque

groupe de champignon morphologiquement identique a été envoyé pour identification chez
CABI biosciences (Royaume-Uni). Les genres Alternaria, Epicoccum et Fusarium
représentent plus de 80% des genres identifiés.
Parmi notre collection 12 champignons (F1 à F12) présentaient un tapis mycélien rose
caractéristique des Fusarium sur milieu PDA. L’individu F4 a été identifié par CABI
biosciences comme Fusarium graminearum. L’identification par des techniques de biologie
A C
Fig. 27. Différents symptômes observés sur le houblon. A feuille desséchée (isolement de
Alternaria) B Liane blessée présentant un mycélium rose (isolement de Fusarium graminearum)
C Liane entière correspondante.
56
moléculaire des 12 Fusarium a donné lieu au développement d’une méthode d’identification

ainsi que la validation de marqueurs phylogénétiques. Ces travaux sont présentés dans le
chapitre II.
F. sambucinum et F. avenaceum ont déjà été décrits comme des pathogènes du houblon.
Ils provoquent des infections au niveau des cônes ou alors un chancre du collet dans le cas de
F. sambucinum. Au cours d’une campagne de prélèvements décrie plus haut, F. graminearum
a été retrouvé sur la blessure d’une liane en dépérissement. Les symptômes de cette liane, en
particulier le dépérissement des feuilles correspondent aux symptômes d’une trachéomycose
(Fig. 6). La recherche de F. graminearum à l’intérieur de la liane endommagée s’est révélée
concluante.
Le Postulat de Koch n’a pas été validé par une infection sur liane par F. graminearum,
ce qui ne nous permet pas d’affirmer qu’il s’agit d’un pathogène du houblon. Cependant des
tests d’infection sur feuilles ont présenté un envahissement rapide du tissu de la plante par le
champignon. De ce fait, nous avons voulu aborder l’interaction houblon/F. graminearum
comme un modèle pouvant être transposé à d’autres plantes d’importance économique.
Parmi les ressources dont dispose F. graminearum pour infecter une plante nous avons
choisi de nous focaliser sur les enzymes de dégradation de la paroi cellulaire (CWDE). Les
premières approches suivies par le laboratoire se basaient sur une seule enzyme. Cependant
les CWDE sont présentes dans les génomes des champignons sous forme de familles
multigéniques. L’inactivation de différents gènes de CWDE chez des espèces de Fusarium
n’a pas montré de baisse de virulence (Gomez-Gomez et al. 2001 & 2002, Di Pietro et al.
2001, Huertas-Gonzalez et al., 1999, Garcia-Maceira et al. 2000 et 2001). D’autres membres
des familles de CWDE inactivés ont remplacé l’activité manquante.
Nous avons donc opté pour une approche plus large en étudiant des familles de gènes.
Lors d’une approche génomique décrite dans le chapitre III, nous avons concentré nos
investigations sur la famille des xylanases. Ensuite, nous avons abordé une approche
transcriptomique qui fait l’objet du chapitre IV. Deux axes ont été suivis, le premier par la
constitution d’une banque suppressive soustractive mettant en valeur les familles de CWDE,
le deuxième en complétant les investigations génomiques sur la famille des xylanases par leur
suivi dans le transcriptome.
57
Chapitre II – Identification et marqueurs phylogénétiques du genre Fusarium
Chapitre II – Identification et marqueurs phylogénétiques

du genre Fusarium
58
II. 1. Identification des espèces du genre Fusarium
II. 1. 1. Problématique
Parmi notre collection de champignons filamenteux isolés sur des plants de houblon en
dépérissement, douze individus présentaient une coloration rose fréquemment observée chez
les espèces de Fusarium. La question de l’identité de ces champignons fut soulevée.
Les méthodes d’identification classiques des champignons sont des méthodes lourdes à
mettre en place et à exécuter. Elles demandent en plus une connaissance approfondie du genre
et une expertise visuelle. De plus, la maîtrise des conditions de culture du champignon et en
particulier ses conditions de sporulation sont des points particulièrement importants. La sous-
traitance d’un telle analyse est coûteuse (150€ par individu) mais aussi très longue (2 mois). Il
était donc nécessaire d’acquérir au laboratoire les compétences relatives à l’identification des
espèces du genre Fusarium.
Les méthodes de biologie moléculaire semblaient les mieux adaptées par rapport à la
facilité de mise en œuvre ainsi que par les compétences déjà présentes au laboratoire. La
confirmation de l’appartenance au genre Fusarium a été faite selon la méthode décrite par
Xue et al. (1999). Puis l’assignation des différents Fusarium à leurs espèces respectives a été
effectuée à l’aide de la méthode développé par Edel et al. (1997).
La détermination des haplotypes décrits par Edel qui permettent d’attribuer les
différents Fusarium à leurs espèces respectives a mis en évidence trois cas d’indétermination.
Trois haplotypes non définis ont été trouvés.
Dans le but de disposer au laboratoire d’une méthode fiable et rapide adaptée aux
populations collectées sur le houblon, nous avons développé une méthode d’identification par
la combinaison d’une analyse CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence) à une
analyse de profils obtenus par Western blot. La description de cette méthode fait l’objet de
l’article 1.
59
II. 1. 2. Article 1 - Development of a bipartite method for Fusarium

identification based on cellobiohydrolase-C: CAPS and Western blot analysis,
Hatsch D., Phalip V., Jeltsch J.-M., FEMS Microbiology Letters, 2002
60
[Signalement bibliographique ajouté par : ULP – SCD – Service des thèses électroniques]
Development of a bipartite method for Fusarium identification based on

cellobiohydrolase-C: CAPS and Western blot analysis
Didier Hatsch, Vincent Phalip, Jean-Marc Jeltsch
FEMS Microbiology Letters, 2002, Vol. 213, pages 245-249
Pages 245-249 :
• La publication présentée ici dans la thèse est soumise à des droits détenus par un éditeur
commercial.
• Pour les utilisateurs ULP, il est possible de consulter cette publication sur le site de
l'éditeur :
http://dx.doi.org/10.1016/S0378-1097(02)00825-X
• Il est également possible de consulter la thèse sous sa forme papier ou d'en faire une
demande via le service de prêt entre bibliothèques (PEB), auprès du Service Commun de
Documentation de l'ULP: [email protected]
II. 1. 3. Extension du travail

La méthode d’identification présentée dans l’article est basée sur la combinaison des
analyses CAPS et des analyses de profil par Western blot. Chaque méthode seule ne permet
pas d’obtenir l’identification complète.
Lors de ce travail nous avons constaté l’obtention de deux types d’amplification pour la
topoisomérase II pour la souche F1. Une première amplification correspondant à F.
sambucinum et une deuxième correspondant à F. graminearum. L’amplification et le clonage
ont été renouvelés pour la cellobiohydrolase-C (cbh-C) et le même résultat a été obtenu. La
non contamination des matrices de PCR ainsi que la pureté de la souche ont été confirmées.
La souche F1 est probablement une souche issue d’un croisement entre F. sambucinum et F.
graminearum.
6 souches de références du genre Fusarium ont été ajoutées à notre collection : F.
sporotrichioides, F. poae, F. solani f.sp. pisi, F. oxysporum f.sp. melonis, F. moniliforme et F.
lateritium. Ces souches correspondent à des pathogènes couramment retrouvés en Europe. Les
fragments de CBH-C ont été clonés et séquencés. L’analyse des séquences a permis d’établir
une nouvelle stratégie d’analyse CAPS. L’analyse CAPS peut à elle seule faire la distinction
entre les 11 espèces de Fusarium et requiert 4 enzymes de restriction (Tab. 4).
ND EcoRI HphI BsmaI MwoI

F. graminearum 334 77, 257 25, 309 18, 26, 100, 190 14, 128, 192
F. sporotrichioides 336 336 336 18, 26, 102, 190 14, 130, 192
F. poae 331 74, 257 71 ; 103, 157 18, 26, 97, 190 15, 125, 191
F. sambucinum 330 119, 211 70, 103, 157 18, 26, 96, 190 14, 15, 124, 177
F. solani f.sp.pisi 327 327 103, 224 44, 58, 225 15, 135, 177
F. tricinctum 336 336 336 26, 102, 208 15, 45, 132, 144
F. avenaceum 334 334 334 26, 34, 66, 208 15, 45, 132, 142
F. .venenatum 330 119, 211 70, 103, 157 18, 26, 96, 190 14, 15, 124, 177
F. oxysporum f.sp. melonis 344 344 25, 78, 241 110, 234 20, 39, 138, 147
F. moniliforme 341 341 25, 78, 238 107, 234 45, 147, 149
F. lateritium 332 65, 267 103, 229 44, 96, 192 126, 206
Tableau 3. Taille des fragments obtenus par l’analyse CAPS. ND : non digéré.
66
II. 1. 4. Conclusions et perspetives

Le développement de cette méthode d’identification a été la réponse à une
problématique du laboratoire : identifier facilement et rapidement les échantillons des
prélèvements au champ du genre Fusarium.
Les analyses CAPS sont très efficaces mais se heurtent à deux limites. La première
limitation concerne la description des profils de référence. Si le profil n’est pas encore décrit,
l’identification n’est pas réalisable. Dans ce but nous avons ouvert une section CAPS sur
notre site Internet (http://phytopathologie.u-strasbg.fr). Cette page décrit les nouveaux profils
obtenus et se veut interactive avec les autres laboratoires. La deuxième limite se trouve être la
possibilité de mutation des sites de restriction. La souche F6 présentait un profil de digestion
par MspI non identifié par la méthode décrite par Edel. La séquence de la zone ADNr
correspondante présentait un site muté, il est donc impossible d’attribuer correctement un
profil.
L’avantage des méthodes CAPS est le fait de pouvoir éviter un séquençage du fragment
cible mais aussi de pouvoir réaliser rapidement l’analyse. L’analyse par profil de Western est
une approche complémentaire qui peut dans certains cas lever l’ambiguïté lorsque l’on se
retrouve face à des séquences mutées. Le profil Western obtenu pour la souche F6
correspondant bien au profil défini pour F. sambucinum. Le désavantage de la méthode est
l’ajout du temps de culture du champignon sur milieu minimum contenant de la carboxy
méthyl cellulose.
Grâce à la méthode d’analyse CAPS étendue, le laboratoire est capable en une journée
de confirmer l’appartenance au genre Fusarium ainsi que d’attribuer un nom d’espèce à partir
des champignons isolés. Dans le cas d’incertitude le séquençage rapide du fragment amplifié
permet d’obtenir des informations très détaillées. L’identification de mutations ponctuelles ou
alors l’identification d’un nouveau profil peuvent être obtenu par cette méthode.
67
II. 2. Validation de marqueurs phylogénétiques
II. 2. 1. Problématique
Les travaux réalisés sur la cbh-C ont mis en évidence la possibilité d’utiliser cette cible
pour l’identification des Fusarium. Cependant, la technique repose sur une approche bipartite.
Nous avons essayé d’utiliser un deuxième marqueur moléculaire pour pouvoir réaliser une
identification basée uniquement sur une approche CAPS. La topoisomérase II a été choisie
comme deuxième cible car elle fait partie des gènes domestiques. Un fragment du gène de
l’enzyme avait préalablement été cloné au laboratoire.
Les résultats d’amplification ont montré des amplifications doubles pour la souche F1.
Ce qui a conduit à la distinction de cette souche particulière et à l’extension de la méthode
CAPS-cbhC initiale à 11 espèces de Fusarium. L’analyse CAPS étendue permet d’identifier
les 11 espèces de Fusarium à elle seule. Nous nous sommes intéressés à l’utilisation de cet
autre marqueur moléculaire pour deux raisons. Premièrement la combinaison de deux
marqueurs permet de surmonter des problèmes d’indétermination lorsque l’un des marqueurs
présente une mutation ponctuelle. Deuxièmement l’approche par deux cibles différentes
permet d’obtenir une meilleure fiabilité quant à l’analyse.
Nous avons choisi d’utiliser une approche phylogénétique pour valider l’utilisation de
ces deux marqueurs par rapport au marqueur de référence : l’ADNr.
Le clonage des fragments de gène de la topoisomérase II des différentes espèces ainsi
que l’analyse phylogénétique des différents marqueurs sont présentés dans l’article 2.
68
II. 2. 2. Article 2 - Use of genes encoding cellobiohydrolase-C and

topoisomerase II as targets for phylogenetic analysis and identification of
Fusarium, Hatsch D., Phalip V., Jeltsch J.-M., Research in Microbiology, 2004
69
[Signalement bibliographique ajouté par : ULP – SCD – Service des thèses électroniques]
Use of genes encoding cellobiohydrolase-C and topoisomerase II as targets for

phylogenetic analysis and identification of Fusarium
Didier Hatsch, Vincent Phalip, Jean-Marc Jeltsch
Research in Microbiology, 2004, Vol. 155, pages 290–296
Pages 290–296 :
• La publication présentée ici dans la thèse est soumise à des droits détenus par un éditeur
commercial.
• Pour les utilisateurs ULP, il est possible de consulter cette publication sur le site de
l'éditeur :
http://dx.doi.org/10.1016/j.resmic.2004.01.002
• Il est également possible de consulter la thèse sous sa forme papier ou d'en faire une
demande via le service de prêt entre bibliothèques (PEB), auprès du Service Commun de
Documentation de l'ULP:
[email protected]
II. 2. 3. Extension du travail

L’étude par Southern blot avec deux enzymes de restriction différentes montre des
fragments uniques majoritaires ainsi que deux bandes de plus faible intensité dans le cas de la
cbh-C (Fig. 28). Les gènes codant la cbh-C et la topII sont vraisemblablement en copie
unique. Ces éléments expérimentaux ont été confirmés par l’analyse de la séquence du
génome de F. graminearum.
Cbh-C TopII
A
H S E H
9,4 kb
4 kb
3,6 kb
2,6 kb
B
S H H H S
ATG STOP
C
E H E H
ATG STOP
Fig. 28. A Southern blot révélant la présence des gènes de la topoisomérase II (topII) et
cellobiohydrolase-C (cbh-C) en copie unique .B Représentation schématique du gène cbh-C ; C
Représentation schématique du gène topII. Digestion : E : EcoRI, H : HindIII, S : SacI. Les
sondes utilisées pour l’hybridation sont schématisées par des traits bleus. Les dessins ne sont
pas à l’échelle.
77
II. 2. 4. Conclusions et perspetives

Les deux nouveaux marqueurs moléculaires ont été validés en référence à l’ADNr.
Indépendamment, les séquences de la cbh-C et de la topII sont plus informatives au niveau
phylogénique malgré leur taille plus restreinte que la zone d’ADNr. Mais c’est lors de la
combinaison des informations que l’apport des marqueurs est le plus remarquable.
L’utilisation de différents marqueurs pour l’identification des Fusarium permet de
passer outre des problèmes de mutations. Ainsi il est possible de replacer facilement à l’aide
de plusieurs marqueurs un champignon inconnu dans les différentes espèces de Fusarium.
Une application au laboratoire de ces marqueurs est le contrôle de routine de l’identité
du champignon utilisé lors des travaux de biologie moléculaire.
La multiplication des marqueurs moléculaires ainsi que leur combinaison permet
d’obtenir des arbres phylogénétiques de plus en plus précis. Il est également important
d’élargir la population d’espèces dans laquelle le marqueur est validé. L’extension de ce
travail serait de réaliser le clonage et le séquençage des différents marqueurs d’abord dans des
populations d’espèces référencées puis dans d’autres espèces.
78
Chapitre III – Génomique appliquée du pathogène
Chapitre III – Génomique appliquée du champignon

Fusarium graminearum
79
III. 1. Problématique
Lors de la mise à disposition du génome de F. graminearum par le Whitehead Institute
(Cambridge, MA, USA) plusieurs questions ont été soulevées au laboratoire. Comment
pouvoir, à partir des 36Mb de données brutes, localiser les séquences déjà clonées au sein de
l’équipe ? Et par extension comment localiser rapidement des gènes d’intérêts ?
L’annotation complète du génome ne faisait pas partie des priorités du laboratoire. De
plus, l’annotation était en cours de réalisation dans d’autres laboratoires. Nous avons donc
décidé de développer un outil basé sur une approche fluide. Ainsi nous souhaitions mieux
cibler nos investigations vers des familles de CWDE.
Parmis elles, les xylanases sont des enzymes capables de déstructurer les parois
végétales en diminuant la cohésion entre les différentes couches de polymères. Nous nous
sommes focalisés sur ces enzymes dans le but de déterminer leur implication en pathologie
mais aussi par rapport à l’intérêt industriel qu’elles peuvent représenter. Nous avons alors
appliqué notre outil pour la prédiction des xylanases de F. graminearum.
III. 2. Prédiction de gènes
III. 2. 1. Mise en place des outils d’analyse

Les outils mis en place devaient respecter différentes contraintes notamment la rapidité
d’utilisation, la mise à jour automatisable et la flexibilité. Pour ce faire nous avons basé notre
stratégie sur l’analyse des ORF (Open Reading Frames, phases de lecture ouvertes).
La prédiction des ORF a été réalisée avec le programme GETORF du package
EMBOSS. Des paramètres spécifiques ont été utilisés. La recherche des ORF a été menée
selon la définition suivante : région entre deux codons STOP. Une taille minimale a été
appliquée afin de limiter le bruit de fond. Les enzymes d’intérêt pour le laboratoire comme les
CWDE ont des tailles minimales de l’ordre de 500pb. De plus leurs gènes contiennent de
petits introns de 30 à 50pb. De ce fait la taille minimale des ORF a été réglée à 300pb soit
100aa. 71 654 ORF ont été prédites à partir du génome de F. graminearum.
A partir de ce jeu de données, deux voies ont été suivies. La première a été de
concaténer les ORF, puis de les indexer pour obtenir une base de donnée interrogeable par
BLAST. La deuxième voie suivie, a été de comparer chaque ORF avec la banque de données
de séquences de protéines non redondantes NR (GenBank CDS translations + PDB +
80
SwissProt + PIR + PRF) à l’aide du programme BLASTP. Le paramètre de l’expectation joue

un rôle important lors de telles analyses. En effet plus la valeur de l’expectation est petite plus
la probabilité relative à la taille de la banque de trouver par hasard une séquence similaire est
faible. Ainsi deux analyses ont été effectuées avec des expectations de 10-3 et 10, qui ont
conduit à l’obtention de résultats pour 16 009 ORF et 63 494 ORF respectivement. Les
résultats de BLAST ont été stockés dans une base de données. Une recherche par mot clé a été
mise en place. Les mots clés sont cherchés dans les résultats de BLAST uniquement dans les
définitions des séquences homologues.
Un résultat classique de recherche se présente sous la forme suivante :
Query= Fusarium.145_238 [44573 - 44088] (REVERSE SENSE) graminearum
Cette réponse nous indique que le résultat de BLAST de l’ORF 238 prédite sur le contig
145 allant de la position 44 573 à 44 088 en sens reverse contient le mot clé cherché. Un
avantage non prévu de l’approche a été mis en évidence lors des premières recherche par mot
clé dans les résultats de BLAST, dans de nombreux cas des réponses de ce type apparaissent :
Ce type de réponse met directement en évidence la présence d’un intron entre les
positions 138 551 et 138 582. Les ORF 260 et 261 correspondent à différents exons du même
gène.
L’accès à la recherche par BLAST dans les ORF prédites ainsi que la recherche par mot
clés dans les résultats de BLAST ont été ouvert à la communauté scientifique en septembre
2003 sur le site de notre serveur de bio-informatique : http://biotec.u-strasbg.fr. Les fiches de
résultat de BLAST peuvent être mise à jour automatiquement et régulièrement en fonction des
mises à jour de la banque non redondante de protéine. Cette approche est donc fluide car en
constante adaptation par rapport aux séquences connues.
III. 2. 2. Application des outils

Les outils de recherche mis en place ont été appliqués dans la recherche des xylanases
dans le génome de F. graminearum.
Nous avons recherché le mot clé « xylanase » dans les résultats de BLAST et 76 ORF
ont été trouvées. Parallèlement deux séquences de xylanases de Fusarium oxysporum
81
(AAC06239, AAC06240) ont été comparées par BLASTP à la banque de données de

séquences des ORF de plus de 100aa. Cette comparaison a mis en évidence 7 ORF.
La compilation de ces premiers résultats a mené à la sélection de 36 régions
correspondant à différentes ORF. Des investigations plus poussées et une analyse de séquence
manuelle a été effectuée. Le codon d’initiation correspondant au plus grand peptide possible a
été selectionné. Les introns ont été déterminés par combinaison de l’observation de
l’apparition de codons STOP dans les phases de lecture, mais aussi par l’analyse des résultats
de recherche par mot clé présenté plus haut. Les sites d’épissage ont alors été déterminés. Les
motifs GTnnGT en 5’et nAG en 3’ sont remarquablement conservés dans ces séquences. 27
séquences codantes ont ainsi été délimitées (Tab. 4). Parmi ces 27 séquences, 10 présentent
un, voire plusieurs introns de petite taille typiques des champignons.
La xylanase 19 correspond à une xylanase déjà présente dans les banques de données
(AAP41129, Watson unpublished).
Les traductions des zones correspondantes aux xylanases 4, 6, 8, 11, 12 et 20 présentent
des homologies avec des xylanases. Il n’a pas été possible pour ces zones de prédire des gènes
soit par l’absence de détermination de codon d’initiation soit à cause de problèmes de phases
de lecture ne pouvant être rétablis par un intron.
Les zones correspondantes aux xylanases 22 et 23 correspondent aux extrémités de deux
contigs. Ces extrémités correspondent aux parties 5’ et 3’ d’un même gène qui présente de
fortes homologies avec un inhibiteur de xylanase.
82
N° xyl N° contig Introns Position sur le contig

1 8 0 [11279 ... 12223]
2 259 3 [48 179 … 48 548] [48 602 … 49062] [49 115 … 49 235] [49298 … 49338]
3 266 0 [110074 … 111228]
4 ND
5 303 0 [62519 … 63370]
6 ND
7 318 0 [48351 … 49715]
8 ND
9 133 0 [16790 … 18517]
10 145 0 [111471 ... 112478]
11 ND
12 ND
13 158 0 [34956 … 35813]
14 406 2 [156291 ...156579] [156633 …156750] [156803 …157397]
15 160 1 [160670…160950] [161006…161411]
16 415 2 [135260 … 134705] [134653 … 134249] [134197 … 134031]
17 433 2 [149588…149915] [149969…150194] [150240…151029]
18 168 0 [89573 … 88485]
19 457 2 [103532 …103821] [103875 … 103965] [104019 … 104333]
20 ND
21 464 2 [104501…104570] [104623…104940] [104993…105750]
22 I
23 I
24 468 1 [52795 … 52349] [52295 … 51759]
25 147 1 [7494 … 7146] [7088 … 6466]
26 315 0 [160440 … 161417]
27 316 0 [33614 … 31923]
28 318 0 [51670 … 50123]
29 321 1 [58277 ... 58387] [58521 … 59516]
30 323 0 [105872 … 107083]
31 Cbh-C
32 363 0 [12972 ... 11989]
33 457 0 [20242 … 21855]
34 468 0 [3865 ... 4887]
35 470 1 [10998 … 11152] [11218 … 12574]
36 6 2 [5814 … 6480] [6533 … 6650] [6714 … 7029]
Tableau 4. Prédiction des xylanases dans le génome. ND : non déterminé, I : inhibiteur de xylanase,
cbh-C : cellobiohydrolase-C
III. 3. Validation des prédictions
III. 3. 1. Clonage et séquençage

Dans le but de confirmer les prédictions des séquences codant pour des xylanases de F.
graminearum, des amorces ont été dessinées pour réaliser l’amplification des 27 candidats
(Annexe 3).
83
L’ARNm rétro-transcrit de F. graminearum cultivé sur milieu minimum M3 contenant

comme seule source de carbone des parois de houblon (Annexe 1) a été utilisé comme matrice
pour l’amplification des séquences codantes des candidats. 22 amplicons ont été clonés et
séquencés (Tab. 5). Ces amplifications valident les prédictions comme gènes activement
transcrits, cependant les candidats restent putatifs vis à vis de leur activité biologique. Les
tailles des xylanases varient de 228 à 575aa.
Certains messagers n’ont pas été amplifiés. Nous ne pouvons cependant pas affirmer
que la prédiction était fausse. La présence de la molécule peut être discutée dans la population
de messagers provenant du champignon cultivé dans des conditions minimales avec comme
seule source de carbone des parois de houblon. En effet, certains gènes peuvent être régulés
selon d’autres conditions, comme le pH du milieu de culture ou la présence d’autres substrats.
N° xyl Taille cDNA (pb) Taille protéine (aa) Accession

1 945 314 AY575957
2 960 319 AY730561
3 1155 384 AY575958
7 1365 454 AY575959
9 1728 575 AY730562
13 858 285 AY575960
14 1002 333 AY648858
15 687 228 AY575961
16 1128 375 AY648859
17 1344 447 AY575962
18 1089 362 AY575963
19 696 231 AY648860
21 1146 381 AY575964
24 984 327 AY575965
25 972 323 AY648861
26 978 325 AY648862
27 1692 563 AY730563
28 1548 515 AY730564
32 984 327 AY575966
33 1614 537 AY730565
34 1023 340 AY575967
35 1521 506 AY730566
Tableau 5. Liste des xylanases putatives dont les séquences codantes des cDNA ont été clonées
et séquencées.
84
III. 3. 2. Analyse des séquences

