UNIVERSITE CHEIKH ANTA DIOP DE DAKAR

Faculté des Sciences Ecole Inter-Etats

et Techniques des Sciences et Médecine
Vétérinaires (EISMV)

Année: 2002

ETUDE COMPARATIVE DE LA FERTILITE DE

DEUX MILIEUX DE CULTURE D'ORIGINE
DIFFERENTE, UTILISES POUR LA RECHERCHE
DES COLIFORMES THERMOTOLERANTS DANS
LES FILETS DE POISSON CONGELES

MEMOIRE DE DIPLOME D'ETUDES APPROFONDIES

DE PRODUCTIONS ANIMALES

Présenté et soutenu publiquement

15 juin 2002 à 10 h à l'EISMV

par

ABDELSALAM ADOUM DOUTOUM

Né le 09 décembre 1970 à ABECHE (Tchad)

MEMBRES DU JURY:

Président: Monsieur François Adébayo ABIOLA

Professeur à l'EISMV

Membres: Messieurs: Malang SEYDI

Professeur à l'EISMV
Bhen Snona TOGUEBAYE
Professeur à l'UCAD
 AU NOM D'ALLAH
LE TOUT PUISSANT, LE MISERICORDIEUX

ET SON PROPHETE MOUHAMMAD (P.S.L.)

Je dédie ce travail :

.:. A mon grand frère feu lieutenant YOUSSOUF (In memoriam) et à ses
enfants SOULEYMANE, FATIMA et ACHTA, très tôt privés de
l'affection paternelle.
C'est vous qui avez parachevé l'éducation des parents en nous enseignant la
rigueur, l'excellence, la labeur. ~"
Je me rappelais de votre vivant que vous m'appelez souvent « le
Professeur ». Je pense que, très tôt, vous avez décelé en moi des valeurs
intrinsèques. C'est le chemin que nous avons pris et avec l'aide de Dieu, cela
va se réaliser.
Que votre âme repose en paix au paradis.

•:. A mon père

Nous tenons de vous notre leçon de modestie, de discrétion et de
persévérance dans l'effort.
Puissiez-vous trouver dans ce travail l'expression de notre reconnaissance
pour tous les sacrifices que vous avez faits pour nous.

•:. A ma mère
Je vous dois tout, ce travail est le fruit de tant d'années de sacrifices que
vous avez consentis pour nous.

•:. A mon grand frère, le Docteur MAHAMAT et à son épouse

Je pense également infiniment à vos enfants AIMANA, mRAHIM et
NASSIR « le Professeur ». Mon départ pour les études post-universitaires a
laissé un vide très difficile à combler surtout que je suis l'un des oncles les
plus écoutés par mes neveux sus-désignés.

•:. A tous mes frères et sœurs

.:. A tous les miens

.:. Au Directeur Général de la GER, Ali TAHIR qui s'est engagé pour moi
pour que ma vie familiale soit un succès. En dépit du problème qui s'est
posé, vous demeurerez toujours un grand frère consulté et suivi.
"
.:. Au Directeur Général de l'IUSTA, le Docteur Mahmout YOUSSOUF et
Secrétaire Général de l'IUSTA, Mr Daboulaye DJIMOUDJEBAYE
Vous avez tout fait pour que je puisse bénéficier de cette première fonnation
post-universitaire et donc concourir aux différents grades du CAMES .

•:. A tous les cadres de l'IUSTA

.:. A mon jeune frère et ami AHMAT ABOULMALI qui, malgré sa jeunesse,
a été doté par Dieu, de valeurs humanitaires et scientifiques qui le prédispo-
sent à un avenir radieux.

•:. A la famille SALEH KHARIFENE

.:. A la famille SOW

.:. A tous mes amis, je n'ose citer de noms de peur d'en oublier.

.:. A mes camarades de promotion

.:. A toute la colonie tchadienne à Dakar

.:. A tous ceux qui ont participé à ma formation

.:. A tout le personnel du service HIDAOA

.:. Au Sénégal, pays hôte et de Téranga, pays dans lequel nous avons eu la
chance d'effectuer des études universitaires (doctorales) et post-universitaires
(spécialisation) dans d'excellentes conditions. Nous sommes en fait un
produit tout fait du Sénégal.

.:. Au Tchad, ma patrie qui ne cesse de soucier pour que les jeunes
enseignants-chercheurs arrivent à accéder à des grades du CAMES pour
exceller dans la sphère du savoir.

•:. Enfin à la Science: Nous ne· pouvons occulter ce savoir universel qui,
chaque jour que Dieu fait, apporte des améliorations pour le bien-être de
l'homme mais également pour comprendre des mécanismes nouveaux. A
travers cette discipline, nous dédions ce modeste travail à' tous les
scientifiques du Nord comme du Sud qui travaillent quelquefois
laborieusement pour arriver à des résultats inouïs. Ils constituent un jalon
pour la génération à venir de manière que la recherche scientifique va évoluer
inexorablement et à jamais vers un processus infini dans l'espace et dans le
temps.
 ~ REMERCIEMENTS Il

.:. Madame Isabelle PAIN a bien voulu faire la première correction du

manuscrit. Merci infiniment pour tout cela.

•:. Monsieur Lamine KONE qui a été de tout temps mon complice. Tout le
travail de manipulation a été fait en duo. Il me manque de mots pour le
remerCIer.

•:. Monsieur Nalla BA aussi, doit être remercié autant car il a été de tout temps
sollicité. En plus de cela, pendant les vacances de MT KüNE, il est venu nous
donner un coup de main déterminant pendant une semaine alors qu'il était en
congé.

•:. Madame DIEYE a apporté des corrections fort utiles car elle s'est
familiarisée au vocabulaire d'hygiène alimentaire.
Merci infiniment.

.:. Madame MAR doit être remerciée pour le fait qu'elle a fait montre d'une
gestion rigoureuse en termes de réactifs et de produits et cela, malgré le
nombre très important de stagiaires pour que nos travaux donnent des
résultats excellents.

•:. Monsieur SANE a toujours nettoyé et désinfecté les laboratoires pour que
nos résultats soient fiables .

•:. Monsieur DIEDHIOU doit être remercié pour le fait qu'il a beaucoup
contribuer pour que l'atmosphère devienne vivable. En plus de par ses
tournées, toutes les trente minutes, la sécurité est plus que garantie, sécurité
qui a été un gage pour un travail dans la sérénité et le calme.

•:. Docteur Abdoulaye SOW, Mamadou TRAORE, Thiémokho TRAORE,

Abdoulaye BA qui, grâce à leurs échanges fructueux, ont fait en sorte que je
ne suis pas loin du pays. C'est pourquoi un voyage prévu pendant les
vacances pour se ressourcer s'est révélé superflu. Comme le monde est petit,
ces retrouvailles nous seront beaucoup utiles ultérieurement.
 liA NOS MAITRES ET JUGES Il
- A notre Président du jury, Monsieur François Adébayo ABIOLA
Professeur à l'EISMV de DAKAR
Vous nous faites l'insigne honneur de présider notre jury de
mémoire de DEA malgré vos multiples occupations.
Soyez assuré que votre disponibilité et votre simplicité nous ont
profondément marqué.

