REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTI.FIQUE

Université d’Oran des Sciences et de la Technologie Mohamed Boudiaf USTO-MB

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département du Vivant et de L’environnement

Cours: Technique de contrôle microbiologique

A l’usage des étudiants de 3ème Année Licence

Spécialité : Microbiologie

Présenté par : Dr. MERZOUK Yamina

(Enseignante-chercheuse à l’Université d’USTO-MB-)

2021-2022
 Préambule

La recherche de la qualité au sens large est actuellement une préoccupation fondamentale pour
l’industrie agroalimentaire. La qualité se définit à partir de système de référence, exemple :
normes, labels, appellation. Elle s’obtient par l’application de procédures bien définies et
maitrisées. Elle se contrôle par des systèmes de vérification et des techniques d’analyses
standardisées. Au niveau microbiologique, l’hygiène est une donnée fondamentale. Les
objectifs de la sécurité servent à identifier et valider la nature et l’efficacité des suivis de
fabrication, tels que surveillance renforcée à certains points critiques de maitrise, et
d’investigations microbiologiques approfondies. L’ensemble de ces activités visant à réduire la
variabilité des résultats obtenus et la probabilité de mettre sur le marché des produits non
satisfaisants. Dans ce contexte l’analyse microbiologique des produits finis reste indispensable,
car elle permet avec une certaine inertie d’éviter, dans le cas où des produits dangereux ou non
conformes seraient fabriqués, leur commercialisation ou leur consommation. Ce type de
contrôles est souvent pratiqué par des laboratoires officiels.
Table des matières

Listes des abréviations

Listes des figures
Listes des tableaux
Introduction……………………………………………………………………………... 01
I- Objectifs du contrôle microbiologique……………………………………………….. 02
I.1 - Définition de la qualité…………………………………………………………….. 02
I.1.1 Qualité hygiénique………………………………………………………………… 02
a. Infections alimentaires……………………………………………………........... 03
b. Toxi-infections alimentaires…………………………………………………….. 03
c. Intoxications alimentaires……………………………………………………….. 03
I.1.2 Qualité technologique……………………………………………………………... 04
II. Politique de contrôle…………………………………………………………………. 04
II.1 Niveaux de contrôle………………………………………………………………… 04
II.2 Fréquence des contrôles…………………………………………………………….. 04
II.3 Paramètres à contrôler……………………………………………………………… 05
II.3.1 Microorganismes responsables d’une altération de la qualité hygiénique……….. 05
a. Bactéries pathogènes………………………………………………………......... 05
b. Bactéries témoins de contamination………………………………….………….. 05
II.3.2 Microorganismes responsables d’une altération de la qualité marchande….............. 05
II.4 Méthodes de contrôle……………………………………………………………….. 06
II.4.1 Techniques microbiologiques de culture…………………………………………. 06
II.4.2 Techniques microscopiques………………………………………………………. 06
II.4.3 Techniques microbiologiques………….……………………………………… 06
III. Prélèvement, transport et préparation des échantillons……………………………… 06
III.1 Les aliments solides………………………………………………………………... 07
a. Prélèvement en bateau……………………………………………………........... 07
b. Prélèvement dans les citernes (Wagons ou dans des camions)…………………. 07
III.2 Les aliments liquides………………………………………………………………. 08
III.3 Échantillonnage en surface…………………………………………………........... 09
III.4 Techniques de dilution…………………………………………………………….. 10
IV. Techniques classiques de numération des microorganismes………………………... 12
IV.1 Numération microscopique…………………………………………………........... 12
a. Utilisation des cellules à numération…………………………………………… 12
b. La méthode de Breed……………………………………………………………. 13
c. Technique de filtration à épifluorescence directe (DEFT)………………............ 14
d. Numération après passage sur un milieu d’enrichissement…………………….. 14
IV. 2 Numération sur milieu solide……………………………………………………… 15
a. Dans la masse (pour plate)……………………………………………………… 15
b. Étalement en surface (spread plate) ……………………………………………… 15
c. Étalement en surface en spirale (spiral plate) ……………………………………. 15
d. Filtration sur membrane………………………………………………………….. 15
e. Dénombrement par culture en milieu solide……………………………………… 16
IV.3 Numération sur milieu liquide……………………………………………………... 19
V Techniques récentes de numérations…………………………………………………. 22
V.1 la methode ELISA de type sandwich……………………………………………….. 23
V.2 L'immunoséparation magnétique et I'IMS-ELISA……………………………........... 24
V.3 Utilisation de sondes nucléiques……………………………………………………. 25
V.4 Utilisation de l'amplification génique (amplification en chaîne par polymérase
(PCA) ou polymerase chain reaction (PCR)……………………………………………… 25
V.5 ATP-métrie……………………………………………………………………......... 26
VI. Identification phénotypique des germes……………………………………………. 27
VI.1 Caractères culturaux……………………………………………………………….. 27
VI.2 Caractères morphologiques et structuraux………………………………………… 29
a. Coloration de Gram………………………………………………………........... 29
b. Coloration de Ziehl-Neelsen (acid-fast stain)…………………………………… 30
c. Coloration de la capsule ………………………………………………………… 30
d. Coloration des endospores (sporulation) ………………………………………. 30
VI.3 Caractères biochimiques et physiologiques ………………………………………. 30
a. Demande en O2………………………………………………………………… 30
a.1 Aérobie strict………………………………………………………………… 30
 a.2 Anaérobie strict……………………………………………………………… 30
a.3 Anaérobie aérotolérant………………………………………………………. 30
a.4 Anaérobie facultatif…………………………………………………………. 30
a.5 Microaérophile……………………………………………………………… 30
b. Oxydation-fermentation est assimilation des sucres ………………………….. 31
c. Types fermentaires (tests RM / VP)…………………………...……………........ 31
d. Accepteurs de l’H2……………………………………………..…………........... 32
d.1 La sulfito réduction………………………………………………………….. 32
d.2 La réduction des nitates……………………………………………………… 32
e. Enzymes respiratoire ……………………………………………………………. 32
e.1 Catalase……………………………………………………………………… 32
e.2 Cytochrome oxydase………………………………………………………… 32
f. Dégradation des acides aminés ………………………………………………….. 33
f.1 TDA, Tryptophanase et PDA………………………………………………… 33
f.2 L’Ornithine-Décarboxylase (ODC), la Lysine-Décarboxylase (LDC) et
l’Arginine-Décarboxylase (ADH)……………………………………....................... 34
g. Dégradation du lactose ONPG…………………………………………………... 34
h. Dégradation de l’urée Uréase …………………………………………………… 34
i. Caractères biochimiques et physiologiques divers ………………………………. 34
i.1 Mobilité.……………………………………………………………………... 34
i.2 Températures de croissance, halophilie-osmophilie et Ph…………………… 34
i.3 Résistance aux antibiotiques et aux inhibiteurs……………………................. 34
i.4 Caractères immunologiques (sérologique)……………………….………….. 35
i.5 Pouvoir pathogène ………………………………………………….………. 35
- Coagulase…………………………………………………………………….. 35
- Hémolysines α, ß et γ…………………………………………………………. 36
- ADNase………………………………………………………………………. 36
i.6 Galeries API……………………………………………………….…………. 37
- Choix de la galerie……………………………………………………..…....... 37
- Technique……………………………………………………………..……… 38
VII. Réalisation du contrôle………………………………………………………............ 39
VII.1 Contrôle des matières premières …………………………………………………... 39
V.II.2 Contrôle de la fabrication Dans les industries de fermentation…………................ 40
VII.3 Contrôle du nettoyage et de la désinfection ………………………………………. 40
VII.4 Contrôle des produits finis…………………………………………………........... 41
Conclusion………………………………………………………………………………. 43
Références bibliographiques……………………………………………………………. 44
Liste Des Abréviations
AFNOR : Association Française de Normalisation
ISO : Organisation Internationale de Normalisation
NA : Norme Algérienne
H% : Teneur en eau
MS% : Matière sèche
pH : Potentiel d’hydrogène
2√ : Racine carrée
3√ : Racine cubique
SM : Solution mère
DM : Dilution mère
G : Gramme
ml : Millilitre
mm : Millimètre
mm3 : Millimètre cube
cm2 : Centimètre cube
min : Minute
s : Seconde
DEFT : Direct Epi- fluorescent Filter Technique
UFC : unité formant colonie
NPP : Nombre le plus probable
BAAR : Bacilles Acido Alcoolo Résistants
H2O2 : Eau oxygénée
O2 : Oxygène
CO2 : Dioxyde de carbone
C : Carbone
TSE : Tryptone sel eau
VF : Gélose viande foie

PCR : Amplification in vitro de l'ADN (Polymerase Chain Reaction)

