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République Algérienne Démocratique et Populaire
Ministère de l’Enseignement Supérieure et de la Recherche

Scientifique
Université Abderrahmane Mira – Béjaïa
Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Département des Sciences Biologiques de l’Environnement
Mémoire de Fin de cycle
En vue de l’obtention du diplôme de MASTER
Option : Environnement et sécurité alimentaire
Thème
Isolement et caractérisation de champignons

cellulolytiques des sols de Béjaïa
Membres du jury Réalisé par :
Président : Mr Sidi H. Melle : HOCINI Aïda
Promoteur : Mr Ramdani N. Melle : MEZIANI Wassila
Examinateurs : Mr Boulila A/G.
Mr Hamlat M.
Promotion : 2013
Remerciements
Louange tout d’abord à Dieu, notre créateur qui nous a
donné la force pour terminer ce modeste travail.
Toutes nos infinies gratitudes à notre promoteur, Monsieur

RAMDANI.N, Maître-assistant à l’Université de Béjaïa,
pour son encadrement, sa qualité humaine, sa patience et son
dynamisme et de nous avoir guidé et conseillé pour mener à
bien ce travail.
Nous remercions aussi les membres de jury qui nous ont fait
l’honneur d’accepter le jugement de notre travail.
Notre sincère reconnaissance à nos enseignants du

Département des Sciences Biologiques et de
l’Environnement.
Enfin, nous remercions tous ceux qui ont contribué de prés ou

de loin à l’élaboration de ce modeste travail, trouvent ici
l’expression de notre profonde gratitude et respect.
Aida, Wassila
.DEDICACES
Je dédie ce modeste travail à mes très chers

parents pour leur soutien et pour leurs
encouragements qu’ils n’ont pas cessés de
m’apporter tout au long de mes études.
A mon très cher grand père que Dieu
l’accueille auparadis.
A ma sœur Kahina et mon frère A/Malek qui
ont toujours été là pour moi.
A tous mes amis Melissa, Fitz etJes, Chahra,
Hocine qui étaient chaque jour avec moi et
surtout àLamine et Lounis et Dizay.
A toute ma famille, mes tantes, mes oncles et
mes cousines Linda et Nabila et mes cousinset
mes camarades
A mon binôme Aida et à toute sa famille
A tous les enseignants qui ont contribué à ma
formation durant tout le parcours de mes
études.
A toute la promotion 2012/2013 ESA
MEZIANI Wassila
DEDICACES
Au nom de Dieu Tout Puissant, je dédie ce travail

A ma chère mère, à mon cher père, les deux
personnes qui se sont beaucoup sacrifiées pour
moi, m’ont aidée et soutenue, sans eux je
n’aurais eu la volonté d’atteindre ce niveau
A mes deux chers frères Sofiane et Adel qui ont
toujours été là pour moi
A mon fiancé Sid-Ali qui m’a toujours soutenu
A toute ma famille
A toutes mes copines,camarades, cousines,
cousins et collègues
A mon binômeWassila et toute sa famille
A tous les enseignants et les éducateurs qui ont
contribué à ma formation durant tout le parcours
de mes études jusqu’à ce jour ;
A toute la promotion de 2012 /2013
Environnement et Sécurité Alimentaire
HOCINI Aida
SOMMAIRE
INTRODUCTION 01
CHAPITRE I : Synthèse bibliographique

Partie I : La cellulose
I.1. Définition 03
I.2. Source et localisation de la cellulose 03
I.3. Structure moléculaire de la cellulose 03
I.4. Structure supramoléculaire de la cellulose 04
I.5. Propriétés de la cellulose 05
I.5.1. Solubilité 05
I.5.2. Substitution de la cellulose et solubilité 06
I.6. Dégradation biologique de la cellulose 06
I.7. Le papier 07
I.7.1. Généralités 07
I.7.2. Différents types de pates 07
I.7.2.1. Pâtes mécaniques 08
I.7.2.2. Pâtes chimiques 08
I.7.2.3. Pâtes mi- chimiques 08
I.7.3. Dégradation du papier 08
I.7.3.1. Les causes de vieillissement naturel du papier 08
I.7.3.2. Les facteurs de dégradation du papier 09

- La température et l'humidité 09
- La lumière 09
- Les micro-organismes 09
- Les insectes 10
- La pollution 10
Partie II : La Cellulase
II.1. Généralités 11
II.2. Nomenclature 11
II.3. Structure de la cellulase 11
II.4. Les différentes origines de la cellulase 12
II .4.1 Origine animale 12
II .4.2 Origine végétale 12
II .4.3 Origine microbienne 12
II.5. Quelques caractéristiques de la cellulase 13

II.5. 1. Réaction et spécificité 13
II.5. 2. Substrats naturels 13

II.5. 3. Activité enzymatique 13
II.5. 4. Poids moléculaire 13

II.5. 5. pH optimum 13
II.5. 6. Température optimale 14
II. 6. Mécanisme d’action de la cellulase 14

II. 7. Les enzymes cellulolytiques 14
Partie III : Les champignons

III.1. Généralités 17
III.2. Caractéristiques générales des champignons 17
III.3. Modes de reproduction des champignons 18

III.3.1. Reproduction asexuée 18
III.3.2. Reproduction sexuée 18
III.4. Mode de vie des champignons 18

- Le saprophytisme 18
- Le parasitisme 18
- La symbiose 18
III.5. Classification des champignons 19
CHAPITRE II : Matériels et Méthodes

II.1. Matériels 22
II.1.1. Origine et prélèvement des sols 22
II.1.2. Milieux de culture 22
II.1.3. Substrats cellulosiques 22
II.2. Méthodes 23
II.2.1. Analyse physico-chimique des sols 23
II.2.1.1. Mesure du pH 23
II.2.1.2. Dosage du calcaire total 23
II.3. Test de biodégradation du papier dans les sols 23
II.4. Dénombrement et isolement des champignons 23
II.4.1. Préparation des suspensions- dilutions 24

II.4.2. Ensemencement 24
II.4.3. Méthode de dénombrement 24
II.4.4. Purification 24
II.4.5. Conservation des souches 25
II.5. Sélection des souches cellulolytiques 27

II.5.1. En milieu solide 27
II.5.2. En milieu liquide 27
II.6. Identification des champignons cellulolytiques 27
II.6.1. Etude Macroscopique 27
II.6.2. Etude Microscopique 28
II.7. Evaluation de l’activité cellulosique 28
II.7.1. Dosage des sucres réducteurs par le DNS 29
CHAPITRE III : Résultats et Discussions

III.1. Résultats des analyses du sol 30
III.2. Test de biodégradation du papier 30
III.3. Isolement et dénombrement des champignons 31
III.4. Sélection des souches cellulolytiques 32
III.5. Identification des champignons 36

III.5.1. Etude macroscopique 36
III.5.2. Etude microscopique 40
III.6. Evaluation de l’activité cellulolytique des souches 44
CONCLUSION 47
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES 48
ANNEXES
RÉSUMÉ
Liste des figures
Figure 1 : Structure moléculaire de la cellulose (page 4)
Figure 2: structure micro fibrillaire de la cellulose (page 5)
Figure 3 : Procédé de dénombrement et d’isolement des champignons cellulolytques (page 26)
Figure 4 : droite d’étalonnage de glucose (page 29)
Figure 5: Densité de champignons dans les sols (page 32)
Figure 6 : Les différents cas de figure observés sur le papier filtre Wattman N°1 après 7 jours
d’incubation à 28°C.(page 33)
Figure 7 : Les différents cas de figure observés sur milieu solide avec Le réactif iodo-ioduré
(solution de lugol) et le réactif rouge Congo (page 35)
Figure 8 : Les caractères macroscopiques de la souche fongiques (OG4a2V) de Oued Ghir

(page 36)
Figure 9 : Les caractères macroscopiques de la souche fongiques (OG4a2O) d’Oued Ghir

(page 37)
Figure 10: Les caractères macroscopiques de la souche fongiques (OG3b2) d’Oued Ghir
(page 38)
Figure 11 : Les caractères macroscopiques de la souche fongiques (BM4a2) d’Oued Ghir

(page 39)
Figure 12 : Les caractères microscopiques des souches fongiques (OG4a2V, BM4a2)

(page 40)
Figure 13 : Les caractères microscopiques de la souche fongique (OG4a2O) (page 41)

Figure 14: Les caractères microscopiques de la souche fongique (OG3b2) (page 42)
Figure 15: les activités CMC ase des souches (page 45)
Liste des tableaux
Tableau 1 : les résultats d’analyse du pH et du CaCO3 (page 30)
Tableau 2 : résultats du test de biodégradation du papier dans le sol (page 31)
Tableau 3 : Observation des tubes pour la dégradation du papier (teste du papier) (page 33)
Tableau 4 : Résultats des activités CMC ases des souches (page 44)
Introduction
INTRODUCTION
La diminution des ressources combustibles fossiles et des produits chimiques de base
ont suscité un vif intérêt pour les ressources carbonées naturelles renouvelables. A ce titre, la
cellulose, constituant majeur de la paroi des cellules végétales et polymère organique le plus
abondant sur terre, a été au centre des recherches de nature très diverse pour la production
d'énergie ou de matières premières nouvelles. Elle est considérée comme une source
inépuisable dans un contexte mondial où la demande en produits écologiques et
biocompatibles est particulièrement croissante.
La production annuelle mondiale de cellulose est estimée à 1,5.1012tonne

(Berlioz,2007),parfois transformée en matières tels que le papier. Ce dernier est utilisé à
grande échelle dans plusieurs domaines,il est considéré comme un matériau de base servant à
écrire, à imprimer, à emballer, il est également utilisé dans la fabrication de composants
divers.
Par ailleurs, notre société se trouve actuellement confrontée aux problèmes d'économie
d'énergie, de pollution et de prolifération des déchets de tous genres (déchets agricoles, rejets
de l'industrie alimentaire, résidus forestiers et de l'industrie du bois, ainsi que les déchets
urbains). Tous ces déchets constituent des sources potentielles de cellulose.
La valorisation de la cellulose est d'un intérêt considérable. Sa dégradation conduit à la

production des composés chimiques et énergétiques qui jouent un rôle important dans le cycle
de carbone et de l'énergie de la biosphère. Elle peut également permettre de répondre aux
besoins d'énergie des pays en voie de développement qui n'ont pas les moyens de se procurer
les combustibles dont ils ont besoin.D’où une nécessité de la transformer,soit par :
- une hydrolyse chimique du bois conduisant à des sucres fermentescibles ;