Hommages respectueux.

- A notre Directeur de mémoire, Monsieur Malang SEYDI,

Professeur à l'EISMV de Dakar
Vous nous avez séduit par la rigueur de votre raisonnement
scientifique, votre ardeur, votre ardeur, votre simplicité et votre
disponibilité.
Vos qualités d'homme de sciences et d'homme pieux forcent au
respect, à l'admiration et constituent pour nous un modèle.

Veuillez trouver ici l'expression de nos sincères remerciements et

de notre profonde gratitude.

- A notre maître et juge, Monsieur Bhen Sikina TOGUEBAYE,

Professeur à la Faculté des Sciences et Technique de l'Université Ch. A.
Diop de Dakar
Nous gardons de vous un souvenir vivace d'un grand scientifique,
disponible, ouvert envers tous. Vous avez spontanément acèepté de
juger ce travail.
Veuillez trouver ici l'expression de nos sentim~nts les meilleurs.
 -a-

Il TABLE DES MATIERES Il

Pages

INTRODUCTION............................................. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

PREMIERE PARTIE: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE · · ·. 2

Chapitre premier : PREPARATION ET MODES DE CONTAMINA-

TION DES FILETS DE POISSON · · · · · 2
1. Préparation des filets de poisson · · · ·.. ·....................................................................... 2
2. Modes de contamination 3
3. Conséquences des traitements sur les bactéries · 4
3.1. Action du filetage 4
3.2. Action du froid . · ·..· · · · · · ·..·. ·................................................................................................. 4

Chapitre deuxième: COLIFORMES et COLIFORMES THERMOTOLERANTS 5

1. Définitions 5
2. Relation entre Entérobactéries et Coliformes . ·. · · · · ·.................................................... 5
3. Principaux genres d'entérobactéries colifonnes en hygiène
alimentaire et santé publique.............................................................................................................................................................. 6
3.1. Escherichia 6
3.2. Klebsiella······..·. · · ·· · · ·· -......................................................................................................... 6
3.3. Enterobacter . · · · · · · · ·....................................................................................................................... 6
3.4. Citrobacter "'.................................................................................................... 7
4. Signification des coliformes thennotolérants · ·..·..· ·· ·..................... 7

Chapitre troisième: LES MILIEUX DE CUL TURE'..·..· · · · ·"' · ·..·. 8

1. Définition.............. 8
2. Facteurs d'appréciation de la qualité des milieux de culture · · 8
2.1. Fertilité· · · ·..· ·.................................................................................................................................................... 8
2.2. Stérilité 8
2.3. Sélectivité · · · · ·..· · ,. . .g
2.4. Le pH --.----..-------.-.- - - - - - - - - - - - -..- . - - 8
3. Milieux d'isolement sélectif pour les colifonnes et Escherichia coli ......·.. 9
3.1. Milieux liquides · · · · · · ··................................................................................................ 9
3.1.1. Bouillon Lactosé Bilié au Vert Brillant (BLBVB)" · · · 9
3.1.2. Bouillon Lactosé Bilié au Bromo-Crésol Pourpre (BLBCP) 9
3.1.3. Bouillon de Schubert :................................................................................ 9
3.2. Milieux solides · ·..· ·..· · · ·..·..· · 10
3.2.1. Gélose Lactosée au Chlorure de triphényl tétrazolium et
au Tergitol 7 10
 -b-
Pa2es
3.2.2. Gélose au Désoxycholate Citrate Lactose et Saccharose
(DCLS)··········································_····· la
3.2.3. Gélose Lactosée de DRIGALSKI·····················.·.·········..· .· · · · Il
3.2.4. Gélose Lactosée à l'éosine et au bleu de méthylène (EMB)
de Levine·················································....................................................................................................................................... Il
3.2.5. Gélose au Violet cristal au Rouge neutre à la Bile et au
Lactose (VRBL) _....................................................................................................... Il

DEUXIEME PARTIE: MATERIEL ET METHODES·············································· 13

Chapitre premier: MATERIEl:;· ··············· ········ ······ ···· 13

1. Cadre des analyses : 13
2. Produits analysés··············································· 13
3. Matériel de prélèvement···········································................................................................................................................................... 13
4. Matériel de laboratoire············································ 13

Chapitre deuxième : METHODES·········..············ · ········· ····· _ _ 14

1. Dénombrement des coliformes thermotolérants·········································· _ 14
1.1. Références normatives······ · · · · · ·.· · · · · · · · _:.. . . . . . 15
1.2. Préparation de la solution mère et des dilutions décimales··················· 15
1.3. Préparation des milieux de culture················································ 15
1.3.1. Fertilité·············································· 16
1.3.2. Stérilité·············································· 16
1.3.3. Sélectivité············································....................................................................................................................................... 16
1.3.4. Le pH 16
1.3.5. Préparation des deux milieux de culture · · · . · · · · · · · · 16

~:~: ~:~~~~~~~~i601~~i~~.==::==~~-=:=::::=:.::=~: :17~

1.6. Expression des résultats ·.._·· · . · · · · ········ · · · ·
1.6.1. Cas général·.. . . . · · . ·. . · · ·. . ·······..· · · · · . . ·.................................................................................................................... 17
1.6.2.Boîtes contenant moins de 15 colonies caractéristi-
ques au niveau de la suspension mère ·..· · · : 17
1.6.3. Boîtes contenant aucune colonie caractéristique au niveau

2. Traitement ::s l~;:re:~~èr~=·.==·=:==:=:==~::

3. L'analyse de· variance (ANOVA} · · · . · · · · · · ·.· 18

TROISIEME PARTIE: RESULTATS ET DISCUSSION 19

Chapitre premier: RESULTA TS·· · , · ·· · · ·..· · · 19

1. Le pH ···· ·· · · · ··19
2. La flore 20
 - c-

Pafes

3. La Stérilité·.·· ·.· ····· · 20

4. La température · ·..· · · · ·.............................................................................................................................. 21
. 5. Comparaison directe de deux milieux · ·.. · · · · ·................................................ 21

Chapitre deuxième : DISCUSSION 23

1. Le pH 23
2. La f1ore · · ·..· ·· ·.. · · · · 23
3. La stérilité · · · · · · ·· ·.............................................................................................................................................................. 24
4. La température 24
5. Milieux de culture _.. . . . 24

CONCLUSION GENERALE · · · 26

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES · ··· · 27

 - 1-

INTRODUCTION

Pour les pays côtiers en général, et pour les pays côtiers africains en
particulier, la pêche est la principale sOUfce. de protéines d'origine animale. En
outre, pour certains pays comme le Sénégal, elle constitue un secteur vital de
l'activité économique. C'est pourquoi, au cours des deux dernières décennies, le
tissu industriel sénégalais a vu naître de nouvelles unités que sont les sociétés
exportatrices de produits de la pêche. Les industries traitant les filets de poisson
occupent une place considérable. Elles sont approvisionnées essentiellement par
la pêche industrielle (70%) mais également par la pêche artisanale (30 %) (23).

Les grands consommateurs de filets de poisson sont les pays euro-

péens, très exigeants en matière d'hygiène alimentaire.