Les séquences des xylanases clonées ont été ré-analysées en cherchant le type de famille
de glycoside hydrolase d’appartenance selon Henrissat (Tab 6). Sur ce tableau nous avons
également rappelé le type d’enzyme le plus homologue ainsi que l’organisme chez qui le plus
proche homologue est trouvé.
Les xylanases 14 et 18 ne présentent pas d’homologies avec des familles de glycosides
hydrolases. Cependant les séquences ont des homologies vis à vis d’arabinosidase et xylanase
bactériennes respectivement. La xylanase 13 montre des homologies vis à vis de xylanases
bactériennes cependant un morceau de domaine AES (estérase/lipase) est retrouvé dans
l’enzyme. L’activité réelle de ces trois « xylanases » est inconnue. La xylanase 16 a été
identifiée comme une pectate lyase. Elle avait été intégrée dans le set de séquences initiales de
part les homologies de son CBD (cellulose binding domain) avec des xylanases en possédant
un. Cette exemple illustre la nécessité du contrôle manuel des résultats automatisés.
Famille de
N° xyl Homologie Organisme
Glycoside hydrolase
CBD
2 endo-1,4-β-xylanase (EC 3.2.1.8) C 10
21 endo-1,4-β-xylanase (EC 3.2.1.8) C (Fox) 10
24 endo-1,4-β-xylanase (EC 3.2.1.8) C (Fox) 10
19 endo-1,4-β-xylanase (EC 3.2.1.8) C (Fg) 11
1 β-1,3-1,4-glucanase B 16
3 β-1,3-1,4-glucanase B 16
7 endo-1,4-β-xylanase (EC 3.2.1.8) B 43 C-ter type IV
9 endo-1,4-β-xylanase (EC 3.2.1.8) B 43
25 1,4-β-xylosidase (EC 3.2.1.37) B 43
27 1,4-β-xylosidase (EC 3.2.1.37) B 43
26 α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) C 62
13 xylanase B AES
16 pectate lyase (EC 4.2.2.2) C (Fg) PL N-ter fungal CBD_1
14 arabinosidase B x
18 endo-1,4-β-xylanase (EC 3.2.1.8) B x
Tableau 6. Détermination de l’appartenance aux famille de glycoside hydrolase. Homologie : type
d’enzyme de l’homologue le plus proche. Organisme : organisme de la séquence homologue, B :
bactérie, C : champignon (Fg : F. graminearum ; Fox : F. oxysporum). Famille de glycosyl
hydrolase : x : pas de motif trouvé, PL : pectate lyase, AES : esterase/lipase. CBD : cellulose binding
domain.
85
Les xylanases 2, 17, 21 et 24 appartiennent aux familles de glycoside hydrolase 10. De

nombreux membres de cette famille montrent des activités sur différents substrats (Collins et
al., 2004). Les xylanases 21 et 24 montrent de fortes homologies avec des xylanases de F.
oxysporum. Les xylanases 15 et 19 font partie de la famille 11 qui est historiquement
considérée comme la famille des vraies xylanases (Collins et al., 2004).
Les xylanases 1, 3 (famille 16) et 26 (famille 62) sont des enzymes supposées être bi-
fonctionnelles et avoir un site catalytique caractéristique des familles 10 ou 11 (Collins et al.
2004).
Les xylanases 7, 9, 25, 27, 28, 32- 35 font partie de la famille 43. Il s’agit de la famille
la plus représentée. Des analyses fonctionnelles n’ont pas confirmé l’activité de cette famille
d’enzymes sur le xylane (Collins et al., 2004).
III. 4. Prédiction de structures

Un projet de modélisation a été confié à un groupe d’élèves de l’Ecole Supérieure de
Biotechnologie de Strasbourg et a porté sur les xylanases 15 et 24. Elles ont été choisies
comme candidates pour la modélisation de leur structure par homologie. Ce type de
modélisation est basé sur l’utilisation d’une structure connue (matrice). La protéine cible est
alignée sur la séquence peptidique de la matrice et la structure 3D est déduite par homologie.
Ces deux xylanases ont été choisies car elles font partie des familles 11 et 10 respectivement.
Des évidences biologiques ont montré des activités enzymatiques sur le xylane chez des
homologues de ces enzymes.
III. 4. 1. Détermination des modèles

Les séquences des protéines ont été étudiée et plusieurs paramètres des protéines ont été
déterminés (Tab. 7). Il s’agit d’enzymes de petite taille mais avec des points isoélectiques
plutôt basiques. La localisation des acides aminés impliqués dans le site catalytique a été
réalisée par homologie.
86
Taille MM Site de Famille de

Enzymes pI Résidus du site catalytique
(aa) (Da) clivage l’enzyme
Glycosyl
Xyl15 228 24 544 9.35 19-20 Glu 122 et Glu 214
hydrolase 11
15-16
Glycosyl
Xyl24 327 35 739 9.39 ou Glu 154 et Glu 262
hydrolase 10
22-23
Tableau 7. Caractéristiques des xylanases 15 et 24. MM : masse moléculaire prédite, pI : point
isoélectrique prédit. Site de clivage : site de clivage prédit du peptide signal. Les résidus du site
catalytique ont été prédit par homologie.
Fig. 29. Alignement des séquences de xylanases 15 et 24 avec leur plus proche homologue ayant
une structure connue. Boite rouge : séquence N-terminale contenant un peptide signal éliminé
du modèle.
87
Les séquences des xylanases 15 et 24 ont été comparées à l’aide de BLASTP à la

banque de protéine non redondante NR. Parmi les séquences présentant une structure, 1XND
et 1TUX ont montré la plus grande homologie vis des xylanases 15 (64%) et 24 (54%)
respectivement(Fig. 29). 1XND est une xylanase provenant de Trichoderma harzianum dont
la structure cristallographique a été résolue à 1.8 Å (Campbell et al., 1994). 1TUX,
homologue de la xylanase 24, provient de Thermoascus aurantiacus et a été cristallisé à la
même résolution que 1XND (Natesh et al., 1999). Les séquences ont été alignées et les parties
N-terminales des xylanases ont été retirées. Ces séquences contiennent des peptides signaux et
ne sont donc pas décrites dans les modèles de structure.
Le programme MODELLER a créé différents modèles de structure pour les deux
enzymes. Le modèle présentant la fonction objective la plus basse a été retenu pour chacune
des xylanases. La fonction objective repose sur le calcul de la pseudo énergie qui est calculée
en fonction des champs de force et de contraintes issues de l’alignement de séquences.
Les modèles obtenus pour les xylanases 15 et 24 ont été évalués avec le programme
PROCHECK. Il permet d’évaluer la stéréochimie des modèles notamment par la géométrie
des liaisons peptidiques.
Les diagrammes de Ramachandran ont été réalisés pour les structures prédites et les
matrices utilisées (Annexe 4). La structure prédite de la xylanase 15 présente un diagramme
de Ramachandran cohérent avec sa matrice. Seul le résidu thréonine 21 est dans une zone
limite par rapport à la stéréochimie (Fig. 30). Le diagramme de Ramachandran pour la
xylanase 24 ne montre pas d’aberrations structurales, seule l’alanine 84 se situe dans une zone
limite (Fig. 31).
Les diagrammes d’énergie ont également été réalisés pour les xylanases et leurs
matrices. L’énergie totale des molécules est négative. Et les différences d’énergie entre les
matrices et les modèles sont proches de zéro.
88
Fig. 30. Diagramme de Ramachandran pour la xylanase 15 et sa matrice 1XND. Les triangles
symbolisent les résidus glycine.
89
Fig. 31. Diagramme de Ramachandran pour la xylanase 24 et sa matrice 1TUX. Les triangles
symbolisent les résidus glycine.
90
Le modèle obtenu pour la xylanase 15 présente une hélice α ainsi que 14 brins β repliés
en deux feuillets (Fig. 32). Le modèle correspond à la structure classique des xylanases de la
famille 11 des glycosides hydrolases (Fig. 24). Les feuillets β forment une poche hydrophobe
pouvant recevoir le xylane. On retrouve les résidus impliqués dans la catalyse autour de cette
poche.
La xylanase 15 présente deux cystéines (C160 et C168) à une distance de 5,09 Å
compatible avec la formation d’un pont disulfure. Ce pont disulfure n’est pas présent dans
1XND, ce qui nous laisse supposer que la xylanase 15 est plus thermostable que 1XND.
Fig. 32. Modèle de structure de la xylanase 15. Les acides aminés du site catalytique sont
indiqués en rouge et en vert. Les cystéines sont indiquées en blanc.
Le modèle de la xylanase 24 correspond à la structure canonique de la famille 10 des

glycosides hydrolases. Le modèle présente un ensemble de 15 hélices α situées à l’extérieur
de l’enzyme et 8 feuillets β formant un « TIM barrel » (Fig. 33.).
Deux cystéines proches forment un pont disulfure entre une hélice et un brin β. Ce pont
est également présent dans la matrice 1TUX.
91
Fig. 33. Modèle de structure de la xylanase 24. Les acides aminés du site catalytique sont
indiqués en rouge. Les cystéines sont indiquées en blanc.
Bien que les deux enzymes présentent des structures très différentes, elles utilisent le
même mécanisme d’action pour l’hydrolyse de la liaison β 1-4. Dans les deux cas il s’agit
d’un mécanisme de double déplacement. L’un des deux résidus glutamine du site actif agit
comme donneur de proton alors que l’autre agit comme base nucléophile.
III. 4. 2. Application à l’amélioration enzymatique
Les xylanases de la famille des glycoside hydrolases 11 contiennent deux résidus acide
glutamique impliqués dans un réseau de ponts hydrogènes et essentiels pour la catalyse
enzymatique. L’un des deux fonctionne en temps que nucléophile, le second en tant que
catalyseur acide/base dans le mécanisme de double déplacement. Un troisième résidu,
adjacent à l’acide glutamique servant de catalyseur acide/base semble essentiel et détermine le
pH optimum de l’enzyme. Il s’agit d’une asparagine (N) pour les enzymes dites « alcalines »
et d’un acide aspartique (D) pour les enzymes dites « acides » (Torronen et Rouvinen, 1997).
Il a été montré que la substitution N/D peut moduler le pH optimum de la xylanase BCX de
Bacillus circulans en abaissant ce dernier de 5,7 à 4,6 (Joshi et al., 2000).
92
Dans la séquence de la xylanase 15, les résidus du site actif sont la glutamine 122 en
tant que nucléophile et la glutamine 214 en tant que catalyseur acide/base. L’asparagine en
position 81 pourrait être impliquée aussi dans la catalyse car elle est proche du résidu
glutamine 214 dans la structure. L’enzyme est dite « alkaline » de part son pI basique mais
aussi de par l’intervention de l’asparagine dans le mécanisme moléculaire (Torronen et al.,
1997). Le pH optimum des xylanase dites « alkalines » est compris entre 4 et 8. La
substitution de l’asparagine en position 81 par un acide aspartique (N81D) peut permettre la
formation d’une liaison hydrogène plus courte et plus stable entre l’acide aspartique 81 et la
glutamine 214, par rapport au pont asparagine 81/glutamine 214 dans la séquence sauvage.
Le modèle de structure de xylanase 15 - N81D a été réalisé. La structure 3D de
l’enzyme reste inchangée (Fig. 34). Cette modification peut conduire à une diminution du pH
optimum de la xylanase 15.
Fig . 34. Modèle de structure de la xylanase 15 (orange) et de la xylanase 15 - N81D (rouge).

Les résidus glutamine sont représentés en verts, l’asparagine en bleu foncé et l’acide aspartique
en bleu clair.
93
III. 5. Conclusions et perspetives

La prédiction de gène de la famille des xylanases a abouti à la sélection de 36 zones
contenant putativement des gènes de xylanases. L’amplification des ADNc correspondant a
permis de valider 22 gènes exprimés par le champignon lors de sa croissance sur milieu
minimum contenant des parois de houblon.
L’analyse des séquences révèle leur appartenance à différentes familles de glycoside
hydrolase : 10, 11, 16, 21, 43 et 62. Certains des homologues de ces enzymes ont montré une
activité biochimique sur le xylane, d’autres sur la cellulose et d’autres présentent un spectre
large d’action sur différents polyosides. La fonction biologique des xylanases prédites est
encore putative et doit encore être confirmée par des analyses biochimiques.
La prédiction des structures par homologie a été réalisée pour les xylanases 15 et 24.
Les modèles moléculaires obtenus sont en accord avec les matrices et les règles de
stéréochimie.
L’ingénierie de protéine peut créer des molécules plus adaptées à des conditions
industrielles. Nous proposons une modification de la xylanase 15 dans le but de diminuer son
pH optimum. Elle pourrait trouver des applications dans le blanchiment de la pâte à papier en
condition acide (Tenkanen et al., 1997). Les modèles moléculaires permettent également de
prédire des modifications dans le but de stabiliser les enzymes pour les rendre plus résistantes
aux hautes températures. L’ajout de pont disulfure dans l’enzyme peut être envisagé. Toutes
ces prédictions nécessitent des travaux de mutagenèse dirigée ainsi que la production des
protéines correspondantes. Ces expériences pourront valider les prédictions.
Les 22 ARNm correspondant aux différentes xylanases sont retrouvés simultanément
dans le transcriptome de F. graminearum cultivé dans un milieu contenant, comme seule
source de carbone, des parois de houblon. Ceci montre la mobilisation de familles
enzymatiques pour la dégradation de substrat complexe. L’étude par famille semble alors
indispensable pour comprendre le mécanisme d’attaque des parois.
94
Chapitre IV. Transcriptome du champignon
Chapitre IV – Transcriptomique du champignon Fusarium

graminearum
95
IV. 1. Suivi de l’expression des xylanases
IV. 1. 1. Problématique
La validation de la prédiction de 22 gènes a été faite par clonage de la séquence codante
des ARNm correspondants. Cette validation a mis en évidence la présence simultanée des
ARNm codant pour les 22 xylanases dans la population d’ARN du champignon lors de sa
culture sur milieu minimum contenant de la paroi de houblon.
Ce constat nous a amené à nous poser des questions quant au niveau d’expression des
gènes et notamment de leur activation ou non en présence de substrats déterminés. Certaines
xylanases prédites appartiennent à des familles multifonctionnelles, d’autres ne présentent pas
de motif typique de glycoside hydrolase. L’induction de l’expression des gènes correspondant
par rapport à certains substrats pourrait donner des indications quant aux substrats des
enzymes et leur activité putative.
Nous avons décidé de suivre le niveau d’expression de chacun des gènes prédits (cf.
chapitre III) dans les populations d’ARN messagers provenant de F. graminearum cultivé
dans un des milieux minimums différant les uns des autres par la ou les source(s) de carbone.
Nous avons cherché à vérifier si le substrat, le xylane, provoquait l’augmentation de
l’expression des gènes des xylanases prédites. De même nous avons étudié l’effet inducteur
du produit de dégradation enzymatique du xylane : le xylose. L’abolition de la transcription
dans les cas précédents a également été testée par l’ajout de glucose. Le même schéma a été
reproduit avec la carboxyméthyl-cellulose (CMC) et son produit de dégradation le cellobiose
car certaines des xylanases prédites sont potentiellement bi-fonctionnelles et peuvent avoir un
spectre de substrat large. Nous avons également cherché à quantifier la présence des
messagers sur un substrat complexe comme les parois de houblon (Tab. 8).
Effet recherché Source de carbone

Glucose
références
YPG
Xylane
induction par le substrat
CMC
Xylose
induction par le produit
Cellobiose
Xylane Glucose, Xylose Glucose
abolition de l'induction
CMC Glucose, Cellobiose Glucose
induction par un substrat complexe Parois
Tableau 8. Différentes sources de carbone ajoutées au milieu minimum M3 pour le suivi de la
transcription des gènes prédits.
96
IV. 1. 2. Détermination du niveau d’expression des xylanases
IV. 1. 2. 1. Méthode de détermination
IV. 1. 2. 1. 1. Descriptif de la méthode

La Q-RT-PCR (Quantitative Retro-Transcription PCR) est une technique permettant de
détecter et de quantifier les ARNm au sein d’une population de molécules. La détermination
des quantités se base sur le nombre de cycles minimum (Ct) nécessaire pour arriver à un seuil
correspondant à une fluorescence dans le tube réactionnel. Le seuil est déterminé pour
correspondre à la zone d’amplification linéaire de la réaction de PCR.
Deux techniques de quantification existent. La quantification absolue se base sur une
gamme étalon qui permet d’obtenir une quantité de produit initialement présente en ng dans la
réaction. La quantification relative exprime le nombre de fois qu’un messager se trouve
présent dans une condition donnée par rapport à une condition de référence et cela par rapport
à un gène de référence interne.
La quantification relative nous a semblé plus appropriée que la détermination de profil
d’expression des différents gènes. De plus, la référence interne à un gène domestique permet
de s’affranchir de problèmes de calibration. Le gène de la β-tubuline a été utilisé comme
référence interne pour la quantification relative (AY360063).
IV. 1. 2. 1. 2. Validation
Des amorces ont été dessinées pour amplifier des fragments compris entre 150 et 250pb
avec des températures d’hybridation comprises entre 62 et 66°C (Annexe 3).
Les simplifications mathématiques à l’origine d’un calcul rapide correspondant à la
quantification relative imposent que l’efficacité de la réaction PCR soit identique pour les
gènes cibles et le gène de référence (Annexe 5).
La validation est réalisée pour chaque couple d’amorce par rapport aux amorces du gène
référence. Elle est réalisée en calculant les différences de Ct entre un gène cible et le gène de
référence sur une gamme de concentration couvrant 4 à 6 logs. Le report de ces valeurs sur un
graphique permet de déterminer le coefficient directeur et ainsi de vérifier que la différence
dans la quantification des deux gènes est constante. Un coefficient directeur inférieur à 0,1
permet de confirmer que l’efficacité d’amplification est bien la même pour les deux cibles.
97
Les efficacités d’amplification ont été validées pour les 22 couples d’amorces contre le
couple d’amorces pour la référence. Un exemple de droite obtenue est montré en Fig. 35.
4,5
4
3,5
3
y = 0,0714x + 3,6333
Delta Ct
2,5
2
1,5
1
0,5
0
-3 -2 -1 0 1
Log de la concentration
Fig. 35. Validation de l’efficacité d’amplification pour les amorces de la xylanase 16. Le
coefficient directeur est inférieur à 0,1.
IV. 1. 2. 2. Quantification par Q-RT-PCR

Le niveau d’expression des différents gènes prédits a été déterminé par la méthode de
Q-RT-PCR relative. Le niveau d’expression sur le milieu M3-Glc a été pris comme condition
de référence dans le calcul pour déterminer le niveau « 1X » d’expression des gènes.
Les profils de niveau d’expression sur les différents milieux ont pu être regroupés en
différents types d’induction présentés dans les sous-parties suivantes. Dans le but de visualiser
facilement les niveaux d’expression des différentes xylanases sur le même graphique, les
valeurs de quantification ont été exprimées en pourcentage du niveau maximum pour chaque
gène. La comparaison directe entre les différentes xylanases ne peut pas être effectuée car
chacune se rapporte à la valeur d’expression 1X de la condition de référence, mais cette
valeur n’est pas la même pour les différents gènes.
98
IV. 1. 2. 2. 1. Les xylanases induites par les parois
Les gènes des xylanases 9, 14 et 25 présentent une très nette induction de leur
expression sur milieu paroi (Fig. 36). Les xylanases 9 et 14 montrent une
augmentation de leur expression sur milieu YPG. Cette induction peut être liée à des
composants de la paroi cellulaire des levures qui sont contenus dans le milieu.
140
X09
120 X14
100 X25
80
60
40
20
0
e
se
lc
C
e
lc
lc
G
lc
is
lc
n
os
M
G
G
G
ro
YP
lo
la
bi
Pa
C
se
e
Xy
Xy
os
lo
M
lo
la
el
C
bi
Xy
Xy
lo
el
C
Fig. 36. Profil du niveau d’expression des gènes des xylanases 9, 14 et 25.
IV. 1. 2. 2. 2. Les xylanases induites par les parois et le xylane

La xylanase 13 présente une induction du gène correspondant lors de la culture sur
milieu M3 Xylane (Fig. 37). Cependant elle présente une induction bien plus forte lors de la
présence de parois de houblon dans le milieu de culture. Aucune autre induction n’est
retrouvée pour ce gène.
99
120
X13
100
80
60
40
20
0
ne
lc
lc
se
G
lc
lc
C
is
lc
e
os
G
G
G
G
M
ro
G
YP
lo
la
C
Pa
bi
se
ne
e
Xy
Xy
os
lo
M
lo
la
el
C
bi
Xy
Xy
lo
el
C
Fig. 37. Profil du niveau d’expression du gène de la xylanase 13.
IV. 1. 2. 2. 3. Les xylanases induites par les parois et la CMC
Les xylanases 7, 18, 26 et 28 présentent un profil d’induction par les parois de houblon
et la CMC (Fig. 38). Les xylanases 7 et 28 présentent un domaine glycoside hydrolase de la
famille 43. La xylanase 26 appartient à la famille 62 et la xylanase 18 ne présentait pas de
domaine d’une famille de glycoside hydrolase. Les familles 43 et 62 sont des familles
multifonctionnelles.
120
X07
100 X18
X26
80
X28
60
40
20
0
ne
se
e
lc
lc
lc
lc
s
lc
oi
os
M
G
G
G
G
YP
lo
la
r
bi
Pa
C
ne
se
e
Xy
Xy
os
lo
M
lo
la
el
C
bi
Xy
Xy
lo
el
C
Fig. 38. Profil du niveau d’expression des gènes des xylanases 7, 18, 26 et 28.
100
IV. 1. 2. 2. 4. Les xylanases induites par les parois, le xylane et

le xylose
Les gènes des xylanases 2, 15, 17, 24, 32, 33, 34 et 35 subissent une induction très forte
sur le milieu contenant du xylane (Fig. 39). De plus les gènes de ces enzymes présentent une
régulation vis à vis du produit de dégradation du xylane : le xylose induit l’expression de ces
gènes. La présence de glucose dans les milieux de culture abolit les inductions par les parois,
120
X02
100 X15
X17
80
X24
60 X32
X33
40 X34
20 X35
0
e
lc
lc
G
lc
e
s
lc
lc
n
s
i
os
G
G
G
M
YP
ro
G
G
la
lo
bi
Pa
C
e
Xy
Xy
e
os
n
s
lo
M
la
io
el
C
l
Xy
Xy
b
C
lo
el
C
Fig. 39. Profil du niveau d’expression des gènes des xylanases 2, 15, 17, 24, 32, 33, 34, 35.
le xylane et le xylose.
La xylanase 17 de la famille des glycoside hydrolases 43 présente une induction du
même ordre de grandeur par le milieu YPG que par le milieu contenant des parois.
L’induction de cette enzyme par des glucides de petite taille comme le xylose pourrait être à
la source d’un tel résultat.
Les xylanases 2, 17 et 24 font toutes partie de la famille de glycoside hydrolases 10.
Les xylanases 19, 21 et 27 présentent des profils d’expression différents des autres par
l’absence complète des ARNm correspondant dans les milieux contenant du glucose à
l’exception du milieu YPG où leur niveau d’expression est extrêmement faible (Fig 40).
101
140
X19
120
X21
100 X27
80
60
40
20
0 * + * * * * *
lc
ne
lc
se
lc
lc
C
e
G
is
lc
os
G
G
ro
M
G
YP
lo
la
C
Pa
bi
ne
se
e
Xy
Xy
os
lo
M
lo
la
el
C
bi
Xy
Xy
lo
el
C
Fig. 40. Profil du niveau d’expression des gènes des xylanases 19, 21, et 27. * pas
d’amplification détectée, + quantité faible d’ARNm detectée.
La xylanase 21 fait partie de la famille des glycoside hydrolases 10 mais contrairement

à ses homologues son gène n’est pas induit par le xylose.
La xylanase 19 appartient à la famille des glycoside hydrolases 11 au même titre que la
xylanase 15. Les gènes de ces deux enzymes présentent des inductions similaires par les
parois, le xylane, le xylose et la CMC.
IV. 1. 2. 2. 6. Les xylanases non induites

Les xylanases 1 et 3 présentent un profil d’expression qui ne peut être mis en rapport
avec les différents substrats présents dans les milieux de culture (Fig. 41).
Les deux enzymes appartiennent à la famille des glycosides hydrolases 16 qui
constituent une famille d’enzymes multifonctionnelles. Des domaines β-glucanase peuvent
également être retrouvés dans ces deux enzymes.
102
3,0
X01
2,5 2,2 X03
2,0
1,7
1,6
1,5 1,2
1,2
1,0 1,0
1,0
0,6 0,7
0,4 0,5
0,4
0,5 0,3 0,3 0,3 0,3
0,1 0,2 0,2
0,1 0,1
0,0
0,0
lc
ne
lc
se
is
lc
C
G
lc
lc
os
G
G
M
G
ro
G
G
YP
lo
la
bi
Pa
e
ne
se
C
Xy
Xy
os
lo
M
lo
la
el
C
bi
Xy
Xy
lo
el
C
Fig. 41. Profil du niveau d’expression des gènes des xylanases 1 et 3. Les profil est exprimé en
nombre de fois relatives à la condition de référence M3-Glc.
IV. 1. 2. 2. 7. Réinvestigation des résultats obtenus sur M3-

parois
Les différentes xylanases ont montré une induction de la transcription de leur gène par
rapport à leur niveau basal lors de la culture sur milieu contenant des parois de houblon. Dans
le but de comparer les quantités d’ARNm des différentes xylanases entre elles, la
quantification relative a été effectuée par rapport à la β-tubuline puis par rapport à la quantité
de la xylanase la moins exprimée dans cette condition. Nous obtenons ainsi le niveau
d’expression de chaque xylanase quantitativement en nombre de fois de la quantité de
l’ARNm de la xylanase 01 (Fig. 42).
103
900 836
802
800
700 667
600
500 457
400
300 265
180 198
200 130 131 136
84 92
100 59 67 74
27 36 42
1 1 2 8 11
0
C
1
6
7
5
4
7
4
9
2
3
6
9
3
5
7
8
3
8
4
1
cb 2
5
X0
X1
X1
X3
X1
X2
X3
X0
X3
X0
X2
X1
X3
X2
X0
X2
X1
X1
X2
X2
X0
X1
h-
Fig. 42. Quantification de l’expression des xylanases sur milieu paroi par rapport au niveau du
transcrit de la xylanase 01 (en nombre de fois). La cbh-C a été ajoutée comme contrôle .
La quantification des niveaux d’expression des gènes des xylanases par rapport au gène
le moins exprimé permet d’obtenir un profil pour toute la famille de gènes.
Les gènes des xylanases 2 et 15 se trouvent être les plus exprimés dans cette condition
de culture. L’ARNm du gène de la CBH-C est présent en forte quantité comparable à ceux des
xylanases 2 et 15.
Les gènes des xylanases les plus exprimés dans cette condition de culture sont des
représentants des familles glycoside hydrolases 10 et 11. Ce diagramme laisse supposer
l’implication majoritaire des familles de glycoside hydrolases 10 et 11 dans la dégradation des
parois végétales.
IV. 1. 3. Discussion
Le suivi de l’expression des gènes des xylanases prédites a permis de définir différents
profils d’expression en fonction des sources de carbone présentes dans le milieu de culture
présentés dans les histogrammes précédents. Ces profils ont été évalués d’une manière
qualitative et regroupés dans le tableau 9.
104
Xylane Xylose CMC Cellobiose