BCPL : Bromocresol Purple Lactosé

RM-VP : Rouge de Methyl-Vogs Proskauer
ONPG : Ortho-Nitrophényl-β-Galactopyranoside
St : Staphylococcus
E : Enterococcus
S : Streptococcus
Liste des figures
 Liste des tableaux
Titre Page
Titre Page
Figure
Tableau1 :1Matériels d’échantillonnage.
: Résultats de dénombrement a. Grande pellesolide
sur milieu et pelle à main b .et c sonde cylindrique
19 08
dTableau
et e échantillonnage de fond ou à soupape
2 : Représentation des résultats de recherche des coliformes totaux dans le lait 20
Figure 2 : Echantillonnages : (a) Boites de contact, (b) et (d) lames d'immersion
Tableau 3 : Table de Mac Grady de trois tube par dilution donne pour chaque nombre (c)
10
écouvillons. 20
caractéristique le nombre le plus probable (NPP) dans 1ml de la dilution
Figure 3 :4Protocole
Tableau expérimental
: Dénombrement d'une liquide,
sur milieu dilutioncas
successive de de
de la série facteur
deux10tubes 11
21
Figure 4 :5 Les
Tableau broyeurs
: Table de Grady
de Mac laboratoire : (a)tube
de deux Broyeur à main donne
par dilution (mortier et pilon),
pour chaque(b) broyeur
nombre
électrique à pédale
caractéristique type stomacher,
le nombre (c) broyeur
le plus probable électrique
(NPP) dans 1mltype mortier
de la et pilon, (d) broyeur 22 12
dilution
électrique type à couteaux
Figure 5 : Représentation schématique : (a) quadrillage de la cellule de THOMA (b) cellule
13
de THOMA.
Figure 6 : Représentation schématique : (a) quadrillage de la cellule de MALASSEZ. (b)
13
cellule de MALASSEZ
Figure 7 : Filtration sur membrane : a. montage de filtration, b. filtre membrane après
16
culture
Figure 8 : Compteur de colonies 18
Figure 9 : Culture bactérienne (colonies) 18
Figure 10 : Protocole du test ELISA 24
Figure 11 : Représentation schématique indiquant les différents points ou peut être ajoute
l'ADN compétiteur au cours d'un protocole d'isolation d'ADN à partir d'un échantillon 26
environnemental.
Figure 12 : Appareil d’ATPmétrie 27
Figure 13 : Représentation schématique des caractères fréquemment utilisés pour
29
caractériser macroscopiquement une colonie bactérienne.
Figure 14 : Croissance des bactéries selon la demande en O2. 1. Aérobie strict ; 2. Aero-
31
anaerobie facultative ; 3. Microaerophile ; 4-anaerobie stricte
Figure 15 : Interprétation du types fermentaires (tests RM / VP) 32
Figure 16 : Test de coagulase 36
Figure 17 : Test d’hémolysine (Colonies bêta-hémolytiques de streptocoques du groupe A) 36
Figure 18 : Test ADNase 37
Figure 19 : Guide de choix de la galerie Api (A- Guide pour les bacilles Gram négatif ; B-
38
Guide pour les bacilles Gram positif ; C- Guide pour les cocci Gram positif et négatif).
Introduction

Le contrôle microbiologique est l’opération de vérification de la qualité intrinsèque des produits

alimentaires et non alimentaires, destinés à la consommation et l’utilisation humaine et animale.

Cette opération est la recherche et le dénombrement des microorganismes d’altération et

pathogènes dont la réalisation impose le recours aux méthodes d’analyses en utilisant des
milieux de culture, des réactifs et d’autres équipements.

Le but du contrôle est de garantir une bonne qualité hygiénique et une bonne qualité marchande
et de minimiser les pertes. Il permet d’éviter la présence de microorganismes pathogènes dans
les produits afin de ne pas risquer une altération de la qualité hygiénique des produits finis ou,
au moins de détecter ces microorganismes s’ils sont présents dans les produits finis avant leur
commercialisation. Une altération de la qualité hygiénique met en cause la santé du
consommateur (intoxications alimentaires).

Une altération de la qualité marchande modifie les caractéristiques plastiques et

organoleptiques du produit. Elle n’est pas dangereuse mais rend le produit non
commercialisable. Elle intervient généralement lentement au cours du stockage (levures
osmophiles, par ex.).

Les objectifs visés par cette matière sont la connaissance de l’ensemble des techniques de
contrôle des activités microbiennes (examen microbiologique des prélèvements et des liquides
biologiques, contrôle de qualité, …), l’utilisation et l’amélioration de leurs propriétés
lorsqu’elles sont bénéfiques (levures, yaourt, antibiotiques, vaccins, …).

Ce manuscrit débute par une introduction, ensuite il traite la notion qualité et ses deux
composantes (hygiénique et marchande), ainsi que la politique qualité.

Après, il décrit le prélèvement, le transport et la préparation des échantillons, une fois terminé,
une section est consacrée aux techniques classiques de numération (microscopiques, en milieux
solides et en milieux liquides), mais aussi aux techniques de détection rapide, cette dernière est
non parfaite sans la section ultérieure traitant l’identification phénotypique des
microorganismes en rassemblant les caractères culturaux, morphologiques, biochimiques et
physiologiques. Après cela une autre section dévoile le contrôle des matières premières, des
levains, de la fabrication, de nettoyage et de la désinfection et des produits finis. Enfin, une
section faite aperçu sur la caractérisation et l’évolution de l’analyse microbiologique.

1
I- Objectifs du contrôle microbiologique

Le contrôle microbiologique des aliments a pour objectifs de contrôler les caractères moins
apparents mais fondamentaux d’un produit alimentaire.

I.1 - Définition de la qualité

 La qualité c’est la valeur d’une chose" (langage courant).

 La qualité c’est le degré d'excellence possédé par un produit" (dictionnaire).
 La qualité c’est assurer la conformité d'un produit par rapport à ce qui a été prévu"
(entreprise).
 La qualité est inversement proportionnelle à la variabilité des résultats" (statistique).
 La qualité c’est satisfaire les besoins du consommateur" (M. DEMING).
 La qualité c’est l'aptitude d'un produit à satisfaire ses utilisateurs" (AFNOR).
 La qualité c’est l’aptitude d'un ensemble de caractéristiques intrinsèques à satisfaire des
exigences" (ISO 9000 : 2005).

Donc l'utilisateur d'un aliment (le consommateur), attend plusieurs satisfactions (besoins,
exigences), d’où on a plusieurs composantes (aspects) de la qualité d’un produit alimentaire,
qui sont en nombre de huit principales composantes :

 Les 4 S (Sécurité : hygiénique, Santé : nutritionnelle, Saveur : organoleptique

et Service : usage)

 Les 2 R (Régularité et Rêve) ;

 La T et la E (Technologique et Etique).

I.1.1 Qualité hygiénique

L’absence de microorganismes pathogènes ou leurs toxines susceptibles de nuire à la santé du

consommateur.

La présence de tels microorganismes et de ses composés toxiques conduit à des maladies de

type alimentaire. Suivant la nature de microorganismes en cause, trois cas de maladie peuvent
se présenter :

2
  Infections alimentaires

 Toxi-infections alimentaires

 Intoxications alimentaires

a. Infections alimentaires : ensemble des symptômes après ingestion d’une quantité de

microorganismes altérants vivants dans le produit alimentaire ou dans l’eau. Entéropathogènes
ou virus : Salmonella enterica (Salmonellose), Shigella spp. (Dysenterie Bacillaire), Yersinia
enterocolitica (Yersiniose), E. coli entéropathogène, et infections virales.

b. Toxi-infections alimentaires : ensemble des symptômes après ingestion d’une quantité de

microorganismes pathogènes vivants dans le produit alimentaire et la sécrétion après ingestion
d’une toxine. C’est le cas par exemple de : Clostridium perfringens et Bacillus cereus (Gastro-
entérite) et Vibrio cholerae (Choléra).

Symptômes : Ces deux derniers se manifestent par :

Diarrhées, vomissements, douleurs abdominales et sont associés avec de la fièvre et

des troubles apparaissant après une période moyenne à longue.

c. Intoxications alimentaires : ensemble des symptômes après ingestion d’une quantité de

toxine présente dans le produit alimentaire, le produit est dangereux à consommer, même
si le microorganisme pathogène n’est plus vivant dans le produit. C’est le cas par exemple
des Staphylococcus aureus, Clostridium botulinum (Botulisme), Aspergillus flavus,
Penicillium citrinum.

Symptômes: diarrhées, vomissements, douleurs abdominales, signes neurologiques,

sans fièvre et les troubles apparaissent rapidement

Le contrôle microbiologique de la qualité hygiénique vise à éviter la présence de

microorganismes pathogènes dans le produit alimentaire afin de ne pas risquer sa qualité
hygiénique, ou au moins de détecter ces microorganismes s’ils sont présents avant sa
commercialisation.

3
I.1.2 Qualité technologique

La qualité technologique (marchande) d’un produit alimentaire est l’aptitude de ce produit à la

transformation et à la distribution.

Le contrôle microbiologique de la qualité technologique vise à détecter la présence de

microorganismes pouvant altérer la qualité marchande de produit fini, et de vérifier l’efficacité
de la technologie après leur application, afin de stocker et de commercialiser des produits
alimentaires microbiologiquement stables.

II. Politique de contrôle

Le contrôle microbiologique de la fabrication des produits destinés à la consommation humaine

et / ou animale fait partie d’un système de régulation, dont la fonction est de détecter, le plutôt
possible, toute anomalie de ce système de façon à permettre une réaction préventive destinée à
empêcher toute évolution défavorable de la qualité.

II.1 Niveaux de contrôle

On a trois niveaux de contrôle : avant, en cours et après la fabrication du produit.