- une combustion directe pour la production d'énergie;
- une pyrolyse qui transforme la cellulose en combustibles tels que méthane, hydrogène,
mono et dioxyde de carbone et éthylène
- une dégradation biologique (biodégradation ou bioconversion) qui se fait par
hydrolyse enzymatique utilisant des cellulases et engendre une grande diversité de
composés de faible poids moléculaire(hexoses, pentoses, di et tri-saccharides) ;
1
Introduction
La biodégradation de la celluloseest un des paramètres majeurs contrôlant le cycle du carbone

sur terre. Elle est assurée exclusivement par des microorganismes du sol et plus
particulièrement par les champignons qui sécrètent des enzymes hydrolytiques afin d’accéder
à leur principale source de nutriments qui se trouve sous la forme de polymères glucidiques
tel quelacellulose(Carlile et al., 1997).
L’hydrolyse enzymatique de la celluloseconduit à des sucres solublespuis, par fermentation, à

des produits de métabolisme comme les acides, les alcools et à la production des protéines
d'organismes unicellulaires (P.O.U.) utilisées dans l'alimentation animale (Pourquie et
Vandecasteele, 1984).
De nombreux champignons sont cellulolytiques. Ils produisent des endoglucanases,

desexoglucanases et des β-glucosidases qui seraient des enzymes aux propriétés
trèsparticulières (Bèguin, 1990). La biodégradation de la cellulose a lieu aussi en aérobiose
(la surface du sol) qu’en anaérobiose (le rumen animal). Ainsi, la cellulose constitue une
source d’énergie renouvelable (Zermane2008).
Le présent travail a pour objectifs d’une part, l’isolementet la caractérisationdes souches de

champignons capables de dégrader la cellulose, à partir de deux sols de la région de Béjaïa
et, d’autre part, d’évaluer leur activité cellulolytique en vue de sélectionner les souches
cellulolytiques les plus performantes.
2
Chapitre I : Synthèse bibliographique
Partie I : La cellulose
I.1. Définition
Selon Marouf et Tremblin (2009) la cellulose est la molécule organique la plus abondamment
synthétisée lors de la photosynthèse et la plus renouvelable sur la planète. C’est un polymère
naturel qui joue un rôle essentiel dans la structure des plantes et elle représente le constituant
majeur des fibres végétales (coton, lin, chanvre, jute, ramie, etc.) et des végétaux utilisés dans
l’industrie du papier. Dans le bois, principale matière papetière, la cellulose représente 40 à
49% de la matière sèche chez les résineux ou conifères (pin, sapin, épicéa) et 30 à 40% chez
les feuillus (peuplier, hêtre, charme). En effet, un arbre produit environ 10g de cellulose par
jour
I.2. Source et localisation de la cellulose
Selon Marouf et Tremblin (2009) La cellulose est synthétisée dans le cytoplasme des cellules
végétales, au niveau de la membrane cellulosique où elle est associée à des polymères de
lignine. Elle se dépose à l’extérieur de la membrane plasmique pour former les parois
cellulaires. Cet ensemble forme une structure compacte, quasiment imperméable et participe
au soutien et à la rigidité des tissus.
La paroi cellulosique est formée de deux structures différentes :
 La lamelle mitoyenne qui constitue la paroi primaire et renferme près de 70% de lignine ;
 La paroi secondaire qui est constituée par 3 lamelles (S1 à S3). C'est la paroi la plus
importante, elle résulte de l'incrustation de la cellulose par la lignine et par les
hémicelluloses.
I.3. Structure moléculaire de la cellulose
La molécule de la cellulose est un homopolymère linéaire, de formule brute (C6H10O5)n qui a

été déterminée par Willtatter et Zechmeister en 1913 (Marouf et Tremblin, 2009). Elle résulte
de la polycondensation de plus de 10000 unités de molécules de D-glucopyranose, liées les
unes aux autres par des liaisons ß-(14) glycosidique (substitution d’un groupe hydroxyle de
l’hémiacétal d’un sucre avec un groupe hydroxyle d’un alcool d’un autre sucre) (figure 1).
3
Figure 1 : Structure moléculaire de la cellulose
Sa masse moléculaire est très élevée, de l’ordre de 500 KDa et elle peut atteindre 5000 KDa.
Deux unités de glucopyranose constituent une unité cellubiose (dimère fondamental).
L’élucidation de sa structure polymère date de 1926 avec les travaux de Staudinger (Berlioz,
2007 ; Marouf et Tremblin, 2009).
Selon Pourquie et Vondecasteele (1984), à l’état naturel, les molécules de cellulose sont
associées en une structure complexe à la fois fibrillaire et cristalline dont l’organisation exacte
reste encore l’objet de plusieurs controverses.
I.4. Structure supramoléculaire de la cellulose
La présence de nombreux groupes hydroxyle (-OH) confère à la chaine de cellulose une

grande tendance à former des liaisons hydrogènes intramoléculaires et intermoléculaires. Ce
type de liaisons est responsable de la formation de structures supramoléculaires. Les chaînes
de cellulose s’agrègent, formant des fibres élémentaires qui se lient côte à côte par des
liaisons hydrogènes constituant des microfibrilles rigides et insolubles. La structure
supramoléculaire de la cellulose est illustrée par la figure 2 d’après Reguant et Rinaudo,
(1999), cités par Arezki in Berki (2010).
Les cristaux de cellulose native fortement des microfibrilles de 2 à 50 nm de large ; les zones
amorphes correspondent principalement aux chaînes en surface des cristaux. Les
microfibrilles sont de tailles et de sections variables selon les sources de la cellulose (Wertz,
2009).
4
Figure 2: structure microfibrillaire de la cellulose Ruguant et Rinaudo
I.5. Propriétés de la cellulose
Au niveau des industries agroalimentaires, la seule propriété qui soit vraiment importante
concerne la solubilité de la cellulose en présence d'eau. Cette solubilité se répercute sur son
comportement en milieu hétérogène.
I.5.1. Solubilité
La cellulose est insoluble dans l'eau mais la présence des fonctions hydroxylées lui donne un
caractère hydrophile ce qui lui permet de fixer un grand nombre de molécules d'eau et
entraîne le gonflement de la cellulose : c'est un hydrocolloïde (Voet et Voet, 2005).
La cellulose peut être solubilisée dans les acides, les bases ou les complexes inorganiques
(liqueur de Schweitzer). La solubilisation de la cellulose est possible par conversion de cette
dernière sous la forme de dérivés esters ou éthers. Il y a de ce fait perte de la structure
cristalline et solubilisation sous formes de solutions visqueuses dont la viscosité va dépendre
du degré de polymérisation. La substitution des hydroxyles n'est pas nécessairement élevée,
on définira un degré de substitution qui pourra varier de 1 à 3 (substitution des hydroxyles en
C2, C3, C6) (Marouf et Tremblin , 2009).
5
I.5.2. Substitution de la cellulose et solubilité
Les principaux produits dérivés de la cellulose sont utilisés dans les industries
agroalimentaires sont les suivants : cellulose microcristalline (36kDa) obtenue par traitement
acide, elle est partiellement dépolymérisée et peu soluble. Les autres produits sont des éthers
de la cellulose comme : la carboxyméthylcellulose (CMC), l'hydroxypropylcellulose (HPC),
la méthylcellulose (MC), les éthers mixtes d'hydroxypropyl-méthylcellulose (HC-MC) et
méthyl-éthylcellulose (MC-EC).
Dans le cas des éthers renfermant une chaîne latérale hydroxylée comme dans le cas de l'HPC,
il est possible d'avoir des substitutions au niveau de cette chaîne latérale. Il faut distinguer
dans ce cas le degré de substitution (DS) qui ne concerne que les hydroxyles du glucose et un
module de substitution (MS) qui concerne à la fois les hydroxyles du cycle et ceux des
chaînes latérales. Ainsi, une hydroxypropylcellulose pourra avoir un DS de 2 et un MS de 3
ce qui voudra dire qu'il y a 2 hydroxyles du cycle qui sont éthérifiés par un radical
hydroxypropyle et l'une des fonctions hydroxylée d'une chaîne latérale est elle-même
substituée. Si les substitutions sont réparties de façon homogène, on obtiendra des solutions
filantes, si la répartition est hétérogène on obtiendra des solutions granuleuses (Marouf et
Tremblin, 2009).
I.6. Dégradation biologique de la cellulose
La biodétérioration et la biodégradation sont deux termes se rapportant aux dégradations

biologiques.
- La biodétérioration est définie comme l’ensemble des modifications des propriétés
physico-chimiques et mécaniques d’un matériau ou d’un matériel par l’action
d’organismes vivants. Ces modifications sont inopportunes et préjudiciables à
l’utilisation et/ou au bon fonctionnement du matériau ou du matériel.
- La biodégradation est définie comme l’ensemble des réactions de transformation ou de

destruction des éléments constitutifs d’un matériau dû à l’action d’une ou plusieurs
entités biologiques (Hilaire, 1994).
6
Différents organismes (bactéries, champignons, insectes) sont susceptibles de dégrader la

cellulose par le biais de leurs métabolites. Dans le cas des champignons, il a été indiqué
précédemment qu’ils peuvent dégrader les substrats en sécrétant des toxines, des pigments, ou
encore des enzymes telles que les cellulases qui dégradent la cellulose.
La dégradation de la cellulose par les cellulases a été très étudiée en raison de l’importance
de ces enzymes dans les industries pharmaceutiques, agro-alimentaires et textiles (Gusakov et
al., 2000 ; Karmaker et Ray, 2011; Kovacs et al., 2008; Li et al., 2007; Singhania et al., 2010).
Le mécanisme d’hydrolyse de la cellulose se ferait dans un premier temps via un premier

acide aminé de la cellulase qui protone l’oxygène de la liaison glycosidique. Un second acide
aminé de l’enzyme chargé négativement arrache un hydrogène à une molécule d’eau formant
ainsi un ion HO- qui agit comme un nucléophile sur un carbone d’une molécule de glucose (Li
et al., 2007; Singhania et al., 2010).
I.7. Le papier
I.7.1. Généralités
Le papier (du latin papyrus) est une matière fabriquée à partir de fibres cellulosiques
végétales. Il se présente sous forme de feuilles minces et est considéré comme un matériau de
base dans les domaines de l’écriture, du dessin, de l’impression, de l’emballage et de la
peinture. Il est également utilisé dans la fabrication de composants divers, comme les filtres
(Blet, 2011).
Le processus de fabrication du papier remonte à l’Antiquité ; il se fait en deux étapes :
- la désintégration de la matière première dans l’eau afin d’obtenir des fibres individuelles
en suspension;
- la formation de feuilles feutrées lorsque cette suspension est disséminée sur une surface
poreuse et adaptée, à travers laquelle l’eau peut s’égoutter (Blet, 2011).
1.7.2. Différents types de Pâtes
La pâte à papier est composée de la cellulose du bois, obtenue après élimination des parties
dures du bois (la lignine). Le traitement chimique classique fait appel à des agents très
corrosifs (soude, chlore, dioxyde de chlore etc.) et consomme beaucoup d’énergie (broyage,
7
cuisson sous pression). De plus, la production de pâte à papier pollue de grandes quantités
d’eau et génère de mauvaises odeurs. Une amélioration du procédé de fabrication est très
difficilement rentable car le papier est une matière première produite à très bon marché
(Anonyme, 2007).
1.7.2.1. Pâtes mécaniques
Elles sont obtenues en râpant le bois à l’aide d’immenses meules appelées « défibreurs », qui
arrachent les fibres. La pâte mécanique est essentiellement destinée à la fabrication de
produits nécessitant moins de résistance, tels que le papier journal, certains papiers de presse
magazine et certains cartons (Houtmeyers, 2006).
1.7.2.2. Pâtes chimiques
Elles sont obtenues en faisant cuire le bois à haute température dans des « lessiveurs » en
présence de produits chimiques, pour dissoudre la lignine et libérer les fibres.
Les pâtes chimiques sont utilisées pour la fabrication de produits qui offrent une grande
résistance. A la différence des pâtes précédemment présentées, la pâte chimique est utilisée
pour fabriquer du papier de qualité supérieure, avec une durée de vie plus longue. Ce papier
qui ne contient plus de lignine est appelé « papier sans bois » (Houtmeyers, 2006).
1.7.2.3. Pâtes mi- chimiques
Elles proviennent de bois (ou paille) ayant subi un traitement chimique modéré, complété par
un traitement mécanique. Cette pâte à très haut rendement a des propriétés intermédiaires
entre les pâtes mécaniques et chimiques.
Le bois est composé de 50 à 80% de cellulose et de 20 à 30% de lignine. La cellulose est faite
de fibres, de longueurs variables, reliées entre elles par la lignine. Plus les fibres sont longues
(c’est le cas des résineux, les sapins, en général), plus le papier sera résistant (Houtmeyers,
2006).
1.7.3. Dégradation du papier
1.7.3.1. Les causes de vieillissement naturel du papier
Selon Zermane (2008) le papier présente naturellement dans sa composition des éléments qui,
en vieillissant, se dégradent et participent à la fragilisation des œuvres. Le papier est
8
essentiellement constitué de fibres de cellulose. Le processus naturel de vieillissement casse

