Université Mohamed Khider-Biskra

Faculté des sciences exactes et des sciences de la

nature et de la vie
Département des sciences de la nature et de la vie

Génie génétique

Mr. BENSLAMA A.

2016/2017
Génie génétique

Introduction

Le génie génétique est un ensemble de techniques de biologie moléculaire

permettant d‘étude de matériel génétique. Ces techniques ont fourni à la médecine
et à l'industrie un moyen efficace de produire en grandes quantités des protéines
spécifiques, qui, auparavant, n'étaient disponibles (si elles l'étaient) qu'en quantité
extrêmement faibles. Ces techniques ont permis également d'étudier la régulation de
leur expression et ainsi de mieux comprendre le développement de maladies
génétiques.

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Génie génétique

Les outils de génie génétique

Les vecteurs
Les cellules hôtes

Génie génétique

Les enzymes Les sondes

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Génie génétique

Les cellules hôtes

Les cellules qui sont habituellement transfectées par des vecteurs contenant des
fragments d’ADN, sont destinées à permettre d’amplifier ce vecteur en même temps
que leur croissance.

Des bactéries comme Escherichia coli sont utilisées pour recevoir des plasmides.
Certaines souches de cette espèce sont plus particulièrement développées pour
permettre la transfection de certain vecteurs : souche DH5α pour les plasmides
pUC18 ou pUC19, HB 101 pour le plasmide pBR322, souche JM 109 dépourvue
d’opéron lactose pour les vecteurs à β-galactosidase.

Des levures comme Saccharomyces cerevisiae (levure de bière) ou Pichia pastoris

sont utilisées pour des vecteurs eucaryotiques, ainsi que des végétaux : Spodoptera
frugiperda ou Trichoplusiani.

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Les cellules hôtes

Les cellules animales en culture du hamster doré : CHO (Chinese hamster ovaries) ou
BHK (baby hamster kidneys) ou de la souris : lignée 3T3 peuvent recevoir des vecteurs
spécifiques. Certaines lignées de cellules humaines en culture (cellules HeLa) peuvent
aussi être employées.

Les vecteurs

Ce sont des molécules d’ADN construites à partir de plasmides ou de virus

(cosmides), qui permettent le transfert de gènes entre cellules.

Les plasmides sont des petites molécules circulaires d'ADN

double brin, ils portent certains gènes fonctionnels (tels que des
gènes de résistance à certains antibiotiques). L'une des plus
célèbres constructions est celle du plasmide pBR 322 (Bolivar et
Rodriguez), de très nombreux vecteurs utilisés actuellement en
sont dérivés. Il’y’a a plusieurs classes de plasmides.

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Les vecteurs

Les phages sont des virus qui infectent les bactéries. Deux phages sont très utilisés
comme vecteurs: le phage lamba et le phage M13 (mais maintenant les phages
dérivés de ces deux phages). Les séquences de ces phages utilisés comme vecteurs
sont connues (40 à 50 kb d'ADN double brin). Les extrémités de cet ADN sont simples
brins sur une longueur réduite, et complémentaires l'une de l'autre et surtout
formant des extrémités cohésives. Ces séquences sont appelées séquences cos (pour
cohésives).

Le phage lambda (Enterobacteria phage λ) est un virus bactériophage qui infecte la

bactérie Escherichia coli. Ce bactériophage est un virus à ADN double brin.

Le bactériophage M13
. est un phage dont la forme libre est constituée d’une
membrane entourant un ADN simple brin de 6,4 kilobases

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Les vecteurs
Les phages

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Les sondes

C’est la propriété d’appariement des acides nucléiques, selon les lois de la

complémentarité entre deux séquences de bases qui a permis d’élaborer cette méthode
de détection des fragments. Il suffit de disposer d’une copie fidèle et pure d’un gène pour
repérer la séquence complémentaire sur le génome. Cette copie, appelée sonde, est
spécifique, c’est-à-dire qu’elle ne peut s’hybrider qu’avec le gène dont elle est la copie. Il
convient d’abord de dissocier, par chauffage à 100°C, les brins d’ADN qui composent le
gène, afin qu’ils se ré associent avec la sonde.
Le " marquage " de la sonde par des isotopes radioactifs; et plus rarement par des
marqueurs non radioactifs, dits froids repérables au moyen d’anticorps; permet de la
suivre jusqu’à son point de fixation.