 Contrôle préventif : effectué, avant la fabrication, sur les matières premières et les
adjuvants.
 Contrôle en cours de fabrication : effectué sur le produit mais aussi sur le matériel,
les locaux, et le personnel.
 Contrôle sur les produits finis : effectué sur le produit fini afin de conclure sa
conformité aux normes.

II.2 Fréquence des contrôles

La fréquence de contrôle est établie sur la base de l’expérience et les moyens disponibles et en
fonction de type de produit (type de fabrication), même selon le type d’usine (unité de
production). Un contrôle répété permet de déterminer les points critiques.

Exemple:

Cas des laiteries : le contrôle hygiénique officiel des ateliers de traitement prévoit pour le
contrôle du lait selon la quantité de lait traitée et selon les fréquences suivantes

 2 fois par jours si quantité de lait traitée ≤ 5000 l/j

 3 fois par jours si quantité de lait traitée comprise entre 5000 et 10 000 l/j
4
  5 fois par jours si quantité de lait traitée ≥10 000 l/j

Remarque : Les échantillons doivent être prélevés à des intervalles de temps supérieurs à 15
min.

II.3 Paramètres à contrôler

Les microorganismes à contrôler varient suivant la technologie et les caractéristiques

physicochimiques du produit en cours de fabrication et du produit fini, mais cependant, on peut
les répartir en deux groupes :

II.3.1 Microorganismes responsables d’une altération de la qualité hygiénique

a. Bactéries pathogènes : Clostridium spp., Salmonella spp., St. aureus, Streptocoques

fécaux, Escherichia coli, Shigella, Listeria monocytogenes, Bacillus spp., Yersinia
enterocolitica, Campylobacter jejuni.

b. Bactéries témoins de contamination : St. aureus (témoin d’une contamination

cutanéomuqueuse, Streptocoques fécaux, et coliformes fécaux (témoins d’une
contamination fécale).

II.3.2 Microorganismes responsables d’une altération de la qualité marchande

Levures dans les produits sucrés ou les produits acides, moisissures dans les produits peu
hydratés, bactéries lactiques et acétiques dans les produits acides.

Dans l’industrie agro-alimentaire, ce contrôle concerne :

- La matière première avant son entrée à l’usine.

- L’eau utilisée pour le lavage et la transformation des produits.

- Les surfaces des locaux et des ustensiles qui intervient dans le stockage, la découpe ou
tout autre processus de transformation.

- L’air ambiant dans les ateliers de transformation de traitement et des hangars de stockage.

- Le personnel de l’unité qui intervient depuis la réception de la matière première jusqu’au

stockage du produit fini.

- Le matériel de conditionnement et emballage.

5
II.4 Méthodes de contrôle

Les méthodes de contrôles sont devisées en deux :

II.4.1 Techniques microbiologiques de culture qui sont longues, couteuses, et demandent un

délai de réponse très important ;

II.4.2 Techniques microscopiques (état frais, coloration simple : de bleu de méthylène et

double de Gram) qui sont simples, rapides, et de faible cout. Toutefois, la sensibilité de ces
derniers n’étant pas toujours suffisante, donc il est recommandé de faire, en parallèle, un
contrôle par les techniques microbiologiques de culture dites classiques.

II.4.3 Les techniques microbiologiques de culture peuvent, quelques fois, être efficacement
remplacées par le contrôle de paramètres physicochimiques liés à la présence de
microorganismes à l’instar de :

1. La teneur en eau (H%),

2. La matière sèche (MS%),

3. Le potentiel d’hydrogène (pH) et l’acidité.

III. Prélèvement, transport et préparation des échantillons

Il est important que le laboratoire d’analyse microbiologique reçoit un échantillon représentatif

du lot de produit, non endommagé ou modifié lors du transport et du stockage. Et dès lors, il
sera utile de donner les définitions suivantes :

 Produit : la matière qu’on veut analyser.

 Lot : l'ensemble d'individus d'un produit de caractéristiques uniformes.
 Échantillon : une ou plusieurs unités d'échantillonnage prélevées.
 Échantillon global : l’ensemble des unités d’échantillons prélevés du même lot.
 Échantillon pour laboratoire : nombre réduit d’unités de l’échantillon global, de
quantité représentative nécessaire pour analyse au laboratoire (cinq (5) unités pour
l’analyse microbiologique, et trois (3) unités pour l’analyse physicochimique).
 Non endommagé ou modifié : l’échantillon doit être gardé protégé contre toute
contamination provenant de l’environnement, et même conservé dans des conditions
réduisant toute modification du nombre de microorganismes présents.

6
Selon les normes ISO et les normes Algériennes (NA), la majorité des techniques utilisées pour
l'échantillonnage des produits se présentant sous forme préemballée peuvent être résumées dans
trois techniques :

1. Technique des pourcentages : pour les lots considérés très importants (1 %

s’agit d'un grand lot, 10 % lorsqu'il s'agit d'un lot plus au moins petit).

2. Technique de la racine carrée (2√) : pour les lots considérés pas très grands
(2√ de l'effectif du lot).

3. Technique de la racine cubique (3√) : pour les lots considérés assez grands
(3√ de l'effectif du lot).

Exemple: il est réalisé en prélevant un nombre d’échantillons égal à la Ѵ du nombre de

divisions élémentaires, du produit à analyser. Exemple pour un lot de 10 000 boites de
conserves, le nombre d’échantillons est égal à 100.

Toutefois, ce nombre demeure toujours excessif.

III.1 Les aliments solides

Pour mieux expliquer la procédure d’échantillonnage des produits en vrac solide on prend
l’exemple des grains, dont l’échantillonnage se fait avec le matériel suivant : grandes pelle
et pelle à main, sonde cylindrique.

a. Prélèvement en bateau : se fait pendant l’opération de déchargement en plusieurs

endroits et à des intervalles de temps déterminés, ainsi à partir de l’échantillon global, on
réalise l’échantillon de laboratoire.

b. Prélèvement dans les citernes (Wagons ou dans des camions) : se fait dans toute la
hauteur de la couche à l’aide d’une sonde cylindrique, et à des endroits de prélèvement au
centre et à environ 50 cm des parois.

7
III.2 Les aliments liquides

La procédure d’échantillonnage des produits en vrac liquides se fait à l’aide d’un

échantillonneur de fond ou à soupape, à partir de : Citernes (fixes, wagons, camions, navire) :
sur un produit homogène et à différents niveaux, et à partir de l’échantillon global on obtient
l’échantillon de laboratoire. Si, le produit n’est pas homogène, on doit réaliser des
prélèvements, séparés par intervalle de temps, de haut en bas. Dans le cas des citernes navires,
l’échantillonnage s’effectue en cours de transvasement, par de prises fréquentes à intervalle
régulier.

Figure 1 : Matériels d’échantillonnage : (a) grande pelle et pelle à main (b, c) sonde
cylindrique (d, e) échantillonnage de fond ou à soupape

8
L’échantillonnage destiné à une analyse microbiologique revêt une précaution supplémentaire
par rapport au prélèvement destiné à un contrôle physico-chimique. Celle d’être réalisé en
conditions stériles :

 Flacon stérile, rempli sans toucher l’échantillon avec les mains ni un quelconque
matériel (broc, entonnoir, pipette…) à moins d’avoir été désinfecté ; dans le cas d’une
désinfection chimique, attention aux résidus de produit ;
 Bouchon stérile ;
 Flambage du col de la bouteille. Après le prélèvement, maintien de l’asepsie :
 Interdiction stricte d’ouvrir le flacon jusqu’à l’analyse ;
 Ouverture de l’échantillon seulement sous hotte à flux laminaire ou à proximité directe
de la flamme bleue du bec Bunsen ;
 Aucune culture microbienne, en tube ou en boîte de Pétri, ne doit être ouverte à l’air
libre.
 Pour les prélèvements réalisés sur une chaîne technologique, prélever au niveau de
chacun des équipements de façon à diagnostiquer toute source de contamination
possible : par exemple, pour une chaîne de mise en bouteille, on réalise un prélèvement
d’échantillon à l’entrée puis à la sortie du filtre.

Les échantillons doivent avoir un transport rapide et un stockage bref ; Les températures
suivantes sont recommandées durant le transport :

 Produits stables : température ambiante (inférieure à 40 °C) ;

 Produits congelés ou surgelés : de préférence inférieure à −18 °C ;
 Autres produits non stables à température ambiante : de 1 °C à 8 °C.

Les températures suivantes sont recommandées durant le stockage :

 Produits stables : température ambiante (de 18 °C à 27 °C) ;

 Produits congelés ou surgelés : de préférence inférieure à −18 °C ;
 Autres produits non stables à température ambiante : 3 °C ± 2 °C.

III.3 Échantillonnage en surface

Dans certains cas, on réalise un échantillonnage en surface : En règle générale on met la surface
à analyser en contact avec un diluant stérile, puis on prélève la suspension microbienne ; Par
écouvillonnage de la surface, à l’aide d’un écouvillon qui est ensuite mis en suspension dans
un diluant stérile, ou directement étalé sur un milieu gélosé ; Au moyen de boites de contact ou
9
lames d'immersion remplies du milieu gélosé, qui est pressé contre la surface à soumettre à
l'essai.

Figure 2 : Echantillonnages : (a) boites de contact, (b, d) lames d'immersion (c) écouvillons.

III.4 Techniques de dilution

Une fois arrivés au laboratoire, les échantillons doivent être préparés en vue du contrôle
microbiologique.

