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    AHC Par Anomalies de La MB - Déficit Enzymatique

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    ANAMIES HEMOLYTIQUES CONSTITUTIONELLES PAR

    ANOMALIES DE LA MEMBRANE/DEFICITS ENZYMATIQUES


    INTODUCTION :

    L’anémie : du taux d’hémoglobine en dessous des VN (qui varient en fonction de l’âge, du sexe, et de
    l’état physiologique du sujet).

    L’anémie est dite hémolytique quand le mécanisme principal est la destruction prématurée du GR
    avec réduction de la durée de vie à moins de 120 jours.

    RAPPEL PHYSIOLOGIQUE :

    Membrane du GR :

    Constituants de la membrane : lipides, glucides, pro+++

    Les protéines appartiennent à deux sous groupes :

     pro. Extra-mb = périphériques : constituent le cytosquelette et sont représentées par : la


    spectrine ; l’ankyrine ; la protéine 4.1 ; la protéine 4.2 et l’actine b. Autres : adducine, la
    dématine (protéine 4,9), la tropomoduline et la tropomyosine.
     Protéines trans-membranaires = intégrées : bande 3 et glycophorine.

    Rôle : Maintient la forme du GR, assure sa déformabilité, et l’échange trans-membranaire.

    Métabolisme érythrocytaire :

    Le GR a un métabolisme propre à lui qui lui permet d’assurer son rôle de transporteur d’oxygène.

    Le métabolisme du GR s’effectue selon deux voies :

    A 90% : MB par voie anaérobie : permet la formation d’ATP ; NADH ; 2,3-DPG

    10% : v. aérobie : formation de : NADPH et Glutathion réduit

    III/ MECANISME DE L’HYPERHEMOLYSE :

    L’hyper-hémolyse du GR peut être provoque par :

    Une anomalie de la membrane :

    o Perte d’interactions verticales entre le cytosquelette et la bicouche lipidique


    ex : Sphéocytose : bande 3 ; ankyrine ; spectrine ; et la protéine 4.2)
    o Perte d’interaction horizontale :
    Ex : Elliptocytose : anomalie d’interaction α-β / β-protéine4.1 /protéine 4.1 –actine
    o Anomalie de la perméabilité membranaire membrane aux cations : stomatocytose

    anomalie enzymatique Déficit congénitale en enzyme ou à l’inactivation par anomalie


    moléculaire.
    IV / DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE :

    CIRCONSTANCE DE DECOUVERTE :

    *Signe d’anémie : Asthénie et dyspnée

    *Signes d’hémolyse : ictère et splénomégalie

    *A l’occasion d’anémie brusque survenant à la suite de prise de fèves ou de certains médicaments :


    oriente vers u déficit en G6PD où l’anémie s’accompagne d’émission d’urine foncé.

    *Parfois la découverte est fortuite à l’occasion d’un bilan.

    EXAMENS DE PREMIERE INTENTION OU D’ORIENTATION :

    1. Hémogramme : permet l’étude des trois lignées :


    GB : N / avec présence de myélémie qui témoigne de la régénération
    Plaquette : N
    GR : normocytose parfois macrocytose ;Normochrome ; parfois régénérative.
    Le frottis sanguin peut mettre en évidence :les sphérocytes (GR de coloration foncée à Ø
    réduit+ absence de dépression centrale) Elleptocytes (GR de forme ovale) Stomatocytes (GR
    avec dépression centrale en forme de bouche) stomato-ovalocytes et les schisocytes
    (fragments de GR qui témoignent d’une hémolyse)

    2. Le bilan d’hémolyse :
    Bilirubine libre, LDH
    Hp .
    Test de Coombs direct négatif.

    Au total, les examens de première intention retrouvent une ANEMIE, NORMOCYTAIRE,


    NORMOCHROME (hémogramme) HEMOLYTIQUE ( bilan d’hémolyse) , REGENERATIVE (taux de
    réticulocytes)et d’origine constitutionnelle( test de Coombs direct)

    EXAMENS DE DEUXIEME INTENTION OU DE CONFIRMATION :

    EXPLORATION DES ANOMALIES DE LA MEMBRANE

    1. Etude de la fragilité osmotique du GR :

    La résistance globulaire osmotique : étude de la résistance des hématies aux solutions de NaCl à des
    pressions osmotique croissante : l’hémolyse normale débute à 0,45 – 0,50%.

    Débute plus précocement en cas d’anomalies de la membrane (test + ds toutes les anomalies de la
    membrane)

    2. Test d’auto-hémolyse après 48h à 37°

    L’hémolyse spontanée est < 5% et à 1% sans et avec glucose. Elle est très en cas de pathologie mb.
    3. Test d’hémolyse au glycérole acidifié :

    on utilise un milieu hypotonique qui ralenti l’entrée de l’eau dans le GR, on mesure ensuite le temps
    nécessaire pour obtenir 5% de l’hémolyse initiale. L’hémolyse physiologique se produit après 30 min
    chez le sujet normal. Elle est bcp plus rapide en cas d’anomalie mb : 50 à 100 sec.