les molécules constituant les fibres du papier de façon lente et irréversible. Le degré et la
vitesse de détérioration dépendent d’une part de l’instabilité chimique des matériaux
constitutifs et d’autre part des facteurs extérieurs de dégradation comme l’environnement, les
conditions de rangement et de manipulation
1.7.3.2. Les facteurs de dégradation du papier
selon Zermane ( 2008)
- La température et l'humidité
Les températures élevées accélèrent la dégradation des matériaux instables présents au sein
des œuvres mais également parmi les techniques graphiques. Associées à une forte humidité,
elles favorisent également le développement des micro-organismes responsables de la
moisissure des matières organiques. A l'opposé, les températures basses rendent le papier
friable. Les écarts trop brusques de température peuvent provoquer des dégradations
physiques comme des fendillements ou des décollements. De même de trop grandes
fluctuations du taux d'hygrométrie provoquent des variations dimensionnelles menant
également à des fendillements et des décollements, ou bien encore à des déformations.
- La lumière
La lumière qu'elle soit naturelle (soleil) ou artificielle (lampe), dégage essentiellement deux
types de rayonnements aussi dangereux l'un et l'autre pour les œuvres d'art :
 Les rayons infrarouges : présents en grande quantité dans la lumière naturelle, ils
produisent une élévation de la température et ont un effet desséchant sur les matériaux
organiques, tel que le papier, le vieillissement sera alors plus rapide.
 Les rayons ultraviolets : présents en grande quantité dans la lumière produite par des
lampes halogènes ou à fluorescence, et dans une moindre mesure dans la lumière du
soleil, ils provoquent, par exemple, le jaunissement des œuvres exposées.
- Les micro-organismes
Les micro-organismes susceptibles de s'attaquer aux œuvres sont des champignons (comme
les moisissures) et des bactéries. La plupart des moisissures se développent entre 4 et 30°C et
seulement lorsque l'humidité relative dépasse les 60%. Les dégradations observées sont
9
l'apparition de tâches indélébiles de couleurs diverses et un affaiblissement du papier, jusqu'à

parfois leur destruction totale.
- Les insectes
Certaines conditions sont propices au développement des insectes. Ils s’attaquent alors aux
objets ou documents contenant de la cellulose pour se nourrir. Ainsi, une température et une
humidité élevées, une mauvaise ventilation, un nettoyage insuffisant et irrégulier, la présence
de nourriture, la mauvaise étanchéité des portes et des fenêtres, le mauvais état du bâtiment et
l’intégration dans l’environnement d’objets déjà contaminés sont les principales causes de
développement des insectes. Les dégradations provoquées par les insectes sont progressives et
peuvent aller de simples trous épars dans les objets à leur destruction totale. Les insectes
utilisent les matériaux organiques pour se nourrir et pour faire leurs nids. Ils créent des
dommages physiques pour déposer leurs œufs (galeries), et chimiques par l’intermédiaire de
leurs larves. Ces dernières secrètent des substances qui dégradent la matière organique afin de
la rendre comestible.
- La pollution
Elle se présente sous la forme de gaz et de particules solides, toutes deux dangereuses pour les
œuvres. La pollution atmosphérique est une des premières causes externes d’altération
chimique. Parmi les gaz polluants les plus corrosifs présents dans l’air d’une ville, il faut citer
les composés soufrés (les dioxydes et les trioxydes de souffre), les composés azotés comme
l’oxyde d’azote ou encore l’ozone. Ces composants réagissent avec l’humidité de l’air et
forment des composés accélérant la dégradation des œuvres, comme par exemple l’acidité.
Les particules minérales, métalliques ou organiques présentes dans l’air peuvent contribuer à
catalyser certains processus de dégradation. Elles peuvent également favoriser la croissance
de micro-organismes toujours présents dans l’atmosphère (pollen, spores…).
10
Partie II : La Cellulase
II.1. Généralités
Le terme général de « cellulase » est employé pour caractériser les enzymes impliquées dans
la dégradation de la cellulose (Jouany, 1994). Les cellulases sont un groupe d’enzymes
cellulolytiques qui hydrolysent les liaisons β –(14)- glycosidiques présentes dans la
cellulose (Voet et Voet 2005).
Ces enzymes sont produites typiquement par les bactéries, levures et protozoaires, qui jouent
un rôle majeur dans la digestion des animaux, et la transformation de la matière organique
végétale en humus dans le sol. Elles ont aussi des applications biotechnologiques et
industrielles.
Selon Jean Pelmont (1995), les cellulases constituent des systèmes enzymatiques capables
d’hydrolyser les macromolécules de cellulose en molécules de sucres suffisamment petites
pour passer à travers les membranes cellulaires.
Des micro-organismes cellulolytiques sont doués d’un système enzymatique encore plus
élaboré ; il s’agit d’un complexe multienzymatique extracellulaire situé à la surface des
cellules et cellulosome. De tels complexes ont jusqu’à présent été décrits uniquement chez des
microorganismes anaérobies, essentiellement des bactéries de l’ordre Clostridium (Desvaux,
2001).
II.2. Nomenclature
 Nom codifié de la Cellulase (EC : 3.2.1.4)
 Nom systématique: 1,4 - (1,3 ; 1,4) - β-D – Glucan4 –glucanohydrolase
 Nom recommandé: cellulase
II.3. Structure de la cellulase

La majorité des cellulases microbiennes étudiées sont des glycoprotéines, avec un taux élevé
en acides aminés acides (Beldman et al., 1985) et ne sont pas des métalloprotéines (Saha et al.,
1994). Elles ont généralement une structure modulaire avec deux domaines fonctionnels
distincts : le site catalytique et le site de fixation du substrat, habituellement reliés entre eux
11
par un peptide glycosylé flexible riche en Ser / Pro et Thr appelé ≪linker ≫ (Cavako-Paulo,
1998 ; Receveur et al., 2002 ; Hasper et al., 2002).
La présence du domaine de fixation est essentielle pour la dégradation de la cellulose
cristalline de coton, car elle augmente la concentration de l’enzyme autour du substrat et de ce
fait améliore la catalyse enzymatique (Din et al., 1991 ; Boraston et al., 1998). Le site actif
situé dans le domaine catalytique, a la forme d’un tunnel où la réaction hydrolytique a lieu
(Henrissat et Bairoch, 1996).
Le domaine de fixation des cellulases fongiques comporte 36 acides aminés et se fixe de
façon réversible à la cellulose (Linker et Teeri., 1996), grâce à la tyrosine qui joue un rôle
important dans la fixation du substrat par une interaction hydrophobe (Reinikainen, 1994).
II.4. Les différentes origines de la cellulase
Les cellulases sont largement répandues dans la nature. Elles sont recensées chez des
organismes très divers : bactéries, champignons, plantes etc. De ce fait, les cellulases peuvent
avoir plusieurs origines : animale, végétale et microbienne (Bensmira, 2006). Ces origines
sont :
II.4.1. Origine animale
Plusieurs espèces animales (omnivores et herbivores) utilisent la cellulose comme source

d’énergie, malgré leur incapacité à produire des cellulases endogènes, mais ceci est dû à une
vie symbiotique des microorganismes dans leur système digestif. Des cellulases ont été
isolées à partir du suc digestif d’escargot comestible Helix pomatia, de la moule bleue Mytilus
edulis et du mollusque marin Littorina brevicula.
II.4.2. Origine végétale
Les cellulases jouent un rôle important dans la maturation des fruits ou elles participent à la
libération des arômes. Ces enzymes végétales sont généralement obtenues par extraction à
partir des fruits tels que les grains de raisin, les amandes douces, des céréales tels que l’orge et
le riz de la variété Oryza sativa. Les préparations cellulasiques d’origine végétale sont
dépourvues d’exo- β-glucanases.
II.4.3. Origine microbienne
Les bactéries et les moisissures utilisent la cellulose pour la production de quantités

substantielles d’enzymes extracellulaires qui sont alors facilement récupérées du milieu de
12
culture après fermentation, ces enzymes peuvent être présentes sur la surface des cellules. Les
cellulases bactériennes et fongiques sont les plus étudiées notamment en raison de leurs
utilisations potentielles en biotechnologie.
II.5. Quelques caractéristiques de la cellulase
II.5.1. Réaction et spécificité

Elle est représentée par l’endohydrolyse des liaisons 1,4-β -D-glucosidiques de la cellulose et
des lignines mais aussi l’hydrolyse des liaisons 1,4 et 1,3 en β-D- glucanes (Schamburg et
Salzmann, 1991).
II.5.2. Substrats naturels

La cellulase peut avoir différents substrats naturels tels que : la cellulose, dont la dégradation
complète nécessite une action complémentaire des enzymes cellulolytiques ; il en est de même
pour d’autres substrats cellulosiques tels que les Xyloglucanes ainsi que le coton (Lynd et al.,
2002).
II.5.3. Activité enzymatique

L’activité cellulasique est exprimée en unités internationales. Elle correspond à la quantité
d’enzymes dégradant la carboxymethylcellulose en carbohydrates réduits (1 micromole de
glucose par minute) Elle varie de 60U à 1168 U et plus pour les enzymes immobilisées
(Withers, 2001 et Teeri, 1997).
II.5.4. Poids moléculaire

Les cellulases ont des poids moléculaires très variables qui dépendent principalement de leurs
origines. Certaines endoglucanases ont des poids moléculaires de 30 à 90 KDa, alors que
d’autres sont de dimensions beaucoup plus faibles de l’ordre de 13 KDa (Odier et Rouau,
1985 ; Dan et al., 2000). Les exoglucanases ont des poids moléculaires de 30 à 50 KDa
(Singh et al. , 1990) alors que les β -glucosidases ont des masses moléculaires plus élevées
variant de 90 à 240 KDa (Sanyal et al., 1988).
II.5.5. pH optimum
La plupart des préparations cellulolytiques étudiées ont un pH optimum variant de 3 à 7 (Lynd
et al., 2002). Celles d’origine fongique ont une gamme plus limitée (pH de 4 à 5)
contrairement aux cellulases bactériennes dont le pH optimum est proche de la neutralité
(Buchholz et al., 1983).
13
II.5.6. Température optimale

La température optimale des cellulases fongiques varie entre 40 et 70 °C alors que celle des
bactéries varie entre 50 et 100°C, ce qui explique leur utilisation en industrie du textile (Ando
et al. , 2002).
II. 6. Mécanisme d’action de la cellulase

