PCR

Polymerase Chain
Reaction

Jimena Bohórquez-Herrera, PhD

https://bit.ly/2SeiLSa (27/04/2020)
 Reacción en cadena de la polimerasa
• Método usado para amplificar un segmento particular
de ADN

• Técnica de laboratorio común utilizada para hacer

muchas copias de una región particular de ADN.

• Pilar fundamental en la biología molecular

• Puede producir billones de copias de una secuencia

específica de ADN en unas pocas horas

• No permite replicar genes de gran tamaño, ni un genoma completo: Generalmente el ADN

amplificado en PCR es de un tamaño entre 2-3 kb (2000-3000 nucleótidos)

• Muchas aplicaciones (ej. forense, enfermedades, fósiles, ID spp, ecología, medicina, etc.)
Premio Nobel de Química
1993 “…Emocionado, comencé a calcular potencias de dos en
mi cabeza: dos, cuatro, ocho, 16, 32. Recordé vagamente
que dos elevado a diez era aproximadamente mil y que,
por tanto, dos a la veinte era alrededor de un millón.
Detuve el coche en un desvío sobre el valle de Anderson.
Saqué lápiz y papel de la guantera. Necesitaba
comprobar mis cálculos. Jennifer, mi soñolienta pasajera,
protestó aturdida por la parada y la luz, pero exclamé
que había descubierto algo fantástico.”

1983

“Mi mente regresó al laboratorio. Las cadenas de ADN se enrollaron y flotaron.

Espeluznantes imágenes azules y rosas de moléculas eléctricas se inyectaron en algún
lugar entre la carretera y mis ojos. (…) No dormí esa noche. A la mañana siguiente
había diagramas de reacciones de PCR por todas partes.”
https://onscience.es/como-se-invento-la-pcr-polimerasa/ (27/04/2020)
https://thebiologynotes.com/polymerase-chain-reaction-pcr/ (27/04/2020)
https://www.sciencelearn.org.nz/videos/1663-pcr-the-polymerase-chain-reaction-explained (26/04/2020)
Esta foto de Autor desconocido está bajo licencia CC BY-SA

Reacción en cadena de la polimerasa

•Técnica para hacer muchas copias de una

determinada región de ADN in vitro (en un
tubo de ensayo en lugar de que ocurra
dentro de un organismo).

•En la PCR, la reacción se somete repetidamente a un ciclo de cambios de temperatura

que permiten la producción de muchas copias de la región blanco.

•La PCR tiene muchas aplicaciones en la investigación y en la práctica. Se utiliza de forma

rutinaria en la clonación de ADN, el diagnóstico médico y el análisis forense de ADN.
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Reacción en cadena de la polimerasa

•Con una sola célula espermática o de cabello, se puede
amplificar suficiente ADN para realizar un análisis y
producir bandas diferenciadas en gel de agarosa.

•Se pueden amplificar fragmentos de

interés en el ADN de un organismo,
escogiendo los cebadores (primers)
apropiados

•La selectividad de los cebadores puede usarse para identificar la probabilidad de que un
individuo sea portador de un particular alelo de un gen.
 ¿Qué se necesita?
1. Muestra de ADN con la secuencia de interés
2. Primers o cebadores
3. Una ADN polimerasa termoestable (TAQ polimerasa)
4. 4 nucleótidos trifosfatados
5. Solución tampón
6. Tubos de pared delgada
7. Termociclador  Puede generar gradientes de temperatura
drásticos en periodos de tiempo muy cortos.
8. Aqua Milli Q
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Primers - cebadores
• Moléculas cortas (oligonucleótidos)
sintéticas de una sola hebra, de unos
18-30 nucleótidos aproximadamente

• Son manufacturados comercialmente y

se pueden diseñar para complementar
con cualquier secuencia de ADN

• Posee una secuencia específica que se complementa a la región adyacente o vecina al

fragmento que se desea amplificar.