C'est pour protéger la santé publique contre les risques de toxi-

infections alimentaires que les pays de l'Union Européenne (DE) ont adopté des
. normes fixant les modalités de contrôle sanitaire des produits de la pêche. Ainsi
la directive 91/493/CEE du 22 juillet 1991 (12) fixe les règles sanitaires régis-
sant la production et la mise sur le marché européen des produits de la pêche
destinés à la consommation humaine. Cette directive impose aux entreprises
aussi bien des obligations de moyens que de résultats.

Plusieurs usines de pêche sénégalaises s'y conforment pour arriver

à des résultats microbiologiques satisfaisants.

Pour rechercher des coliformes thermotolérants dans les aliments, le

milieu recommandé par les normes internationales est le VRBL. Ce milieu étant
fabriqué par différent~ laboratoires, il a été constaté des disparités dans les
résultats obtenus au cours des analyses. C'est pour trouver l'origine de ces
disparités et aboutir à des résultats fiables que nous avons choisi de travailler sur
le thème suivant: « Etude comparative de la fertilité de deux milieux de
culture d'origine différente, utilisés pour la recherche des coliformes ther-
motolérants dans les fIlets de poisson congelés ».

Cette étude comprend trois parties :

- Dans la première partie, la synthèse bibliographique présente la préparation

et les modes de contamination des poissons, les coliformes thermotolérants et
enfin les milieux de culture.
- Dans la seconde partie, sont précisés le matériel utilisé et la méthodologie
employée.
- La troisième partie traite les résultats, leur discussion et propose des amélio-
rations.
 -2-

PREMIERE PARTIE: SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

Chapitre premier: PREPARATION ET MODES DE CONTAMINATION
DES FILETS DE POISSONS
Un filet de poisson correspond à chaque morceau de chair levé de
part et d'autre de l'arête centrale du poisson. Son épaisseur et sa longueur sont
variables. TI contient peu ou pas d'arêtes (2).

1. Préparation des filets de poisson (fig.I)

Les poissons utilisés pour la fabrication des filets appartiennent

essentiellement à deux familles (soleidae et cynoglossidae) (23). Le dia-
gramme ci-dessous indique les étapes de cette préparation.
Figure 1 : Diagramme de fabrication des filets de poisson

JJ JJ
FILETS DE POISSONS FILETS DE POISSONS PLATS:
RONDS: MEROUS, BARS, SOLES, MOSTELLES
ETC•••
Réception Réception
u u
Filetage-lavage Pelage-lavage
Opérations u u
souillées Pelage Filetage
u u
Lavage Lavage
u u
Trempage Trempage
(eau + glace + HTH) (eau + glace + HTH)
u u
Egouttage Egouttage
u u
Calibrage Calibrage
u u
Opérations Conditionnement Conditionnement
« propres » u u
Emballage Emballage
u u
Contrôle pondéral Contrôle pondéral
u u
Congélation Congélation
u u
Stockage Stockage
HTH = Hypochlorite de potassium
SOURCE: (29)
 -3-

2. Modes de contamination

Si de nombreux auteurs s'accordent à dire que le poisson de son

vivant présente une chair paucimicrobienne grâce à son épithélium cutané, il
se contamine toutefois relativement facilement du fait de la présence de nom-
breux germes dans ses branchies, dans son appareil digestif et son revêtement
cutané (2, 24)

Selon DHAOUI (7), les animaux aquatiques se contaminent dans

l'eau au cours de leur déplacement, leur respiration et leur alimentation. La
double contamination endogène et exogène a été constatée par beaucoup de
chercheurs (19) (voir tableau 1).

Tableau 1: Contamination bactérienne des poissons

Type de contamina- Bactéries

tion Groupes Taux

Primaire: Gram (+) Gram (-) Tube digestif:

Bactéries propres Mésophiles : (2-3 %) 1 - Psychrotrophes : 95 % 106 _ 108/ml
aux poissons - Micrococcus - Pseudomonas
- Corynéformes - Aeromonas
- Erysipelothrix rhu- - Flavobacterium Branchies:
siopathiae = (Ba- Moraxella 103 _ 106/g
cile du rouget) Alcaligenes
- Clostridium botuli- Acinetobacter
num de type E Cytophaga
- - Listeria Photobacterium
2 - Entérobactéries rares :
(2-3 %)
Surtout coliformes

Secondaire : - Stap hylococcus D'origine humaine: Peau:

Bactéries surajou- - Clostridium 1 - Entérobactéries W-106/cm2
tées => par conta- - Streptococcus Morganella (ex Proteus)
mination fécale Klebsiella-Enterobacter
E.coli - Salmonella Branchies:
2 - Psychrotropes moins 102 _ 105/cm2
nombreuses apportés
surtout par l'eau

Source (24)
 -4-

3. Conséquences des traitements sur les bactéries

3.1. Action du filetage

Compte tenu du fait que les filets de poisson entrent en contact avec
le personnel et avec le matériel souillé (caisses, tables de filetage, eaux contami-
nées), ils pourraient se contaminer, même s'il existe différents traitements qui
ont pour but de réduire de façon significative la flore de contamination.

Le lavage qui est réalisé en début de production, permet de dimi-

nuer la contamination superficielle. Selon ROZIER et.coll. (21), c'est une étape
très importante car elle conditionne la durée de vie commerciale du produit.

3.2. Action du froid

Le froid est un procédé qui a une action bactériostatique mais non

bactéricide stricto-sensu. En effet, la congélation peut détruire électivement une
population bactérienne, en particulier à Gram positif. Mais pour les bactéries à
Gram négatif, il faut maintenir l'état de congélation pendant un temps assez long
pour les détruire (4).

Cependant, cette proportion détruite pendant la congélation est insi-

gnifiante. Lors de la décongélation, les bactéries peuvent retrouver leur niveau
initial de contamination.

Le traitement par le froid est tout de même indispensable pour li-

miter le développement microbien et l'activité des enzymes bactériennes et
tissulaires responsables de l'altération des poissons.

Selon ROSSET (20), toute baisse de température de 5°C peut di-

minuer de deux fois la vitesse de croissance des germes de contamination super-
ficielle. Le froid permet ainsi d'assurer une conservation par inhibition ou arrêt
total des différents processus de dégradation, mais son action varie selon son
intensité.

La réfrigération permet une conservation de courte durée, car son

effet n'est pas bactéricide mais bactériostatique alors que la congélation (-18°C,
température de référence) inhibe le développement de plusieurs groupes bacté-
riens et le blocage de réactions enzymatiques.

Il ressort de ces notions, deux applications principales: la réfrigé-

ration permet une conservation à court terme, tandis que la congélation assure
une conservation à long terme.
 -5-

Chapitre deuxième: COLIFORMES ET COLIFORMES THERMO-

TOLERANTS

L'une des causes les plus fréquentes de rejet des filets de poisson
à l'exportation est la présence de colifonnes thermotolérants, d'où nécessité
de connaître bien ce groupe bactérien.