Pour pouvoir reconnaître spécifiquement une séquence d'ADN, on utilise au laboratoire

un petit morceau d'ADN synthétisé (sonde) dont la séquence correspond au moins en
partie à celle d'un des brins du DNA. Parce qu'elle est complémentaire de l'autre brin du
DNA, la sonde est capable de se fixer spécifiquement sur l'autre brin à l'endroit où se lit la
séquence complémentaire. En marquant cette sonde par un atome radioactif ou par une
molécule fluorescente liés covalentiellement à un des nucléotides de la sonde, on peut
détecter la sonde et le morceau d'ADN complémentaire qui lui est hybridé.

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Les sondes

Un fragment de DNA double brin affecte normalement une structure secondaire en

double hélice. En élevant la température , ce qui dénature partiellement la double
hélice. Lorsque la température atteint 95°C. toutes les liaisons hydrogène sont
rompues et la dénaturation de l'ADN est complète : ADN simple brin, qualifié de «
dénaturé ». En refroidissant brutalement (glace) les structures secondaires ne se
reforment pas et l'ADN reste dénaturé. Si on refroidit doucement, la double hélice se
reforme progressivement. Un oligonucléotide (sonde) ajouté à ce moment peut
s'hybrider avec un fragment complémentaire de l'ADN, dès que la température
descend en-dessous d'un certain seuil. L'hybridation d'une sonde marquée (atomes
radioactifs, radicaux fluorescents ou ligands spécifiques) sur un ADN dénaturé
permet de marquer spécifiquement tous les fragments de ce t ADN dont la séquence
est complémentaire de la sonde.

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Les sondes

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Les enzymes

Il ’y a plusieurs enzymes

Les nucléase

Une nucléase est une hydrolase qui clive les liaisons phosphodiester de brins d'acides
nucléiques entre deux nucléotides, Il existe 2 types de nucléases

Les nucléase Exonucléases

Ces enzymes éliminent des nucléotides un à un à partir d'une extrémité de l'ADN. Il

en existe différents types, par exemple la Bal31,

Les nucléase Endonucléase

Les endonucléases sont des nuclease capables de couper au milieu de la chaîne, par
opposition aux exonucléases qui n'attaquent que les nucléotides situés aux
extrémités des fragments. Il en existe différents types: à clivages non spécifiques et à
clivages spécifiques (les enzymes de restriction)

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Les enzymes

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Les enzymes Les enzymes de restriction

Les enzymes de restriction sont des endonucléase qui peuvent couper un fragment
d'ADN au niveau d’un endroits spécifique ou d'une séquence de nucléotides
caractéristique appelée site de restriction (4 à 6 paires de bases).
Plusieurs centaines d'enzymes de restriction sont actuellement connues, on en
retrouve naturellement dans un grand nombre d'espèces de bactéries.

Fut étudié par W. Arber à l’Université de Genève dans les années 60. Il obtint avec D. Nathans et
H. Smith le prix Nobel de Médecine en 1978 pour la découverte et les applications des enzymes
de restriction.

Les enzymes de restriction sont produites par des bactéries et constituent un

mécanisme de défense contre les infections par les bactériophages, des virus
spécifiques des bactéries. Lorsque le virus injecte son ADN dans le micro-organisme,
celui-ci est coupé par l'enzyme de restriction au niveau de ses sites spécifiques. La
destruction du génome du virus bloque ainsi l'infection. Le nom d'enzyme de
restriction provient de ce mécanisme.

