DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR Y GENÉTICA

Unidad de Bioquímica y Biología Molecular

FACULTAD DE CIENCIAS. UEx
BIO_Bioenergética y Metabolismo. Curso 2022/2023 Prácticas de laboratorio Práctica Nº 2
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Práctica Nº 2. SEPARACIÓN DE LÍPIDOS UTILIZANDO CROMATOGRAFÍA DE CAPA

FINA Y APLICACIÓN A LA MEDIDA DE LA ACTIVIDAD DE FOSFOLIPASAS:
FOSFOLIPASA A2.

OBJETIVOS
a) Conocer la técnica de cromatografía en capa fina, TLC, sus características y los factores
que en ella intervienen.
b) Calcular valores de Rf de varias sustancias y deducir la relación que existe entre la
polaridad de las sustancias que se analizan y la de los eluyentes utilizados.
c) Monitorizar una cinética enzimática mediante TLC.
Los lípidos en los materiales biológicos se hallan formando una mezcla compleja que se
extrae con disolventes. Su separación se hace habitualmente por cromatografía, un método
que consiste en la separación de una mezcla de dos o más compuestos por distribución
entre dos fases: la fase móvil, que transporta las sustancias que se separan y que progresa
en relación con la otra, denominada fase estacionaria. Los sólidos finamente pulverizados
tienen el poder de adsorber en mayor o menor grado otras sustancias sobre su superficie.
Este fenómeno de adsorción selectiva es el principio fundamental de la cromatografía. En
esta práctica se utiliza la cromatografía en capa fina (o TLC, abreviatura de “Thin Layer
Chromatography”), en la que una placa o soporte de vidrio o metal está recubierta
generalmente de gel de sílice formando una finísima capa de un espesor en torno a 0.1
mm, que constituye la fase estacionaria. Generalmente estas placas contienen un
compuesto fluorescente para permitir su visualización por luz UV, a 254 nm. La separación
en este material se efectúa no sólo por adsorción sino por partición.
En el experimento las muestras de lípidos que se desean analizar y que se encuentran en
un disolvente adecuado, se aplican de forma puntual con capilares, a una corta distancia
del borde inferior de la mencionada placa. Después se introduce en la cubeta o recipiente
que contiene el solvente adecuado (fase móvil), y se tapa. El solvente ascenderá, por
capilaridad, a través del soporte y arrastrará los lípidos de la muestra provocando su
reparto de acuerdo a su polaridad y produciendo “manchas”.
Se incluyen patrones de lípidos conocidos que permitirán identificar en los problemas
aquellas manchas que queden a la misma altura que las manchas de alguno de los
patrones. Cuando el frente del disolvente se sitúe próximo a la parte superior de la placa,
se saca la placa de la cubeta, se deja secar y se visualizan las manchas de los diferentes
componentes. Las manchas se revelan por luz UV o con vapores de yodo.
Al revelar por luz UV los compuestos lipídicos de las muestras quenchean la fluorescencia
y aparecen como puntos negros. Si se revela con vapores de yodo, las distintas manchas
de lípidos se irán poniendo de color marrón por adsorción preferente del iodo sobre las
zonas de la placa que contienen materia orgánica. Así se
determinará la posición de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente.
La relación de las distancias recorridas por el compuesto y por el disolvente, desde el punto
de origen del cromatograma, se conoce como Rf (rate factor). El Rf tiene un valor constante
para cada compuesto en condiciones determinadas. Estas condiciones pueden ser el tipo
de absorbente utilizado, el tamaño de la cubeta, la temperatura, el disolvente, etc.
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distancia recorrida por la muestra

𝑅𝑓 =
distancia recorrida por el solvente

La distancia que recorre la muestra o compuesto se mide desde el centro de la mancha,

por lo tanto, hay que hacer unas marcas en la placa.
Cuanto más polar sea el compuesto, más retenido estará en el absorbente, y por tanto irá
más lento y el Rf será también menor. Por otra parte, los compuestos poco polares, se
desplazan a más distancia desde el origen. La polaridad del disolvente influye en el valor
del Rf, por lo que también hay que tenerlo en cuenta. Así, para un mismo tipo de
compuesto, un aumento de la polaridad del disolvente hará aumentar su desplazamiento
en la placa y por lo tanto también aumentará su Rf. Para encontrar el eluyente ideal, es
necesario probar con diferentes disolventes con distintas polaridades o con mezclas de
varios de ellos. En estos casos, debemos cambiar a disolventes más o menos polares.