Glc YPG Parois Xylane Xylose CMC Cellobiose
Glc Glc Glc Glc
X09 + + +++++ + + + + + + + +
X14 + + +++++ + + + + + + 0 0
X25 + + +++++ + + + + + + + +
X13 + + +++++ ++ + + + + + + +
X07 + + ++++ + + + + +++++ + + +
X18 + + +++++ + + + + +* + + +
X26 + + +++++ + + + + ++++ + + +
X28 + + ++++ + + + + +++++ + + +
X02 + + ++ +++++ + + + + + + +
X15 + + ++ +++++ + + + ++ + + +
X17 + +++++ +++++ ++ + +++ + ++ + + +
X24 + + +++++ +++++ + ++ + +++++ + + +
X32 + + + +++++ + ++ + + + + +
X33 + + + +++++ + ++ + + + + +
X34 + + +++ +++++ + + + +++++ 0 0 +
X35 + + + +++++ + ++ + + + + +
X19 0 + + +++++ + ++ 0 + 0 0 0
X21 0 + +++++ +++++ + + + +++++ 0 0 0
X27 0 0 +++ +++++ + +++ + ++ 0 0 0
Tableau 9. Profil d’expression des xylanases prédites sur les différents milieux de culture. L’attribution
qualitative a été effectuée selon le critère suivant le pourcentage étant rapporté à l’induction la plus forte de
100% : +++++ >80%, ++++ >60%, +++ >40%, ++ >20%, + >0%, 0 pas d’ARNm amplifiés. * induction
de 60X par rapport au niveau basal du gène.
Les gènes des xylanases 9, 14 et 25 sont induits par la présence de parois de houblon.
Le gène de la xylanase 13 montre une augmentation de transcription lors de la culture sur les
milieux contenant des parois et du xylane. Les gènes des xylanases 7, 18, 26 et 28 présentent
une induction par les parois de houblon et la CMC. La xylanase 7 présente un domaine
glycoside hydrolase de la famille 43, comme la xylanase 28, cependant c’est la seule enzyme
qui possède un domaine de fixation à la cellulose à son extrémité C-terminale. Malgré les
homologies envers des xylanases, la xylanase 7 pourrait appartenir aux cellulases de part son
induction par la CMC et la présence d’un CBD. Les homologies de séquences de ces deux
xylanases étaient les plus fortes pour des séquences bactériennes. La xylanase 26 appartient à
la famille des glycosides hydrolases 62, qui est une famille multifonctionnelle. Les
homologies de séquences pour cette enzyme nous ont laissé supposer une activité
arabinofuranosidase. La xylanase 18 présentait des homologies avec une xylanase bactérienne
mais pas de domaine d’une famille de glycoside hydrolase. Elle montre une induction bien
plus faible (60X) par la CMC par rapport à une induction forte (1272X) par les parois de
houblon. Les gènes des xylanases 2, 15, 17, 19, 21, 24, 27, 32-35 sont induits de manière très
105
forte par le xylane et les parois de houblon, de même que le xylose sauf exception pour le
gène de la xylanase 21.
Certaines xylanases peuvent présenter une spécificité de substrat réduite. Ces enzymes
peuvent agir sur différents substrats, les membres de la famille 10 ont montré des activités sur
des substrats cellulosiques de faible poids moléculaire (Biely, 2003). Il serait intéressant pour
chaque enzyme de comparer sa spécificité de substrat aux sources de carbone qui induisent le
plus fortement l’expression du gène correspondant.
A l’exception des gènes des xylanases 19, 21 et 27, les différents gènes semblent être
exprimés à un niveau basal dans des conditions de culture contenant du glucose. Une
induction de certains gènes est observée en présence de xylose, produit de dégradation du
xylane par les xylanases. Dans leur review sur les xylanases, les auteurs présentent le
mécanisme d’induction des gènes des xylanases par les produits de leur propre action comme
communément admis (Collins et al., 2004). Cependant l’induction des gènes par le xylose
n’est jamais aussi élevée qu’avec le xylane et peut être abolie par la présence de glucose. Ces
observations tendent à montrer la présence de différents mécanismes de régulation des gènes
des xylanases.
La quantification des ARNm sur le milieu contenant des parois de houblon ainsi que la
redondance des membres de certaines familles de glycosides hydrolases valident l’approche
par famille. Les xylanases 3 et 4 de F. oxysporum f. sp. lycopersici appartiennent
respectivement aux familles de glycosides hydrolases 10 et 11 et correspondent
respectivement aux xylanases 21 et 19 de F. graminearum. La disruption de leur gènes n’a
pas entraîné de diminution significative de la virulence du champignon sur la tomate (Gomez-
Gomez et al., 2002). La quantité d’ARNm de la xylanase 19 est faible comparée à celle des
xylanases les plus exprimées. La xylanase 21 fait partie des gènes les plus exprimés dans cette
condition de culture tout comme les autres membres de la même famille de glycosides
hydrolases 10. La compensation de l’activité perdue pour le produit d’expression d’un gène
par celui des autres membres de la même famille pourrait être mise en avant pour expliquer
l’absence de diminution de virulence. Les résultats de quantification sur le milieu contenant
des parois de houblon doivent cependant être comparés à des résultats de quantification lors
d’infection de plantes par F. graminearum. Ainsi l’induction présentée par ce milieu pourrait
être comparée à celle qu’occasionne une pathologie.
106
IV. 1. 4. Conclusions et perspetives

L’étude plus poussée de la régulation peut être envisagée en incluant cette fois le facteur
temps. Le suivi du niveau d’expression des gènes devra être effectué à différents temps dans
le but de discerner les mécanismes mis en jeu pour la régulation des gènes des différentes
xylanases.
L’expression majoritaire des xylanases 2, 15, 21 et 24 sur le milieu M3-Parois illustre
bien le problème de compensation d’activité qui peut être rencontré lors de l’interruption de
gène. L’activité perdue peut être compensée par l’activité d’autres membres de la même
famille. Ces résultats confirment la nécessité d’une approche par famille dans l’élucidation de
l’interaction hôte-pathogène au travers de la dégradation de la paroi végétale.
Dans l’optique d’une étude plus poussée des différentes xylanases, les xylanases 2, 15,
21 et 24 présentent les meilleures caractéristiques pour être de bons candidats : une régulation
complexe des gènes, une expression majoritaire sur un milieu contenant des parois de houblon
et des homologies fortes avec des enzymes dont l’activité biologique a été démontrée.
107
IV. 2. Etude spécifique du transcriptome par approche soustractive
IV. 2. 1. Problématique
L’étude de la transcription des gènes prédits des xylanases a mis en valeur la nécessité
d’étudier des familles de gènes dans le cas des CWDE. Dans le but d’élargir nos
investigations à d’autres CWDE et d’obtenir un profil de CWDE majoritairement exprimées
en présence de paroi de houblon, nous nous sommes intéressés à une approche plus globale
par l’intermédiaire de l’analyse d’une banque d’EST.
Une première banque d’ADNc de F. graminearum cultivé sur milieu M3 contenant des
parois de houblon a été réalisée. 192 clones ont été séquencés. La CBH-C a été retrouvée
parmi ces EST. Cependant la majorité des EST étaient répétées dans la banque et
correspondaient à des activités domestiques.
Nous avons voulu entamer une approche plus ciblée pour obtenir une meilleure
représentation de la population spécifique d’ARN messagers induits par les parois de houblon.
L’approche par hybridation suppressive soustractive présente de nombreux avantages. Cette
technique permet d’enrichir une population d’ARNm en diminuant le bruit de fond des gènes
domestiques. De plus la méthode incorpore une étape de PCR visant à égaliser la
representation des EST. De ce fait des ARNm différentiellement exprimés et variant en
abondance dans la population de départ se retrouve dans des proportions similaires.
La description et l’analyse de la banque résultant de l’hybridation suppressive
soustractive d’ARNm de F. graminearum cultivé sur milieu contenant des parois contre le
même milieu contenant du glucose sont présentées dans l’article 3.
108
IV. 2. 2. Article 3 - The transcriptome of Fusarium graminearum

grown on plant cell walls reveals several families of pathology-related genes, Hatsch
D., Phalip V., Petkovski E., Jeltsch J.M., soumis dans Fungal Genetics and Biology
109
The transcriptome of Fusarium graminearum grown on plant cell walls reveals
several families of pathology-related genes.
Didier HATSCH a, Vincent PHALIP a, Elizabet PETKOVSKI b and Jean Marc JELTSCH a *
a
U.M.R. 7100, Université Louis Pasteur-CNRS, Ecole Supérieure de Biotechnologie de Strasbourg, Boulevard
Sébastien Brant, BP 10413, 67412 Illkirch-Graffenstaden Cedex, France
b
Institut de Médecine Légale, Université Louis Pasteur, 11 rue Humann 67085 Strasbourg Cedex FRANCE
Keywords : Gibberella zeae, SSH, CWDE, suppressive subtractive hybridization, EST
* Corresponding author : Tel. : +33 3 90 24 47 89; Fax : +33 3 90 24 46 83.

E-mail adress : [email protected]
Web : http://phytopathologie.u-strasbg.fr
Abstract
Fusarium graminearum (téléomorphe Gibberella zeae) is a broad host range pathogen
that infects several crop plants, mainly cereals. A strain of F. graminearum (N° CABI) was
isolated surprisingly from diseased hops. A suppressive subtractive hybridization protocol has
been applied to cDNA from F.graminearum grown on hop cell walls (tester) and on medium
containing glucose (driver). 963 EST were generated by the sequencing of 1056 randomly
chosen clones (dbEST ACC-ACC) and were assembled in 124 contigs and 413 singleton
sequences. Comparing the translation with the Genbank non-redundant protein database, we
determined that the 537 unique EST sequences correspond to 441 unique mRNA. Among
these, 36 EST were identified coding for proteins related to pathology like 17 CWDE (Cell
Wall Degrading Enzymes) and 4 enzymes of the trichothecene biosynthesis cluster. Moreover
we described 36 EST corresponding to transporters and finally 15 EST which translation is
related to stress proteins. The medium containing hop cell walls not only induce CWDE genes
but also genes associated with pathogenicity and virulence. Thus it could be considered as
valuable for mimicking part of the interaction between the plant and the fungus.
110
1. Introduction
Filamentous fungi are well known phytopathogens (Scheinpflug and Heupel, 1998;
Kimura et al., 2001). Attention has been focused on fungal genera isolated from diseased hops
(Humulus lupulus, L.) (Phalip et al., 2004) other than downy and powdery mildews
(respectively Pseudoperonospora humuli and Sphaerotheca humuli), which are common
pathogens of this plant. One of these, Fusarium is composed of several phytopathogen species
(Nicholson et al., 2003). Although Fusarium sambucinum is known as the agent of Fusarium
canker in hops and was mostly identified in the collected samples, another one, Fusarium
graminearum (teleomorph : Gibberella zeae) happened to be isolated from wounded hops. F.
graminearum is of particular importance since it is responsible for worldwide crop losses due
to either pathogenesis (Munkvold, 2003) or food spoilage by its mycotoxins (Legzdina et al.,
2004).
Plant infection by fungi was shown to involve the fungal cell wall degrading enzymes
(CWDE) (Kang et al., 2002). CWDE are composed of several families: xylanases, pectinases,
cellulases and proteases. It is believed that CWDE are playing a key role in pathogenesis
(Esquerré-Tugayé et al, 2000), and are acting at different stages of the host-pathogen
interaction (Roncero et al. 2000). The role of several enzyme families has been investigated.
For exemple Isshiki et al. (2001) reported that the endopolygalacturonase of Alternaria citri is
essential for citrus black rot. However it is not the case for that of Alternaria alternata, the
fungus causing citrus brown spot (Isshiki et al., 2001). Furthermore two genes encoding
different xylanases have been disrupted in Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici without any
noticeable effect on its tomato infection (Gomez-Gomez et al., 2002). As CWDE mostly
result from the expression of multiple gene families, any member of a given family can
compensate for a lost gene as it was shown in Magnaporthe grisea (Wu et al., 1997). Thus a
better knowledge of these gene families is still requested to progress in the understanding of
the fungal pathogen mode of action.
One classical route is the study of cDNA libraries in order to discover new sets of genes
and to give information on their expression. Kruger et al.(2002) reported the identification of
F.graminearum pathology-related genes by screening a cDNA library from infected wheat.
The major part (98%) of the library was composed of EST from the host plant and only
sixteen EST were found to correspond to fungal proteins implicated in pathology. To
overcome this methodological bias, libraries were built from fungus grown on nitrogen and
carbon starvation media (Trail et al., 2003). These culture conditions were shown to induce
111
pathology-related EST, classified as homologues to sixteen different genes associated with

pathogenicity and virulence in other fungi.
The focus of our study was to characterize families of CWDE secreted by F.
graminearum in contact with plant cell walls. In order to avoid contamination with plant
sequences and to specifically favor EST coding for CWDE, a suppressive subtractive
hybridization protocol has been applied involving cDNA from F. graminearum grown on hop
cell walls (tester) and on medium containing glucose (driver). The resulting EST library was
analyzed with special respect first to CWDE then to pathology, transport and stress.
2. Material and methods

2.1. Fungal strains and culture conditions
Fusarium graminearum (Gibberella zeae) was originally isolated from diseased hops
and identified by CABI Bioscience (United Kingdom). The fungus was cultivated on PDA.
The method developed on maize by Sposato et al. (1995) was adapted for the preparation of
hop cell walls. F. graminearum was cultured at 25°C on 10 mL M3 medium (Mitchel et al.
1997) with either Glucose (M3-G) or hop cell walls (M3-CW) as sole carbon source at a
concentration of 10g L-1.
The Escherichia coli strain TOP10 (F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15
∆lacΧ74 recA1 araD139 ∆(araleu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG) was used for
all cloning procedures.
2.2. Preparation of subtracted library
F. graminearum was cultured 48h and 96h respectively in M3-G and M3-CW. At these
times the fungal mycelium was still growing and occupied a volume of 5mL. RNA was
extracted with the RNeasy® kit (Qiagen, Germany), and poly A+ RNA were further purified
with Oligotex mRNA kit (Qiagen, Germany).
The subtracted library was constructed according to the PCR-Select™ cDNA
Subtraction Kit (BD Biosciences, CA). Poly A+ RNA extracted from the M3-CW culture was
used as tester and poly A+ RNA extracted from M3-G as driver. The β-tubulin gene
(AY303689) was used to estimate the relative enrichment of the library in a standard PCR
experiment with the specific primers betatub-5 5’- TGT TGA TCT CCA AGA TCC GTG
112
AGG - 3’ and betatub-3 5’- GGT AGT TCA GGT CGC CGT AAG AGG - 3’. The
subtracted cDNA were cloned into ddTTP tailed HincII digested pUC19 and transformed into
E.coli TOP10.
2.3. Sequencing and sequence analysis
cDNA clones were purified with the R.E.A.L. prep 96 kit (Qiagen, Germany). Plasmids
were sequenced with the BigDye terminator kit v1.1 (Applied Biosystems, CA), sequencing
reactions were further purified with Autoseq 96 plate (Amersham Biosciences, NJ), separated
and read on an ABI prism 3100 apparatus (Applied Biosystems, CA).
The Phragment assembly program (PHRAP) was used to assemble overlapping or
repeated EST into contigs and singletons. The six-frame translations of the sequences were
blasted (BLASTX) against the nr database (non-redundant GenBank CDS
translations+PDB+SwissProt+PIR+PRF) (Altschul et al., 1997). Sequences without any blast
hit in the database and shorter than 300bp were enlarged to 300bp using related genomic
sequences (AACM00000000) and blasted again. When no hit was found a larger region up to
4kb was taken and searched for predicted proteins. If such a protein was identified, the
starting EST was analyzed whether it could match to either the 5’ or the 3’ untranslated region
and the corresponding predicted protein sequence was then used to identify the EST.
The functions of the proteins generated from the EST dataset were attributed according
to the F. graminearum predicted protein (Whitehead) and to the functional assignment
performed by MIPS (http://mips.gsf.de/genre/proj/fusarium/). The functions of the EST that
have not been assigned to any predicted protein have been manually determined.
3. Results
3.1. Construction of the subtracted library
A differentially expressed library has been created through suppressive subtractive

hybridization technique. The mRNA populations for the subtraction were obtained from F.
graminearum grown on two media varying in the carbon sources: hop cell walls for the tester
and glucose for the driver. Subtraction efficiency has been assessed by comparing the
abundance of β–tubulin amplicon in subtracted and unsubtracted populations. A difference of
10 cycles is observed to obtain a similar amplification of the β–tubulin target (Fig. 1). This
indicates that the enrichment of cDNA sequences resulting from the subtraction process was
113
effective and in accordance with typical result for such experiments (PCR-Select™ cDNA
Subtraction Kit user Manual).
The transformation event generated roughly 10 000 transformants. A subset of 1056
randomly selected clones was grown and plasmids were prepared for sequencing. The
sequences were trimmed of the vector and primer sequences. 963 sequences were deposited in
dbEST (ACC – ACC). All the EST were found in the F. graminearum genome and analyzed
with PHRAP in order to assemble contigs from the repeated and overlapping sequences. A
total of 537 unique sequences (124 contigs and 413 singletons) was obtained. The average
insert size was 357 ±169 bp and only 21 sequences exhibited a polyA tail with a mean size of
26 ±7bp.
3.2 Functional attribution of the proteins deduced from the EST
The 537 EST sequences were blasted (BLASTX) against the non-redundant protein
database. Non-overlapping EST could match to the same predicted protein of F.graminearum.
This was the case for 169 EST corresponding in fact to 73 predicted proteins. Consequently
the number of unique mRNA identified is 441. Among these, 18 EST could neither be
assigned to any other sequence found in the non-redundant protein database nor to
untranslated regions of the corresponding predicted mRNA. Furthemore 12 EST showed only
homologies with proteins from other organisms than F. graminearum.
A functional annotation of the predicted proteins of F.graminearum has been done at
the Munich Information Center for Protein Sequences (MIPS) according to the MIPS
functional catalogue version 2.0. Using this annotation, functions were attributed to the 411
(444-18-12) EST homologous to predicted proteins. The functions of the 30 (18+12) other
EST were attributed by comparison with the Saccharomyces cerevisiae dataset (Fig 2.). A
function could be assigned for 51% of the EST.
The blast results were analyzed. For each blast result the best hit was selected for which
experimental evidences were available. According to their possible implication in pathologies,
transport and stress, 89 pertinent EST were sorted out and further studied.
Thirty-six pathology related EST have been identified, sub classified in cell wall
degrading enzymes, toxin pathways and others (Table 1). Two members of the xylanase
family, an arabinofuranosidase, a polygalacturonase, a pectate lyase, a galactanase, an
endoglucanase and a glucosidase are present among the CWDE. Moreover two secreted
chitinases are retrieved. In addition to enzymes acting on the polymerized sugars, five
114
different proteases were identified. Some EST correspond to genes coding for enzymes
involved in toxin biosynthesis pathways and others EST are showing high homologies to
proteins known to be acting or being involved in pathogenesis.
Thirty-six members of the transport systems have also been found (Table 2). Two main
transporter categories have been highlighted. The first is that of the nitrogen source
transporter (13 mRNA), including several general amino acid permeases and acidic amino
acid permeases. The second category is that of the carbon source transporter (9 mRNA) which
is mainly composed of hexose transporter. Finally, several other transporters (14 mRNA) are
present namely purine-cytosine permease, cation transporter, metal ion transporter and
transporters of unknown specificity.
Fifteen EST are corresponding to mRNA coding for protein involved in stress response
mechanisms. Different heat shock proteins are found but also proteins produced in starvation
conditions.
Discussion
Suppressive subtractive hybridization is widely used to characterize differentially

expressed genes between two cellular states or culture conditions. In this study a differentially
expressed cDNA library has been constructed using mRNA from F. graminearum grown on
hop plant cell walls as tester and grown on glucose for the driver. The library showed an
enrichment in differentially expressed sequences (Fig 1.). 1056 clones were selected and the
corresponding plasmids were sequenced. 956 sequences have been assembled in 124 contigs
and 407 singletons representing 537 unique sequences corresponding to 441 unique mRNA.
Functions were assigned to the 441 EST representing unique mRNA according to the
MIPS functional catalogue (V2.0) (Fig 2.). In N or C-starved EST libraries, the Protein
synthesis and Metabolism categories were found to correspond to 20% and 10% respectively
(Trail et al. 2003). In our subtracted library they represent 8% and 25% respectively.
Moreover, prevalent mRNA measured by their redundancy like the homologue to DigA
protein (CAC27452) is not found in the subtracted library, and the homologue to the 30KD
HSP (P40920) only once. Thus being coherent with the enrichment awaited for this type of
library.
The genome of Fusarium graminearum has been sequenced and released
(AACM00000000). Proteins were predicted over the whole genome out of the nucleotide
sequence data (Fusarium graminearum Sequencing Project (Broad Institute of MIT and
115
Harvard, http://www.broad.mit.edu)). 411 EST were found to have their translation products
homologous to predicted proteins of F. graminearum. Thus the corresponding predicted genes
can now be considered as expressed genes.
Changing the carbon source in the medium from glucose to plant cell walls was
supposed to induce several CWDE. In the subtracted library, several EST show homologies
with different CWDE families (Table 1). Those are corresponding to the one needed to
degrade each layer of the plant cell wall, namely cellulases for cellulose, pectinases for pectin
and xylanases for xylan. Moreover synergistically acting enzymes are found for the pectinase
and xylanase, respectively galactanase and arabinofuranosidase, which principal function is to
depolymerize side chains in order to give free access to the core polymer to the other enzyme
(Le Nours et al., 2003; Koseki et al., 2003). In a cDNA library build with the total mRNA of
infected wheat spikes with F.graminearum, four EST corresponding to xylanases have been
found (Kruger et al., 2002). They are corresponding to three predicted proteins, sequences
BM138109 and BM135798 being homologous to different parts of predicted protein
AAE73188. EST ac11 is corresponding to this protein, thus there may be a correlation
between the presence of this mRNA and the implication of the protein in pathologies. Among
the CWDE we previously characterized the cellobiohydrolase-C (AY196784). The absence of
the cellobiohydrolase-C in the subtracted library is confusing, since it is found in a cDNA
library constructed with mRNA from F.graminearum grown on M3-CW (data not shown).
Although it is supposed to be found by screening more clones, the lack of some highly
expressed mRNA have already been reported for cellulase and can be considered as intrinsic
to the SSH method used to construct the library (Schmoll et al., 2004). 5 proteases are
identified and putatively secreted in the medium. Other proteins have a homologous EST in
the subtracted library. Contig62 shows homologies to an unknown protein of Glomerella
cingulata, which is weakly induced by N starvation but is expressed at early stages of
infection, detected by northern blots at 3 days after inoculation (Manners, J.M., personal
communication). Two different integral membrane protein homologues are found. They are
supposed to interact with hydrophobic surfaces in order to detect leaf surfaces (DeZwann et
al., 1999 ; Perfect E., personal communication). A carnitine acetyl transferase was found in
the N-starved library (Trail et al. 2003) and is also present here: it was shown to be a
pathogenesis gene by insertional mutagenesis (Sweigard et al. 1998). EST 1g01 encodes a
cutinase G-box binding protein, a positive transcriptional activator of cutinase genes (Li et al.,
1997), already found in a cDNA library of F.graminearum infecting wheat (Kruger et al.,
2002). The ceratoplatanin protein family, of which the snod-protein is a member, was shown
116
to be secreted during infection of wheat leaf by Stagonospora nodorum (Hall et al., 1999). A
homologue of this protein from Coccidioides immitis (Q00398) showed serine proteinase
activity thus may give a clue to its implication in pathology (Pan and Cole, 1995). The genus
Fusarium is well known for producing several mycotoxins, but mainly trichothecenes, which
are implicated in plant pathologies (Proctor et al., 1995). Four EST translations are
homologous to enzymes implicated in the trichothecene biosynthesis pathway, thus
underlining the induction of toxin synthesis in the M3-CW medium. Other EST are coding for
protein with high homologies to protein implicated in toxin synthesis for which
F.graminearum is not a known producer.
Thirty-six EST are corresponding to mRNA coding for proteins of the transporter class
(Table 2). These transporters are produced in order to allow active transport of nitrogen or
carbon sources present in the medium. Proteins are minor plant cell wall constituents, which
can be hydrolyzed by released fungal proteases thus liberating small peptides and amino
acids. These are the main organic nitrogen sources in the medium. Different permeases and
transporters have been identified in the subtracted cDNA library allowing specific or non-
specific amino acid uptake. Enzymatic hydrolysis of the different layers of the plant cell wall
by the fungus generates different kind of oligosaccharides. In order to be able to use these
energy sources the fungus should display various uptake systems. Transport systems are
found in the library assuring the uptake of most sugars available in the fungus’s environment.
Nevertheless no transport system specific for glucose was recovered although the cellulose
layer complete hydrolysis generates only glucose. The first filamentous ascomycete glucose
transporter named gtt1 has been characterized in Trichoderma harzianum (Delgado-Jarana et
al., 2003). The corresponding protein in F. graminearum, EAA69031, was not found in the
EST dataset. Since the medium used to produce the driver cDNA contains glucose, the
corresponding transporter cDNA should have been suppressed by the hybridization process.
Some cooperatively acting transporters are found like the plasma membrane ATPase
homologue which creates a proton gradient necessary for many other transporters (Tanner and
Caspari, 1996). For example, singleton 6d01 is homologous to a ferrioxamine B transporter of
the yeast S. cerevisiae. The siderophore transporters, recognizing siderophore-iron chelates,
are important for the fungus, since they are produced during iron deprivation and allow its
efficient uptake.
Fifteen EST showed homologies to protein implicated in stress response of the fungus
to its environment. 8 heat shock proteins are found in the library. Singleton 9d06 is
117
corresponding to the mRNA coding for the HEX1 protein of Hypocrea jecorina which
transcription was shown to be induced on cellulase-inducing medium (Curach et al. 2004).
Polymer of this protein forms Woronin bodies which function is to seal the septum of the
hyphae in response to cellular damage. Mutants of Magnaporte grisea lacking the Hex1 gene
were shown to be unable to survive under nitrogen starvation thus it is supposed that the
Woronin bodies provide a defense against the nutrient-limiting environment during host-plant
infection (Soundararajan et al. 2004). EST 7a08 is homologous to the cross-pathway control
gene 1 of Neurospora crassa. The corresponding protein is required for the regulation of
amino acid biosynthetic genes. This gene was found to be induced by starvation, reflecting the
effect of the culture conditions (Paluh et al., 1988).
Using the suppressive subtractive hybridization methods gives a specific insight in the
transcriptome of F. graminearum grown on minimal medium containing hop cell walls. The
simple change in the carbon source present in the medium resulted in much more changes in
the cell activity than only producing enzymes to degrade the cell walls. Classically nutrient
starvation is known to induce gene related to pathogenesis (Trail et al., 2003). The EST found
in the subtracted library give the clue, that the fungus grown on plant cell walls switches not
only to a metabolism linked to carbon starvation but also to a growth where genes associated
with pathogenicity and virulence are expressed. The use of such a medium to study the fungus
by mimicking part of its interaction with a plant should be seen as valuable for taking an
insight from the pathogen point of view in the interaction with its host.
Based on the presented EST dataset, a selection of genes will be studied by specific
deletion and used for the design of micro arrays experiments in order to contribute to a better
understanding of the host/pathogen interaction.
118
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300
200
Fig. 1. Amplification of the β-tubulin at 18, 23, 28 and 33 cycles using the substracted
and the unsubtracted cDNA population as matrix. The size of specific β -tubulin amplicon is
234 bp (arrow). M : molecular marker.
Metabolism
25%
Unclassified
42% Energy
4%
Cell cycle and