Les cellulases se distinguent des autres glycosides hydrolases par leur capacité à hydrolyser
les liaisons s-osidiques entre les résidus glycosyliques. (Lynd et al., 2002).
L’hydrolyse enzymatique des liaisons glycosidiques s’effectue par un mécanisme acide/base,
constitué d’un donneur de proton et d’une base nucléophile (Sinnott, 1990). Ceci signifie que
la rupture de la liaison osidique fait intervenir une série d’échanges d’électrons et de protons
entre certains résidus de l’enzyme et du substrat. Généralement, l’hydrolyse des liaisons
glycosidiques β (1-4) de la cellulose se fait avec rétention de la configuration du carbone
anomérique (Gebler et al., 1992). Les produits d’hydrolyse peuvent avoir comme
conséquence l’inversion ou la conservation (double mécanisme de rechange) de la
configuration anomérique du carbone-1 à l’extrémité réductrice (Birsan, et al., 1998 ;
Ooshima et al., 1990 ; Withers, 2001).
La nature insoluble de la cellulose représente un défi pour les systèmes cellulases ; pour s’y
adapter la plupart des cellulases ont une structure modulaire facilitant la fixation de l’enzyme
à la surface de la cellulose, pour amorcer l’hydrolyse de la cellulose. Le système de cellulases
montre une activité collective plus élevée que la somme des activités de différentes autres
enzymes, un phénomène connu sous le nom de synergie (Lynd et al., 2002).
Quatre formes de synergisme ont été rapportées (Din et al., 1994 ; Teeri, 1997) :
 Synergie endo-exoglucanase
 Synergie exo-exoglucanase
 Synergie exoglucanase et β –glucosidase (la cellobiose en tant que produit final)
 Synergie intramoléculaire entre les domaines catalytiques et le ≪linker ≫.
II. 7. Les enzymes cellulolytiques
Sous le nom de cellulase, sont regroupées plusieurs enzymes dont seule l’action synergique
peut aboutir à l’hydrolyse complète de la cellulose cristalline. Elles peuvent être produites
séparément ou sous forme de complexe (Jean Pelmont, 1995).
14
L’activité cellulasique se traduit par l’action de trois types d’enzymes :
A. L’exo β(1-4) glucanase ou Cellobiohydrolase (EC. 3.2.1.91)

Cette enzyme attaque les polymères de cellulose par les extrémités non réductrices et libère
exclusivement du cellobiose. L’enzyme seule n’est active ni sur la cellulose cristalline, ni sur
la cellulose soluble (carboxymethyle cellulose). Par contre, elle attaque l’action de
l’endocellulase sur la cellulose cristalline, seuls quelques champignons filamenteux
(Trichoderma resei, Trichoderma koningii, Fusarium solani, Chaetomium thermophile,
Sporotrichum pulverulentum) semblent disposer d’une cellobiohydrolase (Scriban., 1999).
B. Endoβ (1-4) glucanase ou Endocellulase (EC. 3.2.1.4)

L’endocellulase est capable de rompre les liaisons internes de la chaîne cellulosique.
L’attaque se fait au hasard et entraîne la libération de cellodextrines, de cellobiose et de
glucose. L’endocellulase est très active sur les celluloses solubles. L’activité est d’autant plus
importante que le degré de polymérisation est élevé. Par contre, son activité est très faible sur
la cellulose cristalline. L’attaque, au hasard, a pour effet de créer de nouvelles extrémités non
réductrices qui deviennent à leur tour des sites réactifs pour les cellobiohydrolases (Hasper et
al., 2002).
La complémentarité des deux types d’enzymes cités ci-dessous explique en partie l’effet
synergique du mélange. Par contre, le mécanisme de coopération cellobiohydrolase
/endocellulase qui permet l’hydrolyse de la cellulase cristalline, reste encore mal connu
(Scriban, 1999).
Tous les microorganismes cellulolytiques possèdent au moins une endocellulase, parfois
plusieurs tel que Trichoderma koningii qui possède quatre endocellulases à caractéristiques
très différentes (Scriban, 1999).
C. Β(1-4) glucosidase ou Cellobiase (EC. 3.2.1.21)

La cellobiase hydrolyse la liaison β glucosidique du cellobiose et libère deux molécules de
glucose. Selon sa spécificité, la cellobiase peut être active sur les β (1-4) oligoglucosides,
mais l’activité diminue rapidement quand la longueur de la chaîne augmente.
De nombreux auteurs ont montré que la cellobiase est fortement inhibée par son produit
d’hydrolyse le glucose. L’importance du rôle de la cellobiase lors d’une saccharification a été
soulignée par plusieurs auteurs. En effet, en hydrolysant le cellobiose, la cellobiase permet
15
d’éviter l’inhibition de la cellobiohydrolase, ainsi la vitesse globale de la cellulolyse est

étroitement dépendante de l’activité cellobiasique ( Lynd et al., 2002).
Les microorganismes à forte activité cellulasique, en particulier Trichoderma viridae, sont
déficients en cellobiase. Ceci se traduit par une accumulation de cellobiose et par une baisse
de la vitesse de saccharification (Scriban, 1999).
A l’intérieur de chaque classe peuvent exister plusieurs enzymes différentes se trouvant sous
forme d’isoenzymes (Scriban, 1993).
16
Partie III : Les champignons

III.1. Généralités
Les champignons constituent un ensemble très diversifié que l’on estime, bien que les chiffres
soient approximatifs, à un million d’espèces. Cependant, seulement 14% de ces organismes
ont été découverts (Hawksworth et Rossman, 1997 ; Hawksworth, 2001 ; Neubert et al.,
2006). Ils présentent des caractères communs aux plantes et aux animaux qui ne permettent
pas de les classer dans l’un ou l’autre règne, ils forment donc un règne à part (Bouchet et al.,
1999).
III.2. Caractéristiques générales des champignons
Les champignons sont des eucaryotes et leurs noyaux sont minuscules. Ils sont dépourvus de
chlorophylle et de pigments assimilateurs (Genevès, 1990 ; Genevès, 1992).
Ils sont Thallophytes, c’est à dire ne possédant pas de racines, ni de tiges, ni de feuilles. Ils se
caractérisent par la formation de filaments (hyphes) libres ou entrelacés dont l'ensemble est
désigné sous le nom de mycélium. Celui-ci peut être coenocytique (non cloisonné, c'est-à-dire
hyphe résultant de divisions nucléaires répétées, sans divisions cellulaires concomitantes), soit
cloisonné (Bouchet et al., 1999 et Boiron , 2005).
Les champignons présentent des parois cellulaires mais à la différence de celles des plantes,
elles sont composées de chitine et non de cellulose, la principale forme de stockage des
glucides est le polysaccharide glycogène (Indge, 2004). Ils se reproduisent essentiellement
par des spores uni- ou pluricellulaires. On distingue, selon leurs origines, les spores sexuées et
les spores asexuées. La forme sexuée, ou téléomorphe, a pour fonction de maintenir l’espèce
et apparait souvent en fin de saison alors que la forme asexuée, dite aussi forme imparfaite ou
anamorphe, assure la propagation. La nutrition s’effectue à travers des haustoria, c’est-à-dire
des tubes suçoirs (Bouchet et al., 1999).
17
III.3. Modes de reproductions des champignons

Les champignons présentent deux types de reproduction :
III.3.1. Reproduction asexuée
Les spores représentent le mode de reproduction asexué le plus commun chez les
champignons : elles sont produites soit dans des sporanges, soit à partir de cellules d’hyphes
appelées cellules conidiogénes (Raven et al., 2000).
III.3.2. Reproduction sexuée

Elle est assurée par des gamètes ou des spores formées à la suite d’une méiose. Cette
reproduction sexuée est très variable tant sur le plan de la diversité des organes que sur celui
des cycles de développement. La fécondation peut s’effectuer chez un même individu
(homothallisme) ou entre deux individus différents (hétérothallisme) (Sterullu, 1991).
III.4. Mode de vie des champignons
Indépendamment du classement hiérarchique en plusieurs groupes et sous-groupes, les

champignons sont classés selon leur mode de vie en trois grandes catégories: les saprophytes,
les parasites et les symbiontes.
 Le saprophytisme : les espèces saprophytes se développent aux dépens des

substances mortes d’origines animale ou végétale (Bouchet et al., 1999). Ces espèces jouent
un rôle essentiel au sein des cycles biologiques en minéralisant les matières végétales ou
animales mortes (Marouf et Reynaud, 2007).
 Le parasitisme : plusieurs champignons mènent une vie parasite vis-à-vis des
substances organiques (Florent, 1993). Le parasitisme est généralement nuisible et souvent
nocif. C’est le cas des espèces responsables de maladies sur les végétaux tel que l’oïdium
(blanc) (Bouchet et al ; 1999).
 La symbiose : Raven et al., (2000) ; Marouf et Reynaud (2007), définissent la
symbiose comme une association étroite et durable entre les organismes d’espèces différentes,
pouvant appartenir à des règnes différents , vivant en équilibre les uns avec les autres et tirant
les bénéfices mutuels de cette union, mais pouvant vivre séparément.
- Les lichens : sont constituées d’une association entre champignon (principalement du
phylum Ascomycota) et une cyanobactérie. L’algue, capable de photosynthèse, va fournir les
18
molécules organiques carbonées au champignon qui en retour fournira les éléments minéraux
à l’algue.
- Les mycorhizes : sont constituées d’une association entre un champignon et la racine
d’une plante. Les mycorhizes constituent la forme de symbiose la plus répandue à l’échelle
planétaire. On estime que 90% des végétaux contractent spontanément cette association. Les
champignons vont développer un réseau de filaments mycéliens à partir de la racine et vont
être impliqués dans la nutrition minérale des plantes. C’est d’ailleurs une association
symbiotique qui aurait permis aux plantes de coloniser le milieu terrestre.
III.5. Classification des champignons
Les champignons ont fait l'objet de classifications multiples et complexes. Elles sont en
constante évolution. (Barnett et Barry, 1972 ; Botton et al, 1990 ; Bouchet et al, 1999).
On distingue globalement 03 divisions selon (Strullu, 1991 ; Davet, 1996) :
 Division 1 : GYMNOMYCOTA : champignons à zoïdes, cellules dépourvues de paroi

(présence de myxamibes et de plasmodes);
 Division 2 : MASTIGOMYCOTA : champignons à zoïdes (présence de spores
mobiles);
 Division 3 : AMASTIGOMYCOTA : champignons sans zoïdes (pas de cellules
mobiles, pas de flagelles).
Les champignons sont subdivisés en quatre sous embranchements :
a) ZYGOMYCOTINA ou ZYGOMYCÈTE : elle est présentée essentiellement par

les zygomycètes, elles comprennent environ 200 espèces, rassemblent des champignons
saprophytes, ainsi que des champignons parasites d'insectes (Entomophthorales), de
Nématodes et d'Amibes (Zoopagales), et de plantes. Les Zygomycètes sont caractérisées par
un mycélium siphonné ou coenocytique, une reproduction asexuée le plus souvent par
sporocystospore et une reproduction sexuée par fusion de gamétocyste.
b) ASCOMYCOTINA ou ASCOMYCÈTE : les Ascomycètes comprennent environ
15.000 espèces, auxquelles il faut ajouter un nombre à peu près équivalent d'espèces
lichénisantes. Ils sont caractérisés par un mycélium cloisonné ou unicellulaire (levure) ; une
reproduction asexuée par des conidies et une reproduction sexuée par formation de spore
méiotique (ascospores) dans des asques.
19
c) BASIDIOMYCOTINA ou BASIDIOMYCÈTE : Il existe environ 20.000 espèces,

ce sont des champignons que l'on peut considérer comme les plus perfectionnés. Ils sont
caractérisés par un mycélium cloisonné ou unicellulaire (levure), une reproduction asexuée
par des conidies et une reproduction sexué par formation de méiospore (basidiospore) dans
des basides.
d) DEUTEROMYCOTINA ou DEUTEROMYCETES (champignons imparfaits) :
encore appelés Adélomycètes. Les Deutéromycètes ne constituent pas un groupe naturel, mais
d'un ensemble artificiel regroupant environ 15.000 espèces (plus du quart des champignons
actuellement connus). Ils sont caractérisés par un thalle en général cloisonné ou unicellulaire,
ne présentant jamais, ou très exceptionnellement, de forme de reproduction sexuée ; la
plupart présentent, néanmoins, des affinités d'Ascomycètes et ils se reproduisent uniquement
par voie végétative au moyen de spores asexuées (conidie) ou par simple fragmentation du
mycélium (arthroconidie). Les Deutéromycètes se divisent en trois sous-classes :
- Les Blastomycètes : Levures avec ou sans pseudomycélien.