1. Définitions
Selon l'ISO (International Standardisation Organisation), les co-
lifonnes se définissent comme étant des bacilles à Gram négatif, non sporulés,
oxydase (-), aérobies ou anaérobies facultatifs, capables de se multiplier en
présence de sels biliaires ou d'agents de surface ayant les mêmes propriétés et
capables de fennenter le lactose avec production d'acide, de gaz et d'aldéhyde·
en 48 h à une température comprise entre 35 et 37°C (NF ISO 4832 - juillet
1991). C'est donc des entérobactéries Lactobre (+)

En microbiologie alimentaire, les coliformes thermotolérants (ou

« fécaux») sont des coliformes qui, incubés à une température de 44°C ±
1°C, pendant 24 heures au moins, présentent les mêmes propriétés (12).

2. Relation entre Entérobactéries et Coliformes

La figure 2 indique la relation entre les entérobactéries et les coli-

fonnes.

Figure 2 : Relations Enterobacteriaceae - coliformes - E. coli

SOURCE: (13, 14)

 -6-

3. Principaux genres d'Entérobactéries coliformes en hygiène ali-

mentaire et santé publique

3.1. Escherichia

Ce sont des bactéries qui ont comme habitat naturel le tube di-
gestif de l'homme et des animaux notamment le colon et le rectum.

Elles ont été découvertes en 1885 par ESCHERICH et sont large-

ment répandues dans le milieu extérieur, par l'intermédiaire des excrétats (24).

L'espèce d'origine fécale la plus répandue est E. coli. Grâce à

son pouvoir de multiplication dans certains endroits pollués, ce germe peut
constituer une source de contamination dans les industries agro-alimentaires.
Sa présence dans les aliments est indicatrice de la présence de certaines bacté-
ries pathogènes de la famille des germes entériques (Salmonella spp, Shigella
H!12.). En effet, beaucoup d'études ont montré la forte corrélation positive qui
existe (1, 2) entre ces germes.

- Selon CHANTAL (4), certaines souches d' E.coli sont très pathogènes et
sont responsables de maladies graves chez l'homme.

3.2. Klebsiella

Les bactéries de ce groupe sont fréquemment de coloration bi-

polaire dont les dimensions sont comparables à celles d'E. coli (03, - 1,5 x 0,6
- 6Jlm) (17) et présentant en outre une grande spécificité.

Le chef de file de ce groupe est représenté par Klebsiella pneu-

moniae qui vit à l'état commensal dans le tube digestif de l'homme et des
animaux. Leur pouvoir pathogène chez l'homme s'exprime par des pneumo-
nies aiguës avec fonte purulente, des otites, des méningites, des infections de
l'appareil urinaire (néphrites, cystites ... ), des diarrhées aqueuses persistantes
(2: à 14 jours) sans fièvre ni vomissement associés (15, 26) et des colites hé-
morragiques (6).

3.3. Enterobacter

Les espèces composant ce genre sont très répandues dans le sol et

les égouts. Elles mènent une vie commensale dans le tube digestif de
l'homme et des animaux, mais deviennent pathogènes quand les hôtes sont
 -7-

sensibles (surmenage, sous-alimentation, immunodépression, etc ... ) et sont

alors à l'origine de pleurésies, méningites et pyélonéphrites.

3.4. Citrobacter

D'une manière générale, ce sont des espèces commensales de

l'intestin de l'homme et des animaux, mais elles peuvent également devenir
opportunistes et dans ce cas, elles sont à l'origine de gastro-entérites, en parti-
culier Citrobacter freundii.

4. Signification des coliformes thermotolérants

Escherichia coli est en général considéré comme bon témoin de

contamination fécale. Sa présence est constante dans les fèces humaines. Chez
les animaux, il représente également les coliforrnes intestinaux majoritaires.
Dans les eaux, il est considéré comme peu fragile et disparaît en général avec
les pathogènes qu'il accompagne.

La température de 44oC sélectionne principalement les colifor-

mes thermotolérants tels que E. coli, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter
freundii et Enterobacter cloacae. Certains coliforrnes intestinaux ne cultivent
pas à 44°C, inversement certains coliformes cultivant à cette température ne
sont pas d'origine fécale: ces observations sont fréquentes dans les végétaux
en particulier (13) ; cette culture se fait sur des milieux spécifiques.
 -8-

Chapitre troisième: LES MILIEUX DE CULTURE

1. Définition

Les milieux de culture se définissent comme étant la préparation

de substances, sous forme liquide, semi-solide ou solide, qui contiennent des
composants naturels etJou synthétiques destinés à permettre la multiplication
(avec ou sans inhibition de certains micro-organismes) ou l'identification ou à
préserver la viabilité de micro-organismes (NF T 90-461 juillet 2001). Un
bon milieu de culture s'apprécie par un certain nombre de facteurs

2. Facteurs d'appréciation de la qualité des milieux de cuIture

Certaines qualités sont indispensables à un milieu pour favoriser

le développement bactérien. Ainsi un milieu de culture doit être confonne à
certains paramètres.

2.1. Fertilité

C'est la capacité d'un milieu de culture à récupérer quantititati-

vement certains micro-organismes cibles (NF T 90-461 juillet 2001).

2.2. Stérilité

C'est l'absence de culture dans des conditions données (NF T90-

461 juillet 2001). Elle doit concerner le matériel, le milieu, l'environnement
et le manipulateur.

2.3. Sélectivité

C'est la capacité d'un milieu de culture à favoriser la croissance

de certains micro-organismes spécifiques cibles au détriment de certains mi-
cro-organismes non cibles, (NF T90-461 juillet 2001).

2.4. Le pH

Il traduit le potentiel d'hydrogène de chaque milieu.

Les bactéries se développent en général en milieu neutre (7,3 -

7,4) ou légèrement alcalin (7,5 -7,6).
 -9-

3. Milieux d'isolement sélectif pour les coliformes et Escherichia coli

(11)
3.1. Milieux liquides

3.1.1. Bouillon Lactosé Bilié au Vert Brillant (BLBVB)

Il est utilisé pour rechercher et dénombrer les coliformes dans le

lait, les produits alimentaires et l'eau. Pour dénombrer Escherichia coli au
moyen du test de Mackenzie dans les mêmes produits au cours de l'analyse
bactériologique des eaux.

C'est lUl milieu composé de Peptone bactériologique, de la bile

de bœuf, du lactose et du vert brillant pour un pH optimum de 7,2 ± 0,2, le
milieu est placé dans un tube contenant une cloche dite « cloche de durham»
permettant de recueillir éventuellement le gaz formé au cours de la multipli-
cation des coliformes. Pour permettre le développement des bactéries, ce mi-
lieu doit être incubé à 44°C (±O,SOC) pendant 48 heures au moins.

3.1.2. Bouillon Lactosé Bilié au Bromo-Crésol Pourpre (BLBCP)

C'est lUl milieu qui est utilisé en bactériologie alimentaire princi-

palement au cours de l'analyse de l'eau. Il pennet de rechercher et de dénom-
brer les coliformes, par la fennentation du lactose et la production de gaz.

3.1.3. Bouillon de Schubert

Le milieu de Schubert, modifié par Fennel, est un milieu per-

mettant d'identifier rapidement Escherichia coli. Sa fonnule est composée de
tryptophane, d'acide glutamique, de sulfate d'ammonium, de citrate de so-
dium, de peptone de mannitol et d'eau distillée. Son pH optimum est de 7,4.
Comme le milieu précédent, après l'avoir préparé, il faut le stériliser.