DNA processing
3%
Classification Transcription
not yet clear cut 6%
7% Protein Fate Protein
5% synthesis
8%
Fig 2. Distribution of the function of the EST according to the MIPS functional
catalogue. Percentages are calculated from the 441 unique identified mRNA sequences.
126
EST # Acc-FG Description Accession Expectation Reference

CWDE
difJ8e05 EAA67375 beta-glucosidase 5 [Coccidioides posadasii] AAL09829 1E-106
contig36 EAA69039 extracellular chitinase [Blumeria graminis] AAK84437 1E-107
difJ1f04 EAA69182 leucine aminopeptidase [Aspergillus sojae] AAN31395 1E-113
difJ8g05 EAA69544 beta-1,3-glucanosyltransferase [Paracoccidioides brasiliensis] AAP91684 1E-126
difJ8b11 EAA70592 exochitinase [Trichoderma harzianum] AAB47060 0 Draborg et al. (1995)
difJ7b06 EAA71508 endoglucanase, putative [Aspergillus fumigatus] CAF31975 1E-57 Foreman et al. (2003)
difJ6g12 EAA71669 extracellular elastinolytic metalloproteinase precursor [Aspergillus fumigatus] P46075 0 Jaton-Ogay et al. (1994)
difJac11 EAA73188 xylanase [Setosphaeria turcica] CAB52417 4E-073 Degefu et al. (2001)
difJ8h10 EAA74871 chain A, structure of two fungal beta-1,4-galactanases [Corynascus heterothallicus] 1HJS 1E-131 Le Nours et al. (2003)
contig35 EAA75374 trypsin precursor [Fusarium oxysporum] P35049 2E-099 Rypniewski et al. (1993)
difJag12 EAA76051 pectate lyase [Glomerella cingulata] AAA75471 7E-069
difJbd03 EAA76448 exopolygalacturonase [Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici] AAF12737 0 Posada et al. (2000)
contig80 EAA78230 endo-1,4-beta-xylanase (EC 3.2.8) [Humicola grisea] JC5861 1E-095 Iikura et al. (1997)
difJ8g01 EAA78248 related to alpha-L-arabinofuranosidase A precursor [Neurospora crassa] CAF05858 0 Koseki et al. (2003)
difJ2f12 EAA78281 prolidase (proline dipeptidase) [Emericella nidulans] CAC39600 1E-154
difJaa06 EAA78500 subtilisin-like serine protease PR1C [Metarhizium anisopliae var. anisopliae] CAD11898 0
difJ5c08 EAA78639 glucoamylase precursor[Neurospora crassa] XP_327956 1E-166 Hata et al. (1991)
Toxins
Trichothecene synthesis pathway
difJ1f12 EAA68538 monooxygenase [Fusarium sporotrichioides] AAO27751 8E-031 Brown et al. (2001)
contig119 EAA69768 reductase [Fusarium sporotrichioides] AAO27755 1E-125 Brown et al. (2001)
contig104 EAA69769 monooxygenase [Gibberella zeae] AAO34681 0 Brown et al. (2001)
difJ8e08 EAA78237 deacetylase [Cryptococcus neoformans var. neoformans] CAD10036 1E-018 Brown et al. (2001)
Aflatoxin pathway
contig77 EAA72210 O-methyltransferase [Aspergillus parasiticus] BAA86103 3E-058 Motomura et al. (1999)
difJ7g04 EAA75438 versicolorin b synthase-like protein, putative [Aspergillus fumigatus] AAC49318 1E-117 Silva et al. (1996)
Other toxins
contig117 EAA69779 PaxU [Penicillium paxilli] AAK11532 7E-061 Scott et al. (2001)
contig86 EAA70229 reductase RED1 [Cochliobolus heterostrophus] AAM88292 1E-083 Rose et al. (2002)
difJ1e03 EAA76520 methyltransferase required for diphthamide biosynthesis [Saccharomyces cerevisiae] NP_013273 1E-102
127
Other pathology related proteins

Manners J.M. personal
contig62 EAA68081 induced 3 days post infection - unknown [Glomerella cingulata] AAB92222 1E-034 communication
difJ1e01 EAA68682 carnitine acetyl transferase [Magnaporthe grisea] AAB88887 0 Sweigard et al. (1998)
contig1 EAA69530 aldehyde dehydrogenase; ALDH [Cladosporium fulvum] AAF82789 0 Coleman et al. (1997)
difJ3b03 EAA70055 probable SnodProt1 precursor [MIPS] [Neurospora crassa] XP_328493 1E-036
difJ7d10 EAA70685 NADPH oxidase 1 [Podospora anserina] AAK50853 0
contig100 EAA71148 CaNAG2 [Candida albicans] BAB43813 1E-072 Yamada-Okabe et al. (2001)
Perfect personal
difJ2h08 EAA71225 integral membrane protein [Blumeria graminis] AAL56992 9E-23 communivcation
difj8c01 EAA75690 integral membrane protein [Magnaporthe grisea] AAD30438 8E-22 DeZwaan et al. (1999)
difJ7d09 EAA76281 PAK kinase [Magnaporthe grisea] AAP93639 7E-051 Li et al. (2004)
difJ1g01 EAA76711 cutinase G-box binding protein [Nectria haematococca mpVI] AAB04132 0 Li et al. (1997)
Perfect E. personal
difJ4b08 EAA77986 integral membrane protein [Blumeria graminis] AAL56992 3E-013 communivcation
Table 1. EST from the subtracted library presenting homologies with pathology related proteins sorted by Acc – FG (accession of the
corresponding F. graminearum predicted protein).
128

Transporters
N source transporters
difJ1d10 acidic amino acid permease [Penicillium chrysogenum] AAS10167 1E-005 Trip et al. (2004)
contig89 EAA67186 acidic amino acid permease [Penicillium chrysogenum] AAS10167 1E-071 Trip et al. (2004)
difJ7d06 EAA70215 related to neutral amino acid permease [Neurospora crassa] CAE76088 5E-045
difJ3b12 EAA70514 GabA permease, putative [Aspergillus fumigatus] CAE47957 0 Hutchings et al. (1999)
contig107 EAA71470 neutral amino acid permease - [Neurospora crassa] S47892 2E-038 Koo et al. (1991)
difJ7e05 EAA72339 di/tri peptide transporter 2 [Phaeosphaeria nodorum] AAO31597 7E-098
difJ6b03 EAA72554 Amino-acid permease [Hypocrea lixii] P34054 0 Vasseur et al. (1995)
difJ7b09 EAA73508 plasma membrane carnitine transporter Agp2p [Saccharomyces cerevisiae] NP_009690 1E-105
difJ2c04 EAA75118 general amino acid permease Gap1p [Saccharomyces cerevisiae] S38111 1E-117 Trip et al. (2004)
difJ6e09 EAA75973 amino-acid permease [Schizosaccharomyces pombe] NP_595009 1E-101 Sophianopoulou et al. (1989)
difJ8e06 EAA75973 amino-acid permease [Schizosaccharomyces pombe] NP_595009 1E-101 Ivanova et al. (2003)
contig97 EAA76673 neutral amino acid permease [Neurospora crassa] S47892 1E-114 Koo et al. (1991)
difJad12 EAA78103 general amino acid permease; Gap1p [Saccharomyces cerevisiae] NP_012965 1E-136 Trip et al. (2004)
C source transporters
contig94 EAA68315 qinate permease [Neurospora crassa] XP_325881 2E-059 Geever et al. (19889)
difJ5g04 EAA68539 related to L-fucose permease [Neurospora crassa] CAD71039 8E-021
contig13 EAA69832 maltose permease [Aspergillus oryzae] BAB59002 1E-126
contig95 EAA71135 MSTA protein [Emericella nidulans] CAC80843 6E-054
difJ7f10 EAA72224 maltose permease [Aspergillus oryzae] BAB59002 1E-082
contig15 EAA74377 carboxylic acid transport protein [Metarhizium anisopliae] AAM19667 0
difJ6c03 EAA74464 hexose transporter [Aspergillus oryzae] BAC20337 3E-067
difJ5c02 EAA76686 maltose permease [Aspergillus oryzae] BAB59002 1E-114
difJ3c06 EAA78529 sugar phosphate permease [Schizosaccharromyces pombe] NP_596430 1E-076
Other transporters
difJ7c08 EAA67222 MIT family metal ion transporter PI066 [Schizosaccharomyces pombe] NP_595545 1E-099
difJ2c05 EAA67491 cation efflux family protein [Arabidopsis thaliana] NP_181477 7E-045
contig48 EAA67898 plasma membrane H+ ATPase [Neurospora crassa] AAA33563 0 Ferrol et al. (2000)
difJ5d11 EAA69954 putative MSF transporter [Schizosaccharomyces pombe] NP_595140 1E-141 Wright et al. (1996)
129
difJ1e05 EAA70159 outer mitochondrial membrane protein porin [Neurospora crassa] XP_323644 1E-103
difJ2b10 EAA70733 MFS transporter of unknown specificity [Schizosaccharomyces pombe] NP_593504 9E-053
difJ8h05 EAA71679 transport of pyridoxine; Tpn1p [Saccharomyces cerevisiae] NP_011329 1E-068 Ball et al. (1999)
difJ9g01 EAA72812 MFS transporter of unknown specificity [Schizosaccharomyces pombe] NP_593504 5E-065
difJ1f11 EAA73543 transporter, unknown specificity [Aspergillus fumigatus] CAE47906 1E-073
difJ6d01 EAA74343 ferrioxamine B transporter [Saccharomyces cerevisiae] NP_010849 1E-120
difJbg09 EAA74902 allantoate permease; Dal5p [Saccharomyces cerevisiae] NP_012686 1E-044
difJ5h11 EAA77343 sodium transport ATPase FST [Nectria haematococca mpVI] AAB04131 0
difJ9f11 EAA78294 choline transporter-related [Arabidopsis thaliana] NP_173921 4E-021
difj4f08 EAA78738 purine transporter [Emericella nidulans] CAE00849 0 Cecchetto et al. (2004)
Table 2. EST from the subtracted library presenting homologies with Transporter related proteins sorted by Acc – FG (accession of the
130

contig98 heat shock protein CLPA [Paracoccidioides brasiliensis] AAO73810 3E-073
contig57 EAA67128 heat shock protein 70 [Emericella nidulans] CAA67431 1E-119
difJ af11 EAA67391 low temperature requirement protein A [Bacillus cereus ATCC 14579] NP_832921 7E-006
difJ8a06 EAA67487 small heat shock protein [Chaetomium globosum] AAR36902 2E-057
difJ ae07 EAA67818 heat shock protein 78 [Leptosphaeria maculans] AAO49455 0 Idnurm et al. (2003)
difJ 6f03 EAA68554 dnaj protein [Schizosaccharomyces pombe] NP_594359 2E-010
contig99 EAA70431 HSP70 [Hypocrea jecorina] AAP40020 0
difJ 9d06 EAA72434 highly expressed on cellulase-inducing medium [Hypocrea jecorina] AAQ56234 2E-071 Curach et al. (2004)
difJ 9b07 EAA74718 70 kDa heat shock protein [Paracoccidioides brasiliensis] AAP05987 0
difJ 3d01 EAA75185 related to Hsp90 associated co-chaperone [Neurospora crassa] CAD21185 3E-006
contig66 EAA76137 against heat-induced protein aggregation [Saccharomyces cerevisiae] NP_116638 2E-060
difJ 2a10 EAA76757 Ydj1p heat shock protein [Saccharomyces cerevisiae] NP_014335 4E-099
difJ7a08 EAA76927 cross-pathway control protein 1 [Neurospora crassa] A30208 4E-042 Paluh et al. (1988)
difJ 9a10 EAA76934 COP9/signalosome complex subunit 7B [Schizosaccharomyces pombe] Q09722 5E-034
contig108 EAA77628 DNA damage-responsive protein 48 [Saccharomyces cerevisiae] NP_013897 9E-020
Table 3. EST from the subtracted library presenting homologies with stress related proteins sorted by Acc – FG (accession of the
131
IV. 2. 3. Extension du travail
L’article 3 présente la réalisation d’une banque suppressive soustractive. Les séquences

les plus remarquables par rapport aux aspects de la pathologie, du transport et du stress y sont
présentées en détail. La totalité des 537 EST uniques ainsi que le meilleur hit obtenu par
recherche d’homologie dans la banque de protéines non redondantes sont présentés dans
l’annexe 6.
Lors de ce travail deux EST ont montré des homologies avec des xylanases. La
comparaison de la traduction de ces deux EST avec les xylanases prédites a permis
d’identifier les EST contig80 et ac11 comme les xylanases 02 et 15. Ces deux xylanases font
partie des familles de glycoside hydrolases 10 et 11 respectivement. Elles sont les deux
xylanases les plus fortement exprimées sur milieu parois (Fig. 42). Ainsi il est possible de
supposer que les gènes correspondant aux EST trouvés dans la banque suppressive
soustractive sont les gènes les plus différentiellement exprimés. Les 9 autres CWDE trouvées
dans la banque soustractive sont donc potentiellement les représentants de chaque famille de
CWDE les plus exprimées lors de la culture de F. graminearum sur milieu parois. De plus le
singleton ac11, correspondant à la xylanase 15, montre des homologies avec les séquences
BM138109 et BM135798. Ces deux séquences sont des EST trouvées dans une banque de
cDNA de F. graminearum infectant des épis de blé. Nous pouvons donc supposer que la
xylanase 15 pourrait être fortement exprimée dans des conditions d’infection sans spécificité
de l’espèce hôte.
Les allergies d’origine fongiques sont de plus en plus importantes dans les pathologies
humaines provoquant asthmes et problèmes cutanés et intestinaux (Helbling, 2003). Trois
EST de la banque suppressive soustractive, 6f06, 8h02 et le contig93, présentent des
homologies avec des allergènes décrits chez l’homme (Achatz et al., 1995 ; Hoff et al., 2003).
132
IV. 2. 4. Conclusions et perspetives
L’analyse de la banque suppressive soustractive nous permet d’obtenir une vision

ponctuelle dans le transcriptome de F. graminearum. L’objectif visé était d’obtenir un aperçu
des familles de CWDE induites par les parois de houblon. 12 EST correspondant à des
CWDE ont été retrouvés. Parmi eux 2 xylanases correspondent aux xylanases 02 et 15
majoritairement exprimées sur milieu paroi. La xylanase 15 semble être une enzyme
importante car elle est également retrouvée dans une banque d’EST de F. graminearum
infectant des épis de blé. Une investigation plus poussée de cette enzyme semble prometteuse
dans la compréhension du mécanisme d’infection intervenant lors de la dégradation de la
paroi cellulaire de la plante.
Cependant le changement de source de carbone entre les deux conditions de culture
n’induit pas seulement des gènes dont le produit contribue à la dégradation de la source de
carbone et à son assimilation au sein de la cellule mais également des gènes induits dans des
conditions de déplétion et lors de pathologie. Le comportement du champignon sur le milieu
M3-CW semble similaire à celui qu’il adopte lors d’une infection. L’étude de cas d’infection
de houblon permettrait de confirmer cette hypothèse et donc de valider la culture de F.
graminearum sur paroi de houblon comme un modèle mimant une partie du processus
d’infection in-vitro.
133
Chapitre V – Conclusion et perspectives
134
V. 1. Identification et marqueurs phylogénétiques
Nous avons développé une méthode d’identification des espèces de Fusarium bipartite
décrite dans l’article 1. L’approfondissement des travaux avec le gène de la cbh-C a permis
d’étendre l’analyse CAPS sur ce gène et de définir des profils permettant d’identifier 11
espèces de Fusarium.
Dans l’article 2 nous avons décrit la validation du gène de la cellobiohydrolase-C et de
celui de la topoisomérase II comme marqueurs phylogénétiques sur une population locale de
Fusarium. La validation de ces deux gènes par rapport au cluster d’ADNr entérine l’approche
d’identification en utilisant l’un ou l’autre de ces marqueurs. L’extension de ce travail
consiste à élargir la population considérée à un plus grand nombre d’espèces couvrant les
différents complexes ainsi que les différentes lignées de chaque représentant.
Les frais de séquençage ainsi que la rapidité d’obtention des séquences ont
considérablement été réduits grâce à l’évolution des technologies. Ainsi l’identification peut
être réalisée rapidement par le séquençage direct des amplicons. Une base de données de
séquences de facteur d’élongation α de différentes espèces de Fusarium a récemment été mise
en place (Geiser et al., 2004). Les auteurs préconisent l’amplification d’un fragment de ce
gène suivi de son séquençage pour l’identification de Fusarium.
Le laboratoire assure le suivi des populations de champignons filamenteux présents sur
les plants de houblon en dépérissement grâce à la préparation rapide d’un grand nombre
d’échantillon d’ADN génomique (Phalip et al., 2004). L’identité des différents champignons
est déterminée par séquençage d’un amplicon correspondant à l’ITS 1, l’ADNr 5.8S et l’ITS2
et comparaison entre la séquence de ce dernier et les séquences contenues dans Genbank.
Cette approche permet d’identifier tous les genres répertoriés dans la base de données
publique. Cependant, en guise d’alternative et pour leur identification rapide, certains
individus présentant une couleur rose-orangée lors de culture sur milieu PDA sont testés pour
leur appartenance au genre Fusarium puis identifiés grâce à l’analyse CAPS qui reste peu
coûteuse. De plus cette analyse est utilisée couramment au laboratoire pour vérifier
rapidement l’identité du champignon utilisé dans différentes expériences.
135
V. 2. Génomique du champignon Fusarium graminearum
Le génome de F. graminearum a été rendu public en mars 2003 par le Whitehead

Institute (Cambridge, MA, USA).
Dès la publication du génome, nous avons cherché à identifier des gènes de CWDE.
Nous avons développé une approche basée sur l’analyse des ORF pour mettre rapidement en
place des outils de recherche. Ces outils ont été mis à disposition de la communauté
scientifique en septembre 2003. Ils sont régulièrement mis à jour en comparant les ORF aux
nouvelles versions de bases de données des protéines non-redondantes. Ces outils peuvent être
utilisés pour prédire n’importe quel type de protéine. L’annotation du génome a été mise en
place 7 mois après la publication du génome sur le site internet du Whitehead Institue en
octobre 2003.
Nous avons focalisé nos recherches sur la famille des xylanases. 27 régions contenant
des séquences codant pour ce type d’enzymes ont été localisées. Nous avons cherché à
confirmer les prédictions en clonant les séquences codantes des ARNm correspondant. 22
séquences codantes ont pu être clonées validant la prédiction des gènes correspondant et
faisant ainsi « accéder » chaque gène putatif au statut de gène transcrit. L’analyse fine des
séquences a révélé la présence de plusieurs familles de glycoside hydrolases. La prédiction de
la structure des xylanases 15 et 24 nous permet d’envisager des éléments d’ingénierie
protéique. Une modification est proposée dans le but de baisser le pH optimum de la xylanase
15.
Ce travail se poursuivra par le clonage dans un vecteur d’expression des 22 xylanases
prédites et leur surexpression. Il sera ainsi possible de caractériser biochimiquement les
enzymes et confirmer leurs activités enzymatiques vis à vis de différents substrats potentiels,
notamment le xylane. L’étude de la structure 3D des protéines par cristallisation est également
envisagée pour comprendre les mécanismes moléculaires en jeux lors des réactions
biochimiques mais aussi dans le but de pouvoir prédire des inhibiteurs par modélisation
moléculaire. Chaque famille de glycoside hydrolases possède une structure propre (Fig. 24),
le design d’inhibiteur spécifique à chaque famille permettrait d’engager des études de
pathologie en inhibant spécifiquement et sélectivement une famille.
136
V. 3. Transcriptomique du champignon Fusarium graminearum
Le transcriptome de F. graminearum a été exploré de deux manières. Le suivi de

l’expression des xylanases prédites dans différentes conditions de culture a constitué une
première approche. Une stratégie plus globale a été suivie par la réalisation et l’analyse d’une
banque différentielle d’ADNc.
Plusieurs types de profils d’expressions des xylanases putatives ont été mis en évidence.
L’étude de ces profils révèle différents mécanismes de régulation. Une première extension
d’un travail consistera à ajouter la dimension « temps » aux expériences déjà réalisées. Il
devra ainsi être possible de décortiquer la régulation fine de l’expression de ces gènes. Le
suivi d’induction sur d’autres substrats correspondant à différentes couches de la paroi
cellulaire des plantes comme la pectine est également envisagé.
L’induction forte sur le milieu paroi a conduit à classifier les xylanases en fonction de la
quantité de leur ARNm dans cette condition. Les xylanases les plus fortement exprimées dans
cette condition de culture appartiennent aux familles de glycoside hydrolases 10 et 11. Ce
constat nous laisse supposer leur implication majoritaire dans l’attaque de la paroi cellulaire
des plantes dont la composition et l’organisation est proche de celle existant chez le houblon.
L’étude du transcriptome par hybridation suppressive soustractive a permis de mettre
également en évidence l’induction forte des gènes des xylanases 02 et 15. De plus dans le cas
de la xylanase 15, des évidences expérimentales montrent que le gène de cette enzyme est
également induit dans des conditions d’infection d’épi de blé (Kruger et al., 2002).
L’étude plus poussée des xylanases 02, 15, 21 et 24 semble opportune vis à vis de leur
niveau d’expression et des évidences expérimentales. L’approche par famille envisagée sera
poursuivie, par l’étude de l’expression lors de conditions d’infection des autres CWDE mises
en évidence par la banque suppressive soustractive.
Outre plusieurs transporteurs, l’analyse des EST nous a permis de mettre en évidence de
nombreuses protéines impliquées dans la pathologie : celles dont leurs homologues ont
montré une implication dans les pathologies observées pour d’autres genres de champignons
ainsi que différents représentants des gènes du cluster de biosynthèse des trichothecènes. Le
milieu paroi induit donc un ensemble de gènes impliqués dans la pathologie. La mise en
évidence d’autres gènes potentiellement impliqués dans la pathologie pourrait être envisagée
en abordant le séquençage de clones supplémentaires. Ce séquençage s’effectuerait selon la
137
procédure des signatures DACS (Discriminative Analysis of Clone Signatures) permettant

ainsi la production de données dans une logique du haut débit.
Les deux stratégies d’approche du transcriptome nous permettent d’obtenir des gènes
candidats pour des études plus approfondies de l’interaction entre le champignon et la plante
au niveau de la paroi cellulaire. L’action des candidats sélectionnés, comme par exemple les
xylanases 02 et 15, pourra être étudiée plus en détails grâce à l’inactivation du gène
correspondant. Elle pourra être effectuée selon deux approches. La première consiste en une
interruption du gène (Gomez-Gomez et al., 2002). L’autre approche est basée sur le principe
des siRNA. Dans les champignons filamenteux le mécanisme de « silencing » est appelé
«quelling » (Catalanotto et al., 2004). Il est possible d’imaginer l’intégration de transgènes
exprimant constitutivement ou conditionnellement le complément de l’ARNm d’un gène
candidat. Ces approches sont à suivre avec la plus grande prudence de part les phénomène de
complémentation d’activité que l’on pourrait attendre des familles enzymatiques (Gomez-
Gomez et al., 2002).
L’étude du protéome de F. graminearum sur le milieu M3-CW est en cours au
laboratoire. Les résultats de l’analyse pourront être mis en parallèle des résultats obtenus par
la banque suppressive soustractive et confirmer et compléter ces derniers.
V. 4. Modèle d’étude Humulus lupulus / Fusarium graminearum
Le travail de cette thèse s’est majoritairement concentré sur l’un des partenaires du
modèle H. lupulus / F. graminearum dans l’optique de mettre en évidence des gènes candidats
à étudier pour décortiquer l’interaction des deux partenaires en se focalisant sur la dégradation
de la paroi cellulaire de la plante.
Des banques d’EST du houblon ont été réalisées et séquencées au laboratoire. La
collection d’EST de houblon créée au laboratoire contient la signature des principales PRP
(pathogenesis related proteins) mais aussi de nombreuses enzymes des voies de biosynthèse
spécifiques de cette plante.
L’étude plus poussée de l’interaction H. lupulus / F. graminearum est envisagée par une
approche d’analyse de transcriptome par microarrays. Une puce sera développée contenant
des séquences correspondant aux gènes candidats des deux organismes. Il sera ainsi possible
138
de suivre l’évolution en parallèle des gènes potentiellement impliqués dans la pathologie à

différentes étapes de l’infection et du dialogue hôte/pathogène.
Des travaux ont également été initiés en collaboration pour l’étude de l’action
phytopathogène de la souche de Fusarium graminearum caractérisée au laboratoire sur
d’autres plantes, en particulier des céréales.
139
Chapitre VI – Matériels et méthodes
140
Toutes les méthodes utilisées ne sont pas spécifiées dans ce chapitre. Les méthodes
spécifiques sont détaillées dans les différents articles.
VI. 1. Matériel Biologique
VI. 1. 1. Souche de F. graminearum
VI . 1. 1. 1. Description de la souche
La plantation de houblon de la variété Strisselspalt dans la parcelle Burgklamm sur le
ban de la commune de Gingsheim (Bas-Rhin, France) présente régulièrement des épisodes de
dépérissement dont celui de septembre 2000 fut foudroyant. D’une liane, de l’un des plants
malades de cette houblonnière, qui présentait une blessure, la souche de F. graminearum (F9)
étudiée au laboratoire a été isolée.
VI. 1. 1. 2. Conditions de culture

