11 - Secuenciación Bioinformática

Secuenciación de
genomas y principios
básicos de
Bioinformática
Biología Molecular
Universidad del Magdalena
Marcadores moleculares
• Diversidad genética
• Recursos fitogenéticos – Medición variación genética
• Marcadores genéticos
• Descripción
• Tipos
• Propiedades deseables
• Comparación de las técnicas
TIPOS
Los marcadores
moleculares funcionan
como señaladores de
diferentes regiones del
genoma
Identifican en un individuo
las características del
fenotipo, del genotipo o de
ambos
TIPOS
Morfológicos: Medida más

directa del fenótipo.
Desventajas:
• requiere conocimiento
práctico del cultivo
• Sujeto a influencias
ambientales
• Número limitado
TIPOS
Protéicos o bioquímicos: Se basa
en las propiedades de migración
de las proteínas, las cuales
permiten separarlas mediante
electroforesis
Ventajas:
• Equipo de laboratorio
“sencillo”
• Complemento valioso a
evaluación morfológica
Desventajas:
• Sujeto a influencias
ambientales
• Número limitado
TIPOS
Moleculares: Polimorfismos
detectados en la secuencia de
ADN del núcleo o de organelos
Ventajas:
• Número potencialmente
ilimitado
• No sujetos a influencia
ambiente
• Medida objetivo de la
variación
Desventaja:
• Equipo técnicamente más
complejo
Basado en Hibridización
RAPD (Random amplified polymorphic DNA –
Amplificación aleatoria de ADN polimorfico)
El análisis de polimorfismos de una sola
base (SNPs) se basa en el uso de cebadores
específicos que terminen justo antes de la
base a determinar.
Se realiza una reacción de PCR sólo con

los 4 didesoxinucleótidos marcados cada
uno con un fluoróforo diferente.
La detección de la base incorporada

revela la presencia/ausencia de
polimorfismo.
Secuenciación
Conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden
de los nucleótidos (A, C, G y T) en un fragmento de una molécula.
Porqué es importante el genoma

• En él están todas las instrucciones genéticas para el desarrollo y
funcionamiento de un organismo
• En él se ubican los genes, Secuencias codificantes, espaciadoras,
reguladoras, que dejaron de ser funcionales y muchas otras
• En él se depositan los cambios, que se han acumulado a lo largo de la
historia evolutiva de la especie y de todas sus antecesores
Cuaderno 120
https://www.porquebiotecnologia.com.ar/Cuadernos/El_Cuaderno_120.pdf
Secuenciación - Métodos
• Secuenciación de Maxam And Gilbert (1977)

• Secuenciación de Sanger
• Secuenciación automática
• Secuenciación Masiva
• Illumina
• Applied
• Roche
Esta foto de Autor desconocido está bajo licencia CC BY-SA

Método de
degradación A B
química
Basado en la
degradación química
parcial de la cadena
original de ADN
• Muy complejo
• Reactivos peligrosos
• No hay kit Explicación de la figura: (A) el método requiere marcaje radiactivo en uno de los extremos y la purificación del fragmento de ADN
que se desea secuenciar. El tratamiento químico genera rupturas en una pequeña proporción de uno o dos de los cuatro nucleótidos
en cada una de las cuatro reacciones (G, A+G, C, C+T). Luego, se realiza el tratamiento con piperidina a 90ºC para clivar el enlace
azúcar-fosfato en los sitios correspondientes. De ese modo se genera una serie de fragmentos a partir del extremo marcado
radiactivamente hasta el primer lugar de corte en cada molécula.
(B) Los fragmentos posteriormente se separan por tamaño mediante electroforesis en gel, separando los productos de las cuatro
reacciones en cuatro calles del gel distintas. Para visualizar los fragmentos generados se hace una autoradiografía, lo que provee
una imagen de una serie de bandas oscuras correspondientes a los fragmentos marcados con el radioisótopo. A partir de la lectura
de estos fragmentos, desde abajo (fragmentos más pequeños) hacia arriba (fragmentos más grades), se puede inferir la secuencia
de ADN de interés.
Método de terminación en cadena o dedidesóxidos
(Frederick Sanger, 1977)
• Utiliza pocos reactivos tóxicos y
cantidades menores de radioactividad
que en el método de Maxam-Gilbert.
• Principal característica es el uso de
didesoxinucleótidos trifosfato (ddNTPs)
como terminadores de la cadena de
ADN. ddNTPs: Carecen de
uno de los grupos
• Cuando un ddNTPs se incorpora a la hidroxilo
una cadena de ADN en crecimiento no
se puede seguir elongando (ADN pol
necesita un extremo 3’ OH para añadir
el siguiente nucleótido).
Gel de
poliacrilamida-urea
• Tamaño del
fragmento
• Electroforesis
en gel de
policrilamida –
urea.
• Rápido
• Contamina menos
• Cadenas más largas
• Más “barato”
Avance de la Secuenciación en el tiempo
Diagnóstico por HTS