- Les Hyphomycètes : Champignons filamenteux, stériles (Agonomycétales) ou
produisant leurs spores directement sur les hyphes ou sur des conidiophores simples ou
agrégés (Moniliales).
- Les Coelomycètes : Conidies produites dans des pycnides (Sphaeropsidiales) ou
dans des acervules (Mélanconiales).
e- CHYTRIDIOMYCOTA OU CHYTRIDIOMYCETES : sont les seuls champignons à

posséder des spores uniflagellées (zoospores). La présence de spores flagellées semble
restreindre ces organismes aux milieux aquatiques et dans les sols humides. Environ 1000
espèces ont été décrites au sein de cette classe, ce qui correspond à environ 1% des espèces
décrites de champignons. La plupart sont des saprophytes, aérobies ou anaérobies; ils sont
capables de dégrader un grand nombre de substrats. On recense également de nombreux
pathogènes ou de parasites d’algues. Ils sont souvent microscopiques mais peuvent aussi
produire un mycélium.
f- OOMYCETES : ce sont des champignons-algues et regroupent notamment les Diatomées

et les algues brunes, jaunes et dorées. Se sont des eucaryotes à mode de vie aquatique. Ils sont
saprophytes, parfois parasites. Leur multiplication dominante est asexuée, assurée par des
20
planospores (cellules nageuses biflagellées hétérochontes) ou zoospores, produites au sein de

sporocystes.
g- MYXOMYCETES : ce sont des champignons qui possèdent un plasmode et assurent
leur nutrition par phagocytose. Certains sont classés dans les Protistes, d'autres ne peuvent
que faire l'objet d'un règne autonome.
Remarque : Actuellement les espèces issues de la classe des Oomycètes et des Myxomycètes
ne présentent pas les caractères énumérés précédemment et donc ne peuvent plus être
considérés comme des champignons au sens strict (champignons vrais).
21
Chapitre II : Matériels et méthodes
Matériels et Méthodes
II.1. Matériels
II.1.1. Origine et prélèvement des sols
L’isolement des colonies de champignons microscopiques à activité cellulolytique est

effectué à partir de deux sols de la région de Béjaïa; il s’agit du sol de la décharge de
Boulimat et du sol de jardin botanique d’Oued Ghir.
Une partie de ces sols a été séchée à l’air libre pendant une semaine pour subir certaines
analyses physico-chimiques.
II.1.2. Milieux de cultures
Le milieu de base utilisé pour l’isolement des champignons cellulolytiques est CMC-agar,
décrit par Mandels et Weber (1969) et dont la composition par litre d’eau distillée est la
suivante : NaNO3, 2g ; KH2PO4, 1g ; MgSO4 (7H2O), 1g ; KCl, 0.5g ; CuSO4 (5H2O),
0.001g ; MnCl2, 0.001g ; ZnSO4 (7H2O), 0.005g ; CMC, 2.5g ; Agar, 16g. Le milieu est ajusté
à pH 5 et stérilisé à 120°C pendant 20 min.
Par ailleurs, nous avons utilisé trois autres milieux de culture :
- GEM (Gélose à l’Extrait de Malte) ;
- PDA (Potato Dextro Agar) ;
- Milieu Czapeck-Dox
Ces milieux dont la composition figure en annexe permettent la purification et la

caractérisation des champignons.
II.1.3. Substrats cellulosiques
Afin de tester la capacité cellulolytiques de nos champignons, deux types de substrats

cellulosiques ont été utilisés :
- Le papier filtre Whatman N° 1 qui contient de la cellulose insoluble associée à

d’autres substances de nature non déterminée ;
- La CarboxyMéthylCellulose (CMC) soluble (Sigma).
22
II.2. Méthodes
II.2.1. Analyse du sol
Après séchage à l’air libre pendant une semaine et un léger broyage, les sols sont passés au
tamis à mailles carrées de 2mm de diamètre pour éliminer la fraction grossière. La fraction
fine du sol obtenue a subi deux types d’analyse physico-chimique, à savoir :
II.2.1.1. Mesure du pH
Le pH des sols est déterminé par l’emploi d’un pH-mètre à électrode de verre préalablement
étalonné. La réaction du sol est déterminée sur une suspension aqueuse dans laquelle le
rapport sol/eau égale à 1/2,5. Deux mesure de pH sont effectuées : pHeau (acidité actuelle) et le
pHKCL(acidité potentielle).
II.2.1.2. Dosage du calcaire total
Les taux de CaCO3 total des sols sont déterminés par la méthode volumétrique, en
décomposant les carbonates de calcium par l’HCl et en mesurant le volume de CO2 dégagé à
l’aide du calcimètre de Bernard.
II.3. Test de biodégradation du papier dans le sol
Afin de déceler la présence de champignons capables de dégrader la cellulose dans les sols,
nous avons procédé à un test préliminaire de dégradation du papier. Pour cela, les
échantillons de sols ont été répartis séparément dans des boites de pétri en verre stérile.
Ensuite des disques de papier filtre type Whatman N°1 de diamètre de 7 cm ont été déposés
sur la surface des sols préalablement humidifiés. Les boites ainsi préparées sont incubées à
une température ambiante du laboratoire pour une durée de 15jours.
II.4. Dénombrement et isolement des champignons
L’isolement et le dénombrement des champignons cellulolytiques ont été réalisés selon la

technique des suspension- dilutions et étalement sur milieux gélosés, préconisés par Davet et
Rouxel (1997).
23
II.4.1. Préparation des suspensions- dilutions

Pour chaque traitement, 10g de sol sont mis en suspension dans 90ml d’eau distillée stérile.
La solution est agitée pendant 30 min sur un agitateur magnétique puis laissée décanter une à
2min. La suspension obtenue correspond à la solution mère (c’est la dilution 10-1).
Un ml de la solution mère est versé dans un tube contenant 9ml d’eau distillée stérile, c’est la
dilution 10-2. Après agitation, 1ml de la solution 10-2 est prélevé stérilement, puis transféré
dans un deuxième tube contenant comme le premier, 9ml d’eau distillée stérile. La dilution se
fait ainsi jusqu'à 10-7.
II.4.2. Ensemencement
A l’aide d’une pipette stérile, 0.1ml de chaque suspension-dilution est étalé sur le milieu
CMC-agar avec trois répétitions. Les échantillons de culture ensemencés correspondent
respectivement aux dilutions 10-2, 10-4 et 10-6. Les boites de Pétri sont incubées à 28°C et leur
lecture est effectuée toutes les 24 h pendant 7 jours. Ces opérations sont schématisées sur la
figure3.
II.4.3. Méthode de dénombrement
Le dénombrement consiste à compter les colonies présentes sur les boites en Unité Formant
Colonie (UFC). Le comptage se fait macroscopiquement. En tenant compte des
caractéristiques des colonies sur son milieu approprié, seules les boites ayant 30 à 300 UFC
sont retenues. Le nombre d’Unité Formant Colonie (UFC) est déterminé selon la formule :
UFC = Nombre de colonies × Facteur de dilution finale

Poids sec du sol
II.4.4. Purification
Après incubation, une mycoflore variée s’est développée. La pureté des souches est vérifiée
par repiquage successif sur différents milieux.
Le repiquage consiste à prélever avec une aiguille stérile un fragment mycélien à la marge du
thalle, et de le transférer sur les milieux PDA, CMC-agar, GEM et Czapeck-Dox. L’inoculum
est mis au centre de la boite. Après cette opération, les boites de Pétri sont entourées du papier
parafilm et sont mises à incuber à une température de 28°C. Après 72 heures, on observe
l’apparition de colonies bien différenciées.
24
II.4.5. Conservation des colonies
Les colonies pures obtenues sont repiquées par des stries d’épuisement parallèles dans
des tubes à vis contenant le milieu PDA ou CMC-agar incliné de manière à avoir des colonies
abondantes. Après 7 jours d’incubation à 28°C, les tubes de collection sont conservées à 4°C
en évitant le plus possible tout risque de contamination (Botton et al., 1990).
25
10g de sol
+ 90 ml eau distillée stérile
1 ml 1ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
9 ml d’eau
distillée stérile
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml
Ensemencement
Sur boites de Pétri
Incubation à 28°C
Apparition des colonies
Dénombrement et isolement
Purification
Conservation à 4°C
Figure 3 : Procédé de dénombrement et d’isolement des champignons cellulolytiques

26
II.5. Sélection des colonies cellulolytiques

L’isolement des champignons cellulolytiques a été réalisé selon une pression de sélection
progressive. Celle-ci est effectuée selon deux étapes progressives :
II.5.1. En milieu solide

La technique la plus évidente serait de faire apparaître la capacité des champignons à
assimiler la cellulose sur un milieu gélosé (CMC-agar) contenant 1% de carboxymétyl
cellulose, comme seule source carbonée et d’énergie. Le réactif iodo-ioduré (solution de
lugol) ou le réactif rouge Congo sont utilisés pour mettre en évidence la zone d’hydrolyse de
la cellulose qui apparaît autour de la colonie.
II.5.2. En milieu liquide

Le principe reste le même, un milieu liquide totalement dépourvu d’une quelconque source
de carbone, exception faite pour les bandes de papier filtre Whatman n°1 qui servent de
source de carbone, a été utilisé.
Les cultures de champignons sont incubées à 28°C en présence de bandelettes de papier
Whatman n°1 (1 cm de largeur et 10 cm de longueur) stériles plongées dans 10 ml du milieu
sans CMC minéral préalablement stérilisé. L’ensemencement se fait par 1 ml d’une préculture
de chaque souche. Un blanc (sans inoculum) est soumis aux mêmes conditions. La
dégradation du papier est observée visuellement et quotidiennement (Gunnar et al., 1999).
II.6. Identification des champignons cellulolytiques

L’identification des champignons cellulolytiques est effectuée par deux techniques classiques
selon Cahagnier (1998) et Guillaume (2006):
- une étude macroscopique
- une étude microscopique.
II.6.1. Etude Macroscopique

Cette étude est basée sur l’observation des colonies à l’œil nu et à la loupe binoculaire.
L’observation des caractères porte sur :
- l’aspect de la colonie (couleur de la surface et du revers de la boite, texture de la surface
des colonies, topographie…).
- l’aspect des bordures des colonies.
- La couleur du mycélium aérien
- Présence ou absence de gouttelettes sur le mycélium
- Production de pigment diffusible
27
- Vitesse de croissance (diamètre de la colonie à 7 jours : rapide ≥ 3 cm ; modérée : entre 1

et 3 cm et lente ≤ 1 cm).
II.6.2. Etude Microscopique

L’identification des champignons nécessite l’observation au microscope optique. Elle est
basée sur les critères d’identification microscopique réalisés par Breton (1990) et Roquebert
(1998) quand c’est possible à identifier. Pour cela, et à l’aide d’une aiguille stérile on prélève
superficiellement un fragment de la culture que l’on dépose sur une lame. Le frottis ainsi
préparé est ensuite coloré par l’une des solutions suivantes : bleu de coton, rouge Congo
ammoniacal ou le KOH à 10%. Ensuite la lame est recouverte d’une lamelle, puis observée au
microscope photonique à un grossissement G X 40.
L’observation des caractères porte sur :