F. graminearum est maintenu sur milieu PDA (Annexe 1) à 25°C. La production de
spores est obtenue après culture sur milieu SNA (Annexe 1) à 25°C.
Les cultures en milieu liquide sont réalisées dans 10mL de milieu de culture dans des
tubes Falcon de 50mL. L’induction des gènes des xylanases est réalisée par la culture sur
milieu minimum M3 (Annexe 1) additionné de différentes sources de carbone à 10g.L-1. Les
différentes sources de carbone proviennent de Sigma-Aldrich. Les parois de houblon ont été
préparées en broyant des lianes, des feuilles et des cônes de houblon de la variété Strisselspalt
congelés dans l’azote liquide. La poudre obtenue est incubée pendant une heure sous agitation
forte à 21°C dans un tampon phosphate (1M, pH 7). Les parois ont ensuite été filtrées sur du
papier Whatman 3MM et rincées deux fois avec du tampon phosphate. Les parois sont lavées
successivement avec 4 volumes de différents solvants : 2 fois avec de l’eau, deux fois avec du
méthanol, deux fois avec du chloroforme/méthanol (1/1) puis avec du méthanol jusqu’à
l’absence de pigments dans la phase liquide. Deux lavages finaux sont réalisés avec de
l’acétone avant un séchage sous vide. Les parois ainsi préparées sont conservées à 4°C.
141
VI. 1. 1. 3. Conservation des spores

Les spores de F. graminearum sont induites sur milieu SNA et sont récoltées par lavage
de la boîte avec de l’eau stérile. Les spores sont conservées en suspension dans l’eau congelée
à –20°C.
VI. 1. 2. Souche bactérienne

La souche d’Escherichia coli TOP10 (F- mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15
∆lacΧ74 recA1 araD139 ∆(ara leu) 7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG) est utilisée au
laboratoire pour les travaux de clonage qui mettent en jeu des vecteurs plasmidiques.
VI. 2. Techniques de biologie moléculaire
VI. 2. 1. Extraction d’acides nucléiques
VI. 2. 1. 1. Extraction d’ADN plasmidique
Les plasmides sont préparés grâce au kit NucleoSpin® Plasmide de Macherey-Nagel

(Allemagne) selon le protocole du fournisseur. Les solutions de plasmides sont conservées
congelées à –20°C. La quantité est estimée par spectrométrie (mesure d’absorbance à 260nm).
VI. 2. 1. 2. Extraction d’ARN total

Le champignon est cultivé dans un milieu de culture liquide et récolté en phase de
croissance. Le champignon est séché rapidement sur du papier Whatman 3MM et congélé
aussitôt dans l’azote liquide. L’échantillon est broyé dans un mortier avec de l’azote liquide et
l’ARN est isolé grâce au kit Qiagen RNeasy® de Qiagen (Germany). La qualité de l’ARN est
visualisée sur un gel d’agarose. La quantité est estimée par spectrométrie (mesure
d’absorbance à 260nm).
L’ARN extrait est débarrassé de l’ADN résiduel par un traitement à la DNAse RNAse
free, Turbo DNA-free™ d’Ambion (USA).
VI. 2. 1. 3. Extraction d’ARN polyA+

La méthode de préparation des ARN poly A+ est décrite dans l’article 3.
142
VI. 2. 2. Southern blot
VI. 2. 2. 1. Préparation de la membrane

5µg d’ADN génomique du champignon sont digérés dans un volume réactionnel de
200µL pendant 2H. La digestion est précipitée avec un volume d’isopropanol et le culot est
repris dans 15µL d’eau. L’échantillon est déposé sur un gel d’agarose à 0,8% (w/v) et soumis
à une migration électrophorétique. Le gel est coloré à l’aide de bromure d’éthidium et
photographié sous UV (312 nm). L’ADN contenu dans le gel est transféré sur une membrane
de nylon chargée positivement (Roche Diagnostics, Meylan, France) par transfert ascendant.
VI. 2. 2. 2. Préparation de la sonde

Les sondes sont marquées de manière non radioactive à la digoxigénine (DIG, Roche
Diagnostics) (Fig. 43). L’incorporation est effectuée de manière aléatoire lors de la synthèse
par PCR. Le mélange réactionnel contient les différents nucléotides dans les concentrations
suivantes : 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP, 0,18 mM dTTP et 0,02 mM DIG-dUTP (Fig. 43). La
synthèse est vérifiée et quantifiée sur gel. Les sondes sont utilisées à une concentration finale
de 25,0 ng.mL-1 de tampon d’hybridation.
Fig. 43. Structure chimique de la Digoxigénine et de DIG-dUTP.
VI. 2. 2. 3. Hybridation et détection

L’hybridation et la détection sont réalisées selon le protocole DIG high Prime DNA
labeling and detection strater kit II de Roche Diagnostics. L’hybridation est réalisée dans le
tampon d’hybridation standard à une température de 65°C pendant la nuit. Les étapes de
détection utilisent un anticorps couplé à la phosphatase alcaline dirigé contre la digoxigénine
et du CSPD® comme substrat. Les émissions de bioluminescence se détectent avec des films
143
Kodak X-OMATTM (SIGMA) après un temps d’incubation adapté à chaque cas (de quelques
minutes à 2 h).
VI. 2. 3. Rétrotranscription et synthèse d’ADN complémentaire

La rétrotranscription puis la synthèse de l’ADNc ont été réalisées avec le kit de
Clontech à partir de 500ng d’ARN total (Fig 44). Le principe de la méthode réside dans
l’activité guanine terminale transférase de la MMLV-RT (Moloney Murine Leukemia Virus
reverse transcriptase) qui permet à un primer secondaire de s’apparier au premier brin
synthétisé provoquant un « switch » ou glissement de matrice de la MMLV-RT. On obtient
ainsi un premier brin bordé de séquences contenant des adaptateurs utilisables comme cible
pour des amorces de PCR.
Une adaptation a été apportée au protocole : la synthèse du premier brin d’ADN a été
réalisée à 48°C pendant une demi-heure puis la température a été abaissée à 42°C.
L’amplification du deuxième brin a été réalisée sur 17 cycles pour rester dans le domaine
linéaire d’amplification.
VI. 2. 4. Amplification d’acides nucléiques
VI. 2. 4. 1. PCR
L’amplification par PCR est réalisée avec la Taq polymérase de MBI fermentas
(Lithuanie). Le volume réactionnel est de 50µL, la concentration de MgCl2 est de 1,5mM, la
concentration de primer est de 1µM et la concentration de dNTP de 1µM. Les réactions de
PCR ont été réalisées sur un iCycler de Biorad.
Le programme d’amplification suivant a été utilisé pour l’amplification des différentes
xylanases : 95°C 5 min suivie de 35 cycles de 95°C 30 sec, 53°C 35 sec, 72°C 95 sec et
conclu par une extension finale de 2 min à 72°C. La liste des amorces (primers) utilisées pour
l’amplification des séquences codantes des xylanases prédites se trouve en Annexe 3.
144
Fig. 44. Déroulement de la synthèse d’ADNc par la technique SMART™.

Source : Clontech.
VI. 2. 4. 2. Q-RT-PCR
10ng d’ADNc ont été mis en jeu pour la quantification. Elle a été réalisée sur un
thermocycleur Applied 7000 SDS de Applied Bioscience (Royaume-Uni) dans un volume
réactionnel de 25µL avec le mix SYBR Green ® PCR Master Mix (Applied Biosystem,
Royaume-Uni). Les primers ont été utilisés à une concentration finale de 250nM. Toutes les
mesures ont été réalisées trois fois. La spécificité d’amplification a été contrôlée par
évaluation des courbes de fusion. La liste des primers utilisés pour la quantification se trouve
en Annexe 3.
L’analyse des résultats a été effectuée à l’aide du logiciel fourni avec l’appareil. La
valeur seuil pour la détermination des Ct a été réglée à 0,1. A cette valeur, ce seuil était dans
la zone d’amplification linéaire quelle que soit la concentration de matrice présente dans les
différents échantillons.
145
VI. 2. 5. Clonage
VI. 2. 5. 1. Clonage rapide

Le clonage des produits de PCR a été réalisé avec le kit TOPO TA Cloning kit
(Invitrogen, Pays bas).
La méthode nécessite l’utilisation d’un vecteur pré-activé. Deux topoisomérases de type
I sont liées à chaque extrémité du vecteur. Les extrémités T cohésives permettent l’insertion
du produit de PCR présentant les extrémités 3’ A cohésives obtenues lors de la réaction de
PCR grâce à l’activité adénosyl terminale transférase des Taq polymérases (Fig. 45).
VI. 2. 5. 2. Clonage des EST

Le nombre de clones obtenus avec le kit TOPO TA Cloning kit se situe entre 100 et
300. Ce système est incompatible avec l’obtention d’un grand nombre de clone dans le cas de
banque d’EST.
Une méthode basée sur la présence d’extrémité T cohésives a été développée au
laboratoire. Elle a été employée pour préparer un vecteur de clonage pour la réalisation de la
banque suppressive soustractive. 3µg du vecteur pUC19 ont été digérés à l’aide de 100U de
l’enzyme de restriction HincII dans un volume de 100µL à 37°C pendant 2h30. Le vecteur
digéré a été purifié à l’aide du kit Geneclean® Spin kit de Bio101 (Qbiogen, France). Une
extension d’une base a été réalisée en présence des 3µg de vecteur digéré, de 500pmol de
ddTTP et 2U de TDT (Terminal Desoxynucleotide Transferase) dans un volume réactionnel
de 20µL à 37°C pendant 1h. Le produit d’extension a subi une purification à l’aide du kit
Geneclean® Spin kit de Bio101. L’éfficacité de l’extension est testée par ligation du vecteur
sur lui même. 50ng de vecteur sont utilisés par ligation.
VI. 2. 6. Mise en évidence de protéines

Les techniques SDS-PAGE et Western blot nous ont permis de mettre en évidence la
cellobiohyrdrolase-C ; elles sont décrites dans l’article 1.
146
Fig. 45. Principe du vecteur activité du kit TOPO TA cloning.

Source : Invitrogen
VI. 3. Bio-informatique
VI. 3. 1. Analyses de séquences

Les ORF ont été prédites avec le programme GETORF d’EMBOSS (v2.7.1) en incluant
l’option -minsize 300 qui précise au programme que nous ne voulons que les ORF d’une
taille en nucléotides supérieure à 300 pb.
Les recherches d’homologies sont effectuées en comparant les séquences aux bases de
données de séquences par le programme BLAST (Altschul et al., 1997).
Les recherches d’homologie des ORF ont été effectuées avec la version 2.2.6 du
programme BLAST contre la version d’août 2003 de la banque de données de protéines
(GenBank CDS translations + PDB + SwissProt + PIR + PRF). Le paramètre d’expectation a
été placé à 10-3.
VI. 3. 2. Analyses phylogénétiques

Les analyses phylogénétiques ont été effectuées à l’aide du logiciel PAUPv4.0b10 selon
la démarche décrite dans l’article 2.
147
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in heterothallic, homothallic, and asexual gibberella/fusarium species, Fungal Genetics and
Biology, Volume 31, Issue 1, 2000, Pages 7-20.
154
Annexes
Annexes
155
Annexes
Annexe 1 – Milieux de culture
Milieu PDA (Potato Dextrose Agar)

Composants pour 1L : 200g de pomme de terre, 20g d’agar, 15g de dextrose.
Les pommes de terres doivent être découpées en cubes de 12mm en gardant la peau et
rincées sous l’eau. Elles sont cuités pendant une heure dans un litre d’eau. Elles sont ensuite
mélangées avec l’agar et le dextrose dans un blender. Le milieu est ensuite autoclavé pendant
20 min à 121°C.
Milieu SNA (Syntheticher Nährstof Agar)

Composants pour 1L : 1g de KH2PO4, 1g de KNO3, 0,5g de MgSO4-7H2O, 0,5g de KCl,
0,2g de glucose, 0,2g de saccharose, 15g d’agar.
Les composants sont mélangés puis le milieu est autoclavé pendant 20 min à 121°C.
Milieu M3
Composants : 2g de NaCO3, 0,1g de KCl, 0,1g de MgSO4-7H2O, 0,4mg de CuSO4,
0,8mg de FeSO4-7H2O, 0,8mg de Na2MoO4-2H2O, 8mg de ZnSO4-7H2O, 0,04mg de
Na2B4O7-10 H2O, 0,8g de MnSO4-H2O, 1,4g de KH2PO4 et 0, 68g de K2HPO4.
Les composants sont mélangés ainsi que la source de carbone à 10g.L-1. Le milieu est
ensuite autoclavé pendant 20 min à 121°C.
156
Annexes
Annexe 2 – Famille de fongicides et leur cibles.
FONGIDES AFFECTANT LES PROCESSUS RESPIRATOIRES

Site D’ACTION ET/OU EFFET S Action Remarques
Famille chimique C
• Sous–famille P
Substance active (année)
Multi-sites
INHIBITION DE LA GERMINATION DES SPORES
produits minéraux
cuivre C P
soufre C P/É
dérivés du benzène
chlorothalonil ou TCPN (1964) C P
carbamates
• dithiocarbamates
mancozèbe (1961), manèbe (1958), métirame-zinc (1958),
propinèbe (1963), thirame ou TMTD (1942), zinèbe (1943), zirame C P
( ?)
métam-sodium (1951) - - fumigant
chlorométhyl-mercaptans
• phtalimides (dicarboximides)
captane (1952), folpel (1952) C P/C
• sulfamides
dichlofluanide (1964), tolylfluanide (1967) C P
guanidines
doguadine (1957), triacétate de guazatine (1968) C P
quinones
dithianon (1963) C P
hétérocycles divers
• quinoléines
hydroxyquinoléine ou oxyquinoléine (?) ? ? désinfectant
oxyquinoléate de cuivre C P
• triazines
anilazine (1955) C P
hétérocycles soufrés
• thiadiazines
dazomet (1897) - - fumigant
Chaîne respiratoire
INHIBITION DU COMPLEXE II (SUCCINATE-UBIQUINONE
RÉDUCTASE)
amines, amides
• anilides ou phénylamides
carboxine (1966), flutolanil (1981), oxycarboxine (1966) S P/C Spécifique des basidiomycètes
mépronil (1979) S P Spécifique des basidiomycètes
Chaîne respiratoire
INHIBITION DU COMPLEXE III (UBIQUINONE-
CYTOCHROME C RÉDUCTASE)
hétérocycles azotés
• oxazolidinediones
famoxadone (1996) Cu P Se fixe sur le site Qo entre celui du
myxothiazole et celui du stigmetalin
• imidazolinones QOI (inhibiteur de la respiration

fenamidone (1999) C P/C mitochondriale)
• strobilurines
azoxystrobine (1992), S P/C/É
krésoxim-méthyl (1992) C P/É
trifloxystrobine (1998) P P/C/É Circulation mésostémique
Site D’ACTION ET/OU EFFET S Action Remarques
Famille chimique C
• Sous–famille P
Substance active (année)
157
Annexes
PHOSPHORYLATION OXYDATIVE
amines, amides
• pyridylamines
fluazinam (1993) C P découpant
dérivés du phénol
dinocap (1960) C P/É découpant – spécifique des oïdiums
organo-stanniques Inhibiteurs de la phosphorylation
fentine-acétate (1954), fentine-hydroxyde (1954) C P oxydative
FONGICIDES AGISSANT SUR LES MICROTUBULES
COMBINAISON AVEC LA TUBULINE
carbamates
• phénylcarbamates
diéthofencarbe (1986) S P/C actif sur souches résistantes aux
benzimidazoles
• benzimidazoles
bénomyl (1968) S P/C précurseur de carbendazime-sans
effet sur les Oomycètes
carbendazime (1973) S C sans effet sur les Oomycètes
thiabendazole (1964), thiophanate-méthyl (1970) S P/C sans effet sur les Oomycètes
FONGICIDES STIMULATEURS DE DEFENSES NATURELLES
hétérocycles soufrés
• benzothiadiazoles
acibenzolar-méthyl (1999) S P
FONGICIDES AFFECTANT DES BIOSYNTHÈSES
Biosynthèse des stérols (IBS du groupe II)
INHIBITION DE LA ∆8→∆7 ISOMÉRASE ET/OU DE LA ∆14
RÉDUCTASE
amides, amines
• spirocétalamines
spiroxamine (1999) S P/C/É sans effet sur les Oomycètes
• morpholines
dodémorphe (1965), fenpropimorphe (1979) S P/C sans effet sur les Oomycètes
tridémorphe (1969) S É/P sans effet sur les Oomycètes
• pipéridines
fenpropidine (1986) S P/C sans effet sur les Oomycètes
Biosynthèse des stérols (IBS du groupe I)
INHIBITION DE LA 14-α DÉMÉTHYLATION DES
STÉROLS (IDM)
amines, amides
• formamides
triforine (1969)
hétérocycles azotés S P/C sans effet sur les Oomycètes
• imidazoles
imazalil (1973)
S P/C sans effet sur les Oomycètes
prochloraze (1977), prochloraze-manganèse (1977)
P P/C sans effet sur les Oomycètes
• pyridines
pyrifénox (1986)
S P/C sans effet sur les Oomycètes
• pyrimidines
fénarimol (1975) S P/C/É sans effet sur les Oomycètes
nuarimol (1980) S P/C sans effet sur les Oomycètes
• triazoles
azaconazole (1983), bromuconazole (1990), diniconazole (1983), S P/C sans effet sur les Oomycètes
fluquinconazole (1992), flusilazole (1984), flutriafol (1983),
metconazole (1992), myclobutanil (1986), penconazole (1983),
propiconazole (1979), triticonazole (1988)
C P/C sans effet sur les Oomycètes
bitertanol (1979)
cyproconazole (1986), époxiconazole (1993), fenbuconazole S P/C/É sans effet sur les Oomycètes
(1988), hexaconazole (1986), tébuconazole (1986), tétraconazole
(1988), triadiméfon (1973), triadiménol (1978)
158
Annexes
Biosynthèse de l’ARN
INHIBITION DE L’ARN-POLYMÉRASE I
amines, amides
• phénylamides ou anilides S P/C Spécifique des Oomycètes
bénalaxyl (1981), furalaxyl (1977), métalaxyl (1977), ofurace * p Spécifique des Oomycètes
(1992), oxadixyl (1983)
méfénoxam (1998)
Biosynthèse de l’ARN
INHIBITION DE L’ADÉNOSINE-DÉSAMINASE I
• (hydroxy) pyrimidines
bupirimate (1975), éthyrimol (1974) S P Spécifique des oïdiums
FONGICIDES DONT LE MODE D’ACTION N’EST PAS ÉLUCIDÉ OU MULTIPLE
ALTÉRATION DES MEMBRANES CELLULAIRES, ACTION
SUR LA CROISSANCE MYCÉLIENNE, LA PRODUCTION DE
SPORANGES ET GERMINATION DES OOSPORES DES
PHYCOMYCÈTES
carbamates
propamocarbe HCI (1978) S P Spécifique des Oomycètes
ALTÉRATION DES GLUICIDES ?
INHIBITION DE LA GERMINATION DES SPORES ET DE
L’ÉLONGATION DES HYPHES MYCÉLIENS
dérivés du benzène
quintozène ou PCNB (1930) C P
dicarboximides ou imides cycliques
chlozolinate (1980), iprodione (1974), vinchlozoline (1975) C P/C
dicarboximides ou imides cycliques (suite)
procymidone (1976) C/P P/C
• (phényl) pyrroles
fenpiclonil (1988), fludioxonil (1993) C P
organo-phosphorés
• phosphates
tolclofos-méthyl (1982) C P
INHIBITION DE LA BIOSYNTHÉSE DES ACIDES
NUCLÉIQUES DES LIPIDES ET DES ACIDES AMINÉS
MODIFICATION DE LA PERMÉABILITÉ CELLULAIRE ET
STIMULATEURS DES DÉFENSES NATURELLES
amines, amides
• acétamides, cyanooximes
cymoxanil (1976) P P/C Spécifique des Oomycètes :
Péronosporales
• isoxazoles
hyméxazol (1966) S P/C
MALFORMATION DES PAROIS CELLULAIRES
• morpholines
diméthomorphe (1988) S/P P/C Spécifique des Oomycètes
EFFET ANTIPHOSPHATE ET INDUCTEUR D’ÉLICITEURS,
STIMULATEUR DES DÉFENSES NATURELLES
organo-phosphorés
• phosphonates
fosétyl-Al (1977)
BIOSYNTHÈSE DES MÉLANINES S P
• triazines
triazoxide (1982)
organo-phosphorés C P/C Spécifique de l’helminthosporiose
• phosphates
pyrazophos (1969)
S P/C Spécifique des oïdiums et de
l’helminthosporie action sur le
• phosphonates processus respiratoire et sur la
ampropylfos (?) synthèse des phospholipides
? ? Spécifique de l’helminthosporiose
159
Annexes
INHIBITION DE L’ÉLONGATION DES TUBES

GERMINATIFS ET DES HYPHES MYCÉLIENS
• anilinopyrimidines
cyprodinil (1994) S P/C
pyriméthanil (1992) P C
amines, amides
• (hydroxy) anilides
fenhexamid (1997) C P Spécifique de Botrytis, Monilia,
Sclerotinia
INHIBITION DE LA GERMINATION ET DE LA FORMATION
DES APPRESSORIA
• (phénoxy) quinoléines
quinoxyfène (1996) C/P P Spécifique des oïdiums
phénylurées
pencycuron (1981) C P Spécifique de Rhizoctonia solani
160
Annexes
Annexe 3 - Liste des amorces

Les séquences sont décrites de leur extrémité 5’ vers leur extrémité 3’
Amorces utilisées pour l’amplification des séquences codantes des xylanases :

>xyl1-5
ATG CCT TCC AAG TCC ATC CTC G
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl1-3
CTA AAC CTG CAC AGC CTT ACC AG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl2-5
ATG AAA GCC GCC GGC AAG AAG TAC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl2-3
CTA CGA GTT GTT AGT ATA GAT AAT AAC C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl3-5
ATG TCT TGG TCT TTT CGC TC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl3-3
TTA CTA GAT GGC CAT CAA GAT CAC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl5-5
ATG CCC CGA CTT GAC GTC AAC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl5-3
TCA AGC AGA GTT ATC CAC TCT G
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl7-5
ATG GTC AAA GCA AAG TCT TGG G
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl7-3
TTA CTT AAA CTG CCA CCA ATT GAC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl9-5
ATG TGC CTC TGT GCA TCG TCA C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl9-3
CTA CCT ACA AGT TAC TTT CTT C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl10-5
ATG CGT TTT TTC TCC ATC CCT AG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl10-3
TTC TCA TCA TGG TAA GGG CCT AGG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl13-5
ATG AAT CGG GCG TCT TCA CAA C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl13-3
CTA TTC TAT CCA TTT GTT CTG CC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl14-5
ATG ATG AGT GTC CTC GCT CTC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl14-3
TTA TTT GCC ATA CTT TGC AAC AAC C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
161
Annexes
>xyl15-5
ATG GTC TCC TTC ACC TAC CTT CTC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl15-3
TTA TCC AGA GAC AGT CAT GGT AG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl16-5
ATG CGA ACC TCT ACT CTT TTG ACG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl16-3
CTA GCA GGT CTC AGC AAA GCT GTC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl17-5
ATG CAC AAA TCT GCC CTC ATC GG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl17-3
TCA TCG TCG CCA TCG TAG ACG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl18-5
ATG CTC CTA CAT TTC AAG TCT CTG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl18-3
CTA TGC ACC AAA AGC ACT CAT AAG C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl19-5
ATG GTC TCG TTC AAA TCC CTT CTC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl19-3
TTA ACT AGT CTG GAC ATA GAT AGA AG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl21-5
ATG CAC TTC CTA GGA CTC GTC G
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl21-3
TTA GTT GAG GGC GTT GCT CAC AG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl24-5
GAA GTT CTC TTC CCT CCT CTT TAC C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl24-3
TTA ACG GAG AGC GTT GAC AAC AGC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl25-5
CAT CAT GGT TTC CTG GAA TAA CAT C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl25-3
CTA TTT GGA AGG CTC CGC AAA CTG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl26-5
ATG AAG CTC CTC AAC AAC GAC ATC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl26-3
TTA CTT CTT GAG GGT CAA CAG ACC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl27-5
ATG CTT CTC ACG TCT CTC CTC TTC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl27-3
CGG TTT AAG CCT TAA CAA AAA CTC C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
162
Annexes
>xyl28-5
ATG ACG GGC TTC AAG AAG AGC G
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl28-3
CTT ATC GGT TAT CAA ATC TCT CAA CC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl29-5
ATG GCA TCA TTC AAG ACA TCC TCC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl29-3
TCA AAG ACA CTG CCA GTA GTA CTC G
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl30-5
CAT GCG TTT CTC TTC CAC TA TTAG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl30-3
TCA GAG ACA CTG CGA GTA CCA C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl32-5
ATG GCG CCT CTC ATC ACC AAC G
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl32-3
CTC TAG TCG GCT GTA GTG GTA ATG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl33-5
ATG CCT CAA GTC AGG AAC CCA ATT C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl33-3
TCA TAC CTG TCC GAA TCA TCA TGA AC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl34-5
ATG AAG TCC AAG TTG TTA TTC CCA CTC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl34-3
TCA AGG CTT CTT TGT CAA GAT CTT TCC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl35-5
ATG TCG CCT TCT AAC CCC ATT ATC C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl35-3
ATC CAT TTA CTC CAC ATT GAA ATC GG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl36-5
CAT GCT TTC ACG CTA TAT CCT CC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl36-3
CTA AGG TGC CGC CTG GGC TG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
163
Annexes
Liste des amorces utilisées en PCR quantitative :