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Les enzymes Les enzymes de restriction

Pour éviter que l'enzyme de restriction ne coupe l'ADN de son propre génome, la
bactérie fabrique aussi une deuxième enzyme appelée méthylase qui reconnaît
également le site de restriction. La méthylase ne coupe pas l'ADN, mais le modifie en
lui rajoutant un groupement méthyle sur un ou plusieurs nucléotides du site. Cette
méthylation empêche la coupure par l'enzyme de restriction. Les ADN bactériens,
pour échapper à l’action de leurs propres endonucléases de restriction, sont
méthylés sur le C5 de certaines Cytosines et sur le N7 de quelques Adénines.
Propriétés

Les enzymes de restrictions appartiennent à la classe des endonucléases, c'est-à-dire

des enzymes capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nucléotides à
l'intérieur de la chaîne d'un acide nucléique, et plus spécifiquement appartiennent à
la classe des endodésoxyribonucléases puisque spécifique à l'ADN. Les
endonucléases diffèrent des exonucléases, puisqu'elles peuvent cliver les brins
d'acide nucléique de manière interne, alors que les exonucléases n'attaquent la
molécule d'acide nucléique qu'au niveau de ses extrémités.

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Les enzymes Les enzymes de restriction

Propriétés

Les enzymes de restriction sont capables de reconnaître spécifiquement et

uniquement une courte séquence de l'ADN de 4 à 10 paires de bases, et de cliver les
deux brins du duplex d'ADN au site reconnu. Cette propriété a depuis longtemps été
utilisée en biologie moléculaire, puisqu'elles permettent de fragmenter l'ADN en
segments de taille réduite en coupant à des sites définis.

Les enzymes de restriction peuvent être utilisées pour établir une carte génétique
(appelée « carte de restriction ») d'une molécule d'ADN. La carte de restriction
donne l'ordre des sites de restriction le long de cette molécule, et la taille des
fragments produits. Cette technique de caractérisation des acides nucléiques, très
utilisée voici une vingtaine d'années, est supplantée par le séquençage direct,
devenu bien moins coûteux et réalisé de façon routinière.

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Les enzymes Les enzymes de restriction

Propriétés

Elles peuvent être également utilisées pour faire produire à des cellules hôte (par
exemple la bactérie Escherichia coli ) une protéine exogène. Les enzymes de
restriction jouent un rôle crucial dans ce processus car elles permettent, en coupant
le brin à un endroit précis et de manière asymétrique, l'intégration d'un brin d'ADN
spécifique codant pour une protéine précise dans un plasmide dans le but de
l'exprimer dans une bactérie. Cette intégration peut être faite, profitant de
l'asymétrie créée par l'enzyme de restriction, en jouant sur l'homologie de séquence
au site de clivage == site d'intégration.

Selon la relation spatiale entre la séquence reconnue et le lieu de coupure, il est

possible de distinguer trois types d'enzymes de restriction.
Les enzymes de type I et de type III reconnaissent une séquence d'ADN spécifique et
coupent en un endroit aléatoire, d'une distance d'environ 1 000 paires de bases (pb)
pour le type I et de 25 pb pour le type III plus loin que le site de restriction. Ces 2
types ont également une activité méthylasique en plus de leur activité
endonucléasique, ce qui les différencie du type II.
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Les enzymes Les enzymes de restriction

Propriétés

Les enzymes de type II, les plus utilisées, reconnaissent une séquence spécifique et
coupent en un endroit spécifique de cette séquence. Quelques exemples de ces
enzymes figurent ci-dessous.
De manière générale, les enzymes de restriction sont bloquées par le monoazide
d'éthidium.

Lorsqu’une endonucléase de restriction coupe un ADN, le résultat peut être

soit une coupure franche c'est-à-dire au même niveau sur les deux brins ; ce sont les
bords ou les bouts francs : la coupure a lieu au milieu du site de restriction. Il ne peut
pas y avoir de liaison spontanée entre les fragments qui ont résulté de cette coupure.
Seule une T4 ligase peut rétablir la ligation des deux brins d’ADN résultant de la
coupure.