- Hyphes : septés ou non, c'est-à-dire cloisonnés ou non
- Conidiophores : absents, simples, ramifiés
- Cellules conidiogènes : annellide, phialide...
- Conidies : uni- ou pluricellulaires, solitaires, en amas ou en chaînes, forme (ronde, ovale, en
massue...)
- Organes de fructification : périthèces, cléistothèces (sexué), pycnides (asexué)
- Mycélium diffus, épais, coloré ou incolore,
- Présence de types de spores sexuelles (oospores, zygospores, ascospores, basidiospores) ou
asexuées,
- Type et apparence du système sporal,
- Présence de type de structure particulière.
II.7. Evaluation de l’activité cellulasique
Les cultures des différentes colonies ont été réalisées dans des tubes à essai contenant chacun
10ml de milieu CMC liquide additionné de 1 % de cellulose. Les tubes sont inoculés par 1 ml
d’une préculture de chaque souche et incubés à 28°C sur agitateur pour une durée de 72h.
L’activité CarboxyMéthylCellulase (ou CMC-ase) est mesurée selon la méthode de Bernfeld

(1955) cité par Bensmira (2006), utilisant l'acide 3,5-dinitro-salycilique (DNS), dont le
principe est basé sur la mesure du pouvoir réducteur des sucres libérés lors de l’hydrolyse de
la cellulose.
28
A chaud et en milieu alcalin, il y a réduction de l'acide 3,5-dinitrosalycilique (aussi appelé

acide 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoïque) qui joue le rôle d'oxydant, le glucose étant le
réducteur. L'intensité de la coloration rouge est proportionnelle à la concentration de l'ose si
l'on opère dans des conditions physico-chimiques constantes.
L’activité enzymatique (ou CMC-ase) est exprimée par l’unité internationale, définit comme
étant une micromole de glucose libéré par minute et par millilitre (μmol min-1 ml-1), à 50°C et
à pH 5.
Remarque : Nous avons introduit dans cette étude une colonies de référence, Trichoderma
reseii, connue pour son haut potentiel de dégradation de la cellulose.
II.7.1. Dosage des sucres réducteurs par le DNS
Dans les conditions standards, l'activité cellulasique a été mesurée dans 500μl de tampon
citrate de sodium (50 mM, pH 4,8) contenant 0,2 % (m/v) de cellulose et 250μl de solution
enzymatique. Le milieu réactionnel a été incubé à 50°C pendant 30 min. Ensuite, 1500 μl de
solution de DNS y ont été ajoutés. Le mélange a été homogénéisé et chauffé au bain-marie
bouillant (100°C) pendant 5 min, puis refroidi dans de l’eau glacée. La densité optique a été
mesurée au spectrophotomètre à 540 nm contre un témoin contenant les réactifs à l'exception
de la solution enzymatique.
La quantité de sucres réducteurs libérés a été déterminée à l'aide d'une courbe d'étalonnage
réalisée à partir d'une solution de glucose à 2 mg/ml (figure 4). La quantité de sucres
réducteurs est exprimée en mg équivalent de glucose.
29
Chapitre III : Résultats et Discussions
Résultats et Discussions
III.1. Résultats des analyses des sols
Les résultats relatifs à l’analyse du pH et du CaCO3 (%) des sols étudiés figurent dans le
tableau 1.
Tableau 1 : les résultats de l’analyse du pH et du CaCO3
Echantillons pHeau pHKCl (%) CaCO3
Sol de la décharge 7.2 7.0 4.70

publique de Boulimat
Sol du jardin botanique 7.8 7.3 27.1

d’Oued Ghir
En tenant compte de l’échelle de classification établie par Gaucher (inSoltner, 1988), le sol
d’Oued Ghir est légèrement alcalin (pHeau=7.8), avec une teneur élevée en calcaire total (27,1%) ; alors
que le pH du sol de la décharge de Boulimat est neutre (pHeau=7.2), avec une teneur en calcaire total
très faible.
III.2. Test de biodégradation du papier
Les résultats relatifs au test préliminaire (tableau 2) montrent qu’il y a eu dégradation du papier
dans les sols étudiés. Cette dégradation est beaucoup plus importante et rapide dans le sol de la
décharge publique. La dégradation du papier s’explique probablement par la richesse des sols en
matière organique, responsable de la stimulation des microorganismes cellulolytiques.
30
Tableau 2 : Résultats du test de biodégradation du papier dans les sols
Résultats du Photo prise le premier Photo prise après 13jours

Échantillons test de la jour du test 21/01/2013 02/02/2013
biodégradation
Sol de la décharge ++++

publique de Boulimat
Sol du jardin botanique ++

d’Oued Ghir
(++++) Dégradation très importante du papier
(++) Dégradation faible du papier.
III.3. Isolement et dénombrement des champignons
L'isolement des champignons sur milieu de culture gélosé, à partir d'un sol est une étape indispensable
car elle permet, d’une part, d’effectuer un dénombrement des champignons par comptage des colonies
isolées ainsi obtenues et, d’autre part, de vérifier la pureté des isolats d'un échantillon de sol pour
réaliser des identifications.
La figure 5 indique la densité des populations analysées dans les deux sols étudiés. Le dénombrement
des champignons montre que le sol de la décharge de Boulimat a une densité nettement supérieure (6,7
105 UFC/g sol) à celle de l’Oued Ghir (1,4. 105UFC/g sol). Il y a lieu de signaler que c’est les souches
levuriformes qui prédominentsurtout dans le sol de la décharge de Boulimat.
31
UFC x 105/g de sol

5
0
Boulimat Oued Ghir
Figure 5 : Densité des champignons dans les sols
Par ailleurs, le travail effectué a permis d’isoler 30 souches dont 11 souches de moisissures (de couleur
verte, blanches à beige et d’aspect poudreuses ou filamenteux) et 19 souches levuriformes (sèches ou
visqueuses).
Les colonies sèches ou visqueuses de levures ont été éliminées volontairement par des repiquages
consécutifs nécessaires à la purification des souches fongiques. La suite de notre étude ne s’est
intéressée qu’aux formes filamenteuses.
III.4. Sélection des souches cellulolytiques
La quantification des cellulases fongiques sont des objectifs difficiles à atteindre (Stephen etal.,2003).
De ce fait, deux milieux différents ont été mis au point pour permettre une sélection primaire des
souches cellulolytiques: un milieu minéral liquide contenant une bandelette de papier filtre et un milieu
solide contenant de la carboxy méthyl cellulose, comme unique source de carbone. Ces deux tests nous
ont permis de sélectionner les souches fongiques ayant un potentiel de dégradation de la cellulose.
L’analyse des résultats du tableau 3 montre que seules 4 colonies parmi les 11 colonies isolées, sont
capables de dégrader le papier. Les colonies OG4a2V et OG4a2 O ont révélé un potentiel cellulolytique
important vis à vis du milieu liquide, par leur capacité à couper complètement le papier filtre. Par
contre, les colonies OG3b2 et BM4a2 ont montré une croissance faible avec un mycélium peu développé
(figure 6).
32
Tableau 3 : Observation des tubes pour la dégradation du papier (teste du papier)
colonies Croissance sur le Rupture du papier Dégradation du papier

papier
OG4a2 V +++ +++ +++
OG4a2 O +++ +++ +++
OG3b2 ++ -- --
BM4 a2 ++ -- --
BM4d2 -- -- --
BM6b2 -- -- --
BM3c2 -- -- --
OG4c2 -- -- --
BM3a2 -- -- --
BM6a2 -- -- --
OG3a2 -- -- --
OG4a2V OG4a2O OG3b2 BM4a2 Témoin
Figure 6: Les différents cas de figure observés sur le papier filtre Wattman N°1
après 7 jours d’incubation à 28°C.
33
Toutes nos observations ont été comparées à un tube témoin qui au bout du 30ème jour d’incubation n’a
pas changé d’état grâce à sa structure (cristaux très serrés). En effet, cette structure ne peut être
endommagée que par l’action de l’exoglucanase (un sous-groupe de cellulase) (Nam Sun Wang, 2003).
Les mycètes qui la produisent ont la capacité de dissoudre les fibres de cellulose du papier (ou du
coton) et faire ainsi désagréger le matériau (CarlileetWatkinson, 1997), leur potentiel cellulolytique est
déterminé par les différentes modifications apparentes sur le papier (Heeetal.,1993).
La croissance mycélienne des souches fongiques sur la partie immergée du papier, est due
probablement à l’absorption des spores par le papier filtre. Leur condensation vers son extrémité
terminale entraîne une croissance par fixation au support cellulosique. Ce phénomène d’adhésion se
traduit par :
 La présence d’enzymes cellulasiques à la surface des cellules fongiques (Wachingeretal., 1989

; Bond et Stutzenberger, 1989). Par cet effet de proximité, l’enzyme devient plus active
lorsqu’elle est immobilisée à la surface du substrat, et la réaction de dégradation de la cellulose
devient plus intense (Nam Sun Wang, 2003).
 La spécificité des mycètes filamenteux cellulolytiques, qui ont la capacité de pénétrer les
substrats cellulosiques par les prolongements des hyphes, présentant ainsi leurs structures
mycéliennes en cavités confinées dans les particules cellulosiques (Eriksson etal.,1990).
 La formation d’un voile mycélien à la limite liquide/air s’expliquant probablement par l’effet
du flottement des spores s’associant ainsi à la région cellulosique la plus proche(Nam Sun
Wang, 2003)
34
Par ailleurs, la figure7 montre que les quatre colonies OG4a2V, OG4a2, OG3b2 et BM4a2ont
pareillement révélé une capacité à assimiler la cellulose sur milieu solide à base de CMC.
A A A A
B B B B
BM4a2 OG3b2 OG4a2O OG4a2V
Figure7: Les différents cas d’halos observés sur milieu CMC-agar

A- réactif iodo-ioduré (solution de lugol) B- réactif rouge Congo
Les colonies OG4a2V et OG3b2 semblent présenter une activité cellulolytique très importante, avec une
croissance rapide et un envahissement presque complet de la boite après trois jours d’incubation. Il y a
lieu de noter que l’importance et la rapidité de la croissance de la colonie OG3b2ont empêché
l’apparition des halos clairs autour des colonies ; alors que les colonies OG4a2 O, BM4a2 et OG4a2V
ont présenté des halos clairs et visibles autour des colonies, révélés aussi bien par le rouge Congo
qu’avec la solution de lugol.
L’analyse de ces résultats laisse indiquer que les quatre colonies ont une capacité à assimiler la
cellulose, comme seule source de carbone et d’énergie. Ces colonies possèdent donc des cellulases
capables de scinder le polymère (la cellulose) en oligomères de petite taille assimilables par les
champignons.
35
III.5. Identification des champignons

La caractérisation des champignons cellulolytiques est basée sur les critères d’identification cités dans
le chapitre matériel et méthodes.
III.5.1. Etude macroscopique