Así, en el caso de compuestos poco polares, que se desplazan del origen con bastante
facilidad, se utiliza un disolvente apolar, generalmente el hexano. Cuando se trata de
compuestos con una polaridad media, es aconsejable usar mezclas de hexano/acetato de
etilo en diferentes proporciones según la polaridad. Los productos más polares de todos,
los cuales quedan muy retenidos en el absorbente, necesitan un disolvente más polar como
pueden ser el metanol o distintas mezclas de cloruro de metileno/metanol en diferentes
proporciones.
Resumiendo:
-Rf de compuestos polares: menor que la de los no polares.
-Para un mismo compuesto, al aumentar la polaridad del solvente aumenta el Rf.

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Aplicación de la TLC a la medida de la actividad de fosfolipasas:

Fosfolipasa A2. Se realizará una cinética.
Las fosfolipasas (PLA) hidrolizan los ácidos grasos de los glicerofosfolípidos generando el
ácido graso libre y el correspondiente lisofosfolípido. Se distinguen varios tipos:
• La fosfolipasa A1 hidroliza el ácido graso en posición C-1.
• La fosfolipasa A2 hidroliza el ácido graso en posición C-2.
• La fosfolipasa C genera diacilglicerol por un lado y la cabeza polar (con el fosfato) por
otro.
• La fosfolipasa D genera ácido fosfatídico por un lado y la cabeza polar (sin el fosfato) por
otro.

La fosfolipasa A2 es un biomarcador ampliamente utilizado de procesos inflamatorios,

porque su activación dispara la producción de mediadores lipídicos pro-inflamatorios
como prostaglandinas, leucotrienos, tromboxanos y el factor activador de plaquetas (PAF).
Además, se ha demostrado su activación en procesos
neurodegenerativos cuyo desarrollo cursa con un fuerte estrés oxidativo cerebral, como
Alzheimer, Parkinson y esclerosis múltiple. Existen más de 30 isoenzimas con actividad
fosfolipasa A2, que se pueden clasificar en cinco familias principales. Entre ellas destacan
la fosfolipasa A2 citosólica independiente de calcio (iPLA2) y fosfolipasa A2 citosólica
dependiente de calcio (cPLA2) que se han relacionado con la liberación de ácido
araquidónico esterificado en los fosfolípidos.

En esta práctica se va a utilizar la PLA2 dependiente de calcio. Y se comprobará por tanto

que esta enzima es capaz de hidrolizar a su sustrato, la fosfatidilcolica (PC) en presencia de
calcio, generando liso-fosfatidilcolina (liso-PC), mientras que en ausencia de calcio no
catalizará esta reacción.

PC → liso PC + ácido linoleico

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Parte Experimental:

MATERIALES:
-Placas de TLC conteniendo un absorbente sólido: sílica o aluminio, con un indicador
fluorescente inorgánico para la detección por UV de sustancias incoloras (a 254 nm).
(sílica gel on TLC Al foils, 4x8cm, Sigma 70643-50EA)
-Vaso de precipitado de 150 ml, pinzas, capilares (1-5 µl, Sigma 851321), lápiz (no se puede
usar bolígrafo), regla, guantes.
-Baño para calentar muestras a 37 ºC.
-Termobloque para secar muestras a 110 ºC.

