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    TD Examen Bacterio Aliments 2

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    td examen bacterio

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    Examen
    Bactriologique des
    Aliments
    Auto-Contrle par les Professionnels

    TD ENVT HIDAOA - Hubert Brugre, Denis Corpet


    MJ partielle janv 2013

    Cadre rglementaire
     Abrogation

    de larrt du 21 dcembre 1979

    relatif aux critres microbiologiques auxquels doivent satisfaire


    certaines denres dorigine animale.

     Rglement

    CE 2073/2005 de la Commission

    Europenne Critres microbiologiques applicables aux denres


    alimentaires.
    Un des rglement du Paquet Hygine,
    Applicable depuis le 1er janvier 2006.
    
    

    On est pass d'un cadre strict, contraignant mais scurisant, avec des
    critres microbiologique imposs
    A une "responsabilisation" moins confortable ! Consquence frquente
    = augmentation du nombre d'analyses microbiologiques !

    Un peu de recherche prospective: Comment dcider


    "combien de bactries sont acceptables, combien sont "trop" ?"

    FSO/ALOP based food safety policy


    FSO = Food Safety Objective
    ALOP = Appropriate Level of Protection
    Objectif de Scurit de l'Aliment (FSO) =
    Frquence (ou concentration) d'un danger,
    dans l'aliment consomm, qui donne
    le niveau appropri de protection (ALOP).
    Exemple hypothtique de FSO:
    le niveau de Listeria monocytogenes dans un aliment prt l'emploi
    ne doit pas dpasser 3 Log CFU/portion (=1000 bactries)

    Comment tablit-on les FSO partir des ALOP ?

    De ALOP FSO
    La thorie

    Donc ALOP = 10-6


    3- On en dduit qu'on
    Veut moins de 3.5 log
    Du pathogne par repas

    Log Proba (Cas de TIAC / Repas)

    1- On construit la courbe
    observe entre les cas
    pidmiques et la
    contamination des repas
    (bcp d'incertitudes !!)
    2- Choisir ALOP: par ex.
    on dcide qu'on veut
    Un "cas" malade pour
    Un million de repas

    -2

    FSO = 3.5 log CFU


    4- Marge de scurit: On
    met le critre de scurit
    plus bas que le FSO,
    par ex < 100 CFU du pathogne

    Epidmies relles observes


    -3

    -4

    -5

    ALOP

    -6

    -7
    2

    FSO

    Log (Nb CFU pathognes) / Repas


    FSO, Food safety objective
    ALOP, Appropriate level of protection

    Probabilit dinfection

    Loi dose-rponse exprimentale:


    plusieurs courbes en pratique !

    Dose (exposition un nombre de bactries)

    The application of the Appropriate Level of


    Protection (ALOP) and Food Safety
    Objective (FSO) concepts in food safety
    management, using Listeria monocytogenes
    in deli meats as a case study
    

    Gkogka et al. Food Control

    February 2013 - Predictive Modelling of Food


    Quality and Safety. 29 (2), 382393.

    http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S095671351200182X#

    1 Pour contribuer la protection de la sant publique et viter


    les interprtations diffrentes, il convient de dfinir des critres
    de scurit harmoniss relatifs lacceptabilit des denres
    alimentaires.

    critres de scurit des denres alimentaires


    

    2 Les critres microbiologiques fournissent galement une


    orientation sur l'acceptabilit des denres alimentaires et de
    leurs procds de fabrication, de manutention et de
    distribution. Lutilisation de ces critres devrait faire partie
    intgrante de la mise en oeuvre des procdures fondes sur les
    principes HACCP et les autres mesures de contrle de
    l'hygine.

    critres dhygine des procds

    1 critres de scurit des denres alimentaires

    E. sakasakii : Quatre
    prmaturs infects
    en 2004 par le mme
    lait en poudre

    Scurit = Pas de microbe pathogne


    ont t retenus:
    - Listeria monocytogenes
    - Salmonelles
    - Entrotoxine de Staph. aureus
    - Histamine (poissons)
    - Enterobacter sakasakii (actualit, lait poudre)
    - On ne cherche ni E.coli, ni virus (Norovirus,
    hpatite A), car on n'a pas de mthode fiable

    2 critres dhygine des procds


    Hygine procds = il ne faut pas "trop" de bactries banales
    pas "trop" de contaminants "tmoins" (d'origine fcale)

    Critre scurit // Critre hygine

    Anarobies sulfito-rducteurs

    K2

    Dnombrement: ralisation
    Prlvement strile, transport au froid
     Prparation des 5 chantillons:
    

     Aliment

    solide, broy dans un liquide strile


     Ralisation de dilutions dcimales (1 dans 9)