• Dos soluciones de trabajo: Primer F y Primer R.

• El Primer F tiene una secuencia complementaria a la región adyacente que se
localiza corriente arriba de la diana que se quiere amplificar.
• El Primer R es complementario a la región adyacente que se localiza corriente abajo
de la diana que se va a amplificar.
• Los Primers definen la longitud del
fragmento que se va a amplificar.
Primers - cebadores
• Es usual que se amplifiquen sólo regiones específicas
del gen y no el gen completo.

• Los primers actúan como iniciadores del proceso de

síntesis de ADN. https://bit.ly/2yNrlRe (27/04/2020)

• A la hora de elegir los primers o cebadores para la amplificación de un determinado

fragmento se debe tener en cuenta:
• Relación purinas-pirimidinas de 1:1 o 40:60.

• Recomendable que en el extremo 3´- de los primers esté una G o C (no es indispensable).

• Ambos primers deben tener una temperatura de hibridación similar  máxima diferencia de
aproximadamente +/- 5°C.

• La longitud de los primers debe estar comprendida entre 18 y 30 nucleótidos.

 Primers - cebadores
Para recordar:
ADN polimerasa construye la nueva hebra en
dirección 5’ a 3’. Eso significa que se mueve
sobre la vieja hebra en dirección 3’ a 5’

• Los primers se ligan a su secuencia complementaria en el ADN objetivo

• Un primer muy corto tiene una alta probabilidad de encontrar su complemento en un genoma más de
una vez  POCO ESPECÍFICO

Ejemplo: Primer compuesto de seis letras CAGGTC

.
3´ GTGCCGGGACCCTTGTTACGTCGAGGCGCACGTCCGAGTCTCCTGGGACGGGGTGGGGTCCAGGGTGCGAGT 5´

CACGGCCCTGGGAACAATGCAGCTCCGCGTGCAGGCTCAGAGGACCCTGCCCCACCCCAGGTCCCACGCTCA
5´ 3´
 Primers - cebadores
Para recordar:
ADN polimerasa construye la nueva hebra en
dirección 5’ a 3’. Eso significa que se mueve
sobre la vieja hebra en dirección 3’ a 5’

• Los primers se ligan a su secuencia complementaria en el ADN objetivo

• Un primer muy corto tiene una alta probabilidad de encontrar su complemento en un genoma más de
una vez  POCO ESPECÍFICO

• A medida que un primer crece en nucleótidos, la probabilidad de que se encuentre más de una región
complementaria a él, es más difícil  Mayor especificidad y selectividad

3´ GTGCCGGGACCCTTGTTACGTCGAGGCGCACGTCCGAGTCTCCTGGGACGGGGTGGGGTCCAAGGTGCGAGT 5´
CACGGCCCTGGGAACAATGCA
5´ 3´
3´ 5´
GGTGGGGTCCAAGGTGCGAGT
CACGGCCCTGGGAACAATGCAGCTCCGCGTGCAGGCTCAGAGGACCCTGCCCCACCCCAGGTTCCACGCTCA
5´ 3´

Cebador sentido (Primer Forward ) 5´CACGGCCCTGGGAACAATGCA 3´

Cebador antisentido (Primer reverse) 3´ GGTGGGGTCCAAGGTGCGAGT 5´

 Probabilidad de complementariedad en Primers
• La probabilidad de obtener cara (H) o sello (T) al lanzar una moneda es siempre 0,5 para cada vez que
arrojemos la moneda

• A medida que el primer incrementa en tamaño, las probabilidades de una complementariedad extra,
además de la buscada es altamente improbable
 Probabilidad de complementariedad en Primers
• Hay cuatro (4) bases en la molécula de ADN: A, C, G, T

• La probabilidad de encontrar cualquiera de estas bases en el código es de 0,25 (1/4)

• Se vuelve cada vez menos probable que una secuencia de 16 bases (1 probabilidad
en 4300 millones), encuentre más de una zona complementaria