Les caractères macroscopiques des différentes souches sélectionnées sont étudiés sur les milieux
PDA, Czapek-Dox, CMC-agar et GEM les plus communément utilisés. Les critères macroscopiques
reposent sur l’observation de la couleur (recto et verso), la taille, le relief, l’aspect (filamenteux,
collant), la transparence (opaque, translucide) et l’aspect de la pigmentation des colonies.
1- La coloie (BM4a2), isolée du sol de Boulimat, présente des colonies d’aspect poudreux, un
mycélium aérien de couleur vert olive et un mycélium du substrat vert. Une surface plane, ne
présentant aucun pigment sur le revers de la boite. Elle est caractérisée par une croissance très rapide
sur les milieux utilisés, en envahissant la boite au bout du 4éme jour d’incubation.
A B C D
Surface Surface Surface Surface
A B C D
Revers Revers Revers Revers
Figure 8 : Les caractères macroscopiques de la souche (BM4a2)
A = Milieu PDA ; B =Milieu CMC-agar,C =Milieu CzapekDox ; D=Milieu GEM
36
2- La colonie (OG4a2V), isolée du sol d’Oued Ghir, présente un mycélium aérien de couleur
vert olive et un mycélium du substrat vert. Des colonies d’aspect poudreux, une surface plane, ne
présentant aucun pigment sur le revers de la boite. Sa croissance est très rapide sur les milieux
utilisés, en envahissant la boite au bout du 4éme jour d’incubation.
A B C D
Surface Surface Surface Surface
A B C D
Revers Revers Revers Revers
Figure 9 : Les caractères macroscopiques de la souche (OG4a2V)
37
3- La colonie (OG4a2O), isolée du sol d’Oued Ghir, présente des colonies plates d’aspect
duveteux à poudreux, un mycélium aérien de couleur crème au centre et blanche en périphérie,
avec apparition d’exsudats jaunes en vieillissant. Un mycélium du substrat extensif hyalin, jaune à
brun-orange et plus ou moins immergé dans la gélose. Le revers est craquelé, de couleur jaune à
brun-orange. Une surface bombée avec des rides partant du centre jusqu’à la marge. Une bonne
croissance sur tous les milieux utilisés au bout de deux à trois jours d’incubation.
A C D
Surface Surface Surface
A C D
Revers Revers Revers
Figure 10:Les caractères macroscopiques de la souche(OG4a2O)
38
4- La colonie (OG3b2), isolée du sol d’Oued Ghir, présente des colonies cotonneuses, un
mycélium aérien de couleur blanc beige à brun et un mycélium du substrat incolore. Une surface
cotonneuse et des hyphes présentant un port élevé. Elle ne présente aucun pigment. Une
croissance rapide sur les milieux utilisés, en envahissant la boite au bout du 2éme jour
d’incubation.
A B D
Surface Surface Surface
A B D
Revers Revers Revers
Figure 11: Les caractères macroscopiques de la souche fongiques (OG3b2)
39
III.5.2. Etude microscopique

Les caractéristiques microscopiques des souches fongiques sélectionnées ont portées essentiellement
sur la forme des conidiophores, des conidies et du mycélium.
 Les colonies (OG4a2V, BM4a2), bien qu’elles soient isolées de différents sols, ellesont les
mêmes caractères, à savoir :
- un conidiophore hyalin en touffe compacte, septé (cloisonné) et très ramifié,
irrégulièrement verticillé avec des ramifications à angle droit par rapport à l’axe principal.
- des phialides, ovoïdes à ellipsoïdales, isolées ou groupées en petit nombre (2-3) sont disposées
sur les branches, généralement perpendiculaires à l’axe.
- des conidies unicellulaires, rondes ou ellipsoïdales,formant des glomérules au sommet des
phialides.
Ces critères permettent de rattacher nos deux colonies au genre Trichoderma sp1, Trichoderma
sp2.
Aspect microscopique de la Aspect microscopique de la colonie, Aspect microscopique de la colonie,

colonie, colorée avec du KOH colorée avec du rouge Congo colorée avec du bleu de coton
Conidie
Phialide
Conidiophore
Mycélium cloisonné
Figure 12 : Les caractères microscopiques des colonie (OG4a2V, BM4a2)
40
 La colonie (OG4a2O) présente les caractéristiques suivantes :

- un mycélium cloisonné
- des conidiophores nombreux, dressés et non ramifiés, terminés en vésicule et portent des
vésicules hémisphériques
- les têtes conidiennes sont bisériées, très longues et cylindriques
- des phialides formés directement sur la vésicule
- des conidies en chaînes divergentes, globuleuses jusqu’à ellipsoïdales
Cette souche semble appartenir à Aspergillus terreus.

Conidie
Vésicule Métule
Phialide
Conidiophore
Figure 13 : Les caractères microscopiques de la colonie fongique sélectionnée(OG4a2O)
41
 La colonie (OG3b2) est caractérisée par :
- un mycélium ou des hyphes très larges et non cloisonnés.

- un conidiophore séparé du conidiocyste par une membrane appelée columelle.
- Un conidiocyste renfermant des conidiospores.
- la présence de stolons et des rhizoïdes pigmentés.
Ces critères ressemblent à ceux décrits pour le genre Rhizopus.

Paroi de sporocyste
Columelle
Sporocystophore
Mycélium non cloisonné
Figure 14 : Les caractères microscopiques de la colonie fongique sélectionnée (OG3b2)
42
Les caractères morphologiques et microscopiques des quatre colonies citées précédemment

correspondent parfaitement aux descriptions communément admises par Cahagnier, (1998) et
Guillaume (2006). Ces caractères permettent de rattacher :
- les colonies (OG4a2V) et (BM4a2) au genre Trichoderma
- la colonie (OG4a2O) à Aspergillus terreus
- la colonie (OG3b2) au genre Rhizopus.
Trichoderma sont des champignons filamenteux imparfaits appartenant à la classe des

Deutéromycètes. La forme parfaite appartient à la classe des Ascomycètes (Hypocrea). Ce genre
comprend 20 espèces environ, la plupart sont cellulolytiques. Les colonies sont laineuses, à
croissance très rapide, de couleur blanche, jaune-verte ou verte, avec un mycélium hyalin presque
invisible se colorant rapidement en vert par la sporulation et un revers clair. Ils possèdent des
conidies hyalines globuleuses, des conidiophores très ramifiés de façon plus au moins
orthogonale, portant de phialides courtes en forme de quilles. Ils ont un intérêt agro-alimentaire
dans la production de cellulase et d'hémicellulase et comme exhausteur d'arômes. Certaines
espèces sont utilisées en lutte biologique pour la protection d'arbres et cultures végétales contre
l'attaque d'agents phytopathogènes (Cahagnier, 1998).
Aspergillus terreus fait partie du groupe phylogénétique des Ascomycètes, à filaments hyalins et
cloisonnés. Il se distingue des autres espèces d’Aspergillus par la couleur brun-cannelle de ses
colonies, par ses têtes aspergillaires en colonnes compactes et de diamètre uniforme et par
l’existence de conidies solitaires à base tronquée qui sont produites directement sur le mycélium.
Il pousse très rapidement sur tous les milieux usuels. Le mycélium est ras, cloisonné et incolore.
Après sporulation les colonies deviennent duveteuses à poudreuses, et sont de teinte beige à brun-
noisette caractéristique. Le verso des colonies est craquelé, incolore ou jaune à brun-orange. Il
produit un exsudat abondant de couleur ambrée (Cahagnier, 1998 ; Guillaume, 2006).
Le genre Rhizopusfait partie des zygomycètes ayant un mycélium non cloisonné et produisant des
spores non mobiles produites dans un sporange, porté par des sporangiophores insérés sur le
mycélium par groupe de 3 ou 4. Au microscope, les rhizoides sont bruns ramifiés, localisé au
niveau de l’insertion des sporangiophore sur le mycélium. Les columelles sont sphériques,
affaissées en parapluies et les spores de forme irrégulière, allongées brumes striées. Le genre
Rhizopus pousse très rapidement sur tous les milieux usuels. Il est caractérisé par des colonies
laineuses de couleur gris plomb épaisse (Cahagnier, 1998 ; Guillaume, 2006).
43
III.6. Evaluation de l’activité cellulolytique des colonies
Pour évaluer l’activité cellulasique de nos colonies, nous avons introduit dans notre étude une colonie
de référence, Trichodermareseii, connue parmi les colonies fongiques les plus performantes et les plus
actives sur les substrats cellulosiques.
Les champignons de notre collection ainsi que Trichodermareeseisont cultivés sur milieu liquide
contenant la CMC comme seule source de carbone.
Bien qu’elle soit légèrement inférieure à la colonie de référence, Trichodermareesei(Tr), la colonie

OG4a2V (Trichodermasp.), semble présenter une activité cellulasique élevée par rapport aux colonies
BM4a2, OG4a2O et OG3b2. Cette dernière montre une activité CMC-ase la plus faible (Tableau 4).
Tableau4 : Résultats des activités CMC ases des souches
colonies µmol de glucose/min/ml
Tr 0,296 *± 0.05
OG4a2V 0,277± 0.04
BM4a2 0,163± 0.07
OG4a2O 0,139± 0.05
OG3b2 0,03± 0.001
(*) : Représente la valeur moyenne de 3 répétitions ± ecart-types
L’analyse des résultats obtenus (figure 15) montre que, parmi les 04 colonies de champignons
sélectionnées, la colonie OG4a2V, se distinguent par son activité cellulolytique élevée, avec une
activités CMC-ase de 0,277± 0.04 µmol de glucose/min/ml. Aussi, les colonies BM4a2
(Trichodermasp.) et OG4a2O (Aspergillus terreus), possèdent également des activités
cellulolytiques (CMC-ase) remarquables, évaluées respectivement à 0.163± 0.07 et 0.139±
0.05µmol de glucose/min/ml. Par contre la souche OG3b2 (Rhizopussp.), avec une CMC-ase de
0.03± 0.001µmol de glucose/min/ml, possède une activité cellulolytique la plus faible, comparée à
celle des autres moisissures.
44
Ces résultats permettent de conclure que la souche OG4a2V, possède une performance de
production de sucres réducteurs à partir de la CMC supérieure à celle des autres souches, à
l’exception de la souche de référence.
Par ailleurs, la mise en évidence de l’activité CMC-ase dans les surnageants des cultures,
particulièrement des colonies OG4a2V, BM4a2et OG4a2O, laisse penser que les cellulases seraient
extracellulaires, c'est-à-dire libérées par les champignons dans le milieu extérieur. Alors que le
surnageant de la culture de la souche OG3b2 a révélé une faible activité cellulasique, due
probablement à sa localisation endoplasmique ou périplasmique, ce qui rend sa détection difficile.
0,3
Activité CMCase (µmol de
0,25
glucose/min/ml )
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Tr OG4a2V BM4a2 OG4a2O OG3b2*
Figure 15: les activités CMC ase des colonies
Les résultats obtenus suite à la sélection des colonies cellulolytiques, nous montrent que ces
colonies fongiques sont largement distribuées dans le domaine Eucaryades mycètes aérobies qui
sont représentés parmi les subdivisions les plus cellulolytiques (Lyndetal., 2002). Ainsi, les
champignons de la classe des Ascomycètes, Basidiomycètes et Deuteromycètes, contiennent un
grand nombre d'espèces cellulolytiques (Carlile et Watkinson., 1997), qui ont subi un nombre
d'études considérable en ce qui concerne leurs enzymes cellulolytiques. Les plus étudiés étant:
Aspergillus et Trichoderma (Kitamotoet al.,1996 ; Lokingtonet al.,1997 ; Riouet al., 1998;
Fujitaet al.,2002 ) ; elles peuvent produire plusieurs types de cellulases (Scriban, 1999).
Les Trichodermaet les Aspergillussont connus de longue date pour leurs activités
cellulolytiques,ellessont considérées parmi les souches fongiques les plus cellulolytiques
(Peterssonet al.,1981 ; Kubicek., 1998),par leur capacité à produire au moins 3 types de cellulases
45
(exoglucanases, endoglucanases et β-glucosidases) (Shoemakeret al., 1983 ; Pentillaet al., 1987 ;