(NGS), Seq. Gen a
genomas.
Zerbini, 2020. https://youtu.be/c-6YK6RVdCo

“Conjunto de datos organizado de tal modo que permita obtener
con rapidez diversos tipos de información”
“USO DE TÉCNICAS COMPUTACIONALES, MATEMÁTICAS Y

ESTADÍSTICAS PARA EL ANÁLISIS, INTERPRETACIÓN Y
GENERACIÓN DE DATOS BIOLÓGICOS.”
“APLICACIÓN DE LA INFORMÁTICA A
LA INVESTIGACIÓN BIOMÉDICA.”
• ¿Qué es bioinformática?
Adquisición análisis y almacenamiento de la información
genética, principalmente en la forma de ácidos nucleicos y
proteínas. Biología molecular computacional, desarrollo de
Esta foto de Autor desconocido está bajo licencia CC BY-NC
algoritmos y softwares.
Palabras claves en bioinformática
• DNA, RNA, Proteína

• Gen • Genoma,
• Secuenciación transcriptome,
• Alineamiento
proteome,
• Polimorfismos
• SNPs, ESTs, metabolome
Microsatélites … (OMICAS)
marcadores
moleculares • Bases de datos
¿Por qué surge la bioinformática?
• Crecimiento exponencial de
datos (se estima 1 Tera por
semana)
• Tenemos las secuencias
pero…
• Entendemos el código
genético pero ...
• Entendemos las relaciones
evolutivas y las mutaciones
pero …
Objetivos Bioinformatica y Biol molecular computacional
• Convertir la información de la secuencia de nucleótidos o de proteínas de ella derivada
en conocimiento bioquímico y biofísico (funciones estructurales, funcionales y
evolutivas).
• Se busca es decodificar un lenguaje desconocido, extrayendo su significado biológico.
• Localización e identificación de genes, éxones, introns y secuencias reguladores. Ej. La
sustitución de ácido glutámico por valina en la cadena de la hemoglobina A humana
causa un tipo particular de anemia.
• Entendimiento de la estructura de la proteína à función
BASES DE DATOS
• National Center for Biotechnology Information (NCBI)
• GenBank
• European Bioinformatics Institute (EBI)
• EMBL Nucleotide Sequence Database
• DNA Database of Japan (DDBJ)
• National Institute of Genetics
• Las tres comparten sus datos diariamente Coordinadas
por la International Nucleotide Sequence Database
Collaboration (INSDC)
¿cómo acceder a la información?
ExPASy
• Organiza la información por categorías

• Proporciona acceso a banco de datos y a software
• Acceso a varios genomas completo
• Acceso a secuencias no codificantes
https://www.expasy.org/BioHunt/
Recuperación de secuencias
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
• Bases de datos
• Consulta secuencias
• Subir secuencias
• Alinear secuencias
• GenBank
GenBank
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
• Las secuencias pueden ser de diversos tipos y alcances:
• Secuencia de ADN, ARN, aminoácidos
• Secuencia de transcrito, gen, cromosoma, genoma
• Secuencia de mutación (SNP)
• … hasta 40 BBDD distintas
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
Formato fasta
Alineamiento de secuencias
Análisis comparativos buscan

similaridades y diferencias
entre las secuencias de
nucleótidos o aminoácidos, con
la finalidad de inferir analogías
estructurales y/o funcionales y
relaciones evolutivas
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
• https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Curva de crecimiento GenBank - Fundación 4/11/1988
¿cómo subir secuencias?

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Secuenciación de

Morfológicos: Medida más

Se realiza una reacción de PCR sólo con

La detección de la base incorporada

Porqué es importante el genoma

• Secuenciación de Maxam And Gilbert (1977)

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Diagnóstico por HTS

Zerbini, 2020. https://youtu.be/c-6YK6RVdCo

“USO DE TÉCNICAS COMPUTACIONALES, MATEMÁTICAS Y

• DNA, RNA, Proteína

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