Pour l’échantillon liquide, il constitue la solution mère (SM) et si nécessaire des dilutions
décimales sont réalisées dans un diluant stérile (eau peptonnée ou l’eau physiologique), et
utilisées pour la recherche et le dénombrement de microorganismes selon les méthodes de
dénombrement de (s) groupe (s) de microorganisme (s) à rechercher.

Quant à l’échantillon solide, celui-ci nécessite un broyage dans un diluant stérile à l’aide des
broyeurs de laboratoire (Figure 4), cet ensemble (échantillon et diluant) constitue la dilution
mère (DM), et si nécessaire d’autres dilutions décimales sont réalisées.

Le titre des dilutions est calculé de la manière suivante : T= P / V, avec

P: est le poids et/ou le volume de l’aliment,

10
V: est le volume total de l’aliment plus le diluant.

Dans les deux cas (solide et liquide) plusieurs rapports de dilution sont pratiqués (25:225,
10:90, 5:45, 3:27, 1:9, 0.5:4,5), dont le principe est le rapport 1:9. Une partie de l’échantillon,
neuf parties de diluant.

Figure 3 : Protocole expérimental d'une dilution successive de facteur 10

11
 Figure 4 : Les broyeurs de laboratoire : (a) Broyeur à main (mortier et pilon), (b)
broyeur électrique à pédale type stomacher, (c) broyeur électrique type mortier et pilon, (d)
broyeur électrique type à couteaux.

IV. Techniques classiques de numération des microorganismes

IV.1 Numération microscopique

Les techniques de numération microscopique offrent une possibilité de détecter les

microorganismes lors de contrôle de produits, simplement en regardant un échantillon
directement sous microscope optique.

Bien qu’il soit relativement facile de repérer, avec soin et patience, les bactéries, les levures et
les moisissures à l’état frais, il est possible de réaliser des colorations afin de rendre ces
microorganismes plus facilement visibles, ainsi les deux colorations couramment employées
sont la coloration simple au bleu de méthylène et la coloration complexe (double) de Gram.

a. Utilisation des cellules à numération

Les lames type hématimètre comme les cellules de THOMA et de MALASSEZ, pourraient
être employées pour le dénombrement des microorganismes.

Ces lames sont conçues en verre de 2 à 3 mm d’épaisseur comportant une surface délimitée et
quadrillée et recouverte d’une lamelle de sorte qu’elle emprisonne une quantité connue de la
solution-dilution de l’aliment à examiner.

12
 a.1 Cellule de THOMA : d’une taille de 0.2 x 0.2 mm, une profondeur de 0.1 mm et
elle emprisonne un volume de 1 mm3. La cellule est formée de seize (16) grands carrés,
composés chacun de seize (16) petits carrés.

a.2 Cellule de MALASSEZ : d’une taille de de 0.2 x 0.2 mm, une profondeur de 0.2
mm et elle emprisonne un volume de 1 mm3. La cellule comporte cinq (5) bandes
horizontales de cinq (5) lignes chacune et cinq (5) bandes verticales de six (6) lignes
chacune.

Figure 5 : Représentation schématique : (a) quadrillage de la cellule de THOMA (b)

cellule de THOMA.

Figure 6 : Représentation schématique : (a) quadrillage de la cellule de MALASSEZ (b)

cellule de MALASSEZ.

b. La méthode de Breed

Cette méthode utilise des lames comportant une zone délimitée d’un centimètre cube (1 cm3)
sur laquelle on dépose 0.01 ml de la suspension de l’aliment à examiner.

13
Après séchage, fixation et coloration au bleu de méthylène ou éventuellement la coloration de
Gram, les microorganismes sont comptés dans 30 à 50 champs microscopiques.

 La méthode est rapide et bien adaptée pour le comptage des bactéries.

 Toutefois, elle ne distingue pas les cellules mortes des cellules vivantes. L’existence des
amas de cellules sont comptés comme une seule cellule ce qui diminue de la précision
de la méthode.

Après avoir choisis la boite on dénombre les colonies puis on applique la formule suivante :
N=n x 1/D x 10 UFC/ml

N : le nombre dans la solution mère ;

n : le nombre des colonies compté sur la boite ;

D : facteur de dilution ; 10 volume ensemencé 0,1ml ;

L’unité utilisée est l’Unité Formant Colonie (U.F.C.) : c’est une unité plus précise que l’unité
bactéries/ml dans ce cas. Car on compte le nombre d’unités qui forment des colonies, quelque
fois, plusieurs bactéries côte à côte pouvant donner une même colonie. Il est donc plus exact de
parler du nombre d’unités formant colonies que de nombre de bactéries.

c. Technique de filtration à épifluorescence directe (DEFT)

C’est une technique de numération microscopique, qui est appliquée pour le dénombrement des
microorganismes dans toutes sortes de produits.

Elle permet d'obtenir une sensibilité nettement accrue de 103 à 104 microorganismes par ml,
suite à une concentration des microorganismes contenus dans la suspension de l’aliment à
examiner sur un filtre à membrane, suivie d’une coloration à orange d'acridine.

Les microorganismes retenus sur la membrane sont comptés directement sous le microscope à
épifluorescence.

d. Numération après passage sur un milieu d’enrichissement

Cette technique non quantitative est utilisée pour des espèces déterminées (Lactobacilles,
Salmonelles, etc.) ou il existe une corrélation entre le nombre de microorganismes au début et
à l’issue de l’incubation.

14
Une suspension de l’aliment à examiner dans un milieu d’enrichissement sélectif est réalisée,
suivie par une incubation aux temps et température appropriés du microorganisme, puis une
numération sur lame au microscope optique.

IV. 2 Numération sur milieu solide

a. Dans la masse (pour plate)

 C’est la méthode standard d’énumération des germes aérobies, dont l’utilisation

nécessite un milieu de croissance claire pour permettre le comptage des colonies
au moyen d’un compteur de colonies.

 Les germes anaérobies ont besoin d’une deuxième couche de gélose qui permet
de maintenir un environnement anaérobie (méthode de la double couche).

b. Étalement en surface (spread plate)

Cette méthode est préférable lorsque des milieux sélectifs sont utilisés pour le dénombrement
de groupe spécifique de microorganismes aérobies, car elle permet la manifestation de
propriétés coloniales de ces microorganismes, telles que : morphologie, pigmentation,
hémolyse, halos de précipitation, ou changements de couleur du milieu de culture

c. Étalement en surface en spirale (spiral plate)

Pour cette technique, une machine distribue un petit volume entre 0.05 et 0.4 ml de la
suspension de l’aliment à examiner, à la surface des boites qui sont en rotation, ceci en suivant
une distribution spirale à partir du centre vers la périphérie de la boite, ou bien dans d’autres
cas dans le sens inverse à partir de la périphérie vers le centre de la boite.

Après incubation, le comptage des colonies se fait à l’aide d’un compteur de colonie muni d’une
grille de visualisation ou avec un compteur de colonies à laser

d. Filtration sur membrane

Cette technique est utilisée pour estimer le nombre de microorganismes lors du contrôle des
liquides alimentaire (l’eau, boissons…).

Elle consiste à une concentration de microorganismes sur membrane au moyen d’un appareil
de filtration mono ou pluri-postes.

Les filtres utilisés sont conçus à partir de : mélange d’esters de cellulose ; de polymères
similaires (nitrate de cellulose, acétate de cellulose).
15
Figure 7 : Filtration sur membrane : a. montage de filtration, b. filtre membrane après culture

Le nombre de colonies N par ml d’échantillon est calculé de la manière suivante :

N = n / v, avec

n : nombre de colonies,

v : est le volume de l’échantillon qui est égal, généralement, à 100ml.

e. Dénombrement par culture en milieu solide

Principe de la méthode se base sur le fait que chaque colonie macroscopiquement visible
provient d’une cellule microbienne ou UFC (Unité Formant Colonie). La technique employée
est choisie en fonction du rapport du germe à dénombrer avec l’oxygène. Elle peut être réalisée
en boites de Pétri ou en tubes.

- Dénombrement en boites de Pétri

Le dénombrement est réalisé en masse lorsque le germe à dénombrer est aérotolérant ou micro-
aérophile et en double couche lorsque le germe est anaérobie strict.

Dans ce cas le milieu peut être additionné d’un agent réducteur tel que le chlorhydrate de L
cystéine.

Dans tous les cas, le milieu gélosé doit être suffisamment mou c’est à dire additionné de 2%
d’agar seulement pour permettre aux colonies qui se situent dans la masse d’attendre leur taille
normale.

16
- Le mode opératoire

 À partir des dilutions et éventuellement de la suspension mère, ensemencer dans la

masse, au moins 2 boites de Petri par dilution.

 Mettre 1 ml de la suspension dans une boite de Petri vide, et ajouter 10 à 15 ml de milieu

gélosé en surfusion de 40 à 45 °C.

 Homogénéiser le mélange par des mouvements circulaires.

 Laisser le mélange se solidifier à la température du laboratoire.

 Si le micro-organisme est anaérobie stricte, couler une seconde couche assez épaisse sur
la première pour assurer l’anaérobiose.

- Cas ou le germe est aérobie strict

 0,1 ml de la suspension mère ou de ses dilutions sont déposés au centre de la boite de

Pétri préalablement coulée avec le milieu de culture adéquat et étalés uniformément sur
toute la surface de la gélose.