REACTIVOS:
- Mezcla de disolventes cloroformo/metanol/agua en proporción v/v: 65:25:3, para utilizar
en las placas.
- Fosfatidilcolina (PC, de Sigma P3556): se parte de una solución 100 mM (PM=768):7,6
mg/100 µl de disolvente. Y a partir de ésta se prepara PC 20mM por dilución 1/5, en
cloroformo:metanol (70:30).
-Fosfolipasa A2 (PLA2, de páncreas porcino, Sigma P6534). Se preparan dos diluciones: 1:25
y 1:50, en Tris 100 mM, pH 8,0.
-Tris 100 mM, pH 8,0.
-Colato sódico 1% en agua destilada.
-CaCl2 40 mM en Tris 100 mM pH 8,0.
-EGTA 40 mM, en Tris 100 mM pH 8,0.

PROCEDIMIENTO:
1.- Coger cuatro tubos de ensayo de 5 ml (rotularlos como tubos A0, A20, A40 y B.
2.- Añadir los µL de las soluciones de partida tal y como se describe en la tabla adjunta
(siempre en orden horizontal, es decir, añadiendo primero el colato en los 4 tubos, después
el Tris en los 4 tubos, después el EGTA sólo en el B, seguido del CaCl 2 en los tubos A).
Mover muy bien el tubo tras cada adición para que se mezclen bien los compuestos
añadidos y si es necesario agitar en el vórtex. Añadir la enzima en último lugar. Nota: la
enzima “dispara” la reacción. Añadirla justo antes de la incubación.
Soluciones de partida A0 A20 A40 B
PC 20 mM 5 L 5 L 5 L 5 L
secar secar secar secar
Colato sódico 1% 8 L 8 L 8 L 8 L
Tris 100 mM, pH 8.0 10 L 10 L 10 L 10 L
EGTA 40 mM 0 0 0 5 L
CaCl2 40 mM 5 L 5 L 5 L 0
Agitar los tubos para homogeneizar los componentes
PLA2 (1:25) 5 L 5 L 5 L 5 L
Orden para añadir enzima 4 3 2 1
Incubación 37ºC 0 min 20 min 40 min 40 min

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3.- Durante este tiempo, preparar una placa de TLC: trazar una línea paralela con un lápiz
a un centímetro de distancia de los bordes superior e inferior y señalar exactamente con
un punto el lugar donde se va a poner cada muestra, separadas 1 cm entre sí y 1 cm de los
bordes.
4.- Añadir el disolvente (mezcla 65:25:3) en el vaso de precipitado y taparlo.
5.- Transcurridos los tiempos de incubación secar bien los tubos poniéndolos en el
termobloque a 110 ºC durante 3-6 min. Retirar del termobloque y dejar enfriar.
6.- Añadir 20 L del disolvente (65:25:3) a cada tubo y disolver bien las muestras.
7.- Aplicar 10 L de cada muestra sobre la placa. [Si es necesario, aplicar la muestra en dos
veces y no dejarla mucho tiempo para evitar difusión. DEJAR SECAR LA MUESTRA EN LA
PLACA].
8.- Poner la placa en el vaso de precipitado, con cuidado de no tocar los bordes del vidrio,
y de que la línea que contiene las muestras esté siempre por encima del disolvente del
vaso.
Desarrollar la placa hasta que el disolvente alcance la marca a 1 cm del borde superior
de la misma. (Entre 20 y 30 minutos)
9.- Retirar la placa del vaso y secarla dejándola boca arriba sobre el papel de filtro
suministrado.
10.- Visualización de los puntos de migración de las muestras: las muestras aplicadas son
incoloras y se visualizan con vapores de yodo (el yodo es adsorbido por los dobles enlaces
de los ácidos grasos que componen los lípidos, pero no reaccionan de forma permanente
y por tanto es preciso señalar la mancha que aparece porque desaparece enseguida). Otra
forma de ver las manchas es mediante exposición de la placa a luz UV, pero no la vamos a
utilizar. (Entre 15 y 20 minutos)
7.- Calcular los Rf e interpretar los resultados obtenidos.

distancia recorrida por la muestra

𝑅𝑓 =
distancia recorrida por el solvente

Bibliografía:
https://www.youtube.com/watch?v=e99nsCAsJrw
https://www.youtube.com/watch?v=4IyGp6tqFqA
https://www.youtube.com/watch?v=qdmKGskCyh8
http://quimica.laguia2000.com/general/cromatografia-en-capa-fin

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