    K3

    Dnombrement en milieu liquide


    

    Pour chaque srie de culture issue de la mme dilution


    on compte le nombre de tubes positifs (3 sries
    identiques)
    On compose le nombre caractristique,
    et la lecture de la table de Mac Grady nous donne
    le Nombre le Plus Probable: NPP.
    Avantages:
    
    

    Mise en vidence dun caractre particulier


    Phase de ranimation, enrichissement tout fait pour suite

    Inconvnients:
    
    

    Manque de prcision (variabilit de 1 log)


    Lourde mettre en oeuvre

    Source: ENSTA TD microbio

    Table de
    Mac Grady
    pour 3 tubes
    par dilution

    Dnombrement sur milieu solide

    Une bactrie, place sur un milieu favorable, donnera


    naissance une colonie macroscopiquement visible.
    UFC = Unit formant colonie
    Etalement en surface ou en profondeur

    Avantages:

    
    
    

    Plus facile mettre en uvre


    Plus prcise (variabilit de 0.5 log)
    Mthode disolement

    Inconvnients:
    

    Mthodes de revivification parfois ncessaire

    Source: ENSTA TD microbio

    Petrifilm

    Ptrifilms ou boites de Ptri: quelles dilutions compter ?


    Comment calculer les UFC = nombre de bactries par g ou par ml ?
    Comment exprimer le rsultat ?

    Micro-organismes dnombrs ou recherchs


    dans les analyses de routine => on va les voir plus en dtail

    Entrobactries

    Coliformes Fcaux
    E. coli

    Salmonella spp.

    Coliformes Totaux

    Flore Arobie
    Msophile Totale

    Staphylocoques
    coagulase +

    Anarobies
    sulfitorducteurs

    Milieux de culture
    Quy a-t-il dans un milieu de culture ?

    N.S.

    Flore arobie msophile totale =


    FAMT = Microorganismes Totaux
    

    Ensemble des germes capables de se dvelopper sur un


    milieu nutritif 30C en arobiose.

    Milieu ordinaire : glose pour dnombrement ou PCA,


    contenant peptone, glucose, extrait de levure.

    Indicateur dhygine gnrale, valuation de laltration


    microbienne des denres

    Attention flore technologique

    Recherche de flores plus slectives pour certains


    produits

    Milieux de culture slectifs


    Entrobactries

    Glose au cristal violet, rouge neutre,


    bile, glucose (VRBG) ou lactose (VRBL)

    Coliformes

    Glose dsoxychlolate lactose


    Bouillon lactos bili au vert brillant

    E. coli

    BLBVB ou le bouillon de Mac Conkey

    Milieux de culture slectifs:


    inhibent la croissance de certains micro-organismes
    rvlent la croissance de ceux qui sont recherchs
    VRBL

    Hetkoen

    Entrobactries
    

    Bacilles droits, Gram-, aro-anarobie


    Rduction des nitrates en nitrites
    Fermentation du glucose
    Oxydase ngatif

    Nombreuses espces = htes normaux du tube


    digestif des animaux
    Bactries fcales frquemment des
    contaminants alimentaires dorigine fcale
    Certaines espces sont pathognes: lesquelles ?

    Coliformes
    

    Coliformes (df. ISO) (qui a la forme de E.coli) :


    Bacilles Gram-, non sporuls, aro-anarobies,
    capables de se multiplier en prsence de sels biliaires et
    en fermentant le lactose avec production dacide et de
    gaz 37C.

    Coliformes thermotolrants ou fcaux: df. Idem 44C

    E.coli prsums : Coliformes thrmotolrants +


    production dindole partir du typtophane.

    E.coli : E.coli prsums + RM (rouge de mthyle)


    positifs, VP (Voges-Proskauer) ngatif, Citrate ngatif

    Indicateurs de
    contamination
    dorigine fcale
    Un indicateur doit:
     toujours

    tre prsent lorsque


    les micro-organismes pathognes sont prsents

     apparatre

    en plus grand nombre que les agents


    pathognes associs

     avoir

    le mme comportement que les agents


    pathognes dans lenvironnement naturel et au cours
    des procds de fabrication

     doit

    tre mis en vidence, dnombr et identifi


    laide de techniques simples.

    Indicateurs de contamination
    dorigine fcale
    
    

    
    

    Coliformes totaux / fcaux (44C) / E. coli


    Dveloppement de nouveaux milieux
    chromognes spcifiques de E. coli
    gnralisation de cet indicateur qui est un des
    plus sensibles et le plus spcifique
    Entrobactries et coliformes totaux renseignent
    sur la matrise de lhygine gnrale
    Streptocoques fcaux,
    plus rsistants dans le milieu,
    indicateurs du futur ?