 L’étalement est réalisé à l’aide d’un râteau étaleur.

 Cette méthode est bien adaptée pour la numération des aérobies stricts.

 Toutefois sa précision est faible car il y a un risque que des microorganismes adhérents
au râteau étaleur.

Incuber les boites dans les conditions optimales de croissance du germe à dénombrer.

- Lecture : Le dénombrement est réalisé par comptage des colonies à l’aide d’un
compteur de colonies.

17
 Figure 8 : Compteur de colonies

Figure 9 : Culture bactérienne (colonies)

Les boites dénombrables sont celles dont le nombre de colonie est compris entre 30 et 300 ou
25 et 250

Déterminer le nombre de cellules vivantes par ml de la suspension mère (CFU/ml) en appliquant

la formule suivante :

18
Exemple

Tableau 1 : résultats de dénombrement sur milieu solide

IV.3 Numération sur milieu liquide

 Cette numération en milieu liquide est connue sous le nom de la méthode du nombre le
plus probable (NPP) de Mc GRADY.

 Elle est utilisée, généralement, pour la recherche et le dénombrement des coliformes

totaux, coliformes fécaux, et Streptocoques fécaux dans l’eau.

 Permet d’étudier un caractère difficilement mis en évidence sur milieu solide comme
la production d’un gaz.

 En utilisant des milieux peu sélectifs (présomption), elle permet d’effectuer un

dénombrement avec une phase de réanimation, c'est-à-dire que le milieu est favorable
pour le développement même des germes en mauvais état physiologique.

 Les tubes positifs sont alors repiqués sur un milieu plus sélectif (confirmation).

19
 Exemple : Nous considérons que vous avez obtenu les résultats suivants pour l’analyse de
1 ml de lait

Lecture des résultats de la recherche des coliformes totaux

Tableau 2 : Représentation des résultats de recherche des coliformes totaux dans le lait

Tableau 3 : Table de Mac Grady de trois tubes par dilution donnent pour chaque nombre
caractéristique le nombre le plus probable (NPP) dans 1ml de la dilution

20
Exemple :
Tableau 4 : Dénombrement sur milieu liquide, cas de la série de deux tubes
+ : positif, - : négatif

Nombre caractéristique à trois chiffres : 210

Interprétation : Elle est basée sur des données statistiques. Des tables dites de Mac Grady
donnent pour chaque nombre caractéristique le nombre le plus probable (NPP) dans 1ml de la
dilution qui a servi a ensemencer les tubes correspondant au premier chiffre du nombre
caractéristique. Dans le présent exemple et selon la table de Mac Grady 210 correspond à 6,0
(NPP)

• La dilution utilisée pour ensemencer les tubes correspondant au premier chiffre du

nombre caractéristique étant: 10-2. Donc : la dilution 10-2 (d) contient probablement 6
germes/ ml. Déterminer le nombre de germe (N) de la suspension de départ ;

21
Tableau 5 : Table de Mac Grady de deux tubes par dilution donnent pour chaque nombre
caractéristique le nombre le plus probable (NPP) dans 1ml de la dilution

V. Techniques récentes de numérations

De conception plus récente, elles permettent de détecter la bactérie recherchée dans un bouillon
de pré-enrichissement, parfois dans une préparation d'aliment. Elles font appel à l'immunologie
ou à la biologie moléculaire.

Les techniques dites rapides permettent, selon les cas, de réduire le délai de réponse ou de
simplifier les manipulations, ce qui en fait des outils très précises dans l'industrie agro-
alimentaire. Parmi les principales techniques rapides utilisées en microbiologie des aliments,
on peut citer :

 Les méthodes immunologiques, pour la plupart de type E.L.I.S.A.;

 Les techniques de biologie moléculaire, hybridation sur colonies ou polymerase chain
reaction ;
 Le dosage par bioluminescence de l'adénosine triphosphate (A.T.P.) cellulaire ou A.T.P.
métrie;
 Les procédés d'analyse d'image après filtration et coloration des échantillons et la
cytométrie de flux.
22
Certaines de ces méthodes font l’objet d’une validation officielle, lorsqu’il est démontré que les
résultats qu’elles fournissent présentent une bonne corrélation avec les résultats obtenus par les
méthodes de référence. De toutes ces méthodes, seule l’A.T.P. métrie fournit une réponse quasi-
immédiate. Pour les autres techniques, le résultat est au mieux obtenu en 24 à 36 heures.

V.1 La méthode ELISA de type sandwich

Des anticorps hautement purifiés, spécifiques de la bactérie recherchée, sont adsorbés sur les
puits d'une plaque pour microtitration.
Les échantillons à analyser sont répartis dans ces puits. Dans le cas d'une réaction positive, la
bactérie recherchée s'associe aux anticorps et reste ainsi, après lavage, fixée à la surface du
puits. La révélation est réalisée par addition des mêmes anticorps marqués avec une enzyme
(technique sandwich), puis, après lavage, par addition du substrat de l'enzyme.
Dans le cas d'un résultat positif, la réaction entre l'enzyme fixée et son substrat libère des
produits colorés. L'interprétation du test fait appel à des témoins positif et négatif (Figure .10).

23
 Figure 10 : Protocole du test ELISA

V.2 L'immunoséparation magnétique et I'IMS-ELISA

Cette technique consiste en une immunocapture des bactéries recherchées par des billes de
polystyrène magnétiques sur lesquelles sont adsorbés les anticorps spécifiques. Les billes sont
ensuite récupérées et rassemblées sur une plaque aimantée, puis lavées et concentrées.
L’intérêt des supports magnétiques en microbiologie clinique, alimentaire ou environnementale
est grandissant. La nécessité de disposer des résultats très rapidement et de pouvoir concentrer
et détecter des germes pathogènes à partir d'échantillons variés (sang, aliments, eau…) explique
en grande partie cet attrait. Ainsi, la détection de Escherichia coli O157 (100 -1000 bactéries /

24
ml) et Salmonella thyphimurium (1000 - 2000 bactéries / ml) à l'aide de support magnétique est
rendue possible en moins de 60 minutes.
V.3 Utilisation de sondes nucléiques
Des fragments d'ADN ou d'ARN simple brin, d'origine microbienne, sont capables de s'hybrider
avec des fragments complémentaires, les sondes, pour former des duplex stables. La mise en
évidence de l'hybridation entre la sonde et l'acide nucléique cible est effectuée par détection
directe ou par détection indirecte de l'hybride nucléique.
V.4 Utilisation de l'amplification génétique (Polymerase Chain Reaction (PCR)
La PCR consiste à amplifier spécifiquement une séquence d'ADN double brin par l'action
cyclique d'une ADN polymérase thermostable. L'initiation de la synthèse d'ADN est réalisée
par une enzyme au niveau de courtes séquences oligonucléotidiques (amorces), ajoutées au
milieu réactionnel, spécifiques de la séquence d'ADN que l'on souhaite amplifier. La PCR
consiste ensuite en l'enchaînement cyclique de trois processus :
- la dénaturation de l'ADN : le mélange est placé à une température comprise entre 90 et 100°C
pendant une à deux minutes. Elle permet la séparation des deux brins d'ADN ;
- l'hybridation des amorces : la température est ramenée à 50-60°C pendant une à deux minutes
- l'extension des amorces par une ADN polymérase thermostable, le plus souvent la Taq
polymérase extraite de Thermus aquaticus. Le milieu réactionnel est placé alors à une
température de 72°C, valeur optimale d'activité de l'enzyme. L'ensemble des opérations est
réalisé dans un appareil automatique : le thermocycleur.
La PCR, Polymerase Chain Reaction, est utilisée pour reconnaître l’ADN des levures du genre
Brettanomyces. Cette méthode, présente l’avantage d’obtenir en 24-48 heures le résultat, alors
qu’il faut attendre 7 jours pour la méthode de mise en culture sur boîte de Pétri. La numération
des Brettanomyces par PCR peut s’avérer utile tout au long du processus d’élaboration.

25
 Figure 11 : Représentation schématique indiquant les différents points ou peuvent être
ajoutés l'ADN compétiteur au cours d'un protocole d'isolation d'ADN à partir d'un échantillon
environnemental.

V.5 ATP-métrie
Cette technique permet le contrôle microbiologique de toutes les surfaces. Elle présente deux
gros avantages :
Le premier est de conduire à un résultat instantané.
Le second réside dans la simplicité de mise en œuvre de la mesure.
On fait appel à cette technique, notamment dans les cas suivants :
• Contrôle d’hygiène des équipements, notamment de la chaîne de conditionnement. On
s’intéresse à chaque élément qui compose le circuit suivi par l’échantillon : cuve de stockage,
robinet de dégustation, joint et raccord de tuyauterie, pompe (entrée et sortie) et chaque matériel
assurant l’opération contrôlée ; par exemple, pour le conditionnement : filtre, rinceuse, tireuse,
boucheuse… Ce diagnostic hygiène est également intéressant à chaque étape de la récolte, de,
de l’élevage et du stockage.
• Contrôle de l’eau utilisée dans le chai pour les opérations de nettoyage, notamment contrôle
de l’eau du dernier rinçage, très bon indicateur de la procédure de nettoyage mise en œuvre.
• Contrôle des matières sèches lors du conditionnement de l’échantillon : bouteilles, bouchon…
Cette technique utilise l’adénosine triphosphate (ATP), molécule présente dans toutes les

26
cellules vivantes, notamment les cellules microbiennes. L’ATP est la forme universelle de
stockage et de transfert de l’énergie dans la cellule. Elle conditionne donc toutes les activités
vitales des organismes vivants. À la mort de la cellule, cette molécule est rapidement dégradée.
L’ATP est donc un excellent marqueur de la présence d’un microorganisme vivant.