Le dénombrement des Escherichia coli, en milieu liquide,

s'effectue habituellement en deux temps: un premier dénombrement permet
d'apprécier la présence de colifonnes: il s'effectue habituellement sur
bouillon lactosé au BCP dans le cas de l'analyse de l'eau. Chaque bouillon
lactosé au BCP positif est ensuite soumis à un test pennettant dé mettre en
évidence la présence d'E. coli. Le test de Mackenzie est fréquemment utilisé.

Dans le domaine du contrôle bactériologique de l'eau, le milieu

de Schubert peut être avantageusement choisi.
 - 10 -

3.2. Milieux solides

3.2.1. Gélose Lactosée au Chlorure de triphényl tétrazolium

et au Tergitol 7

La gélose lactosée au TTC et au Tergitol 7 est utilisée pour le dé-

nombrement par filtration sur membrane des coliformes thermotolérants (à
44°C pendant 24 heures) dans l'eau.

Il est composé de peptone bactériologique, d'extrait de viande, de

lactose, de bleu de bromothymol, de l'agar. Son pH optimum étant de 7,2 ± 0,2.

En outre, ce milieu contient du Tergitol 7 qui est un polyalcool

inhibant certaines bactéries Gram positif. Le lactose peut être fermenté avec
production d'acides organiques et abaisse le pH du milieu et virage de
l'indicateur de pH, le bleu de bromothymol aujaune.

La préparation est identique à celle 'des milieux précédents.

Le TTC (chlorure de triphényl tétrazolinum) est un indicateur

coloré de potentiel Redox et peut être réduit avec formation de formazon vio-
let par certaines bactéries.

Les colonies caractéristiques des coliformes présentent des colo-

nies dont l'aspect est le suivant: colonies jaunes avec ou sans centre orangé
(pas de réduction du TTC) avec un halo autour ~e la colonie.

3.2.2. Gélose au. Désoxycholate Citrate Lactose et Saccharose

(DCLS}

Parmi tous les milieux proposés pour la recherche et le dénom-

brement des coliformes, c'est celui qui présente le plus d'ingrédients (Dés-
oxych<;>late de sodium, Citrate de sodium, Lactose, Saccharose, Bio-polytone,
Extrait de viande, Thiosulfate de sodium, rouge neutre, agar, eau distillée)
avec un pH optimum de 7,2. .

Contrairement aux autres milieux, celui-ci inhibe partiellement la

croissance des coliformes et évite l'envahissement par Proteus (10). Il s'est
révélé un milieu très sélectif destiné à la recherche et à l'isolement des Sal-
monella et des Shigella (11). Sa préparation est identique aux précédents mi-
lieux.
 11-

3.2.3. Gélose Lactosée de DRIGALSKI

Le milieu de DRIGALSKI pennet la croissance de toutes les en-

térobactéries. Celle des. bactéries à Gram positif est inhibée par le cristal vio-
let. Il est utilisé pour séparer dans une culture les entérobactéries lactose posi-
tives des entérobactéries lactose négatives.

Malheureusement, il n'inhibe que partiellement l'envahissement

des Proteus hauseri. Il doit être autoclavé après sa préparation comme les mi-
lieux précédents.

3.2.4. Gélose Lactosée à l'éosine et au bleu de méthylène

(EMB) de Levine

C'est un milieu utilisé pour l'isolement des entérobactéries, sur-

tout Escherichia coli et Enterobacter. Malheureusement, il n'est pas sélectif
car il permet aussi le développement des levures comme Candida albicans.

3.2.5. Gélose Violet cristal Rou2e neutre Bile Lactose

(VRBL)

C'est le milieu de culture le plus récent utilisé pour la recherche et

l'identification des colifonnes. Les anciens milieux présenteraient des incon-
vénients (fertilité, stérilité, sélectivité) (11). C'est ce qui a poussé les frrmesà
fabriquer ce nouveau milieu qui, en outre, est le seul à ne pas s'autoclaver.

En effet, selon certains auteurs (6, 28), la stérilisation pourrait

dénaturer les facteurs de croissance de nature protéique ou glucidique.

Le VRBL a donc l'avantage de garder au cours de sa préparation

les composants à l'état nonnai. C'est la raison pour laq:uelle beaucoup de
nonnes le recommandent (NF ISO-7218 - Mai 1996, NF V-08-060 - Mars
1996).

Il contient deux inhibiteurs de la flore à Gram positif, des sels bi-

liaires et le cristal violet. Ce milieu contient également du lactose qui peut être
fennenté avec production d'acides organiques qui abaissent le pH du milieu et
font virer l'indicateur coloré de pH, le rouge neutre, au rose rouge. Ce milieu
doit être ensemencé dans la masse, entre deux couches de VRBL.
 - 12 -

Les colonies caractéristiques des colifonnes montrent l'aspect

suivant: colonies de diamètre> 0,5 mm, roses avec éventuellement un halo
d'opacification (précipité de sels biliaires).

Ses larges diffusions et utilisations s'expliquent par le fait qu'il

est recommandé par la plupart des nonnes mais également sa fabrication par
différents laboratoires: Merck, Bio-Rad, Laboratoires Humeau, etc ...
 - 13 -

DEUXIEME PARTIE: MATERIEL ET METHODES

Chapitre premier : MATERIEL

1. - Cadre des analyses

Le laboratoire d'Hygiène et Industrie des Denrées Alimentaires

et d'Origine Animale (HIDAOA) de l'Ecole Inter-Etats des Sciences et Mé-
decine Vétérinaires (EISMV) de Dakar a constitué le cadre de nos analyses.

2. - Produits analysés

Ce sont 300 échantillons de filets de poisson fabriqués par les

différentes usines de la place: SENEGAL PECHE, IKAGEL, AFRIMEX,
AFRICAME~ AMERGE~ etc... mais également des échantillons prélevés
par la Direction de l'Océanographie et des Pêches Maritimes (DOPM).

Tous les produits ont été soumis à une étude bactériologique (re-
cherche et identification des coliformes thermotolérants).

3. - Matériel de prélèvement

Quelle que soit l'origine de l'échantillon, nous avons toujours les

éléments suivants :
- une glacière contenant quelques packs de carboglace pour assurer le trans-
port des échantillons sous régime de froid;
- des produits congelés et conditionnés préalablement dans des sachets sté-
riles et emballés ensuite dans des sachets stériles de type « Stomache~ ».
Ces sachets sont fermés par des baguettes.