>betatubQ-5
TGT TGA TCT CCA AGA TCC GTG AGG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>betatubQ-3
GGT AGT TCA GGT CGC CGT AAG AGG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>cbhQ-5
GAC TCT TGC GGT GGA ACC TAC TCC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>cbhQ-3
TTG GAC TCA GAG TTG GCA ATG ACC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl01Q-5
GCC GAC ATC GAG GTC CTC ACC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl01Q-3
GCC AGA GCT CCT TGT CGT TGA CC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl02Q-5
ATG TCG ACG TTG CCT ACA CTG AGC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl02Q-3
GAC GGC TTC TTG TTG AAG TTG TCG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl03Q-5
CTT CAG ACA CGT TCC TCA CCA TGC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl03Q-3
AGG ATC TCA ATG TCG GCT TCT TGC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl05Q-5
TCG AAC AAG ATA CTC TTC CAG GAG ACG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl05Q-3
CTA TTG CTC CAC CTT CGT CCT TCG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>X7-Q2-5
CAA GTC GCT TCT CGC AAT GG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>X7-Q2-3
TCG TCG ATG AAG ACC GTT GG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl09Q-5
CCT ATA ACG GCA CTG GTG AGA TTG G
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl09Q-3
TAG TTG TTG GCG CTG TAG GTG AGC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl13Q-5
CAA GTC GAA TTC GCC ATC CTT GG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl13Q-3
AGC GTT AAC CAC AGG CAC AAC AGG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl14Q-5
TGA TGA GTG TCC TCG CTC TCT TGG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
164
Annexes
>xyl14Q-3
GGT ACC GAC ATT ACT CGT CAA GAC TGG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl15Q-5
GTC ACC TAC ACC AAC GGC AAC G
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl15Q-3
GGT TGT AGG TGC CGA AGT TCT CG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl16Q-5
TCT TGC GGT AAC TGT AAG GAC AAT GG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl16Q-3
TGG ACA GCT TAG TTG GCT CAC TGC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl17Q-5
ACA aCG GCT ACC TCA GCG ATT CC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl17Q-3
GCA GAG AAC TTG CCA GCA GAG ACC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>X18-Q2-5
TGC TCA GCG ACA CGT CAA GG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>X18-Q2-3
GCG CGA TGT CTT GCT GTC C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl19Q-5
CGA ACC ATC AAC TAC GGA GGT TCC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl19Q-3
GTC GAT CGA AGG CTG TTG GTA ACG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl21Q-5
CAA CCT CGA TAT CGC CAA CTA CGC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl21Q-3
ATG TCA AGC TCG GTA ATG GCA ACC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>Xyl24-Q2-5
CCA GAT GAA GAA CGC CAT CG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>Xyl24-Q2-3
AGG CAA TGC CAA CGA ACT CC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>X25-Q2-5
GAC CAA CCT GCA GCT CTC TCG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>X25-Q2-3
TGT GAA CGC TGT CCG GTA AGG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl26Q-5
CCG TCC AGG TCT ACT CTG TCA AGG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl26Q-3
GAA GGT CTC GTC GTT GGA GGT ACG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl27Q-5
GTC TCA TCA GCC ATG TCT GGA ACC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
165
Annexes
>xyl27Q-3
TGT CAC AGG ATC ACT CCA GCT TGC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl28Q-5
TGA ACA GCG AAG TCA AGG AAC AGG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl28Q-3
AGG AGA TCC AGC TCT AGG CAC AGC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>X30-Q2-5
CCA CCG GCC TCG ACA TCT AC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>X30-Q2-3
CCT CCA TAC CGT CGG TGA GC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl32Q-5
CAA CGA CAA TGG CGA TCA GTA CG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl32Q-3
GCT TGT CAC CGA CAG CAA CAC C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl33Q-5
TCT ATC TCA CCG TGA CAG CTC ATG C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl33Q-3
GAC AAC AGC GAA GCA TCA TAC ACG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl34Q-5
CGC GAC ATG CTC ATT CTT GAC C
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl34Q-3
GAG TGA GTA GTC CAG CCA TCA ACT GG
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl35Q-5
AGC TGT GGA AGG CGT CGA TTA CC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
>xyl35Q-3
GCG GTG TTC ATC CTT GTA TGA TGC
... ... ... |.. ... ... .|. ... ... ..|
166
Annexes
Annexe 4 – Diagramme de Ramachandran
In a polypeptide the main chain N-Calpha and Calpha-C bonds relatively are free to
rotate. These rotations are represented by the torsion angles phi and psi, respectively.
G N Ramachandran used computer
models of small polypeptides to systematically
vary phi and psi with the objective of finding
stable conformations. For each conformation,
the structure was examined for close contacts
between atoms. Atoms were treated as hard
spheres with dimensions corresponding to their
van der Waals radii. Therefore, phi and psi
angles which cause spheres to collide
correspond to sterically disallowed
conformations of the polypeptide backbone. In
the diagram above the white areas correspond to conformations where atoms in the
polypeptide come closer than the sum of their van der Waals radi. These regions are sterically
disallowed for all amino acids except glycine which is unique in that it lacks a side chain. The
red regions correspond to conformations where there are no steric clashes, ie these are the
allowed regions namely the alpha-helical and beta-sheet conformations. The yellow areas
show the allowed regions if slightly shorter van der Waals radi are used in the calculation, ie
the atoms are allowed to come a little closer together. This brings out an additional region
which corresponds to the left-handed alpha-helix.
L-amino acids cannot form extended regions of left-handed helix but occassionally
individual residues adopt this conformation. These residues are usually glycine but can also
be asparagine or aspartate where the side chain forms a hydrogen bond with the main chain
and therefore stabilises this otherwise unfavourable conformation. The 3(10) helix occurs
close to the upper right of the alpha-helical region and is on the edge of allowed region
indicating lower stability.
Disallowed regions generally involve steric hindrance between the side chain C-beta
methylene group and main chain atoms. Glycine has no side chain and therefore can adopt phi
and psi angles in all four quadrants of the Ramachandran plot. Hence it frequently occurs in
turn regions of proteins where any other residue would be sterically hindered.
167
Annexes
Annexe 5 - Calcul de Q-RT-PCR relative
Méthode pour la quantification relative :
La formule (1) décrit l’amplification exponentielle de la PCR :
(1)
Avec Xn : nombre de molécule au cylce n ; X0 : quantité initale de molécules ; Ex :
efficacité de l’amplification de X et n : nombre de cycles
Le cycle seuil est le nombre de cycle nécessaire pour arriver à une quantité définie
d’amplicon.
(2)
Avec XT : nombre de molécules au seuil ; CT,x : nombre de cycles pour atteindre le seuil
et Kx : une constante
Une équation similaire peut être établie pour le gène de référence :
(3)
Avec RT : nombre de molécules références au seuil, R0 : nombre de molécules de
référence initiales ; ER : efficacité de l’amplification de la référence ; CT,R : nombre de cycles
pour atteindre le seuil, KR : une constante.
La division de l’équation (2) par l’équation (3) permet d’obtenir l’expression suivante :
(4)
En supposant que les efficacités de réaction sont identiques : Ex = ER = E On peut
simplifier l’équation (4) :
(5)
168
Annexes
Il est possible de réarranger la formule (5) en :
(6)
Avec XN : X0/R0 quantité de cible normalisée par rapport à la référence ; ∆CT = CT,x -
CT,R la différence des cycles seuils pour la cible et la référence.
La division de XN pour n’importe quel échantillon (q) par le XN du gène dans la

condition de calibration (cb) donne :
(7)
Avec ∆∆CT = CT,q - CT,cb
L’efficacité d’amplification dans les conditions optimales pour la PCR quantitative

(taille de l’amplicon < 150bp) est proche de 1. Ainsi la formule simplifiée pour le calcul de la
quantité relative d’une cible par rapport à une référence peut être calculée par :
2-∆∆CT
La demonstration de la formule de calcul souligne deux éléments :

- Les efficacités sont supposées être identiques : il convient donc pour valider la
méthode de calcul de prouver que la supposition est vraie.
- L’évaluation résulte de la division d’une quantité dans la condition à tester par
une quantité dans une condition de calibration : la condition de calibration n’a
pas le droit d’être égale à zéro sinon le calcul n’est pas autorisé.
169
Annexes
Annexe 6 – Liste des 537 EST de la banque suppressive soustractive
Le tableau suivant contient les 537 EST uniques de la banque suppressive soustractive.
Le numéro d’accession de la protéine prédite à partir du génome de F. graminearum
correspondante est indiqué (Acc Fg). De même que la base de donnée (bdd), le numéro
d’accession (Acc Hit) et la description (Description du Hit) du meilleur hit lors de la
recherche d’homologie sur la banque non-redondante de protéines. Les valeurs de
l’expectation (E-value) ainsi que du score (Score) sont indiquées. Lorsque la protéine prédite
a été utilisée pour identifier l’EST les cases correspondant aux valeurs d’expectation et aux
scores sont laissées vides.
Le tableau a été classé en fonction des numéros d’accession des protéines prédites de F.
graminearum.
170
Annexes
Tableau EST
Clone ID Acc FG bdd Acc Hit Description du hit E-value Score

contig57 EAA67128 emb CAA67431 heat shock protein 70 [Emericella nidulans] 1E-119 429
difj9h03 EAA67128 emb CAA67431 heat shock protein 70 [Emericella nidulans] 1E-119 429
difj8h02 EAA67154 gb AAL79931 thioredoxin-like protein [Fusarium culmorum] 1E-56 219
difj9h01 EAA67154 gb AAL79931 thioredoxin-like protein [Fusarium culmorum] 1E-56 219
difjae09 EAA67154 gb AAL79931 thioredoxin-like protein [Fusarium culmorum] 1E-56 219
difj9c10 EAA67169 pir T49507 probable 26S proteasome regulatory particle chain RPT1 imported – [Neurospora crassa] 1E-97 357
difj9a03 EAA67186 gb AAS10167 acidic amino acid permease [Penicillium chrysogenum] 1E-71 271
contig89 EAA67186 gb AAS10167 acidic amino acid permease [Penicillium chrysogenum] 1E-71 271
difjab12 EAA67203 ref NP_011290 May regulate Golgi function and glycosylation in Golgi; Vrg4p [Saccharomyces cerevisiae] 5E-19 95
difj7c08 EAA67222 ref NP_595545 MIT family metal ion transporter PI066 [Schizosaccharomyces pombe] 1E-99 365
difjbh04 EAA67278 emb CAE47879 chord containing protein homologue, putative [Aspergillus fumigatus] 2E-23 79
difj2c07 EAA67314 T49729 zinc finger protein 1 homolog [imported] - [Neurospora crassa] 1E-13 520
difj5a08 EAA67362 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
difj8e05 EAA67375 gb AAL09829 beta-glucosidase 5 [Coccidioides posadasii] 1E-106 387
difjaf11 EAA67391 ref NP_832921 Low temperature requirement protein A [Bacillus cereus ATCC 14579] 7E-06 55
contig5 EAA67394 emb CAB99181 related to long-chain-fatty-acid-CoA ligase FAA2 [Neurospora crassa] 3E-40 164
difj5b07 EAA67405 ref NP_596229 fibrillarin. [Schizosaccharomyces pombe] 4E-92 339
difj3e06 EAA67409 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
contig56 EAA67447 gb AAM95965 ESDC required for sexual development [Aspergillus nidulans] 4E-43 176
difj8a06 EAA67487 gb AAR36902 small heat shock protein [Chaetomium globosum] 2E-57 223
difj2c05 EAA67491 ref NP_181477 cation efflux family protein [Arabidopsis thaliana] 7E-45 184
difj9f01 EAA67498 ref NP_982784 ABL163Wp [Eremothecium gossypii] deshydrogenase 8E-72 272
difj4g12 EAA67500 emb CAD20227 cytidine deaminase [Methylobacterium chloromethanicum] 2E-04 37
difj3g10 EAA67547 ref NP_767769 bll1129 [Bradyrhizobium japonicum] oxydoreductase 1E-161 571
contig101 EAA67582 emb CAD37155 putative 3-oxoacyl-[acyl-carrier protein] reductase [Aspergillus fumigatus] 1E-28 127
difj6c06 EAA67584 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
difj6f05 EAA67594 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
difj3f11 EAA67600 ref NP_596685 carbamoyl-phosphate synthase [Schizosaccharomyces pombe] 1E-80 300
171
Annexes

contig37 EAA67671 ref XP_323671 60S RIBOSOMAL PROTEIN L5 (CPR4) [Neurospora crassa] 5E-37 154
contig78 EAA67671 ref XP_323671 60S RIBOSOMAL PROTEIN L5 (CPR4) [Neurospora crassa] 4E-46 184
contig7 EAA67676 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
difj5e02 EAA67725 gb AAN32717 protein kinase SNF [Colletotrichum gloeosporioides f. sp. malvae] 1E-116 424
contig111 EAA67736 sp Q9Y8G7 Bifunctional P-450:NADPH-P450 [Fusarium oxysporum] 1E-116 419
difj2h10 EAA67736 sp Q9Y8G7 Bifunctional P-450:NADPH-P450 [Fusarium oxysporum] 3E-04 46
difjaa05 EAA67736 sp Q9Y8G7 Bifunctional P-450:NADPH-P450 [Fusarium oxysporum] 2E-20 100
difj9b03 EAA67745 emb CAE53350 non-ribosomal peptide synthetase [Actinoplanes teichomyceticus] 0,034 40
difj5e03 EAA67750 ref NP_596397 60s ribosomal protein [Schizosaccharomyces pombe] 0,014 40
contig84 EAA67772 ref NP_595736 60s ribosomal protein l7-c. [Schizosaccharomyces pombe] 9E-43 173
difjae07 EAA67818 gb AAO49455 heat shock protein 78 [Leptosphaeria maculans] 0 1112
difj7h07 EAA67819 emb CAE76504 probable ribosomal protein L6.e.B, cytosolic [Neurospora crassa] 4E-17 88
contig6 EAA67839 emb CAE76503 probable ribosomal protein L35 [Neurospora crassa] 3E-14 79
difj9c05 EAA67844 ref NP_851527 putative phytoene synthase [Streptomyces rochei] 4,1 32
difj7e03 EAA67845 ref NP_484214 glycolate oxidase [Nostoc sp. PCC 7120] 05 42
contig48 EAA67898 gb AAA33563 plasma membrane H+ ATPase [Neurospora crassa] 0 1438
contig19 EAA67898 gb AAA33564 plasma membrane H+ ATPase [Neurospora crassa] 0 1438
contig90 EAA67908 gb AAN05587 ribosomal protein L11 [Argopecten irradians] 9E-16 84
difj3g05 EAA67910 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
contig73 EAA68042 ref NP_986457 AGL210Cp [Eremothecium gossypii] Uroporphyrinogen decarboxylase (URO-D) 1E-129 462
contig62 EAA68081 gb AAB92222 induced 3 days post infection - unknown [Glomerella cingulata] 1E-34 145
difj5b08 EAA68083 dbj BAA07784 L41 ribosomal protein [Candida maltosa] 03 43
difj7g08 EAA68107 sp P55059 Protein disulfide isomerase precursor [Humicola insolens] 0 732
difjag07 EAA68238 ref NP_596304 bifunctional purine biosynthetic protein [Schizosaccharomyces pombe] 3E-58 225
difj6f06 EAA68248 gb AAN73248 helix-loop-helix protein [Fusarium culmorum] 0 694
contig94 EAA68315 ref XP_325881 QUINATE PERMEASE (QUINATE TRANSPORTER) [Neurospora crassa] 2E-59 232
difj7c10 EAA68356 gb AAK55436 cytochrome-c oxidase chain VIIc-like protein [Ophiostoma ulmi] 1E-19 97
difj8e03 EAA68385 gb AAL08944 L-arabinitol 4-dehydrogenase [Hypocrea jecorina] 1E-180 631
difj3h08 EAA68414 ref NP_594825 probable arginine N-methyltransferase [Schizosaccharomyces pombe] 2E-24 112
172
Annexes

difjbb07 EAA68421 sp Q9P8I0 Delta-1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase [Aspergillus nidulans] 1E-06 54
contig92 EAA68434 ref NP_983806 ADL290Wp [Eremothecium gossypii] Ribosomal protein L6 1E-63 244
difj3b10 EAA68434 ref NP_983806 ADL290Wp [Eremothecium gossypii] Ribosomal protein L6 1E-63 244
difj8c08 EAA68480 ref NP_596149 cyclin c homolog 1. [Schizosaccharomyces pombe] 3E-10 66
difjbg01 EAA68527 ref XP_327089 probable glutamate decarboxylase [MIPS] [Neurospora crassa] 7E-06 51
difj1f12 EAA68538 gb AAO27751 monooxygenase [Fusarium sporotrichioides] 8E-31 136
difj5g04 EAA68539 emb CAD71039 related to L-fucose permease [Neurospora crassa] 8E-21 103
difj6f03 EAA68554 ref NP_594359 dnaj protein [Schizosaccharomyces pombe] 2E-10 70
difjbf04 EAA68609 gb AAB94631 small S - vegetative incompatibility [Podospora anserina] 9E-81 301
difj1e01 EAA68682 gb AAB88887 carnitine acetyl transferase [Magnaporthe grisea] 0 860
difjaa07 EAA68682 gb AAB88887 carnitine acetyl transferase [Magnaporthe grisea] 0 860
difjaa02 EAA68740 gb AAF37300 secretory pathway Ca2+-ATPase [Aspergillus niger] 0 1074
difj9g12 EAA68756 pir T42521 probable UTP-glucose-1-phosphate uridylyltransferase [Schizosaccharomyces pombe 9E-20 97
difj5d03 EAA68778 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
difj1b01 EAA68785 ref NP_588391 conserved protein; putative tRNA synthetase class II [Schizosaccharomyces pombe] 4E-41 170
difj9g06 EAA68814 ref NP_057175 eukaryotic translation initiation factor 3 [Homo sapiens] 1E-113 411
difj6e12 EAA68814 ref NP_057175 eukaryotic translation initiation factor 3 [Homo sapiens] 1E-113 411
difj8a02 EAA68827 ref NP_010390 Putative membrane protein, conserved in mammals; Tms1p [Saccharomyces cerevisiae] 5E-96 353
difj5c03 EAA68830 sp O13684 PCS1_SCHPO Chromosome segregation protein pcs1 [Schizosaccharomyces pombe] 4E-08 62
difj4e05 EAA68889 emb CAC15500 putative 60s ribosomal protein [Colletotrichum gloeosporioides f. sp. aeschynomene] 2E-04 46
difj5a07 EAA68894 ref NP_011392 Protein component of the small (40S) subunit 6E-04 45
contig116 EAA68955 ref NP_912831 unnamed protein product [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] 0,94 29
difj2g12 EAA68955 ref NP_912831 unnamed protein product [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] 0,94 29
difj4f01 EAA68962 ref NP_014451 Putative GTPase [Saccharomyces cerevisiae] 1E-163 578
173
Annexes

difjbf09 EAA68994 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
difj4a01 EAA69037 gb AAO50962 similar to Dictyostelium discoideum (Slime mold). Citrate synthase 1E-28 126
contig36 EAA69039 gb AAK84437 extracellular chitinase [Blumeria graminis] 1E-107 390
difj7e12 EAA69039 gb AAK84437 extracellular chitinase [Blumeria graminis] 1E-107 390
difj9e08 EAA69039 gb AAK84437 extracellular chitinase [Blumeria graminis] 1E-107 390
difj1f04 EAA69182 gb AAN31395 leucine aminopeptidase [Aspergillus sojae] 1E-113 409
difj9f09 EAA69209 sp P06785 Thymidylate synthase (TS) (TSase) [Saccharomyces cerevisiae] 8E-54 211
difjbb02 EAA69436 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
difj6b07 EAA69455 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
contig1 EAA69530 gb AAF82789 aldehyde dehydrogenase; ALDH [Cladosporium fulvum] 0 733
difj8g05 EAA69544 gb AAP91684 beta-1,3-glucanosyltransferase [Paracoccidioides brasiliensis] 1E-126 453
contig28 EAA69547 ref NP_985779 AFR232Cp [Eremothecium gossypii] gb|AAS53603| AFR232Cp [Eremothecium gossypii] 1E-29 108
difj6f12 EAA69547 ref NP_985779 AFR232Cp [Eremothecium gossypii] gb|AAS53603| AFR232Cp [Eremothecium gossypii] 3E-57 122
difj4h02 EAA69566 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
contig119 EAA69768 gb AAO27755 reductase [Fusarium sporotrichioides] 1E-125 449
difj6f01 EAA69768 gb AAO27755 reductase [Fusarium sporotrichioides] 1E-125 449
contig104 EAA69769 gb AAO34681 monooxygenase [Gibberella zeae] 0 671
contig42 EAA69769 gb AAO34681 monooxygenase [Gibberella zeae] 0 671
contig117 EAA69779 gb AAK11532 PaxU [Penicillium paxilli] 7E-61 235
contig33 EAA69779 gb AAK11532 PaxU [Penicillium paxilli] 7E-61 235
difj7a11 EAA69794 ref NP_595653 sexual differentiation process protein isp4 [Schizosaccharomyces pombe] 3E-25 115
difjbg02 EAA69821 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
174
Annexes

difj3d11 EAA69827 ref NP_567513 acyl-CoA oxidase (ACX1) [Arabidopsis thaliana] 1E-111 404
difj2f09 EAA69831 sp P07754 Alcohol dehydrogenase III [Emericella nidulans] 4E-19 95
contig13 EAA69832 dbj BAB59002 maltose permease [Aspergillus oryzae] 1E-126 454
contig122 EAA69844 ref NP_013542 ornithine aminotransferase; Car2p [Saccharomyces cerevisiae] 5E-81 195
difj9a07 EAA69869 emb CAF32145 fasciclin I family protein, putative [Aspergillus fumigatus] 7E-27 123
difj5d11 EAA69954 ref NP_595140 putative MSF transporter [Schizosaccharomyces pombe] 1E-141 503
contig18 EAA69962 gb AAD52617 glutamine synthase [Nectria haematococca] 5E-48 182
difj3b03 EAA70055 ref XP_328493 probable SnodProt1 PRECURSOR [MIPS] [Neurospora crassa] 1E-36 152
contig29 EAA70074 ref XP_326662 NADH-UBIQUINONE OXIDOREDUCTASE 24 KD SUBUNIT PRECURSOR [Neurospora crassa] 4E-20 99
difj7a04 EAA70074 ref XP_326662 NADH-UBIQUINONE OXIDOREDUCTASE 24 KD SUBUNIT PRECURSOR [Neurospora crassa] 7E-48 191
difjag10 EAA70089 ref NP_594315 60s ribosomal protein l10 [Schizosaccharomyces pombe] 7E-31 116
difj8h09 EAA70092 ref XP_327013 SPERMIDINE SYNTHASE (PUTRESCINE AMINOPROPYLTRANSFERASE) [Neurospora crassa] 1E-136 486
difj1a11 EAA70105 ref NP_010216 cytochrome c oxidase subunit VIIa [Saccharomyces cerevisiae] 1E-07 57
difj1e05 EAA70159 ref XP_323644 OUTER MITOCHONDRIAL MEMBRANE PROTEIN PORIN [Neurospora crassa] 1E-103 377
difj5d04 EAA70159 ref XP_323644 OUTER MITOCHONDRIAL MEMBRANE PROTEIN PORIN [Neurospora crassa] 1E-103 377
difj7c06 EAA70164 ref NP_985666 AFR119Cp ABC1 family [Eremothecium gossypii] 1E-120 436
difj7d06 EAA70215 emb CAE76088 related to neutral amino acid permease [Neurospora crassa] 5E-45 184
contig86 EAA70229 gb AAM88292 reductase RED1 [Cochliobolus heterostrophus] 1E-83 311
difjba10 EAA70393 ref NP_595137 putative mitochondrial ribosomal protein [Schizosaccharomyces pombe] 1E-23 78
difj2b02 EAA70398 ref NP_834349 Metal-dependent hydrolase [Bacillus cereus ATCC 14579] 2E-37 159
contig91 EAA70431 gb AAP40020 HSP70 [Hypocrea jecorina] 0 1076
contig99 EAA70431 gb AAP40020 HSP70 [Hypocrea jecorina] 0 1076
difj7h02 EAA70431 gb AAP40020 HSP70 [Hypocrea jecorina] 0 1076
difj9c01 EAA70438 sp O13418 60S RIBOSOMAL PROTEIN L15 emb|CAA75582| putative ribosomal protein L15 [Aspergillus niger] 2E-21 102
difj4g11 EAA70438 ref XP_328215 60S RIBOSOMAL PROTEIN L15 [Neurospora crassa] 3E-37 155
difj3d12 EAA70467 ref NP_595820 actin-related protein [Schizosaccharomyces pombe] 4E-11 69
difj8h03 EAA70468 ref NP_588387 lysyl-trna synthetase [Schizosaccharomyces pombe] 3E-43 176
contig8 EAA70508 sp Q10499 Putative flavoprotein C26F14C [Schizosaccharomyces pombe] 1E-40 167
difj3b12 EAA70514 emb CAE47957 GabA permease, putative [Aspergillus fumigatus] 0 718
175
Annexes