Figure 12: Appareil d’ATPmétrie

VI. Identification phénotypique des germes

De nombreux caractères phénétiques sont exploités pour identifier une bactérie, déjà isolée à
l’état pur. (Culturaux, morphologiques, biochimiques et physiologiques, immunologiques, et
pouvoir pathogène).

VI.1 Caractères culturaux

 La taille, la forme, la couleur, l’opacité, la surface, la consistance, l’odeur, et

évidemment tout changement produit à la surface du milieu solide, sont les caractères
fréquemment utilisés pour caractériser macroscopiquement une colonie bactérienne
(amas de cellules).

 À l’œil nu ou à l’aide d’une loupe binoculaire, les colonies sont observées par
transparence, réflexion ou transillumination oblique, ceci en lumière naturelle et / ou
artificielle.

 La taille ou le diamètre : peut-être mesurée à l'aide d'une règle millimétrique graduée ;

 L'aspect de la surface : peut-être lisse ou rugueux ;

27
  La forme : (plan, relief, bord) centre parfois surélevé, ombiliqué en creux ;

 L'opacité : les colonies sont décrites comme : opaques (ne laissent pas passer la
lumière) ; translucides (laisse passer la lumière mais on ne voit pas les formes au travers,
transparentes (laissent passer la lumière et voir les formes au travers, comme le verre) ;

 La consistance : au moment du prélèvement il est possible d'apprécier si les colonies

sont : grasses / crémeuses (on obtient facilement des suspensions homogènes) ; sèches
/ muqueuses ;

 La couleur (pigmentation) : sur des géloses ordinaires, les colonies sont

habituellement de couleur crème, alors que sur des milieux sélectifs, les colonies, sont
d’une couleur différente, ceci est due à divers pigments de couleur jaune, rouge, orange,
violet, etc. ;

 Odeur : une odeur caractéristique peut être présente (Pseudomonas aeruginosa, odeur
fruitée associée à celle des pommes vertes).

Trois types de colonies peuvent être distingués :

1. Colonie S (Smooth - lisse) : à surface lisse et bords réguliers, bombés, de consistance

crémeuse et donnant des suspensions homogènes ;

2. Colonie R (Rough - Rugueux) : à surface rugueuse et bords dentelés, plats, de

consistance sèche et donnant des suspensions hétérogènes ;

3. Colonie M (Muqueuse) : à surface lisse et bords réguliers, bombés, filants sous l'anse,
et donnant des suspensions hétérogènes.

Figure 13: Représentation schématique des caractères fréquemment utilisés pour

caractériser macroscopiquement une colonie bactérienne.
28
VI.2 Caractères morphologiques et structuraux

a. Coloration de Gram

 La coloration de Gram (le premier test à réaliser) permet de diviser les bactéries en
deux grands groupes : celles à paroi type Gram+, et celles à paroi type Gram-.

 Cette méthode est basée sur la structure et la composition de la paroi.

 Les lipides assez forts chez les Gram- que les Gram+, sont extraits par l’action de
l’alcool entraînant, ensuite, une augmentation de la perméabilité et l’extraction du
complexe violet de gentiane-iode, ceci lui permettant de prendre la couleur de la
safranine (fuschine).

Ce test permet de diviser les bactéries selon leurs formes en deux grands groupes : Cocci et
bacille, et il fournit de précieuses informations en ce qui concerne le mode de groupement qui
peut être en : diplocoques, chainettes, tétrades, et amas. Il est à noter que même sans ce type de
coloration (coloration complexe et / ou double), à l’état frais la forme, le groupement et la
mobilité pouvons être observés.

29
 b. Coloration de Ziehl-Neelsen (acid-fast stain)

La coloration de Ziehl-Neelsen est spécialement désignée pour les Mycobactéries qui sont
caractérisées par leur aptitude à ne pas être décolorées par les acides dilués et l’alcool, après
avoir été colorées par la safranine ou la fuchsine. Ils sont dits bacilles acido-alcoolo-résistants
(BAAR), exemple : Mycobcterium tuberculosis, qui apparait rose- rouge, souvent parlé et
légèrement incurvée.

c. Coloration de la capsule

La présence d'une capsule est révélée par la coloration à l'encre de Chine, sa mise en évidence
est un indice important pour identifier les microorganismes en deux groupes : les capsulés et
ceux acapsulés, exemple : des diplocoques Gram+ entourés d'une capsule importante, ceci
évoque Streptococcus pneumoniae.

d. Coloration des endospores (sporulation)

La sporulation permet de diviser les bactéries en deux groupes : sporulées et asporulées, ce test
est réalisé soit par coloration au vert de malachite solution à 5 %, soit tout simplement par essai
de culture après pasteurisation. La position de la spore permet l’identification des bactéries en
groupes à l'intérieur de la même famille.

VI.3 Caractères biochimiques et physiologiques

a. Demande en O2 :

Ce caractère permet de classer les bactéries, selon leurs réponses de croissance en présence et
en absence d'oxygène, en 5 groupes :

a.1 Aérobie strict : l’accepteur final de l’hydrogène est obligatoirement l’O2 de l’air,
exemple : Pseudomonas aeruginosa ;

a.2 Anaérobie strict : l’accepteur est de nature différente et l’O2 est toxique ;

a.3 Anaérobie aérotolérant : sont capables de croître en présence ou en l'absence d’O2,

l’accepteur est de nature différente et l’O2 n’est pas toxique, exemple : Campylobacter
jejuni ;

a.4 Anaérobie facultatif (aéroanaérobie) : la bactérie se développe indifféremment dans

des conditions d’aérobie ou d’anaérobiose mais se développe mieux en sa présence, exemple
: Entérobactéries ;

30
 a.5 Microaérophile : ont besoin d’O2 mais à un niveau acceptable.

Figure 14 : croissance des bactéries selon la demande en O2

(1) Aérobie strict ; (2) Aero-anaerobie facultative ; (3) Microaerophile ; (4) anaerobie
stricte ;

b. Oxydation-fermentation est assimilation des sucres

 La détermination de l’oxydation-fermentation et la possibilité que d’autres sucres soient

assimilés comme seule source de carbone sont importantes à des fins taxinomiques.

 Les bactéries assimilent le (s) sucre (s) en produisant de l’acide et fréquemment du CO2
en présence ou en absence d’O2. L’acidification du milieu est détectée par changement
de couleur du milieu dû à la présence d’un indicateur coloré (BCPL, rouge de phénol,
bleu de bromothymol, etc.).

 Le CO2 est révélé par l’élévation de la cloche du durham car il est libéré au fond du tube
(cas de la voie oxydative il est produit en surface donc n’y a pas élévation de la cloche).

c. Types fermentaires (tests RM / VP)

Ces deux tests sont de grande utilité en identification.

 La réaction au Rouge de Méthyle caractérise le type fermentaire acide mixte de la

fermentation butylène glycolique chez les Entérobactéries.

 La réaction de Voges Proskauer caractérise la voie d’acétoïne chez les Entérobactéries

et autres groupes. Les deux sont réalisés sur milieu glucosé Clark et Lubs.

31
 Figure 15 : Interprétation du types fermentaires (tests RM / VP)

d. Accepteurs de l’H2 :

d.1 La sulfito-réduction : les anaérobies sulfito-réducteurs sont capables d’utiliser les

sulfites comme accepteurs d’H2 en les réduisant en sulfures.

Ce test est réalisé sur milieux solides (VF) ou bien semi-solide contenant de Sulfite de Sodium
et l’Alun de Fer.

Après incubation la réduction se traduit par un noircissement (la production d’H2S).

d.2 La réduction des nitrates :

Les anaérobies sont, aussi, capables d’utiliser les nitrates comme accepteurs d’H2 en les
réduisant en nitrites.

Ce test est réalisé sur milieux solides ou bouillons à 1 ‰ de nitrate de potassium.

Après incubation, la réduction nitrates en nitrites est révélée par l’ajout de 0.1 ml du réactif
NiT1 et NiT2. Une coloration instantanée rouge ou rose indique la réduction des nitrates. Un
résultat négatif doit être vérifié par l’addition de poudre de zinc.

e. Enzymes respiratoire

e.1 Catalase : Une enzyme qui hydrolyse le peroxyde d’hydrogène (H2O2) en eau et en
oxygène (un dégagement de bulles d’air, instantanément, indique sa présence).

32
 • Ce test réalisé, généralement par deux techniques, constitue un bon élément de
différenciation et divise les bactéries en deux groupes celles à catalase+ et à celles
catalase-.