    Anarobies
    sulfito-rducteurs
    

    Clostridium:
     htes

    normaux de lintestin
     Tellurique
     Dans les matires en putrfaction
    
    

    Dnombrement sur
    Tryptone Sulfite Cyclosrine
    Indicateur dhygine gnrale
    Prsomption de la prsence de
    Clostridium perfringens

    Staphylocoques coagulase +
    

    S. aureus est la fois:


     Germe

    pathogne car peut scrter une toxine


     Indicateur dhygine
    
    
    

    Dnombrement sur glose de Baird-Parker (dia suiv)


    Vrifier lactivit coagulase +
    Si ncessaire,
    recherche entrotoxines staphylococciques =
    critre de scurit pour les produits laitiers

    Staphylococcus aureus sur glose


    Baird-Parker (jaune duf + tellurite)
    colonies
    de staph.
    noires,
    entours
    dun halo
    + prcipit

    Salmonella spp.
    
    
    

    Dangereux par simple prsence


    Principale source : origine fcale, contamination croise
    Recherche:
    
    
    
    
    

    Pr-enrichissement
    Enrichissement sur bouillon au slnite ou au trathionate
    Isolement sur glose au vert brillant et rouge de phnol et une
    autre glose ventuellement.
    J+3 : suspicion de prsence de Salmonelles
    J+4 : confirmation ou non par la galerie API

    Critres de scurit des denres


    alimentaires
    

    critre dfinissant lacceptabilit dun produit


    ou dun lot de denres alimentaires, applicable aux
    produits mis sur le march
    Les rsultats des analyses :
     rvlent

    la qualit microbiologique du lot contrl.


     peuvent aussi tre utiliss pour dmontrer lefficacit
    de lapplication du systme HACCP ou des bonnes
    pratiques dhygine dans le cadre du procd.

    Critre microbiologique pour un aliment


    Elments pris en compte
    

    Un critre microbiologique permet de


    s'assurer qu'un aliment est acceptable
    compte tenu du nombre de bactries prsents.
    Il se compose des lments suivants:

    
    
    
    
    
    

    Microorganismes /toxines indsirables


    Mthodes d'analyse pour les dtecter / les quantifier
    Plan dchantillonnage (Nb prlevts, taille chantillon)
    Limites microbiologiques juges appropries l'aliment
    Nombre d'units qui doivent tre conformes aux limites.
    Un critre microbiologique doit galement stipuler l'aliment
    et le stade de la chane auxquels il s'applique, et les
    mesures prendre lorsqu'il n'est pas satisfait.

    Source FAO: http://www.fao.org/docrep/w6419f/w6419f05.htm

    K7
    Catgorie de
    denres
    alimentaires

    Microorganismes
    / toxines,
    mtabolites

    Plans
    d'chantillonnage1

    Limites2

    Mthode
    d'analyse
    de
    rfrence3

    Stade
    d'application du
    critre

    1.4 Viande
    hache et prpa
    de viande
    destines tre
    consom. crues

    Salmonella

    Absence
    dans 25 g

    EN/ISO 6579

    Produits mis
    sur le march
    pendant leur
    dure de
    conservation

    1.5 Viande
    hache et
    prparations de
    vde de volailles
    destines tre
    consom. cuites

    Salmonella

    2006
    Absence
    dans 10 g

    EN/ISO 6579

    Produits mis
    sur le march
    pendant leur
    dure de
    conservation

    partir de
    2010
    Absence
    dans 25 g

    Plan dinterprtation 2 classes :


    satisfaisante / insatisfaisante
    Si non satisfaisant, aliment NON commercialis, et mme RAPPEL si dj mis en vente

    Critres dhygine des


    procds
    

    critre indiquant lacceptabilit du fonctionnement du procd


    de production. Un tel critre nest pas applicable aux produits mis
    sur le march. Il fixe une valeur indicative de contamination dont le
    dpassement exige des mesures correctives destines
    maintenir l'hygine du procd conformment la lgislation
    sur les denres alimentaires.