difj2h01 EAA70587 Q9USX4 R33A_SCHPO 60S ribosomal protein L33-A (L37A) 5E-38 157
difj8b11 EAA70592 gb AAB47060 exochitinase [Trichoderma harzianum] 0 758
difj2e09 EAA70618 emb CAE47880 ethanolamine kinase, putative [Aspergillus fumigatus] 1E-112 407
difj7d10 EAA70685 gb AAK50853 NADPH oxidase 1 [Podospora anserina] 0 944
difj8c10 EAA70690 pir A42019 tyrosine-tRNA ligase (EC 6) precursor, mitochondrial – [Podospora anserina] 4E-08 58
difj7h11 EAA70702 ref NP_596422 small nuclear ribonucleoprotein [Schizosaccharomyces pombe] 3E-08 55
difj2b10 EAA70733 ref NP_593504 MFS transporter of unknown specificity [Schizosaccharomyces pombe] 9E-53 209
difj9d10 EAA70777 ref XP_330191 probable pyruvate dehydrogenase beta chain precursor (PDB1) [MIPS] [Neurospora crassa] 2E-62 138
contig53 EAA70844 ref NP_596284 zuotin like; putative zdna binding; dnaj domain containing protein [Schizosaccharomyces pombe] 2E-45 181
difjbf10 EAA70869 sp P28345 Malate synthase, glyoxysomal [Neurospora crassa] 3,7 32
contig46 EAA70869 ref XP_322865 MALATE SYNTHASE, GLYOXYSOMAL [Neurospora crassa] 1E-70 266
contig70 EAA70927 dbj BAA34062 lactonohydrolase [Fusarium oxysporum] dbj|BAA34218| lactonohydrolase [Fusarium oxysporum] 2E-41 169
difj8f10 EAA70927 dbj BAA34062 lactonohydrolase [Fusarium oxysporum] dbj|BAA34218| lactonohydrolase [Fusarium oxysporum] 3E-30 132
difj5a10 EAA70929 ref ZP_00030704 COG1020: Non-ribosomal peptide synthetase modules and related proteins [Burkholderia fungorum] 0,46 35
contig44 EAA70964 gb AAP58401 ribosomal protein Srp1 [Sclerotinia sclerotiorum] 8E-50 197
difj1e09 EAA70964 AAP58401 ribosomal protein Srp1 [Sclerotinia sclerotiorum] 3E-57 221
difj4d11 EAA71027 ref ZP_00092049 COG0738: Fucose permease [Azotobacter vinelandii] 3E-63 244
difj6d12 EAA71027 ref ZP_00092049 COG0738: Fucose permease [Azotobacter vinelandii] 3E-63 244
difj7a05 EAA71106 emb CAD71220 related to chloroperoxidase [Neurospora crassa] 4E-07 55
contig10 EAA71133 emb CAD54043 PhiA protein [Emericella nidulans] 2E-26 120
contig121 EAA71135 gb CAC80843 MSTA protein [Emericella nidulans] 6E-54 209
contig95 EAA71135 gb CAC80843 MSTA protein [Emericella nidulans] 6E-54 209
contig100 EAA71148 dbj BAB43813 CaNAG2 [Candida albicans] dbj|BAB43820| CaNAG2 [Candida albicans] 1E-72 275
difj5g03 EAA71148 dbj BAB43813 CaNAG2 [Candida albicans] dbj|BAB43820| CaNAG2 [Candida albicans] 1E-72 275
contig96 EAA71150 gb AAD42233 glucosamine-6-phosphate deaminase [Mus musculus] 1E-91 338
difj8h04 EAA71150 gb AAD42233 glucosamine-6-phosphate deaminase [Mus musculus] 1E-91 338
176
Annexes

difj2h08 EAA71225 gb AAL56992 integral membrane protein [Blumeria graminis] 9E-23 109
difj4a11 EAA71294 emb CAD38166 putative nuclear transport factor 2 [Davidiella tassiana] 4E-10 57
difj2h07 EAA71295 ref NP_011830 Ribosomal protein L4 of the large (60S) ribosomal subunit [Saccharomyces cerevisiae] 1E-07 57
difj6b06 EAA71295 ref NP_011830 Ribosomal protein L4 of the large (60S) ribosomal subunit [Saccharomyces cerevisiae] 4E-39 161
difjbe02 EAA71307 ref NP_587711 BTB domain and Ankaryin repeat containing protein [Schizosaccharomyces pombe] 2E-75 286
difj9e09 EAA71315 ref ZP_00085158 COG1197: Transcription-repair coupling factor (superfamily II helicase) [Pseudomonas fluorescens PfO-1] 0,012 40
contig107 EAA71470 pir S47892 neutral amino acid permease - [Neurospora crassa] 2E-38 162
difj1b03 EAA71470 pir S47892 neutral amino acid permease - [Neurospora crassa] 2E-38 162
difjae06 EAA71470 pir S47892 neutral amino acid permease - [Neurospora crassa] 2E-38 162
difjbh03 EAA71470 pir S47892 neutral amino acid permease - [Neurospora crassa] 2E-38 162
difj7b06 EAA71508 emb CAF31975 endoglucanase, putative [Aspergillus fumigatus] 1E-57 224
contig9 EAA71538 gb AAQ95166 methyltransferase [Emericella nidulans] 4E-06 45
difjba07 EAA71635 ref NP_596480 putative golgi membrane protein-sorting protein [Schizosaccharomyces pombe] 3E-25 115
difj8b05 EAA71658 ref NP_683570 alanyl-tRNA synthetase-related [Arabidopsis thaliana] 9E-06 50
difj6g12 EAA71669 sp P46075 ELM2_ASPFU Extracellular elastinolytic metalloproteinase precursor 0 727
contig61 EAA71677 emb CAD88590 glucose oxidase [Botryotinia fuckeliana] 4E-65 251
contig58 EAA71678 emb CAF32121 integral membrane protein, putative [Aspergillus fumigatus] 5E-06 54
difj5g05 EAA71679 ref NP_011329 transport of pyridoxine; Tpn1p [Saccharomyces cerevisiae] 1E-68 262
difj8h05 EAA71679 ref NP_011329 transport of pyridoxine; Tpn1p [Saccharomyces cerevisiae] 1E-68 262
difj1f01 EAA71711 emb CAD29613 mfs-family multidrug resistance protein, putative [Aspergillus fumigatus] 0 798
difj4e02 EAA71972 ref NP_596026 pim1 GTPase protein [Schizosaccharomyces pombe] 5E-11 68
difj9g02 EAA72101 ref NP_011856 Involved in pheromone response and pseudohyphal growth pathways; Ste20p [Saccharomyces cerevisiae] 0,044 38
difj8d10 EAA72140 sp P26969 Glycine dehydrogenase [Pisum sativum] 1E-49 197
difj4g02 EAA72184 ref XP_323632 probable branched-chain amino acids aminotransferase [MIPS] [Neurospora crassa] 9E-29 127
177
Annexes

contig77 EAA72210 dbj BAA86103 O-methyltransferase [Aspergillus parasiticus] dbj|BAA86104| O-methyltransferase [Aspergillus parasiticus] 3E-58 227
difj7f10 EAA72224 dbj BAB59002 maltose permease [Aspergillus oryzae] 1E-82 309
difj4f11 EAA72243 ref NP_594121 fibronectin type III domain protein; yeast chs5 homolog [Schizosaccharomyces pombe] 2E-30 132
difj8c12 EAA72268 ref NP_973522 metal-dependent phosphohydrolase HD domain-containing protein [Arabidopsis thaliana] 4E-35 149
difjbc09 EAA72278 gb AAR23110 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase biotin-containing subunit [Emericella nidulans] 8E-48 189
difj9a06 EAA72315 emb CAB46694 SPBC839.01 [Schizosaccharomyces pombe] 1E-106 389
contig65 EAA72328 dbj BAB18098 uricase [Tolypocladium inflatum] 3E-28 125
difj7h12 EAA72328 dbj BAB18098 uricase [Tolypocladium inflatum] 5E-37 154
difj7e05 EAA72339 gb AAO31597 di/tri peptide transporter 2 [Phaeosphaeria nodorum] 7E-98 360
difj8h06 EAA72339 gb AAO31597 di/tri peptide transporter 2 [Phaeosphaeria nodorum] 7E-98 360
contig87 EAA72351 gb AAA85778 fumarylacetoacetate hydrolase 2E-24 68
contig68 EAA72373 emb CAA04820 phenylacetyl-CoA ligase [Penicillium chrysogenum] 4E-17 68
difj4e12 EAA72373 emb CAA04820 phenylacetyl-CoA ligase [Penicillium chrysogenum] 06 42
difj1d05 EAA72409 sp P55250 Fumarate hydratase, mitochondrial precursor [Rhizopus oryzae] 2E-17 90
difj5f02 EAA72428 ref XP_324865 CASEIN KINASE I HOMOLOG HHP1 [Neurospora crassa] 1E-168 592
difj9d06 EAA72434 gb AAQ56234 HEX1 highly expressed on cellulase-inducing medium [Hypocrea jecorina] 2E-71 270
difjac12 EAA72524 ref NP_014661 Membrane protein Rod1p [Saccharomyces cerevisiae] 3E-33 144
difj6b03 EAA72554 pir P34054 INA1_TRIHA AMINO-ACID PERMEASE [Hypocrea lixii] 0 655
difj1d09 EAA72613 gb AAG53992 acyl-CoA thioesterase [Cochliobolus heterostrophus] 1E-25 103
difjac07 EAA72629 gb AAL10705 phosphoenolpyruvate carboxykinase [Emericella nidulans] 0 936
difj3h03 EAA72694 gb AAH56091 Gk2-prov protein [Xenopus laevis] glycerol kinase 1E-127 456
contig114 EAA72694 gb AAH56091 Gk2-prov protein [Xenopus laevis] glycerol kinase 1E-127 456
contig102 EAA72694 gb AAH56091 Gk2-prov protein [Xenopus laevis] glycerol kinase 1E-127 456
difj1a06 EAA72695 ref NP_066190 aquaporin 9 [Homo sapiens] 8E-42 172
contig59 EAA72695 ref NP_066190 aquaporin 9 [Homo sapiens] 8E-42 172
contig113 EAA72695 ref NP_066190 aquaporin 9 [Homo sapiens] 8E-42 172
178
Annexes

contig34 EAA72784 ref NP_010223 Twenty S rRNA accumulation; Tsr1p [Saccharomyces cerevisiae] 1E-135 485
difj7b07 EAA72785 ref NP_011005 Nucleolar protein, belong to the small subunit processome contain the U3 snoRNA [Saccharomyces cerevisiae] 1E-136 486
difj9g01 EAA72812 ref NP_593504 MFS transporter of unknown specificity [Schizosaccharomyces pombe] 5E-65 250
contig67 EAA72929 gb AAO27746 putative methyltransferase [Fusarium sporotrichioides] 0,033 30
difjaa09 EAA73130 ref NP_012667 Xanthine Phosphoribosyl Transferase [Saccharomyces cerevisiae] 3E-32 139
difjac11 EAA73188 emb CAB52417 xylanase [Setosphaeria turcica] 4E-73 275
contig39 EAA73216 emb CAD60593 unnamed protein product [Podospora anserina] 2E-22 107
contig124 EAA73242 dbj BAA33011 flavohemoglobin [Fusarium oxysporum] 1E-133 477
contig74 EAA73242 dbj BAA33011 flavohemoglobin [Fusarium oxysporum] 0,53 35
difj8e12 EAA73242 dbj BAA33011 flavohemoglobin [Fusarium oxysporum] 3E-64 244
difj4g09 EAA73260 gb AAO32580 RPS24 [Saccharomyces kluyveri] 40S ribosomal protein 1E-35 149
difjag05 EAA73294 gb AAO27751 monooxygenase [Fusarium sporotrichioides] 5E-13 75
difj5e11 EAA73437 CAA64974 QI74 protein [Hypocrea lixii] 2E-67 258
difj7f12 EAA73437 CAA64974 QI74 protein [Hypocrea lixii] 2E-67 258
difj3f08 EAA73495 emb CAB11063 RNA-binding protein; eukaryotic conserved protein [Schizosaccharomyces pombe] 2E-74 281
difj3b09 EAA73496 ref NP_593835 putative atp-dependent RNA helicase [Schizosaccharomyces pombe] 5E-88 325
difj7a06 EAA73507 gb AAR92034 elongation factor 3 [Clavispora lusitaniae] 0 1242
difjbg03 EAA73507 gb AAR92034 elongation factor 3 [Clavispora lusitaniae] 0 1242
contig72 EAA73507 gb AAR92034 elongation factor 3 [Clavispora lusitaniae] 0 1242
difj6d04 EAA73507 gb AAR92034 elongation factor 3 [Clavispora lusitaniae] 0 1242
difj7b09 EAA73508 ref NP_009690 plasma membrane carnitine transporter Agp2p [Saccharomyces cerevisiae] 1E-105 385
difj5b12 EAA73522 gb AAR37949 succinate-semialdehyde dehydrogenase [uncultured bacterium 561] 1E-132 472
difjah08 EAA73522 gb AAR37949 succinate-semialdehyde dehydrogenase [uncultured bacterium 561] 1E-132 472
179
Annexes

difj1f11 EAA73543 emb CAE47906 transporter, unknown specificity [Aspergillus fumigatus] 1E-73 279
contig45 EAA73565 ref ZP_00058470 COG0791: Cell wall-associated hydrolases (invasion-associated proteins) [Thermobifida fusca] 2E-11 71
difj1g03 EAA73587 ref NP_012740 ribose-phosphate pyrophosphokinase; Prs1p [Saccharomyces cerevisiae] 7E-72 273
contig115 EAA73595 emb CAE85541 related to lactose regulatory protein [Neurospora crassa] 3E-07 60
difj5g10 EAA73595 emb CAE85541 related to lactose regulatory protein [Neurospora crassa] 3E-07 60
contig40 EAA73614 emb CAD29608 zinc finger protein, putative [Aspergillus fumigatus]
contig63 EAA73614 emb CAD29608 zinc finger protein, putative [Aspergillus fumigatus] 1E-52 206
contig71 EAA73614 emb CAD29608 zinc finger protein, putative [Aspergillus fumigatus] 1E-18 96
difjaf08 EAA73617 emb CAD21513 probable DNA-directed RNA polymerase I [Neurospora crassa] 5E-32 138
difj5d05 EAA73619 CAD01120 related to epithelial zinc-finger ezf protein [Neurospora crassa] 7E-69 671
difjaf01 EAA73638 sp P23704 ATP synthase beta chain, mitochondrial precursor [Neurospora crassa] 2E-46 185
difjab09 EAA73657 emb CAD42868 solanesyl pyrophosphate synthase [Mucor circinelloides f. lusitanicus] 1E-102 374
contig27 EAA73659 sp P59671 60S ribosomal protein L3 emb|CAD70371| probable 60s ribosomal protein l3 (rpl3) [Neurospora crassa] 3E-70 149
difj8b04 EAA73708 ref NP_595319 putative eukaryotic translation initiation factor 3 alpha subunit(eif-3 alpha). [Schizosaccharomyces pombe] 3E-15 82
difjaf10 EAA73708 sp O59742 Probable eukaryotic translation initiation factor 3 [Schizosaccharomyces pombe] 7E-22 105
difj1d01 EAA73721 ref NP_564043 expressed membrane protein [Arabidopsis thaliana] 8E-73 276
difj9f02 EAA73768 gb EAE20031 unknown [environmental sequence] 2E-77 291
contig82 EAA73771 emb CAC28838 related to DNAJ-like protein homolog [Neurospora crassa] 1E-108 394
difj2a02 EAA73785 sp AAB97419 succinate dehydrogenase iron-sulphur protein [Mycosphaerella graminicola] 1E-102 373
difjbb09 EAA73785 gb AAB97419 succinate dehydrogenase iron-sulphur protein [Mycosphaerella graminicola] 1E-102 373
difjbh09 EAA73798 gb AAN62898 cell wall protein; Sed1p [Saccharomyces cerevisiae] 2E-14 81
difj7a01 EAA73916 AAO13381 metacaspase [Aspergillus nidulans] 5E-86 319
difj1b06 EAA74017 gb EAA66474 FAS2_PENPA Fatty acid synthase subunit alpha [Aspergillus nidulans FGSC A4] 2E-47 188
difj5d10 EAA74018 gb AAB41494 fatty acid synthase, beta subunit [Emericella nidulans] 3E-21 102
difj7f08 EAA74018 gb AAB41494 fatty acid synthase, beta subunit [Emericella nidulans] 1E-44 179
difjba05 EAA74019 gb AAO50910 similar to Rattus norvegicus (Rat). Guanine deaminase (EC 3.5.4 [Dictyostelium discoideum] 6E-19 94
contig60 EAA74070 emb CAC28755 probable MAK16 protein [Neurospora crassa] 1E-61 238
difjbh10 EAA74086 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
difj4a05 EAA74129 ref XP_329834 40S RIBOSOMAL PROTEIN S5 [Neurospora crassa] 3E-40 115
difjab03 EAA74129 ref XP_329834 40S RIBOSOMAL PROTEIN S5 [Neurospora crassa] 3E-32 138
180
Annexes

contig85 EAA74131 gb AAN11327 ADP-ATP translocase [Gaeumannomyces graminis var. tritici] 1E-128 460
difj7f05 EAA74170 gb AAL56638 putative DEAD-box RNA helicase [Emericella nidulans] 3E-13 75
difj3g09 EAA74218 ref NP_823172 putative allantoinase [Streptomyces avermitilis MA-4680] 2E-13 76
difj7f04 EAA74224 ref NP_595368 putative U3 snoRNP component [Schizosaccharomyces pombe] 2E-46 186
difj2d11 EAA74225 gb AAC24705 monoubiquitin/carboxy extension protein fusion [Botryotinia fuckeliana] 1E-49 197
difj7d05 EAA74251 gb EAA63472 ARGI_EMENI Arginase [Aspergillus nidulans FGSC A4] 1E-126 453
contig103 EAA74251 gb EAA63472 ARGI_EMENI Arginase [Aspergillus nidulans FGSC A4] 2E-87 323
difj8f07 EAA74275 ref NP_009693 subunit of the Cdc28 protein kinase; Cks1p [Saccharomyces cerevisiae] 3E-34 145
difj6g10 EAA74276 ref NP_596116 possibly required for protein disulfide bond formation in the ER [Schizosaccharomyces pombe] 9E-21 100
difj7b02 EAA74298 emb CAD37159 putative ribosomal protein [Aspergillus fumigatus] 2E-13 75
difj7g06 EAA74298 emb CAD37159 putative ribosomal protein [Aspergillus fumigatus] 7E-10 65
difj1a01 EAA74332 ref NP_010172 Ribosomal RNA Processing; Rrp42p [Saccharomyces cerevisiae] 5E-17 91
difjad09 EAA74332 ref NP_010172 Ribosomal RNA Processing; Rrp42p [Saccharomyces cerevisiae] 5E-17 91
difj9a08 EAA74334 dbj BAA85768 cytochrome c549 [Fusarium oxysporum] 4E-35 147
difj6d01 EAA74343 ref NP_010849 Ferrioxamine B transporter 1E-120 434
difj2g04 EAA74352 ref XP_326728 related to RNA splicing factor PRP9 [Neurospora crassa] 0 645
difj5d02 EAA74367 ref ZP_00059195 COG1024: Enoyl-CoA hydratase/carnithine racemase [Thermobifida fusca] 3E-14 79
contig15 EAA74377 gb AAM19667 carboxylic acid transport protein [Metarhizium anisopliae] 0 738
difj4h06 EAA74387 ref ZP_00098516 COG0329: Dihydrodipicolinate synthase/N-acetylneuraminate lyase [Desulfitobacterium hafniense] 1E-07 57
contig54 EAA74387 ref ZP_00098516 COG0329: Dihydrodipicolinate synthase/N-acetylneuraminate lyase [Desulfitobacterium hafniense] 1E-07 57
contig31 EAA74412 gb AAC09045 GATA transcription factor [Penicillium chrysogenum] 7E-33 97
contig21 EAA74424 ref NP_691595 acyl-CoA dehydrogenase [Oceanobacillus iheyensis HTE831] 9E-61 234
difjac04 EAA74434 dbj BAA85768 cytochrome c549 [Fusarium oxysporum] 3E-10 65
difj5e06 EAA74434 dbj BAA85768 cytochrome c549 [Fusarium oxysporum] 3E-10 65
difj6c03 EAA74464 dbj BAC20337 hexose transporter [Aspergillus oryzae] 3E-67 258
difj9c08 EAA74487 ref NP_414846 NAD+-dependent betaine aldehyde dehydrogenase [Escherichia coli K12] 7E-21 101
contig64 EAA74490 ref NP_116690 Protein component of the large (60S) ribosomal subunit [Saccharomyces cerevisiae] 4E-04 45
difj5c11 EAA74514 ref XP_322653 VACUOLAR ATP SYNTHASE SUBUNIT [Neurospora crassa] 4E-25 108
difjbc05 EAA74559 ref NP_596073 strong similarity to yeast cell division and spore germination protein Krr1p [Schizosaccharomyces pombe] 5E-06 52
181
Annexes

difj7c04 EAA74578 ref NP_177564 mitochondrial substrate carrier family protein [Arabidopsis thaliana] 3E-25 118
difj9a01 EAA74619 gb EAA65057 Mitochondrial import inner membrane translocase subunit TIM17 [Aspergillus nidulans FGSC A4] 5E-57 222
contig2 EAA74639 ref NP_587683 putative exosome 3'-5' exoribonuclease complex [Schizosaccharomyces pombe] 5E-47 187
contig22 EAA74689 gb NP_081828 kynureninase (L-kynurenine hydrolase) [Mus musculus 1E-103 379
difj5h12 EAA74689 gb NP_081828 kynureninase (L-kynurenine hydrolase) [Mus musculus] 1E-103 379
difjaa04 EAA74689 ref NP_081828 kynureninase (L-kynurenine hydrolase) [Mus musculus] 1E-103 379
difj9b07 EAA74718 gb AAP05987 70 kDa heat shock protein [Paracoccidioides brasiliensis] 0 987
difj1g06 EAA74738 ref NP_595525 putative thioredoxin [Schizosaccharomyces pombe] 6E-59 231
difj8h10 EAA74871 pdb 1HJS Chain A, Structure Of Two Fungal Beta-1,4-Galactanases [Corynascus heterothallicus] 1E-131 468
difjbe05 EAA74902 ref NP_012686 allantoate permease; Dal5p [Saccharomyces cerevisiae] 1E-44 182
difjbg09 EAA74902 ref NP_012686 allantoate permease; Dal5p [Saccharomyces cerevisiae] 1E-44 182
difj9b05 EAA75039 pir S47150 NADH2 dehydrogenase (ubiquinone) (EC 1.6.5) [Neurospora crassa] 4E-08 58
contig41 EAA75090 EAA64975 OAT_EMENI Ornithine aminotransferase[Aspergillus nidulans FGSC A4] 1E-166 1513
contig123 EAA75090 sp Q92413 Ornithine aminotransferase (Ornithine--oxo-acid aminotransferase) [Emericella nidulans] 6E-54 211
difjba01 EAA75100 emb CAA98726 something about silencing 10 (SAS10) [Saccharomyces cerevisiae] 5E-30 134
difj2c04 EAA75118 pir S38111 general amino acid permease Gap1p [Saccharomyces cerevisiae] 1E-117 424
contig30 EAA75144 gb AAK63186 probable acyl-CoA dehydrogenase [Glomus intraradices] 5E-70 247
difj3d01b EAA75185 emb CAD21185 related to Hsp90 associated co-chaperone [Neurospora crassa] 3E-06 53
difj4e07 EAA75198 sp O74633 DNA-directed RNA polymerase I polypeptide 2 (RNA polymerase I subunit 2) [Neurospora crassa] 9E-22 103
difjac10 EAA75210 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
difj5c04 EAA75234 AAO27752 deacetylase [Fusarium sporotrichioides] 8E-49 496
difj7g03 EAA75236 ref NP_917158 P0039G053 [Oryza sativa (japonica cultivar-group)] 1E-21 103
contig35 EAA75374 sp P35049 Trypsin precursor gb|AAB27568| preprotrypsin [Fusarium oxysporum] 2E-99 363
182
Annexes

difj9h06 EAA75427 emb CAE47862 oxidoreductase, putative [Aspergillus fumigatus] 0,028 39
difj7g04 EAA75438 gb AAC49318 versicolorin b synthase-like protein, putative [Aspergillus fumigatus] 1E-117 425
difj7h05 EAA75438 gb AAC49318 versicolorin b synthase-like protein, putative [Aspergillus fumigatus] 1E-117 425
difj6e01 EAA75459 ref NP_984686 lysine decarboxylase-like protein [Arabidopsis thaliana] 2E-29 130
difj7c03 EAA75487 ref NP_984794 cytochrome c reductase iron-sulfur subunit [Neurospora crassa] 8E-86 318
difj1b11 EAA75577 gb AAF93498 ribosomal protein L1 [Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961] 5E-18 94
contig11 EAA75582 ref NP_777003 phospholipase A2, group VII (platelet-activating factor acetylhydrolase, plasma) [Bos taurus] 4E-17 92
difj8c01 EAA75690 gb AAD30438 integral membrane protein [Magnaporthe grisea] 8E-22 106
difj9d04 EAA75850 gb AAP92915 serine/threonine kinase IREI [Hypocrea jecorina] 0 1323
difj1a03 EAA75942 ref NP_596806 putative ubiquinol-cytochrome c reductase complex subunit [Schizosaccharomyces pombe] 2E-12 55
difj6e09 EAA75973 ref NP_595009 amino-acid permease [Schizosaccharomyces pombe] 1E-101 371
difj8e06 EAA75973 ref NP_595009 amino-acid permease [Schizosaccharomyces pombe] 1E-101 371
difjag12 EAA76051 gb AAA75471 pectate lyase 7E-69 261
difjbd09 EAA76092 ref NP_014051 NADPH-dependent alcohol dehydrogenase; Adh6p [Saccharomyces cerevisiae] 0,032 39
difjbb11 EAA76102 ref NP_013230 Nucleolar protein part of the small subunit (SSU) processome Dip2p [Saccharomyces cerevisiae] 0 740
contig66 EAA76137 ref NP_116638 involved in protection against heat-induced protein aggregation [Saccharomyces cerevisiae] 2E-60 235
contig38 EAA76166 gb AAF82684 multifunctional beta-oxidation enzyme [Yarrowia lipolytica] 2E-31 135
difj8e10 EAA76167 ref NP_849912 phosphoribulokinase/uridine kinase-related [Arabidopsis thaliana] 1E-08 60
difj3f07 EAA76201 NP_013432 NAD(+) salvage pathway; Nma1p [Saccharomyces cerevisiae] 6E-71 687
contig52 EAA76272 emb CAD27297 probable translation elongation factor precursor, mitochondrial [Aspergillus fumigatus] 4E-46 184
difj7d09 EAA76281 gb AAP93639 PAK kinase [Magnaporthe grisea] 7E-51 200
contig110 EAA76292 gb AAG13457 putative 3-ketoacyl-CoA thiolase [Aspergillus oryzae] 6E-37 154
contig49 EAA76388 sp P34913 soluble epoxide hydrolase [Homo sapiens] 1E-39 166
difj6d07 EAA76388 sp P34913 soluble epoxide hydrolase [Homo sapiens] 1E-39 166
183
Annexes