• La catalase est un test clé communément utilisé pour l’identification des bactéries à
Gram+. Exemple : Staphylocoques ; Listeria monocytogènes sont catalase+ /
Streptocoques est catalase- ;

e.2 Cytochrome oxydase : la dernière enzyme de la chaîne respiratoire, elle catalyse le

transfert de l’H2O sur L’O2, elle est mise en évidence par la réaction d’oxydation de l’oxalte
de diméthyl-paraphénylène-diamine, ce substrat est incolore sous forme réduite est rouge
sous forme oxydée. Inversement à son précédant, l’oxydase est un test clé communément
utilisé pour l’identification des bactéries à Gram-. Exemple : Pseudomonas spp. et Neisseria
spp. Sont Oxydase+ / Acinetobacter spp. est Oxydase-.

f. Dégradation des acides aminés

f.1 TDA, Tryptophanase et PDA : enzymes utilisées en identification bactérienne.

 Le tryptophane-désaminase (TDA) catalyse la réaction de la désamination du

tryptophane en acide indole-pyruvique et ammoniac.
 Tandis que la tryptophanase catalyse la réaction de dégradation du tryptophane en
indole, acide pyruvique, et ammoniac.
 L’addition de chlorure de fer III (FeCl3) réagit avec l’acide indole-pyruvique en donnant
un précipité de couleur marron et l’addition de réactif de Kovacs réagit avec l’indole en
donnant un anneau rouge en surface.

Exemple : E. coli est Indole+.

 Alors que, la phényl-alanine-désaminase (PDA) catalyse la réaction de la désamination

de la phénylalanine en acide phénylpyruvique et ammoniac.
 L’activité de la phényl-alanine-désaminase(PDA) est réalisée sur gélose inclinée à la
phényl-alanine. L’acide phényl pyruvique (APP) donne une teinte verte en présence de
chlorure de fer III.

33
 f.2 L’ornithine-décarboxylase (ODC), la lysine-décarboxylase (LDC) et l’arginine-
déhydrolase (ADH) :

La possession de ces enzymes est un caractère souvent étudié en identification des bacilles
Gram- notamment les Entérobactéries et les Pseudomonas. Les milieux les plus utilisés, en
anaérobiose, sont ceux de Falkow (dont la technique a été étendue par Möller), ces milieux
contiennent, le glucose, un indicateur coloré (généralement le BCPL) et ne renferment qu'un
seul acide aminé, celui dont on veut étudier l'utilisation.

g. Dégradation du lactose ONPG :

 La possession de la ß galactosidase est un caractère couramment utilisé pour

l'identification des bactéries, il est particulièrement pratiqué pour les Entérobactéries
uniquement ceux à lactose-.
 Cette enzyme hydrolyse un analogue du lactose : l’ortho-nitro-phényl-galactopyraniside
(ONPG) en galactose et ortho-nitro-phénol qui présente une couleur jaune.

h. Dégradation de l’urée Uréase : hydrolyse l’urée en ammoniac et carbonate d’ammonium

aboutit à l’alcalinisation du milieu, qui est décelable par changement de couleur du milieu dû à
la présence d’un indicateur coloré (généralement le rouge de phénol).

Ce test permet d'identifier certaines espèces d'entérobactéries, Corynebacterium urealyticum,

et Helicobacter pylori.

i. Caractères biochimiques et physiologiques divers

i.1 Mobilité : est recherchée sur milieu semi-solide (en culot). L’ensemencement est réalisé
par piqûre centrale, après incubation la mobilité se traduit par l’envahissement du milieu.

i.2 Températures de croissance, halophilie-osmophilie et pH : l’évaluation de l’habilité

de croissance dans des conditions hostiles, présente parfois un grand intérêt en
identification. L’habilité à croître à différentes températures, à différentes concentrations en
NaCl ou en saccharose et à différentes valeurs de pH est réalisée sur milieux liquides ou
solides.

i.3 Résistance aux antibiotiques et aux inhibiteurs :

 L’habilité à croitre en présence de certains antibiotiques ou agents inhibiteurs est

largement utilisée en taxonomie.

34
 La présence ou l’absence de multiplication indique la sensibilité ou la résistance de la
bactérie.

 Ce test est réalisé sur milieux liquide ou solide.

 Il est important de souligner que, contrairement aux Gram-, les Gram+ sont sensibles
avec exception (Enterococci, Lactobacilli, Leuconostoc et Pediococcus spp.) à la
vancomycine.

 En revanche, les Gram- sont sensibles aux colistine et polymyxine, alors que les
Gram+ ne le sont pas.

i.4 Caractères immunologiques (sérologique)

Les réactions sérologiques : de type bactérie-anticorps (réaction d’agglutination) ou de

type antigène-anticorps (réaction de précipitation) sont utilisées en taxinomie
essentiellement pour les Entérobactéries dont contiennent trois types d’antigènes : H, O,
et K ; et les streptocoques dont le plus important est le type C : A, B, C, D, N.

Ces tests sérologiques se font principalement suivant la technique de Lancefield basée sur
l'utilisation de polysaccharides (notamment la polyoside C) de l'enveloppe cellulaire en tant
qu'antigène.

i.5 Pouvoir pathogène

- Coagulase : ce caractère permet seul d'affirmer la présence de St. aureus qui est
coagulase+ des autres Staphylococcus qui sont à coagulase- (St. epidermidis, St.
saprophyticus). St. aureus produit deux types de coagulase :

 Coagulase libre (enzyme extracellulaire)

 Coagulase liée (protéine associée à la paroi). Les deux enzymes sont capables in
vitro de coaguler le plasma de lapin (la formation d'un caillot de fibrine insoluble).

35
 Figure 16 : Test de coagulase

- Hémolysines α, ß et γ : enzymes responsables de la lyse des hématies, ils sont mises en

évidence par culture sur gélose au sang.
 Hémolysines α (zone verdâtre due à la metmyoglobine, exemple : S. pneumonia ;
 Hémolysines ß (auréole claire due à la libération de l’hémoglobine, exemple : St.
aureus) ;
 Hémolysines γ (pas de modification, pas d’hémolyse autour des colonies, exemple :
E. faecalis).

Figure 17 : Test d’hémolysine (Colonies bêta-hémolytiques de streptocoques du groupe A)

- ADNase : enzyme qui détruit le noyau des cellules, elle est mise en évidence sur milieux
contenant de l’ADN. L’hydrolyse de l’ADN est caractérisée par une zone claire, exemple :
St. aureus+ et St. epidermidis-

36
 Figure 18 : Test ADNase

i.6 Galeries API

Une galerie API (Analytical Profile Index) est un ensemble de petits tubes miniaturisés
sous nommés tubules contenant des substrats déshydratés prêts à l’emploi permettant
l'identification de microorganismes par la réalisation de tests biochimiques
majoritairement glucidique, protidique et enzymatique. Chaque type de galerie est muni
d’un mode d’emploi et d’une fiche d’interprétation des résultats. Les galeries API les
plus connues sont : 20 E, 20 Staph, 10 NH, 50 CHB et 20 NE (BioMèrieux, Lyon,
France). Cependant, il est nécessaire d’humidifier la galerie par ajout des gouttes d’eau
stérile dans les cupules de la boite, cela empêche l’assèchement des tests.

- Choix de la galerie

Le choix du type de galerie à utiliser repose sur les caractères suivants (Figure19) :

- La forme : cocci ou bacille ;

- Le type de Gram : Gram positif ou négatif ;

- Le test de catalase ;

- Le test de cytochrome-oxydase ;

- La présence de spore (pour les bacilles Gram positif).

37
Figure 19: Guide de choix de la galerie Api (A- Guide pour les bacilles Gram négatif ; B-
Guide pour les bacilles Gram positif ; C- Guide pour les cocci Gram positif et négatif).

- Technique

- Recueillir fond et couvercle d’une boite d’incubation (support en plastique) et répartir

de l’eau dans les alvéoles pour créer une atmosphère humide ;

- Déposer stérilement la galerie dans la boite d’incubation

- Préparer l’inoculum ou la suspension bactérienne dans une ampoule pré-fournie ou

dans un tube d’eau distillée physiologique selon les recommandations de la galerie
(turbidité = 0,5 McFarland) ;

- Introduire la suspension dans les tubes de la galerie en évitant la formation des bulles
;

- Pour les caractères soulignés, remplir les cupules d’huile de paraffine ;

- Pour les caractères encadrés, remplir les tubes et les cupules ;

- Pour les caractères non spécifiés, seul le tube doit être rempli ;

38
 - Après incubation, la lecture de la galerie doit se faire en se référant au tableau de lecture
dédié à chaque galerie ;

- Effectuer les tests nécessitant l’ajout de réactifs

VII. Réalisation du contrôle

La maîtrise de la qualité microbiologique (hygiénique obligatoire et marchande souhaitée par

le fabricant mais aussi le consommateur) passe par un ensemble de démarches qui vont du
contrôle (des matières premières brutes, en cours de transformation ou de produit fini) aux
pratiques de bonnes fabrications en passant par l’identification des principaux points critiques
du système de production / distribution, le plus souvent par une démarche HACCP (Hazard
Analysis Critical Control Point ou système d'analyse des dangers et points critiques). Ces
analyses prennent aujourd’hui largement place dans la plupart des usines et des réseaux de
distribution et permettent (par la réalisation de contrôles judicieux, une bonne évaluation de la
qualité et une mise en évidence d’éventuelles contaminations) les actions correctives qui en
découlent.