Chen et al., 1987, Barnett et al., 1991 ; Takashimaet al., 1999 ; Nogawaet al., 2001). Ces enzymes
peuvent être produites séparément ou sous forme de complexe.
D’autres études ont montré que ces microorganismes cellulolytiques possèdent au moins une
endocellulase, parfois plusieurs tel que Trichodermakoningiiqui possède quatre endocellulases à
caractéristiques très différentes (Scriban, 1999), ce qui explique leur utilisation dans plusieurs
industries : pharmaceutiques, agroalimentaires et chimiques (Demain, 2000).
46
Conclusion
CONCLUSION
La cellulose représente la principale source de carbone organique continuellement

renouvelable grâce au mécanisme de la photosynthèse. Sa décomposition en composés de
faible poids moléculaire tels que les sucres simples, permettrait de résoudre de nombreux
problèmes tels que la pollution de l’environnement (par la biodégradation des déchets urbains,
industriels et agro-industriels)
L’étude des sols a montré, selon le site considéré, un nombre variable de micro-organismes
cellulolytiques : 6,7 105 UFC/g de sol pour le site de la décharge de Boulimat et 1,4. 105
UFC/g de sol pour le site de l’Oued Ghir, avec une prédominance des formes levuriennes
dans les deux sols.
Sur 11 souches de champignons filamenteux isolées des sols étudiés, 04 seulement sont
capables de se développer sur la carboxyméthylcellulose et sur le papier filtre.
L’étude relative aux caractères macroscopiques et microscopiques nous a permis d’identifier

les 04 souches sélectionnées à 03 genres différents. Les souches OG4a2V et BM4a2 semblent
appartenir au genre Trichoderma sp. ; alors que la souche OG4a2O serait rattachée à
Aspergillus terreus. Enfin, la souche OG3b2 serait s’apparente au genre Rizhopus.
L’activité enzymatique (CMC-ase) de la souche OG4a2V a été évaluée à 0.277± 0.04 µmol de
glucose/min/ml. Elle est supérieure à celle des autres souches BM4a (0.163± 0.07 µmol de
glucose/min/ml) et OG4a2O (0.139± 0.05 µmol de glucose/min/ml). L’activité la plus faible a
été observée chez la souche OG3b2 (0.03± 0.001 µmol de glucose/min/ml).
En outre, la capacité de libération de sucres réducteurs à partir de la CMC chez la souche de

référence, Trichoderma reesei (Tr) est supérieure à celle des souches locales, avec une activité
CMC-ase de 0.296 ± 0.05µmol de glucose/min/ml.
En perspective, il est souhaitable de compléter ce travail par :
- l’enrichissement de la collection par d’autres espèces de champignons filamenteux à

partir d’autres milieux environnementaux ;
- la détermination des paramètres physiologiques les plus convenables (pH et
températures optimaux, tampon…) sur l’activité enzymatique de nos souches ;
- la localisation cellulaire des cellulases.
47
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54
Annexes
Composition des milieux
Gélose à l’extrait de Malt
Extrait de malt : 20g
Acide citrique : 5g
Agar : 20g
Eau distillée : 1000 ml
Le milieu est stérilisé à 120°C pendant 30 min.
Milieu PDA
L'infusion de pomme de terre se prépare en faisant bouillir dans l'eau 200 g de pommes de
terre tranchées (lavées et pelées) pendant 30 minutes puis en laissant décanter le bouillon
obtenu. Le bouillon est ensuite filtré à travers une gaze. On dilue ensuite en ajoutant de l'eau
distillée pour un volume final d'un litre. Puis on ajoute 20 g de saccharose et 15g d'agar en
poudre avant une stérilisation par autoclave à 120°C pendant 20 minutes.
Milieu Czapek
NaNO3 2g
K2HPO4 1g
MgSO4,7H2O 0,5g
KCl 0,5g
FeSO, 7H2O 0,01g
Saccharose 30g
Agar 15g
Eau distillée 1000 ml
pH 5, stérilisation par autoclave à 120°C pendant 20 minutes.

Glossaire
Asque : cellule dans laquelle se forment les ascospores.
Conidie : Spore de reproduction asexuée
Conidiospore : partie de mycélium ; plus ou moins longue portant des spores asexuées.
Columelle : stipe filament spécialisé partant la spore ou l’organe de reproduction asexuée
Hyphe : (féminin ou masculin) filament tubulaire cloisonné ou non cloisonné ( septé ou non
septé)
Levure : élément fongique unicellulaire qui se reproduit par bourgeonnement
Lignine : un des principaux composants du bois, avec la cellulose, l'hémicellulose et

des matières extractibles
Matrice : (ou le tissu) dans laquelle des structures plus spécialisées sont incorporées.
Métule : chez les Aspergillus ayant une double rangée de phialides ; nom donnée à celles de
la première rangée.
Molécules organiques : Une molécule organique est une molécule plus ou moins grosse faite
à base d'atomes de carbone.
Moisissure : Désigne des champignons microscopiques. Elles se développent sous l'influence

de l'humidité de l'air et d'une certaine température, sur les végétaux morts et sur les matières
qui s'altèrent (joints de douche, de lavabo...).
Mycélium : ensemble des hyphes ou des filaments d’un champignon
Mycète : Organisme qui appartient au règne des Mycètes (champignons)
Parasitisme : désigne le fait pour un organisme vivant de se nourrir, s'abriter ou se reproduire

en tirant profit d'un autre organisme (l'hôte).
Polymère : une macromolécule de grande taille formée par l'assemblage d'un grand nombre
de molécules identiques
Résineux : Arbre forestier (gymnosperme) riche en matières résineuses, contenues dans les
canaux résinifères. (Les principaux résineux sont le pin et le sapin, l'épicéa, le mélèze, l'if, le
cyprès, le cèdre, le genévrier et le thuya.)
Rhizoïdes : Filament ramifiés dont l’aspect et la fonction évoquent des racines pénétrant dans
le substrat (Mucorales).
Saprophyte : Un organisme est dit saprophyte s'il est capable de se nourrir de matière
organique en décomposition
Glossaire
Sporocyste : chez les zygomycètes ; vésicule portée par un pédicelle sporocystophore

renfermant les spores asexuée
Stolon : chez les Mucorales filament aérien long issu du substrat et capable de se refixer à
distance grâce aux Rhizoïdes.
Spore : élément résultant de la reproduction du champignons
Symbiose : mode de vie association d’organisme différents s’apportant des avantages

mutuels.
Thalle : organisme fongique uni ou multicellulaire formant une structure plus ou moins
organisée
Zygomycète : Champignon siphomycète tel que les mucorales et les entomophtorales,

caractérisé par un mycélium non cloisonné et une reproduction sexuelle par isogamie,
conduisant à la formation de zygospores.
Résumé
La cellulose est le polymère organique le plus abondant sur terre et est considérée comme
une source inépuisable. Sa biodégradation est assurée par des micro-organismes cellulolytique
capable de produire des systèmes enzymatique (appelés cellulase) dont le rôle principale est
d’hydrolyser les macromolécules de cellulose
L’objectif de notre travail est l’isolement et la caractérisation des champignons cellulolytique

à partir de deux sols
La première partie de notre travail nous a permis d’isoler et d’identifier quatre espèces
appartenant à trois genres différents capables de dégradé la cellulose Ces espèces seraient
rattachées aux genres suivants : Trichoderma, Aspergillus et Rhizopus.
Dans la deuxième partie on a confirmé nos résultats de sélection de souche cellulolytique par
un test d’évaluation de l’activité cellulasique
Mots clés : Cellulose, micro-organismes cellulolytques, Cellulase, biodégradation.
Abstract
Cellulose is the most abundant organic polymer on earth and is considered an inexhaustible
source. Biodegradation is provided by cellulolytic microorganism capable of producing
enzymatic systems (called cellulase) whose role is to hydrolyze the cellulose macromolecules
The objective of our work is the isolation and characterization of cellulolytic fungi from two
soils.
The first part of our work has enabled us to isolate and identify four species belonging to three
different genera capable of degraded cellulose. These species are related to the following
genus: Trichoderma, Aspergillus and Rhizopus.
In the second one confirmed our results of strain selection cellulolytic by an evaluation of the
test cellulase activity.
Keywords: Fungi, soil, cellulase, cellulose

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République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieure et de la Recherche

Université Abderrahmane Mira – Béjaïa

Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie

Département des Sciences Biologiques de l’Environnement

Mémoire de Fin de cycle

En vue de l’obtention du diplôme de MASTER

Option : Environnement et sécurité alimentaire

Isolement et caractérisation de champignons

Membres du jury Réalisé par :

Président : Mr Sidi H. Melle : HOCINI Aïda

Promoteur : Mr Ramdani N. Melle : MEZIANI Wassila

Examinateurs : Mr Boulila A/G.

Toutes nos infinies gratitudes à notre promoteur, Monsieur

Notre sincère reconnaissance à nos enseignants du

Enfin, nous remercions tous ceux qui ont contribué de prés ou

Je dédie ce modeste travail à mes très chers

Au nom de Dieu Tout Puissant, je dédie ce travail

CHAPITRE I : Synthèse bibliographique

I.2. Source et localisation de la cellulose 03

I.3. Structure moléculaire de la cellulose 03

I.4. Structure supramoléculaire de la cellulose 04

I.5. Propriétés de la cellulose 05

I.5.2. Substitution de la cellulose et solubilité 06

I.6. Dégradation biologique de la cellulose 06

I.7.2. Différents types de pates 07

I.7.2.1. Pâtes mécaniques 08

I.7.2.2. Pâtes chimiques 08

I.7.2.3. Pâtes mi- chimiques 08

I.7.3. Dégradation du papier 08

I.7.3.1. Les causes de vieillissement naturel du papier 08

I.7.3.2. Les facteurs de dégradation du papier 09

II.3. Structure de la cellulase 11

II.4. Les différentes origines de la cellulase 12

II .4.1 Origine animale 12

II .4.2 Origine végétale 12

II .4.3 Origine microbienne 12

II.5. Quelques caractéristiques de la cellulase 13

II.5. 2. Substrats naturels 13

II.5. 4. Poids moléculaire 13

II.5. 6. Température optimale 14

II. 6. Mécanisme d’action de la cellulase 14

Partie III : Les champignons

III.2. Caractéristiques générales des champignons 17

III.3. Modes de reproduction des champignons 18

III.3.2. Reproduction sexuée 18

III.4. Mode de vie des champignons 18

III.5. Classification des champignons 19

CHAPITRE II : Matériels et Méthodes

II.1.1. Origine et prélèvement des sols 22

II.1.2. Milieux de culture 22

II.1.3. Substrats cellulosiques 22

II.2.1. Analyse physico-chimique des sols 23

II.2.1.2. Dosage du calcaire total 23

II.3. Test de biodégradation du papier dans les sols 23

II.4. Dénombrement et isolement des champignons 23

II.4.1. Préparation des suspensions- dilutions 24

II.4.3. Méthode de dénombrement 24

II.4.5. Conservation des souches 25