difj4g08 EAA76395 sp P14010 4-aminobutyrate transaminase (EC 2.69) – [Emericella nidulans] 4E-59 228
difjbd03 EAA76448 gb AAF12737 exopolygalacturonase [Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici] 0 881
difj8c06 EAA76475 dbj BAC20584 2-oxoisovalerate dehydrogenase alpha subunit [Macaca fascicularis] 6E-41 167
contig112 EAA76482 sp Q8ISP0 40S ribosomal protein S18 gb|AAN52390| ribosomal protein S18 [Branchiostoma belcheri] 8E-57 220
difj1e03 EAA76520 ref NP_013273 Methyltransferase required for diphthamide biosynthesis [Saccharomyces cerevisiae] 1E-102 372
contig43 EAA76570 gb AAC61778 aconitase [Aspergillus terreus] 0 1281
contig81 EAA76570 gb AAC61778 aconitase [Aspergillus terreus] 0 1281
difj8f03 EAA76608 ref XP_218195 similar to splicing factor U2AF homolog - mouse [Rattus norvegicus] 6E-21 76
difj4e04 EAA76646 gb AAO38840 beta-tubulin [Parmelia saxatilis] 3E-37 155
difjab08 EAA76664 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
contig97 EAA76673 pir S47892 neutral amino acid permease [Neurospora crassa] 1E-114 412
difj5c02 EAA76686 dbj BAB59002 maltose permease [Aspergillus oryzae] 1E-114 414
difj1g01 EAA76711 gb AAB04132 cutinase G-box binding protein 0 704
difjaf03 EAA76711 gb AAB04132 cutinase G-box binding protein 0 704
difj2b06 EAA76715 sp P49377 ATP synthase gamma chain, mitochondrial precursor [Kluyveromyces marxianus var. Lactis] 9E-38 158
difj1a02 EAA76753 ref NP_014915 microtubule-associated protein; Ytm1p [Saccharomyces cerevisiae] 4E-80 300
difj2a10 EAA76757 ref NP_014335 yeast dnaJ homolog (nuclear envelope protein); heat shock protein; Ydj1p [Saccharomyces cerevisiae] 4E-99 363
contig55 EAA76759 sp Q9C3Z6 60S acidic ribosomal protein P0 gb|AAK11262| ribosomal protein P0 [Podospora anserina] 4E-55 169
difj9g09 EAA76770 gb AAK68862 CCAAT-binding protein subunit HAP3 [Hypocrea jecorina] 1E-75 284
difj9h05 EAA76780 sp O57539 Nuclear receptor coactivator [Xenopus laevis] 0,55 34
difj3e09 EAA76793 ref NP_015502 Geranylgeranyltransferase Type II beta subunit; Bet2p [Saccharomyces cerevisiae] 1E-23 110
contig76 EAA76800 gb AAS66028 hexose transporter [Aspergillus parasiticus] 2E-72 275
difjad10 EAA76841 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
difj6g05 EAA76842 ref ZP_00109187 COG0161: Adenosylmethionine-8-amino-7-oxononanoate aminotransferase [Nostoc punctiforme] 0,07 38
contig79 EAA76921 pir JC7375 | fructose-1,6-bisphosphatase [Aspergillus oryzae] 4E-52 168
difj6g02 EAA76922 pir S50281 PMP32 protein peroxisomal membrane protein - yeast [Candida boidinii] 2E-16 88
difj7a08 EAA76927 pir A30208 cross-pathway control protein 1 - Neurospora crassa 4E-42 174
184
Annexes

difj9a10 EAA76934 sp Q09722 COP9/signalosome complex subunit 7B [Schizosaccharomyces pombe] 5E-34 147
difjbh06 EAA76960 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
contig106 EAA76971 emb CAE47895 60S ribosomal protein l1-b, putative [Aspergillus fumigatus] 3E-91 305
difj4c03 EAA77044 gb AAO13381 metacaspase [Aspergillus nidulans] 1E-119 430
difj7b03 EAA77220 ref NP_594319 probable succinate dehydrogenase flavoprotein subunit precursor(ec 1.5) [Schizosaccharomyces pombe] 5E-81 301
contig16 EAA77228 ref XP_213850 similar to RIKEN cDNA 1500041N16 [Rattus norvegicus] 2E-50 201
difjbe06 EAA77293 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
difj5h11 EAA77343 gb AAB04131 sodium transport ATPase FST 0 895
difj9f12 EAA77343 gb AAB04131 sodium transport ATPase FST 0 895
difjbf08 EAA77370 dbj BAC66634 succinate dehydrogenase cytochrome b560 subunit [Coprinopsis cinerea] 3E-05 49
difj6c02 EAA77414 ref NP_171806 Uncharacterized protein family UPF0005 with 7 transmembrane domains. [Arabidopsis thaliana] 6E-17 87
difj9d09 EAA77469 pir T52474 probable methyltransferase Pmt2 [Schizosaccharomyces pombe] 1E-12 74
contig109 EAA77497 emb CAD70957 probable ribosomal protein 10, cytosolic [Neurospora crassa] 1E-94 317
difj5g02 EAA77521 ref NP_080671 RER1 homolog retrograde transport, Golgi to ER [Mus musculus] 9E-54 211
difjbh07 EAA77527 ref NP_014886 pseudouridylates U2 snRNA at position 35; Pus7p [Saccharomyces cerevisiae] 1E-89 333
difjbf02 EAA77542 Protein expressed in other organisms without clear function assigned
difjbg05 EAA77573 ref sp Q10156 LKH1_SCHPO Protein kinase lkh1 1E-106 389
difjbh12 EAA77624 gb AAM19083 diacylglycerol acyltransferase [Sus scrofa] gb|AAM66767| diacylglycerol acyltransferase [Sus scrofa] 0,048 39
contig108 EAA77628 ref NP_013897 DNA damage-responsive protein 48 (DDR48)[Saccharomyces cerevisiae] 9E-20 99
difj1b08 EAA77628 ref NP_013897 DNA damage-responsive protein 48 (DDR48)[Saccharomyces cerevisiae] 9E-20 99
difj9f03 EAA77628 ref NP_013897 DNA damage-responsive protein 48 (DDR48)[Saccharomyces cerevisiae] 9E-20 99
difj5b09 EAA77629 gb AAB39564 phosphoinositide-specific phospholipase C [Botryotinia fuckeliana] 2E-20 99
difjaf09 EAA77636 gb AAO25609 NBP35 nucleotide binding protein [Candida glabrata] 1E-120 431
185
Annexes

difj3h11 EAA77682 gb AAH60414 MGC68656 protein [Xenopus laevis] 2E-27 124
difj4b08 EAA77986 gb AAL56992 integral membrane protein [Blumeria graminis] 3E-13 78
difj9g07 EAA78050 sp P08978 60S ribosomal protein L28 (L27A) (L29) (CRP1) [Neurospora crassa] 6E-16 84
difj9a05 EAA78085 gb AAD38394 S-adenosylmethionine decarboxylase [Emericella nidulans] 3E-27 121
difjad12 EAA78103 ref NP_012965 general amino acid permease; Gap1p [Saccharomyces cerevisiae] 1E-136 488
difj4g03 EAA78111 dbj BAC56975 5-carboxyvanillic acid decarboxylse [Sphingomonas paucimobilis] 2E-42 174
difj6c09 EAA78111 dbj BAC56975 5-carboxyvanillic acid decarboxylse [Sphingomonas paucimobilis] 2E-42 174
difjbc01 EAA78113 emb CAE47967 salicylate hydroxylase, putative [Aspergillus fumigatus] 0,75 35
contig80 EAA78230 pir JC5861 endo-1,4-beta-xylanase (EC 3.8) [Humicola grisea] 1E-95 351
difj8e08 EAA78237 emb CAD10036 deacetylase [Cryptococcus neoformans var. neoformans] 1E-18 94
difj8g01 EAA78248 emb CAF05858 related to alpha-L-arabinofuranosidase A precursor [Neurospora crassa] 6,77E+02 0
contig25 EAA78258 emb CAE47957 GabA permease, putative [Aspergillus fumigatus] 1E-129 463
difj2f12 EAA78281 emb CAC39600 Prolidase (proline dipeptidase) [Emericella nidulans] 1E-154 547
difj9f11 EAA78294 NP_173921 choline transporter-related [Arabidopsis thaliana] 4E-21 105
contig20 EAA78329 dbj BAB78511 cystathionine beta-synthase [Pichia pastoris] 4E-34 144
difj6h09 EAA78365 CAA75926 acetyl-CoA carboxylase [Emericella nidulans] 0 8235
difj2b01 EAA78417 AAB51228 short-chain alcohol dehydrogenase [Aspergillus parasiticus] 8E-30 132
difj8f11 EAA78417 AAB51228 short-chain alcohol dehydrogenase [Aspergillus parasiticus] 8E-30 132
difj8h11 EAA78417 AAB51228 short-chain alcohol dehydrogenase [Aspergillus parasiticus] 8E-30 132
difjaa06 EAA78500 emb CAD11898 subtilisin-like serine protease PR1C [Metarhizium anisopliae var. anisopliae] 0 962
difj3c06 EAA78529 ref NP_596430 transmembrane transporter liz1p. Sugar phosphate permease [Schizosaccharromyces pombe] 1E-76 289
difj5c08 EAA78639 ref XP_327956 GLUCOAMYLASE PRECURSOR [Neurospora crassa] 1E-166 586
difj3f09 EAA78652 emb CAB06078 AmMst-1 monosaccharide transporter [Amanita muscaria] 6E-53 210
difj1d07 EAA78729 dbj BAC54259 histone H2B [Rosellinia necatrix] 4E-48 190
difj5g07 EAA78730 CAA75581 histone H2A [Aspergillus niger] 4E-42 171
difj4f08 EAA78738 CAE00849 purine transporter [Emericella nidulans] 0 650
contig69 gb AAO73810 heat shock protein CLPA [Paracoccidioides brasiliensis] 7E-04 44
contig98 gb AAO73810 heat shock protein CLPA [Paracoccidioides brasiliensis] 3E-73 275
186
Annexes

difj1d06 gb AAO73810 heat shock protein CLPA [Paracoccidioides brasiliensis] 2E-17 89
difj6e11 gb AAO73810 heat shock protein CLPA [Paracoccidioides brasiliensis] 7E-65 246
difj8h08 gb AAR09756 Ribosomal protein L37e [Drosophila yakuba] 8E-05 48
difj1d10 gb AAS10167 acidic amino acid permease [Penicillium chrysogenum] 1E-05 50
difj7d02 emb CAA03987 GTP-binding protein (Ran) [Neurospora crassa] 3E-44 116
difj1a08 ref NP_491690 aminotransferase, class I and II family member [Caenorhabditis elegans] 3E-37 155
contig88 ref NP_983969 ADL127Cp Ribosomal Proteins L2, RNA binding domain [Eremothecium gossypii] 2E-57 127
difj1g02 ref NP_984912 AER052Wp Ribosomal protein S14 [Eremothecium gossypii] 2E-08 60
difj4f05 sp O42784 Guanine nucleotide-binding protein alpha subunit [Colletotrichum trifolii] 1E-102 371
contig93 sp P42041 Aldehyde dehydrogenase (ALDDH) (Allergen Alt a 10) [Alternaria alternata] 6E-82 184
difj5h09 EST
difj1a09 EST
difj2g11 EST
difj4d02 EST
difj4h04 EST
difj6h02 EST
difj7g10 EST
difj8c02 EST
difj8d08 EST
difj8e11 EST
difj9a02 EST
difj9d03 EST
difj9d08 EST
difjac05 EST
difjbb03 EST
difjbd08 EST
difjbd10 EST
difjbd12 EST
187
Identification et caractérisation des Fusarium isolés
sur des plants de Houblon en dépérissement
HATSCH D.@ ; PHALIP V. ; JELTSCH J.M.
Introduction :
Le houblon, Humulus lupulus L., est une plante pérenne dioïque dont
les fleurs femelles sont utilisées comme épice aromatique dans les
processus brassicole. La région Alsace assure 1,3% de la production
mondiale. Cependant le houblon est sujet à des épisodes pathologiques
se traduisant par le dépérissement des lianes et par conséquent des
pertes importantes de rendement. Une collection de champignons
filamenteux a été crée à partir de prélèvements effectués sur des plants
de houblon malades. Au sein de cette collection, 12 souches présentent
des éléments caractéristiques du genre Fusarium : couleur et
morphologie des macroconidies. Une des souches est F.graminearum.
Microséquençage de peptide :
Lors de la culture de F.graminearum en milieux M3 supplémenté en carboxy-methyl-cellulose (CMC), une protéine ayant une activité cellulolytique est excrétée. Après
digestion trypsique de cette enzyme, les fragments ont été microsequencés. Trois peptides ont été obtenus : FG1-1, FG1-2 et FG1-3. Nous avons utilisé ces résultats
pour développer pour mettre au point une méthode d’identification basée sur deux approches.
Approche protéique : Approche nucléique :

Un anticorps a été obtenu par injection du peptide FG1-1 chez le lapin. Des primers dégénérés ont été dérivés des peptides : FG1-1 ; FG1-2.
Cet anticorps permet la détection spécifique de Cellobiohydrolase-C du Ils ont permis d’amplifier une partie du gène de la
genre Fusarium. cellobiohydrolase-C chez tous les Fusarium de la collection, dont les
séquences ont été déterminées.
Western : CAPS :
La détection par western blot des Cellobiohydrolases-C contenues dans les A partir des alignements de séquence des primers spécifiques consensus
surnageants de culture M3+CMC, permet la détermination de 4 profils ont été determinés menant à une amplification chez tous les Fusarium.
identifiants 3 espèces et un doublet de deux espèces. L’étude des alignements des séquences a permis de mettre au point une
méthode de distinction entre espèces du genre Fusarium par Cleaved
Amplified Polymorphic Sequence (CAPS). Les différences étant
majoritairement dues à la présence d’un intron dans la séquence
amplifiée.
F.sp F.sa F.gr F.ve F.av
F.sp : Fusarium sporotrichioides ; F.sa : Fusarium sambucinum ; F.gr : Fusarium graminearum ; F.ve :
B : BsmAI ; H : HphI ; E : EcoRI ; ND : non digéré
Fusarium venenatum ; F.av : Fusarium avenaceum
Identification par combinaison des deux approches

F.sp : Fusarium sporotrichioides ; F.sa : Fusarium sambucinum ; F.gr : Fusarium graminearum ; F.ve : Fusarium venenatum ; F.av : Fusarium avenaceum ; F.tr : Fusarium tricinctum
Phylogenie
basée sur une partie
de la séquence de
Conclusions / perspectives :
Cellobiohydrolase-C.
La combinaison des l’analyses CAPS et western :
$ permet une identification de six espèces de Fusarium en quelques jours à
partir de souches isolées.
$ à terme permettra l’identification en quelques jours à partir d’un échantillon
de plante en dépérissement, fournissant un diagnostic rapide aux producteurs de •Phanerochaete chrysosporium :
houblon. champignon cellulolytique
•Clostridium cellulolyticum :
Bactérie cellulolytique
Laboratoire de Phytopathologie / UMR 7100 / ESBS - bd Sebastien Brant - F67400 ILLKIRCH – Contact : [email protected] 188
web : phytopathologie.u-strasbg.fr
Data mining : finding specific genes in a phytopathogenic fungus.
A case study : Fusarium graminearum’s xylanases.
Didier HATSCH*, Vincent PHALIP, Jean-Marc JELTSCH
Introduction : Fusarium graminearum is a widespread phytopathogenic filamentous fungus. It infects several plants of
agricultural value : wheat, barley and rice, causing serious crop losses. Moreover, on a local level, we have found some
specimens on diseased hops (Humulus lupulus L.). The genome of this fungus was released by the Whitehead
Institute/MIT, Center for Genome Research (WI-CGR) on May 1st 2003. In order to quickly identify protein candidates
implicated in phytopathogenesis among these crude data, a combination of approaches has been developed in our
laboratory. Cell Wall Degrading Enzymes are often implicated in phytopathogenesis; among these we focused on
xylanases (EC 3.2.1.8/32/136, ≈300 amino acids), as some of them are overexpressed during plant infection.
Humulus lupulus L.
F. graminearum
ORF prediction : using getorf from the EMBOSS package

71654 ORFs found coding for peptides of more than 100aa
All predicted ORFs are blasted against nr All translations of the predicted ORFs are bundled into a
(all non-redundant GenBank CDS translations + PDB + SwissProt + PIR + PRF) blast compatible database
E-value E-value
10-3 10
Hits : Hits :
16009 63494
The blast results are bundled into a MySQL database for

easy handling
Already known Xylanases

from other Fusarium species Qu e
ry :
p
n ase epti
d e se
yla que
:x nce
ery
Qu
Blast search in the
Word search in translated-ORF
blast results database
Retrieval : 36 Sequence candidates
Fusarium.145_238 [44573-44088] (REVERSE SENSE)
Orientation
Genomic contig
number ORF Position within the contig
number
Sequence analysis : each candidate is analyzed by hand: putative START, STOP codons and introns are predicted in order
to deduce the full coding cDNA sequence. 25 putative xylanase genes out of 36 original sequence candidates were able to be
determined using to this method.
Amplification of deduced
Xylanase 21 Validation of the candidates : mRNA was extracted from a culture of F. graminearum grown on hop cell walls. The
cDNA predicted cDNA were successfully amplified through RT-PCR, cloned and sequenced. Therefore, the gene products of the 22
Genomic targets are no longer putative but expressed proteins.
Perspectives : The cloned cDNAs have to be expressed in order to confirm xylanase activity. Furthermore, the implication in
pathogenesis of these candidate genes will be investigated through expression pattern under different conditions using macro arrays.
Finally, the implication of each of these genes in plant pathogenesis will be tested by gene knock-out.
Conclusion : The data mining method presented uses basic bioinformatic methods. Search parameters have to be well defined (ORF size, E-value, words).
Although it is possible that we could miss some candidates, we have set up very stringent parameters to obtain reliable results : 25 expressed genes out
expressed of 36 sequence candidates. This method appears to be powerful and could be applied to other targets than xylanases.
The tools are available at: http://biotec.u-strasbg.fr
Laboratoire de Phytopathologie / UMR7100

Boulevard Sébastien Brant BP 10413 – F-67412 Illkirch Cedex 189
http://phytopathologie.u-strasbg.fr
Journée du Réseau de Mycologie
Nancy (FR)15 janvier 2003
The genes encoding cellobiohydrolase-C and topoisomerase II

used as targets for phylogenetic analysis and identification of
Fusarium at a species level.
Hatsch D., Phalip V., Jeltsch J.-M.
UMR 7100 / IFR 85 – Laboratoire de phytopathologie – ESBS – Boulevard Sébastien

Brant – 67 400 Illkirhc-Graffenstaden
rDNA is a widely used target for phylogenetic studies and molecular identification
techniques, but is sometimes insufficient. However the use of other target sequences
may allow more reliability and accuracy.
The partial sequence of the Cellobiohydrolase-C gene of 17 Fusarium was cloned and
sequenced. The genomic fragments ranged from 327 to 344bp and contained one intron
inducing the length variability. These sequence data allow completing of our CAPS
method based on this region (actualized data on : http://biotec.u-strasbg.fr).
Moreover a genomic fragment of 724bp coding for the ATP binding domain of the
topoisomerase II gene have been cloned and sequenced for the 11 Fusarium species of
our collection. In addition a fragment ranging from 1123 to 1157bp containing ITS1,
5.8S rDNA, ITS2 and the 5’ end of the 28S rDNA was cloned and sequenced for all the
species, confirming the previous identification.
Phylogenetic analyses of aligned sequences obtained though the three targets show
strongly congruent results. The three phylogenetic trees build with the data gained from
the three regions showed the same topology. The variability found in the topoisomerase
II and cellobiohydrolase-C gene part is high enough to clearly separate the 11 Fusarium
species.
In conclusion these two new genetic markers can be seen as valuable for the
identification and phylogenetic study of the Fusarium species.
190
Résumé
Fusarium graminearum est un agent pathogène de première importance pour les
cultures céréalières. Cette espèce n’est pas répertoriée comme pathogène du houblon
(Humulus lupulus L.), cependant elle a été retrouvée en Alsace sur cette plante lors d’épisodes
de dépérissement. Une technique d’identification des espèces du genre Fusarium basée sur la
cellobiohydrolase-C associant une méthode CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic
Sequence) et une analyse par western blot a été mise au point. Elle permet d’identifier
rapidement et à moindre coût 11 espèces de Fusarium. Dans le but d’améliorer la fiabilité de
l'identification nous avons retenu un autre marqueur moléculaire : la topoisomérase II. Ces
deux nouveaux marqueurs ont été validés et se montrent plus pertinents dans la détermination
des espèces du genre Fusarium que l'ADNr. Une approche de génomique a permis de prédire
et de valider 22 gènes codant putativement pour des xylanases. Lors d’une approche
transcriptomique quantitative, l’expression des différents gènes a permis de mettre en
évidence l’implication majoritaire de 4 xylanases dans la dégradation de parois végétales. La
construction et le criblage aléatoire d’une banque suppressive soustractive a mis en évidence
de nombreuses CWDE (Cell Wall Degrading Enzymes) et confirmé l’implication des
xylanases majoritaires dans la dégradation des parois végétales. De plus des gènes candidats
potentiellement impliqués dans la pathologie ont également été révélés. Ce travail est une
première exploration du couple Humulus lupulus / Fusarium graminearum comme modèle
d’étude. L'apport des marqueurs moléculaires permet d'entamer une nouvelle approche des
populations de Fusarium sur des plants de houblon. L’identification de CWDE étant activées
lors du processus infectieux permet d'engager la recherche d'inhibiteurs de ces enzymes, afin
de comprendre et de contrôler la pathologie.
Abstract
Fusarium graminearum is a pathogen of first importance for cereal crops. This species
is not described as a hop (Humulus lupulus L.) pathogen, however it was found in Alsace on
this plant during decay episodes. An identification method of the species of the genus
Fusarium based on the cellobiohydrolase-C and combining CAPS (Cleaved Amplified
Polymorphic Sequence) analysis and western blot has been developed. This method allows
the quick and reliable identification of 11 species of Fusarium. We investigated another
molecular marker: the topoisomerase II. These two novel markers showed a better accuracy in
the determination of Fusarium species than the rDNA. Through a genomic strategy, 22 genes
coding putatively for xylanases were predicted and validated. A transciptomic approach,
allowed the determination of gene expression profile of the predicted genes and underlined
the major implication of 4 xylanases in cell wall degradation. The construction and random
sequencing of a subtractive suppressive library highlighted several CWDE (Cell Wall
Degrading Enzymes) and confirmed the implication of the major xylanases in the degradation
of plant cell walls. Moreover gene candidates putatively implicated in pathologies have also
been revealed. This work is a first step in the study of the Humulus lupulus / Fusarium
graminearum system as a model. The two novel molecular markers allow a new insight in
fungal communities on hop plants. The identification of CWDE putatively implicated in
pathologies will lead to the design of inhibitors in order to understand and control the
pathological process.

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Présentée pour obtenir le grade de

Interaction hôte/pathogène : étude du modèle Humulus

Soutenue publiquement le 14 décembre 2004

Je leur présente ici toute ma gratitude ainsi que mon amitié.

LISTE DES FIGURES ................................................................................................... 8

LISTE DES TABLEAUX............................................................................................. 10

LISTE DES ABRÉVIATIONS .................................................................................... 11

INTRODUCTION GENERALE ................................................................................. 12

CHAPITRE I – DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES ET PRESENTATION DU

I. 1. LE MODELE D’ETUDE ............................................................................................ 15

CHAPITRE II – IDENTIFICATION ET MARQUEURS PHYLOGENETIQUES

II. 1. IDENTIFICATION DES ESPECES DU GENRE FUSARIUM ............................................ 59

CHAPITRE III – GENOMIQUE APPLIQUEE DU CHAMPIGNON FUSARIUM

III. 1. PROBLEMATIQUE ................................................................................................ 70

CHAPITRE IV – TRANSCRIPTOMIQUE DU CHAMPIGNON FUSARIUM

IV. 1. SUIVI DE L’EXPRESSION DES XYLANASES ........................................................... 70

CHAPITRE V – CONCLUSION ET PERSPECTIVES........................................... 70

V. 1. IDENTIFICATION ET MARQUEURS PHYLOGENETIQUES .......................................... 70

CHAPITRE VI – MATERIELS ET METHODES ................................................... 70

RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................... 70

ANNEXE 1 – MILIEUX DE CULTURE ................................................................... 70

ANNEXE 2 – FAMILLE DE FONGICIDES ET LEUR CIBLES........................... 70

ANNEXE 3 - LISTE DES AMORCES ....................................................................... 70

ANNEXE 5 - CALCUL DE Q-RT-PCR RELATIVE ............................................... 70

ANNEXE 6 – LISTE DES 537 EST DE LA BANQUE SUPPRESSIVE

POSTER 1 : Identification et caractérisation des Fusarium isolés sur des plants de

Fig. 1. Liane de Houblon.......................................................................................................... 16

Tableau. 1. Liste des champignons dont le génome est séquencé............................................ 50

BLAST : Basic Local Alignement Sequence Tool

Fusarium graminearum (téléomorphe Gibberella zeae) est un ascomycète de l’ordre des

Chapitre I – Données bibliographiques et présentation du

I. 1. 1. La plante modèle : Humulus lupulus, L.

collections de plants sauvages. La multiplication par propagation végétative s’applique

Fig. 1. Liane de Houblon.

Fig. 2. Fleur mâle du houblon.

Fig. 3. Fleur femelle du houblon.

Fig. 4. Exemplaire hermaphrodite présentant les deux types d’inflorescences sur

Fig. 5. La culture du houblon en Alsace.

La récolte du houblon s’étale de mi-août à mi-septembre en fonction des variétés

Fig. 6. Houblonnières alsaciennes.

I. 1. 1. 4. Pathologies fongiques du houblon

Pseudoperonospora humuli est un parasite obligatoire du houblon. Il passe l’hiver sous

Fig. 7. Feuille de houblon infectée par Pseudoperonospora humuli.

Fig. 8. Feuille de houblon infectée par Sphaerotheca humuli.

Fig. 9. Feuille de houblon infectée par Verticillium albo-atrum.

I. 1. 1. 4. 5. Autres maladies d’origine fongique

I. 1. 1. 4. 5. 5. Fusarium sambucinum et F. avenaceum

I. 1. 2. Le champignon modèle : Fusarium graminearum

Fig. 10. Apparence de Fusarium graminearum en culture in vitro.

I. 1. 2. 1. 2. Cycle sexuel de Gibberella zeae

I. 1. 2. 1. 3. Spores de Fusarium graminearum

Fig. 12. Différents types de spores de Fusarium graminearum.

L’étude d’un organisme pathogène implique de maîtriser son identification. De plus,

La classification des champignons est historiquement basée sur de nombreux caractères

(Botstein et al., 1980) et la combinaison PCR et RFLP : analyse du polymorphisme de

ETS 18S ITS1 5.8S ITS2 28S IGS

Fig. 14. Cycle infectieux de Fusarium graminearum sur les céréales.

I. 1. 2. 3. 1. Cycle infectieux de Fusarium graminearum