    4. Pink test : Test de lyse au glycérol acidifié modifié :

    Incuber les GR du témoin et du patient avec une solution contenant du glycérol, NaCl et NaN3 ,
    centrifuger, et mesurer la DO à 540 nm . Refaire la mesure après la lyse des GR.

    Le résultat est obtenu en faisant le rapport entre les deux densités.

    5. Test de cryo-hémolyse :

    Lorsque les GR subissent un choc thermique : passage de 37c° à 0°c, il se produit une hémolyse
    massive, les GR normaux sont plus résistants que les GR ayant une anomalie de la membrane.

    Pour le diagnostic de certitude :

    EKTACYTOMETRIE :

    Permet de mesurer la déformabilité du GR soumis à une force de cisaillement constante et à une


    osmolarité croissante.

    Courbe : ID= f( osmolarité ) / ID : index de déformabilité

    On obtient 3 points:

     Point de l’hypotonie : déformabilité nulle.


     Point de l’isotonie : dépend de la surface cellulaire.
     Point de l’hypertonie : dépend de l’état d’hydratation cellulaire.

    CYTOMETRIE EN FLUX :

    Basée sur la mesure de l’intensité de fluorescence des GR après incubation avec de l’éosine
    5’Maléimide (EMA). La liaison entre EMA et protéines mb est responsable de la fluorescence.

    ELECTROPHORESE des protéines de la mb :Permet :

     de séparer les protéines de la membrane.


     De mettre en évidence l’absence ou la diminution d’une bande de migration.
     Quantifier par une étude densitométrique.

    ETUDE MOLECULAIRE : PCR, n’est pas une technique de routine. Utilisée surtout pour le diagnostic
    prénatal.

    ETUDE FAMILIALE :

    Confirme en générale le caractère constitutionnel de l’anomalie lorsque la transmission est dominante.


    Exploration des anomalies enzymatiques :

    Test de dépistage : SPOT TEST

    Incuber un hémolysat du GR avec du G6P et du NADP. Déposer une goutte sur papier filtre et examiner à la
    lumière UV. La production du NADPH se voit par l’apparition d’une tache fluorescente. Cette technique dépiste le
    déficit en G6PD, en PK et en glutathion réductase.

    Test de confirmation : DOSAGE SPECTRO-PHOTOMETRIQUE des enzymes :

    Dosage de la G6PD :

    Incuber un hémolysat du GR avec du G6P et du NADP. La production du NADPH est appréciée par
    l’augmentation de l’absorption à 340 nm. VN : 5,4 - 8,4 U/g Hb

    Dosage de la PK :

    l’hémolysat est incubé avec le pyruvate et du NADH, la décroissance de la densité optique du à la transformation
    du NADH en NAD est proportionnelle à la [Pk] . VN : 5,3-7,9 U/g Hb

    V/ DIAGNOSTIC ETIOLOGIQUE :

    ANOMALIES DE LA MEMBRANE

    SPHEOCYTOSE HEREDITAIRE : anomalie de l’ankyrine, la bande 3, la protéine 4,2 et la α/β spectrine.

     Hémogramme : anémie normocytaire, normochrome, régénérative+sphérocytes sur frottis sanguin ( 5-


    40%) qui peuvent être absents.
     Fragilité osmotique augmentée.
     Ektacytométrie : ID
     Cytométrie : réduction de l’intesité moyenne de fluorescence

    ELLIPTOCYTOSE HEREDITAIRE : anomalie de β/α spectrine /protéine 4,1

     Hémogramme : A. normocytaire, normochrome, régénérative avec présence d’élliptocytes


     Fragilité osmotique
     Ectacytométrie : anomalie avec ID et aspect trapézoidal caractéristique
     Cytométrie : intensité moyenne de fluorescence N

    POIKILOCYTOSE HEREDITAIRE : forme sévère de l’élliptocytose héréditaire.

     Ectacytométrie : courbe plus diminuée


     Cytométrie : intesité moyenne de fluorescence : plus diminuée.

    STOMATOCYTOSE :

     Hémogramme : A. normocytaire/ macrocytaire, normochrome régénérative.


     Fragilité osmotique perturbée.
     Ectacytométrie : permet de distinguer deux formes :
    Courbe décalée à droite : stomatocytose avec hyper-hydratation.
    Courbe décalée à gauche : Stomatocytose avec déshydratation.

    ANOMALIES ENZYMATIQUE :

    Déficit en G6PD : la transmission récessive liée au sexe. Hémolyse déclenchée par un facteur extérieur présence
    de nombreux variant : variant B- et le variant A-

    Dcg de certitude : dosage spectrophotométrique de la G6PD

    Déficit en PK : transmission autosomique récessive. Hémolyse chronique. Dc de certitude : dosage


    spectrophotométrique de la PK.

    Autres :

    Déficit de toutes les enzymes intervennat dans les deux voies métaboliques peuvent être à l’origine des A. H.
    constitutionnelle

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