4. - Matériel de laboratoire

C'est le matériel classique utilisé dans tous les laboratoires·

d'analyse microbiologique de produits alimentaires.
 - 14 -

Chapitre deuxième: METHODES

1. Dénombrement des coliformes thermotolérants (fig.3)

Figure 3 : Dénombrement des coliformes thermotolérants

par comptage des colonies obtenues à 44°C

MODE OPERATOIRE
Dénombrement des coliformes thermotolérants
par comptage des colonies obtenues à 44°C
selon norme V 08-060 (mars 1996)

Prise d'essai
et suspen- ~
sion mère
revivifiée 1 V 25 g+ 225 ml d'EPT\
Dilution 10-
1
1 ml

Dilution dé-
cimale ~~~~ ~,~~
J
r ~ ,. 1~, 1ml 1°1
Incubation à
Isolement
sur milieu
sélectif
(en profon-
9999 44° + 1°C
pendant 24 h
+2h
deur et dou- 10-2
ble couche)

~r ~, ~ ~,

dénombrement des colonies

Lecture caractéristiques
(colonies rouges violacées,
J
d'un diamètre de 0,5 mm)
+
1
ù'

Calcul CALCUL et RESULTAT

 - 15 -

1.1. Références normatives

Nous avons utilisé les nonnes françaises et des nonnes ISO de

1996 appliquées à la recherche de colifonnes thennotolérants pour les pro-
duits solides. Elles sont consignées dans le tableau suivant:

Tableau II: Références normatives

Normes Applications
Méthode de routine
NF V 08-060
Dénombrement des colifonnes thermotolérants par comp-
Mars 1996
tage des colonies obtenues à 44oC

NF ISO 7218
Règles générales pour les examens microbiologiques
Mai 1996

NF V 08-010 Règles générales pour la préparation des dilutions en vue

Mars 1996 de l'examen microbiologique.

1.2. Préparation de la solution mère et des dilutions décimales

(NF V 08-010 - mars 1996) (5)

25 grammes de filet de poisson sont prélevés et introduits asepti-

quement dans un sachet « Stomacher ND». Ensuite, 225 ml d'eau peptonée
tamponnée (EPT) sont ajoutés. Toutes ces opérations se déroulent sous la
hotte à flux laminaire. Ensuite, le contenu du sachet a été homogénéisé pen-
dant 3 mn au « Stomacher ND ». La solution mère, ainsi obtenue, a une con-
centration de 10- 1

Cette suspension est laissée au repos pendant 30 mn, pour obtenir

sa revivification. A partir de cette solution mère, des dilutions décimales suc-
cessives sont réalisées pour faciliter les dénombrements.

1.3. Préparation des milieux de culture

Au cours de cette préparation, nous avons tenu compte des fac-

teurs d'appréciation de la qualité du milieu de culture.
 - 16 -

1.3.1. Fertilité

Pour chaque échantillon, le VRBL A et le VRBL M ont été utilisés

en même temps, de manière à pouvoir comparer les résultats obtenus et en
déduire la fertilité de chacun.

1.3.2. Stérilité

Chaque milieu est coulé dans une boîte de pétri stérile et quel-
quefois mis en contact de l'environnement quelques minutes puis fennée et
incubée à l'étuve 44°C pendant 24 h. Le lendemain, les boîtes sont lues.

1.3.3. Sélectivité

Le VRBL, outre sa sélectivité qui est due à sa composition, est

incubé à 44oC, ce qui inhibe les autres germes non thennotolérants.

1.3.4. Le pH

Chaque jour, nous mesurons le pH de chaque milieu après éta-

lonnage par un pH-mètre.

1.3.5. Préparation des deux milieux de culture

C'est à quelques exceptions près le même procédé qui est utilisé.

Il consiste à suspendre 41,5 g ou 39,5 g de poudre dans 1 litre d'eau distillée.
La solution est chauffée sous agitation jusqu'à ébullition. Le milieu obtenu est
refroidi au bain-marie 50°C.

1.4. Mode opératoire

Compte tenu du délai de péremption (8) et de son mode de prépa-

ration (il ne doit pas être autoclavé), le VRBL est préparé le jour même des
manipulations, dans des conditions très aseptiques.

1 ml de chaque dilution Cl 0- 1 et 10-2) est transféré dans des boîtes

de pétri de 90 mm de diamètre dans lesquelles sont coulés 12 à 15 ml de gé-
lose VRBL A et VRBL M fondues et refroidies séparément dans des boîtes. Ces
dernières sont laissées sur la paillasse' pour solidification.

Après solidification, une deuxième couche de 4 ml de chaque

VRBL est coulée dans les boîtes. Pour s'assurer de la stérilité de chaque mi-
lieu, dans deux boîtes de pétri sont coulées du VRBL A et VRBL M sans li-
quide de suspension.
 - 17 -

Les boîtes de pétri sont placées retournées dans l'étuve de 44° ±

1°C, pendant 24 heures.

1.5. Comptage des colonies

Après 24 h d'incubation, les colonies caractéristiques sont viola-

cées, d'un diamètre 2: à 0,5 mm et parfois entourées d'une zone rougeâtre due
à la précipitation de la bile.

A l'aide du compteur, les colonies caractéristiques sont dénom-

brées pour chaque boîte ne contenant pas plus de 150 colonies.

1.6. Expression des résultats

1.6.1. Cas général

Boîtes contenant moins de 150 colonies caractéristiques et/ou

non caractéristiques au niveau de 2 dilutions successives,' avec une boîte ren-
fermant au moins 15 colonies caractéristiques.

Le calcul du nombre N de micro-organismes par gramme ou mi-

lilitre de produit est obtenu à l'aide de l'équation suivante:
LC LC
N= ou N=
. 1,1 x d

L C = somme des colonies caractéristiques comptées sur les 2 boîtes retenues

V = volume prélevé (1 ml)
nI = nombre de boîtes à la première dilution
n2 = nombre de boîtes à la deuxième dilution
d = taux de dilution correspondant à la première dilution comptée.

Les résultats sont arrondis à deux chiffres significatifs et doivent

être exprimés en nombre de micro-organismes par gramme de produit.

1.6.2. Boîtes contenant moins de 15 colonies caractéris-

tiques au niveau de la suspension mère

Le résultat doit être donné sous la forme:

N=Cxl/g
d d = taux de dilution de la suspension mère
C = nombre de colonies caractéristiques comptées.
 - 18 -

1.6.3. Boîtes contenant aucune colonie caractéristique au ni-

veau de la suspension mère

d = taux de dilution de la suspension mère

2. Traitement des données

Il a été conduit au moyen d'outils infonnatiques avec le tableau

« EXCEL ». Dans la base de donné.es, ont été inscrits le numéro de
l'échantillon, le pH, la flore, la température d'incubation et la nature du milieu.

3. L'analyse de variance (ANOVA)

Des études statistiques descriptives (éhlde de la moyenne, écart-

type, minimum et maximum) ainsi que l'analyse de variance ont pennis de
présenter les résultats et d'appréhender la similarité et la dissimilarité qui
existent entre les deux milieux et l'influence des différentes variables.

L'analyse de variance consiste à déterminer un paramètre F qui

est le rapport de la variance inter-colonnes (Ve) exprimant la variabilité des
mesures dans une colonne à une autre sur la variance intra-colonnes (Vi) ex-
primant la variabilité des mesures dans une colonne encore appelée variance
résiduelle ou variance « due au hasard ». Ainsi, F exprime le rapport entre la
variabilité d'une mesure à l'autre entre les diverses colonnes et la variabilité
des mesures dans une même colonne (17, 22). Si F calculé est supérieur au
(FN-C] c-l lu sur la table statistique des F (au seuil de signification 5 0/0), le
facteur étudié a un effet significatif sur la variabilité éhldiée.