VII.1 Contrôle des matières premières

Le contrôle microbiologique des matières premières doit permettre de vérifier que celles-ci ne
renferment pas de microorganismes risquant de gêner le déroulement de la fabrication ou, de
microorganismes qui, ne pouvant être éliminés par les technologies mises en œuvre, pourraient
altérer le produit fini. Il faut distinguer les biotechnologies comprenant une étape de
fermentation ou non :

- Avec fermentation, pour qu’une fermentation se déroule dans de bonnes conditions, il faut,
théoriquement, ensemencer le levain dans un milieu stérile, sauf dans des cas particuliers où la
fermentation est conduite avec des microorganismes indigènes. Le contrôle des matières
premières dans les industries de fermentation est ramené le plus souvent, à un contrôle de
stérilité ou à un contrôle de propreté microbiologique du milieu. En effet, si pour certaines
industries (antibiotiques, acides aminés, …), le milieu doit être stérile, pour d’autres, comme la
brasserie, un milieu faiblement contaminé peut être utilisé, mais il ne faut pas qu’il renferme de
microorganismes spécifiquement dangereux pour cette industrie.

- Sans fermentation, dans le cas de bio-industries ne mettant pas en œuvre une fermentation
(technologie enzymatique), la qualité microbiologique doit être maintenue à l’aide des facteurs
physico-chimiques habituels : pH, activité de l’eau (Aw), température. Au niveau des matières

39
premières, les contrôles microbiologiques consistent à rechercher les microorganismes
potentiellement dangereux.

V.II.2 Contrôle de la fabrication Dans les industries de fermentation :

Les contrôles consistent essentiellement à apprécier l’évolution des populations microbiennes

dans le milieu au cours du temps, aussi bien le développement du levain que l’apparition et le
développement des contaminants. Pour ces contrôles, les techniques microscopiques sont les
plus utilisées : La technique du compte-cellule permet de faire une numération approximative
des cellules de levain et donc permet de vérifier son développement. Les techniques de
coloration (Gram, bleu de méthylène) permettent d’évaluer une contamination bactérienne dans
le cas de levains à champignons (levures ou moisissures) mais aussi dans le cas des levains
bactériens par les différences de formes ou de Gram des contaminants par rapport aux bactéries
du levain. La technique d’immunofluorescence peut être utilisée pour la recherche de
contaminations bactériennes dans les moûts de fermentation. La cytométrie de flux permet de
détecter plusieurs types de microorganismes séparément (ex, des bactéries et des levures). Cela
peut être appliqué au suivi de fermentation en culture pure (détection de contaminants) ou en
culture mixte (évaluation simultanée du développement de chaque population). - les méthodes
de culture peuvent être utilisées quand un délai de réponse est toléré. Dans les industries
utilisant des cultures aérées, des contrôles sur l’efficacité des systèmes de filtration stérilisante
de l’air sont nécessaires. Dans les industries ne présentant pas une étape de fermentation, les
paramètres de transformation (s’ils sont bien maitrisés) ne permettent que quelques
développements microbiens. Au cours de ces processus, le contrôle microbiologique porte sur
la recherche de germes dangereux.

VII.3 Contrôle du nettoyage et de la désinfection

Entre deux fabrications, les locaux et les installations doivent être nettoyés et désinfectés avant
d’être réutilisés. Les barèmes de désinfection (nature du produit, concentration/temps de
contact) sont définis en fonction de la nature et du nombre de microorganismes à détruire.
Différentes techniques sont applicables suivant les matériels à contrôler. - Pour les contrôles
microbiologiques des surfaces, les techniques les plus utilisées sont les techniques par
impression. Elles consistent à prélever les germes de ces surfaces par contact direct avec le
milieu de culture qui sert à les révéler. Cette technique peut être mise en œuvre avec les boites
« contact » ou tampon de gélose ou avec les lames gélosées. Ces lames existent avec différents
milieux de culture selon le type de microorganismes recherchés. Lames gélosées pour le

40
contrôle de dispositifs moins accessibles (robinet, canules, …), il est recommandé d’utiliser la
technique d’écouvillonnage : l’écouvillon imprégné de liquide stérile est frotté sur le dispositif
à contrôler puis immergé et agité dans un liquide stérile. L’analyse de ce liquide est effectuée
par des techniques classiques et donne des indications sur le niveau de contamination et la
nature des germes présents. La technique d’ATP métrie est bien adaptée au contrôle des
traitements de nettoyage-désinfection. Dans ce cas, un écouvillonnage est effectué sur le
matériel ou la surface à contrôler. L’ATP est ensuite mesurée sur la solution de rinçage de
l’écouvillon. Cette valeur représente aussi bien l’ATP microbien que l’ATP de cellules
animales ou végétales et est donc un indice de propreté de la surface contrôlée. - l’air renferme
des particules (poussières) sur lesquelles les microbes (levures et moisissures le plus souvent à
l’état de spores et aussi des bactéries) sont adsorbés. Selon leur concentration (nombre de
microorganismes/unité de volume d’air), ils représentent un risque plus ou moins élevé de
contamination secondaire. Différents phénomènes sont à l’origine de la contamination de l’air
: la manipulation de certaines matières (ex. les graines) qui émettent une grande quantité de
poussière. Les emballages sont souvent des sources importantes de contamination. Les
personnes sont aussi responsables de la dissémination de particules certaines étant chargées de
microorganismes. Il est donc intéressant de faire des contrôles microbiologiques sur l’air
ambiant. La technique la plus simple consiste à déposer des boites de Pétri contenant un milieu
gélosé, ouvertes aux endroits à contrôler. Cette technique, si elle est appliquée à des intervalles
de temps réguliers, de suivre une évolution et donc mettre en évidence une augmentation de la
charge microbienne de l’air. En outre, il existe des appareils utilisés pour le contrôle de l’air de
façon plus rationnelle. Toutes les techniques de contrôle de la désinfection du matériel et de
l’air ambiant ne conduisent pas à des valeurs absolues. Il convient donc de standardiser les
délais opératoires pour que les résultats aient une signification relative et donnent une idée de
l’évolution de la qualité microbiologique des matériels et des locaux.

VII.4 Contrôle des produits finis

Les contrôles microbiologiques des produits finis portent sur leur qualité hygiénique et leur
qualité marchande, et sont plus ou moins importants suivant la nature des produits et leur
destination. En effet, dans certains cas, le contrôle est ramené à une recherche de quelques
microorganismes dangereux pour le produit mais dans d’autres cas, le produit devant être stérile
(produits destinés aux injections intraveineuses, par exemple) les contrôles sont beaucoup plus
nombreux et sévères. Par ailleurs, il existe pour certains produits des normes ou des critères de
qualité microbiologique : les contrôles porteront alors sur ces paramètres. L’analyse

41
microbiologique traditionnelle des produits finis est quand même indispensable car elle permet
avec une certaine inertie d’éviter, dans le cas où des produits dangereux ou non conformes
seraient fabriqués, leur commercialisation ou leur consommation. Ce type de contrôle souvent
pratiquer par des laboratoires officiels (Contrôle et Répression des Fraudes) n’est pas préventif
et ne permet pas de maîtriser la qualité microbiologique des produits fabriqués. Utilisé seul, il
se révèle sans grand intérêt et souvent même inutile si sa mise en œuvre est longue et sans suite.

42
 Conclusion

Les techniques microbiologiques classiques sont longues et demandent un délai de réponse

trop important pour être utilisées couramment pour un contrôle de la fabrication. Les
méthodes mises en œuvre doivent être simples, donner une réponse suffisamment rapide
pour qu’une correction soit éventuellement possible dans la fabrication, et doivent être peu
coûteuses, de façon à pouvoir multiplier les contrôles et mieux surveiller la fabrication, sans
alourdir excessivement les coûts de production. Les techniques microscopiques
(observation directe, coloration de Gram ou immunofluorescence) présentent des
caractéristiques de simplicité, rapidité et faible coût et sont donc à mettre en œuvre, si cela
est possible, chaque fois qu’une réponse rapide est indispensable. Toutefois la sensibilité
des techniques microscopiques n’étant pas toujours suffisante, il est recommandé de faire,
en parallèle, un contrôle par des méthodes classiques de culture, sur les produits finis.
Quand un grand nombre d’échantillons doit être analysé, la méthode peut être automatisée
avec un système d’analyse d’image ; appareil permettant la préparation d’échantillon
(filtration sur membrane et marquage à l’acridine) et le comptage automatique des bactéries
marquées sur la membrane. L’observation microscopique est, en particulier, utilisable dans
toutes les biotechnologies faisant intervenir une phase de fermentation : cette étape peut
alors être contrôlée efficacement par la recherche des contaminants sur des préparations
microscopiques, à l’aide d’anticorps spécifiques ou des sondes nucléiques couplés à des
fluorochromes. La cytométrie en flux permet d’obtenir un résultat très rapide puisque le
comptage des microorganismes est effectué en une minute après un marquage de 10 à 15
minutes. La sensibilité de la méthode est de l’ordre de 102 à 103 /ml pour les levures et de
104 /ml à 5.104 /ml pour les bactéries, dépendant de la présence de particules
autofluorescentes dans le milieu. Pour les contrôles en cours de fabrication, les techniques
microbiologiques classiques peuvent, quelquefois être efficacement remplacées par des
contrôles physico-chimiques liés à la présence de contaminants comme le pH. Si les
méthodes par culture doivent être employées, il faut les automatiser pour accélérer les
lectures.

43
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