    
    
    
    
    

    Viandes et produits base de viande


    Lait et produits laitiers
    Ovoproduits
    Produits de la pche
    Lgumes, fruits et produits base de lgumes et de fruits

    Interprter un Plan trois classes


    pour tester lhygine des procds
    
    

    Une troisime classe acceptable se glisse


    entre satisfaisant et non satisfaisant
    On* dfinit deux limites microbio (m seuil bas et
    M seuil haut): on acceptera que quelques
    chantillons se trouvent entre les deux
    Le plan dchantillonnage dfinira donc le
    nombre de prises dchantillons n et le nombre
    acceptable entre les deux limites c
    * On cest le rglement CE 2073/2005, qui dit : n = nombre d'units
    constituant l'chantillon; c = nombre maximal de rsultats pouvant prsenter
    des valeurs comprises entre m et M, pour le nombre d'chantillons n ralis

    Catgorie de
    denres
    alimentaires

    Microorganismes

    Prparations E. coli
    de viande

    Plan
    chantillonnage

    Limites

    500
    ufc/g
    ou
    cm2

    Mtho
    Stade
    anad'applilyse de cation du
    rfcritre
    rence

    5000
    ISO
    Fin du
    ufc/g 16649- procd
    ou
    1 ou 2 de fabricm2
    cation

    Action en
    cas de
    rsultats
    insatisfaisa
    nts

    Amliorer
    hygine de
    production
    et
    slection
    matires
    premires

    Plan dinterprtation 3 classes :


    satisfaisant / acceptable / insatisfaisant
    C, nombre maximum de rsultats pouvant prsenter des valeurs
    comprises entre m et M, pour le nombre dchantillons n ralis.

    Prlvements sur carcasse

    Lieux de prlvements
    4 sites sur 5 carcasses
     Cuisse

    x 10 semaines
    Montre hygine abattoir

     Flanc

     Epaule
     Collier

    CARCASSES
    Catgorie de
    denres
    alimentaires

    Microorganismes

    Plan
    d'chantillonnag
    e
    n

    Carcasses de
    bovins,
    dovins, de
    caprins et
    dquids4

    Limites

    Mthode
    d'analyse de
    rfrence3

    Stade
    d'application du
    critre

    Action en
    cas de
    rsultat
    inacceptable

    Nombre de
    colonies arobies

    3,5 log
    ufc/cm2
    moyen
    quotidien

    5,0 log
    ufc/cm2

    ISO 4833

    Carcasses
    aprs
    lhabillage,
    mais avant
    le ressuage

    Amliorer
    lhygine de
    labattage et
    rexamen
    des contrles
    de procd

    Entrobactries

    1,5 log
    ufc/cm2
    moyen
    quotidien

    2,5 log
    ufc/cm2

    ISO
    21528-2

    Carcasses
    aprs
    lhabillage,
    mais avant
    le ressuage

    Amliorer
    lhygine de
    labattage et
    rexamen
    des contrles
    de procd

    Plan dinterprtation 3 classes (sur moyenne des log)


    satisfaisant / acceptable / inacceptable

    Examens Bactriologiques sur Carcasse


    Pour vrifier et amliorer lhygine de labattoir
    Pour quelles autres raisons ?
    
    

    Abattage animal accident


    Contrle officiel si doute
     Septicmie

    ou Tuberculose ?
     Substance antimicrobienne ? (pvt = rein)
    
    

    Vto Inspecteur peut le demander


    pour aide la dcision
    Carcasse garde en consigne
    Si deuxime examen dfavorable = saisie totale

    Questions d'interro possibles (exemples)


    - Quels sont les 2 types de critre microbiol. dfinis par la rglementation europenne ?
    Que signifient-ils? Donner pour chacun d'entre 2 exemples de bactries concernes
    - Citez 4 bactries ou toxines recherches dans les critres microbiologiques de scurit
    - Diffrences entre dnombrements bactriens en milieu liquide et en milieu solide, avantagesinconvnients, et type de rsultat obtenu (on peut faire un schma)
    - Sur un exemple de numration en milieu solide (donn sur le sujet), trouver le nombre de
    bactries par gramme d'aliment, et exprimez-le de faon standard
    - Quelle bactrie et/ou famille de bactries utilise-t-on en gnral comme indicateur de
    contamination fcale ? Donner trois facteurs qui permettent de slectionner/distinguer cette
    bactrie/famille lors de sa numration sur boite de ptri
    -Combien de temps faut-il pour dtecter et confirmer la prsence de Salmonelle dans un
    aliment ?
    - Quels sont les diffrents lments pris en compte pour dfinir un critre microbiologique ?
    - Diffrences entre plan 2 classes et plan 3 classes
    - Que fait lindustriel qui constate lors dun auto-contrle quun aliment quil commercialise nest
    pas satisfaisant pour un critre microbiologique de scurit des aliments ?
    - Que signifie "Plan 3 classes" pour l'interprtation des rsultats de l'analyse bactriologique
    d'un lot d'aliment ? Dfinissez m, M, n et c.
    - Comment contrle-t-on la qualit bactriologique des carcasses dans un abattoir ?
    - Interprter les rsultats d'une analyse microbiologique (sur un exemple). Le plan
    rglementaire d'interprtation sera donn sur le sujet d'exam : inutile de le savoir par cur !

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