En outre, le test de student' s a été utilisé pour comparer directe-

ment les deux milieux de culture et en déduire la fertilité.
 - 19-

TRDISIEME PARTIE: RESULTATS ET DISCUSSION

Chapitre premier: RESULTATS

Six cents (600) résultats ont été obtenus. En plus des données
microbiologiques (nombre de coliformes thermotolérants sur les deux milieux
de culture utilisés), des paramètres tels que la température d'incubation, le
pH, la stérilité sont relevés chaque jour pour essayer d'expliquer les résultats
obtenus.

1. LepH

Pour les deux milieux de culture utilisés (VRBL A et VRBL M),

l'optimum est de 7,4. Les deux tableaux qui suivent, permettent d'établir des
statistiques descriptives (moyenne, écart-type, etc ... ) et l'analyse de variance
inter-groupes et intra-classes de 600 données enregistrées.

.Tableau III : Statistiques descriptives du pH

Milieux Moyenne Ecart.;type N Minimum Maximum

1 7,259 9,751E-02 300 7,0 7,4
2 1
7,288 8,032E-02 300 7,0 7,4
Total 7,274 9,043E-02 600 7,0 7,4

Tableau IV : Analyse de variance du pH en fonction du milieu

Somme des Moyenne Significa-

.-=
.--
Q,l Variations
carrés
ddl
des carrés
F
tion
~1 Inter-groupes 0,126 1 0,126 15,844 0,000
==Q. lntra-classe 4,772 598 0,08
Total 4,899 599

Il ressort de ces analyses statistiques qu'il existe une différence

très significative du pH entre les deux milieux avec P < 0,0001.

Le VRBLM a un pH qui se rapproche du pH optimum (7,4) que

 - 20-

2. La flore

Elle est constituée exclusivement par des coliformes thermotolé-

rants. L'analyse de variance nous a permis de dresser les deux tableaux sui-
vants.
Tableau V: Statistiques descriptives de la flore

Moyenne Minimum Maximum

Milieux Ecart-type N
de 2ermes de 2ermes de 2ermes
1 69,03 198,16 300 0 2040
2 221,63 986,14 300 0 15100
Total 145,33 714,74 600 0 15100

Le tableau ci-dessus fait ressortir que la moyenne de la flore du

premier milieu est de 69,03 alors que celle du second milieu est de 221,63. De
même, le maximum du milieu 1 (VRBL A ) est de 2040 alors que celui du mi-
lieu 2 (VRBLM ) est de 15100 .germes.

Tableau VI : Analyse de variance de la flore en fonction du milieu

Somme des Moyenne Significa-

Variations ddl F
carrés des carrés tion
....-=
Cj
Inter-groupes
3493166,60 1 3493166,602 6,905 0,009
~ combinés
tL1.
-=
~
1
lntra-classe 302508800 598 505869,559

Total 306001967 599

1

Il existe une différence très significative de la flore dans les deux

milieux avec P < 0,005.

3. La Stérilité

Aucun coliforme thermotolérant n'a été dénombré dans les 600

boîtes VRBL A et VRBL M « témoins» qui ont été incubées à 44°C en même
temps que les boîtes de pétri avec inoculum
 - 21 -

4. La température

Tableau VII : Statistiques descriptives de la température

Milieux Moyenne· Ecart-type N Minimum Maximum

1 44,38 0,55 300 43 46
2 44,39 0,54 300 43 46
Total 44,38 0,55 600 43 46

L'analyse statIstIque nous montre que la température

d'incubation des 586 échantillons se trouve dans la fourchette.

14 échantillons ont été incubés à 46°C, mais cette augmentation

de température ne semble pas influencer négativement sur les coliformes qui
ont donc poussé. De plus, 14 est très négligeable par rapport à 600 échan-
tillons.

Tableau VIn: Analyse de variance du milieu en fonction de la température

1 Somme des Moyenne Significa-

Clj Variations ddl F
1. carrés des carrés tion
.e= = Inter-groupes
1. . -
-
Clj
'G.) . . .
Q,~
5
Clj
combinés
Intra-classes
0,007
178,327
1
598
0,007
0,298
0,022 0,881

E-c
Total 178,333 599

Il n'existe pas de différence significative entre la température

d'incubation des deux milieux avec P = 0,881.

5. Comparaison directe de deux milieux

N = 300 = rI = r2

A partir du tableau V, la moyenne en germes du milieu 1 est de

69,03 alors que l'écart-type est de 198,16, la moyenne en germes du milieu 2
est de 221,63 pour un écart-type de 986,14. Ces valeurs nous permettent d'uti-
 - 22 -

liser le test de student' s et de comparer directement la moyenne en gennes du

VRBL A et du VRBLMo

t = (Ml - M 2) / V (S? / rI) + (Sl/ r2)

t= 152,6 / V(l98,16i + (986,14i

300

t= 152,6 / 58,07 = 1 2,671

t 0,001 ; 298 = 12,592 1

lu sur la table

t calculé est supérieur à t lu sur la table (0,025)

En effet: 2,67 > 2,592 1

La différence qui existe entre les deux moyennes est significative avec un
P = 0,001.

Le milieu de culture VRBL M est plus fertile que le VRBLAo

 - 23 -

Chapitre deuxième: DISCUSSION

1. Le pH
Au cours de nos travaux, la moyenne obtenue pour le milieu A
est de 7,259 avec un écart-type de 9,751.10-2, un minimum de 7,0 et un
maximum de 7,4 (valeur optimale). C'est un pH qui ne s'écarte pas de la
fourchette permettant le développement des coliformes fécaux. En effet, selon
GUIRAUD et GALZY (9), les coliformes thermotolérants peuvent se déve-
lopper jusqu'à un pH de 7 voir de 5 pour E.coZt.
Enfin pour THATCHER et CLARK (28), les coliformes fécaux
tolèrent les écarts de pH de 5,2 à 7,9.
Le milieu M se rapproche beaucoup plus de l'optimum avec une
valeur moyenne de 7,288 ; un écart-type de 8,032.10-2 , un maximum de 7,4 et
un minimum de 7,0.
2. La flore

En ce qui nous concerne, les analyses ont porté sur 600 échan-
tillons (filets de poisson) pour les deux types de milieux. Nous avons obtenu
le résultat suivant:

• Pour le milieu A : • Pour le milieu M :

- Moyenne: 69,03 germes/g Moyenne: 221,63 germes/g
Ecart-type: 198,16 Ecart-type: 986,14
- Minimum: 0
Maximum: 2040 germes/g
Minimum: °
Maximum: 15100 germes/go

Quel que soit le milieu, A ou M, la moyenne obtenue est infé-

rieure à celle de NDIAYE (16) qui est de 236 germes/g de filet.

TOURE (29) et SEYDI et coll. (25) ont également trouvé des

résultats supérieurs avec le même milieu et sur les mêmes produits soit res-
pectivement une moyenne de 275 et de 625 germes/g de filet.

Par contre nos résultats sont supérieurs à ceux trouvés par BAER
et coll. (3) dont la contamination des filets analysés varie de 1 à 10 germes/g
de produit.