• A medida que el primer incrementa su tamaño, la probabilidad de que se una a una

zona distinta a la esperada es muy baja

Esta foto de Autor desconocido está bajo licencia CC BY-SA

 ADN POLIMERASA
• Una ADN polimerasa es una enzima que es capaz, a partir
de una hebra molde, generar una hebra complementaria
añadiendo dNTPs (deoxiribonucleotidos trifosfato)

• Para separar las hebras de ADN se someten a elevadas

temperaturas (90°C), por lo que las enzimas normales se
desnaturalizan

• Thermus aquaticus (TAQ)  Bacteria termófila, GRAM negativa,

aerobia y heterótrofa. Esta bacteria vive a temperaturas entre los 50 y
80ºC.

• Las proteínas de los seres termófilos, como T. aquaticus, tienen

una conformación especialmente adaptada a estas temperaturas, por
lo que no se desdoblan y permiten que vivan en estas condiciones para
otros imposibles.
https://bit.ly/3aJbNuM (27/04/2020)

TAQ POLIMERASA
• Actividad polimerasa 5’  3’, añadiendo bases nitrogenadas en ese sentido
de la hebra de ADN.

• Velocidad media de extensión (procesamiento): 60 nucleótidos/seg (en

regiones ricas en uniones G-C).

• Cantidades óptimas: 2 unidades por cada 25 μL de volumen final de reacción.

• Su actividad se ve influenciada por la concentración de dNTPs, Mg+2

• Los fabricantes recomiendan no hacer secuencias de más de 5 Kb.

• La polimerasa fue aislada de T. aquaticus. La que se emplea en los laboratorios proviene de bacterias
E. coli a las que se les ha insertado el gen de la TAQ polimerasa (facilidad y economía).

• La concentración tiene efecto en especificidad y rendimiento de reacción

• Baja concentración: bajo rendimiento.
• Exceso: amplificaciones inespecíficas
https://cientificasenna.com/producto/dntp-y-buffer-para-pcr/ (27/04/2020)

DESOXINUCLEÓTIDOS TRIFOSFATO (dNTPs)

• Son los bloques que usa la ADN polimerasa para crear la
nueva hebra

• Se aplican en grandes cantidades dado que se gastan rápido

• La concentración de dNTP y el MgCl2 siempre va relacionada.

• Para una concentración de 200 μM de cada uno de los dNTP

se suele añadir una concentración de 1.5 mM de Mg2+
• La concentración del stock de dNTPs contiene 10mM de cada unos de los cuatro dNTP a pH 7.

• La concentración final en la reacción puede ir de 20 a 200 µM de cada uno de los dNTPs, dependiendo
del fragmento a amplificar y la concentración de magnesio, la cual resulta en un óptimo balance en
rendimiento, especificidad y exactitud.

• Alta concentración de dNTPs conlleva a un decrecimiento de la especificidad y fidelidad del PCR. En

general 200 µM de cada uno de los dNTPs puede usarse para la amplificación de un fragmento de 2kb
durante 30 ciclos (Viljoen et al. 2005).
 Esta foto de Autor desconocido está bajo licencia CC BY-SA-NC

BUFFER DE AMPLIFICACIÓN
• Provee la fuerza iónica y la capacidad
amortiguadora necesaria durante la
reacción

• Contiene KCl, Tris-HCl y MgCl2.

• Mg  Esencial para actividad enzimática

2+
ADN MOLDE
• Es el ADN que se desea amplificar.
• KCl  Aumenta actividad polimerasa 40% –
60% • La concentración de ADN necesaria para
una reacción de PCR siempre va a ser muy
• Fidelidad del TAQ aumenta a pH 8,3 - 8,8 baja  Depende de la calidad del ADN.