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Les enzymes Les enzymes de restriction

Propriétés

soit une coupure décalée (cohésive) sur les deux brins. On parlera alors d’extrémités
cohésives. Les bouts des deux ADN obtenus ne sont plus francs; ce sont des bouts
collants ou bouts cohésifs. Les coupures sont décalées l’une par rapport à l’autre sur
les deux brins. Les parties simples brins peuvent s’apparier, d’où la possibilité de lier
des fragments d’ADN d’origine différentes :
c’est le phénomène de la recombinaison génétique.

une coupure franche

coupure décalée (cohésive)

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Les enzymes Les enzymes de restriction

Nomenclature

La nomenclature des enzymes de restriction est précise. Cette nomenclature n’obéit

pas aux règles de l’IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), mais
dépend de règles spécifiques. Le nom comporte 3 ou 4 lettres correspondant entre
autres à la bactérie à partir de laquelle on a extrait cette enzyme:
 La première lettre est en majuscule cela correspond à la première lettre du genre de la
bactérie

 La seconde et troisième lettre sont en minuscule et correspondent aux deux premières

lettres de l'espèce bactérienne

 La quatrième lettre correspond à la souche bactérienne, elle est écrite en majuscule mais
n'est pas présente dans toutes les enzymes de restriction

 Enfin un chiffre romain donne le numéro d'ordre de caractérisation de l'enzyme

EcoRI : Enzyme de restriction d'Escherichia (genre) coli (espèce) souche RY317 la première à
être caractérisée (I)
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Les enzymes Les enzymes de restriction

Classification

Il existe trois types d’endonucléases classés en fonction des sites qu’elles

reconnaissent :

1. enzymes de type I : l’enzyme reconnaît un site particulier qui n’a aucune symétrie,
ne coupe pas l’ADN à ce niveau mais à environ 1000 jusqu’à 5000 nucléotides plus
loin et libère plusieurs dizaines de nucléotides.

2. enzymes de type II : ce sont les plus nombreuses et les plus utilisées aux
laboratoires de génie génétique. Leurs sites de restrictions de 4 à 8 paires de bases
sont des séquences palindromiques (se lisent de droite à gauche et inversement,
comme le mot radar et la phrase "esope reste ici et se repose"). Elles coupent au
niveau de leurs sites de restriction.

3. enzymes de type III : L’enzyme reconnaît une séquence mais coupe à une vingtaine
de paires de bases plus loin

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Les enzymes de restriction Exemples d'enzymes de type II

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Les enzymes de restriction Exemples d'enzymes de type II

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Génie génétique

Les enzymes Les ADN ligase

les ADN ligases (EC 6.5.1.1) sont des enzymes de la classe des ligases qui catalysent la
formation d'une liaison phosphodiester entre deux segments d'ADN. Les ADN ligases
interviennent dans plusieurs processus cellulaires essentiels du métabolisme de
l'ADN : dans la réplication de l'ADN et dans la recombinaison homologue.

Les polynucléotide kinase

La polynucléotide kinase catalyse le transfert du phosphate γ de l’ATP sur une

fonction alcool du carbone 5’ d’un ADN ou d’un ARN. Le substrat requiert une
déphosphorylation préalable si la fonction est estérifiée. L’enzyme catalyse aussi
l’échange du phosphate 5’ terminal d’un ADN ou d’un ARN avec le phosphate γ de
l’ATP, en présence d’ADP comme accepteur de phosphate.

La polynucléotide kinase est utilisée au laboratoire pour incorporer du phosphate

radioactif (32P) sur l’extrémité 5’ d’un acide nucléique, soit par transfert, soit par
échange.

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Les enzymes Les ADN ligase

les ADN ligases (EC 6.5.1.1) sont des enzymes de la classe des ligases qui catalysent la
formation d'une liaison phosphodiester entre deux segments d'ADN. Les ADN ligases
interviennent dans plusieurs processus cellulaires essentiels du métabolisme de
l'ADN : dans la réplication de l'ADN et dans la recombinaison homologue.

Les polynucléotide kinase

La polynucléotide kinase catalyse le transfert du phosphate γ de l’ATP sur une

fonction alcool du carbone 5’ d’un ADN ou d’un ARN. Le substrat requiert une
déphosphorylation préalable si la fonction est estérifiée. L’enzyme catalyse aussi
l’échange du phosphate 5’ terminal d’un ADN ou d’un ARN avec le phosphate γ de
l’ATP, en présence d’ADP comme accepteur de phosphate.

La polynucléotide kinase est utilisée au laboratoire pour incorporer du phosphate

radioactif (32P) sur l’extrémité 5’ d’un acide nucléique, soit par transfert, soit par
échange.

ADN polymérase, ARN polymérases et transférases,,,,,,,,,,

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Le clonage

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