Enfin AZIBE (2) et OUATTARA (18) trouvent des résultats très

différents. Le premier rapporte une moyenne de contamination de 625 ger-
mes/g alors que le second trouve une moyenne de 12 germes/g.
 24 -

Avec le Désoxycholate Citrate Lactose Saccharose, NDIAYE

(16) et SITTI (27) ont fait l'étude de l'évolution de la qualité bactériologique
des produits de la pêche destinés à l'exportation sur plusieurs années et ont
constaté qu'il y avait une amélioration significative de la qualité bactériologi-
que. En ce qui nous concerne, d'une façon générale, quel que soit le milieu
utilisé (VRBLA ou VRBL M ), nos résultats seraient largement supérieurs à la
plupart de ceux des auteurs, et cela en dépit de la mise en place des moyens et
conditions defahrication grâce à la méthode d'analyse HACCP ou ADMPC,
même si le VRBL M est trois fois plus fertile que le VRBL A .

Avec le nouveau milieu de culture exigé par la norme européenne

pour la recherche de coliformes, c'est-à-dire le VRBL, on trouve des résultats
qui nous obligent à redoubler de vigilance et à repenser nos systèmes de fa-
brication.

3. La stérilité

Aucune présence de coliformes thermotolérants n'a été observée

dans les boîtes « témoins» ce qui veut dire que ni l'environnement, ni le mi-
lieu, ni les manipulateurs n'ont biaisé les résultats obtenus.

Selon GUIRAUD et GALZY (9), il existe de nombreux milieux

de culture qui permettent le développement, la conservation, l'isolement, la
sélection des micro-organismes.

4. La température

14 échantillons sur 600 ont été incubés à une température se

trouvant au-delà de celle fixée par la norme NF V-08-060 mars 1996, qui est
de 44°C ± 1°C, c'est-à-dire 46°C.

THATCHER et CLARK (28) ont utilisé la norme de 45,5°C ±

2°C et ont obtenu les résultats suivants: le VRBL incubé à 45,5 ± 2°C don-
nait un pourcentage de coliformes de 77,2 % alors qu'à 44°C, ils n'obtenaient
que 53,1 0/0.

5. Milieux de culture

Actuellement, le milieu le plus utilisé pour la recherche des coli-

formes thermotolérants dans les aliments solides est le Violet Red Bile Lac-
tose (VRBL). il est fabriqué par différentes fmnes (laboratoires HUMEAU,
MERCK, BIO-RAD, etc ... ) mais avec la même composition mentionnée :
 - 25 -

peptone, extrait de levure, chlorure de sodium, sels biliaires, lactose, rouge

neutre, cristal violet et agar.

Les deux milieux VRBL, utilisés pour notre étude, ont la même
composition mentionnée excepté le pourcentage d'agar qui varie de 12 à 15 %
selon le milieu.

Tous les auteurs qui ont utilisé le VRBL pour la recherche des
coliformes ont trouvé des résultats relativement supérieurs à ceux qui ont uti-
lisé d'autres milieux de culture. Mais au sein du même milieu, il existerait des
variations au cours du dénombrement. Malheureusement, au cours de notre
travail, nous n'avons pas pu étudier la composition chimique des milieux pour
la comparer avec les mentions de l'étiquetage. Seul le pH a pu être mesuré et
il s'est avéré qu'il est plus fréquent d'atteindre le pH optimum du VRBLM
que du VRBL A lors de la préparation des milieux de culture.

Pour notre travail, l'analyse de variance et le test de student's ont

montré que le VRBLM est très fertile par rapport au VRBL A .

ELLIOT et coll. (8) ont étudié la comparaison de trois milieux

(VRBL, Mac Conkey et la méthode Lauryl Sulfate Tryptone (LST)). Ils ont
trouvé que c'est le VRBL incubé à 45,5°C ± 2°C qui donnait les meilleurs
résultats.

Indépendamment des milieux de culture utilisés, on constate qu'il

y a globalement une amélioration de la qualité bactérienne des coliformes
thermotolérants dans les filets de poisson congelés.

Des études récentes ont été menées par NDIAYE (16) en 1996 et
1997 et par SITTI (27) de 1997 à 2000 sur l'évolution de la qualité bactério-
logique des produits de la pêche destinés à l'exportation. Elles ont montré une
diminution importante des coliformes thermotolérants au fil des années, ce
qui dénote une amélioration significative du respect des règles d'hygiène et
des bonnes pratiques de fabrication dans les usines de transformation des pro-
duits de la pêche.
En effet, selon ABABOUCH (1), les coliformes thermotolérants,
présents dans les aliments, sont témoins du non respect des règles d'hygiène
(contamination fécale des produits). Cette évolution favorable de la qualité
des aliments est sans nul doute le résultat de l'introduction du système Hazard
Analysis Critical Control Points (HACCP) ou Analyse des Dangers et Maî-
trise des Points Critiques (ADMPC) au niveau de toutes les sociétés de trans-
. formation de produits de la pêche à partir de 1996.
 - 26-

CONCLUSION GENERALE
L'exportation des produits de la pêche est une sourcenon négli-
geable de devises pour le Sénégal qui dégage un excédent annuel de 24 mil-
liards de francs CFA (23).

Ces· produits halieutiques commercialisés et exportés vers les

pays de l'Union Européenne (DE), du Canada et des Etats-Unis d'Amérique
doivent répondre à des critères microbiologiques utilisés à des fins réglemen-
taires.

L'autorité compétente nationale a donc entre autres pour mission·

de faire contrôler la qualité microbiologique de ces produits par un laboratoire
agrée.
.
Un des critères microbiologiques concerne le dénombrement des
coliformes thermotolérants dans les produits de la pêche. Or, il s'est avéré que
les résultats relatifs à ce dénombrement étaient très différents d'un laboratoire
à l'autre, qui pourtant avait recours à un milieu de culture ayant la même dé":
nomination commerciale (VRBL) mais provenant de fabricants différents.

Nous avons donc mené des études sur 600 échantillons de filets
de poisson, dont 300 ont été ensemencés sur un milieu VRBLA et 300 sur un
milieu VRBL M pour apprécier les matières.
- Pour le VRBLA , le nombre moyen de germes dénombré est de 69 avec un
écart-type de 198, un maximum de 2040 germes et un minimum de 0
- Pour le VRBL M , le nombre moyen de germes dénombré est de 221 avec
un écart-type de 986, un maximum de 15100 germes et un minimum de O.

Compte tenu de ces résultats, il s'avère que le critère microbiolo-

gique des coliformes thermotolérants fixé pour les filets de poisson congelés,
qui est de 10 germes/g, est toujours largement dépassé.

De plus, le milieu VRBL M se révèle trois fois plus fertile que le

VRBLA , C'est pourquoi nous le recommandons pour la recherche et le dé-
.nombrement des coliformes thermotolérants.

Il serait souhaitable d'effectuer des études plus poussées permet-

tant de compléter les résultats que nous avons obtenus. Ces travaux devraient
porter sur l'analyse de la composition chimique de chaque milieu et de voir si
cela correspond exactement aux mentions figurant sur l'étiquette.
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