• Cuando el ADN es de óptima calidad

(puro) no surgen problemas durante la
amplificación  Mínimo 5 ng por cada 25
μL de reacción.
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1 DESNATURALIZACIÓN

2
HIBRIDACIÓN – ANILLAMIENTO –
ALINEAMIENTO – TEMPLADO

3 EXTENSIÓN
 1 DESNATURALIZACIÓN (96°c)

• La primera reacción consiste en la desnaturalización del DNA, separándose las dos

cadenas por ruptura de los enlaces de hidrógeno.

• Las condiciones típicas de desnaturalización son 95ºC por 30 segundos, o 97ºC por 15
segundos; sin embargo temperaturas más altas pueden ser apropiadas
especialmente para templados ricos en G + C.

• La desnaturalización incompleta permite el apareamiento de las hebras de DNA y

por lo tanto se reduce el rendimiento el producto.

• En contraste, los pasos de desnaturalización a altas temperaturas o por mucho

tiempo provocan perdida de la actividad de la enzima.
 2 ALINEAMIENTO (55°c – 65°c)

• La segunda reacción consiste en la

hibridación de los primers. Para ello se
baja la temperatura y las condiciones
serán tales que se facilitará la unión de
los primers a las cadenas.

• En cada reacción de PCR se utilizan dos cebadores que están diseñados para flanquear
la región blanco  Les agregan secuencias que harán que se unan a cadenas opuestas
del molde de ADN solo en los extremos de la región a copiar.

• Los cebadores se unen al molde mediante complementariedad de bases.

 3 EXTENSIÓN (72°c)

• La polimerasa lleva a cabo su acción, insertando los diferentes nucleótidos

complementarios en el orden que le va indicando la cadena que actúa como molde.

• El tiempo de extensión depende de la longitud y concentración de la secuencia blanco y

de la temperatura.

• Las estimaciones para la tasa de incorporación de nucleótidos a 2ºC varia de 35 a 100

nucleótidos por segundo dependiendo del buffer, pH, concentración de sales y la
naturaleza del templado.

• Un tiempo de extensión de un minuto es considerado suficiente para productos de

hasta 2 kb de longitud.
Esta foto de Autor desconocido está bajo licencia CC BY-SA
CICLOS
• Los tres pasos anteriores constituyen un ciclo.

• La repetición de este ciclo unas 40 veces, por ejemplo, permite obtener, como
resultado de un experimento de amplificación, millones de copias del fragmento de
interés.

• El número óptimo de ciclos dependerá principalmente de la concentración inicial del

templado cuando los otros parámetros son optimizados.

• Demasiados ciclos puede incrementar la cantidad y complejidad de productos no

específicos.

• Pocos ciclos dan un bajo rendimiento del producto.

• La cantidad de DNA dobla teóricamente con cada ciclo de PCR

CICLOS
CICLOS
Genotipificación de apoE:

determinar el alelo presente

en un individuo

Alma Polo Barrios

 gen apo E
• Es un tipo de apolipoproteína que hace parte de los quilomicrones y
las lipoproteínas de densidad intermedia (IDL).
• Esta apolipoproteína es necesaria para el catabolismo normal de las
lipoproteínas ricas en triglicéridos.
• El gen apoE (4 exones y 3 intrones) se encuentra localizado en el
cromosoma 19, formando un cluster con los genes para apoC1 y
apoC2.
• Gen polimórfico: apoE2, apoE3, apoE4.
• El gen apoE más expresado en humanos es el apoE3, y se sugiere
que es el que está más relacionado con el metabolismo de los lípidos.
• Los genes apoE2 y apoE4 están más relacionados con problemas de
cognición y con enfermedades como Párkinson y Alzheimer.
Gen polimórfico apo E
Primers - cebadores
Covid-19

Jimena Bohórquez-Herrera, PhD

https://www.biobasic.com/coronavirus-covid-19-primers#pri (27/04/2020)

FAM: Fluorescein amidites

BHQ1: Black Hole Quencher 1
https://www.youtube.com/watch?v=wOKBalGKJsw