Tema 12

TEMA 12.
HERRAMIENTAS Y TÉCNICAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

1.-ORGANISMOS MODELOS
2.-REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
2.1.-Cálculos: “Basic Melting Temperature (Tm)”
2.2.-Temperatura de hibridación: “annealing temperatura”
2.3.-Diseño de cebadores o “primers”
2.4.-Amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE)
3.-CLONAJE DEL DNA
4.-DETECCIÓN DE LAS MOLÉCULAS BIOLÓGICAS: LEY LAMBERT BEER
5.-AISLAMIENTO Y SEPARACIÓN DE LAS MOLÉCULAS BIOLÓGICAS
5.1.-Métodos de extracción de biomoléculas
5.2.-Centrifugación
5.3.-Cromatografía
5.4.-Electroforesis
5.5.-Secuenciacion
6.-DETECCIÓN DE SECUENCIAS DE DNA ESPECIFICAS
6.1.-Enzimas de restricción y electroforesis
6.2.-Southern Blot
6.3.-Hibridación de colonias
6.4.-Hibridación in situ fluorescente (FISH)
6.5.-Northern Blot
7.-TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE EXPRESIÓN / OTROS TEMAS
Craig et al: Molecular Biology
Copyright © Oxford University Press 2015
VOCABULARIO
PCR Correr
Cebador /primers/oligo Electroforesis
Tm Enfoque isoeléctrico (ISF)
Temperatura de hibridación SDS PAGE
RACE Secuenciación
Clonar Análisis BLAST
Enzima de restricción Degradación de Edman
Vector / Plásmido Fenilisotiocianato (PITC)
Espectro de absorción Southern blot
Cromatografía Hibridación de colonias
Eluir FISH
Cargar Northern blot
1.-ORGANISMOS MODELOS
Gran parte de lo que sabemos sobre los sistemas biológicos proviene del
estudio de unas pocas docenas de organismos: organismos modelo. Por lo
general, son pequeños, fáciles y rápidos de cultivar y manipular en el
laboratorio, y se pueden utilizar para investigar preguntas biológicas básicas.
La mayoría de los organismos modelo clave han sido ampliamente estudiados

genéticamente: los estudios de fenotipos mutantes nos dicen mucho sobre los
procesos biológicos.
Diferentes organismos modelo tienen diferentes ventajas. Por ejemplo, las

bacterias son ideales para estudiar la replicación del ADN: es fácil adquirir
grandes cantidades de bacterias, son fáciles de mutar y tienen tiempos de
generación muy cortos
Los procesos eucariotas deben estudiarse en eucariotas. Los procesos

celulares se pueden estudiar más fácilmente en levaduras unicelulares, pero
se utilizan una variedad de organismos más complejos para observar procesos
multicelulares.

Copyright © Oxford University Press 2015 19.1: Model Organisms
▪ Árbol filogenético de algunos organismos modelo de uso común.
▪ El tiempo de divergencia (en millones de años) se muestra en las ramas

Copyright © Oxford University Press 2015 19.1: Model Organisms Figure 19-01
2.-REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
• Polymerase Chain Reaction-Reacción en cadena de la

polimerasa-primero descrita en 1971 por Kleppe & Khorana,
re-descrita y utilizada con éxito en 1985 por Mullis
• Permite la amplificación masiva de una secuencia específica

que tiene un principio y un fin
• Rápida, robusta, adaptable, y simple*
• Muchas aplicaciones
* Casi siempre
A. ¿Por qué amplificar una secuencia específica?
• Para obtener material para clonar y secuenciar,

o realizar estudios in vitro
• Para verificar la identidad de las
construcciones
• Para elucidar la expresión de los genes
• Para diagnosticar una enfermedad genética
• Para revelar la presencia de microorganismos
• Para identificar un individuo
• Etc.….

B. ¿Qué se necesita para hacer una PCR?
1. Un molde de DNA que contiene la secuencia a

amplificar
2. Primers: oligos que definen los extremos de la

secuencia a amplificar
3. DNA polimerasa estable
4. Buffer, dNTPs
5. Termociclador

C. Programa típico de PCR
1. Desnaturalización: desnaturalizar las hebras (94°C durante 2-5 minutos).
2. Hibridación o Annealing: la temperatura por defecto es de 55ºC. Esta

temperatura es variable y es la más crítica para obtener una buena
reacción de PCR. Está es la mejor variable para empezar a optimizar una
reacción de PCR para un set de primers. Las temperaturas de Annealing
pueden bajar hasta 40-45ºC pero las uniones inespecíficas pueden ser un
problema
3. Extensión: generalmente a 72°C, esta es la temperatura óptima para la

mayoría de las DNA polimerasas.
4. Número de ciclos: Depende del número de copias del DNA y la cantidad

de producto de PCR que se quiera. Generalmente 30-35 ciclos es
suficiente.
PCR animation:
Copyright © Oxford University Press 2015 https://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html
2.1.-Cálculos: “Basic Melting Temperature (Tm)”
Hay varias formulas para calcular la Tm de los cebadores

✓ Formula de Marmur (válida)
Tm= (wA+xT) * 2 + (yG+zC) * 4
w,x,y,z son los números de las bases A,T,G,C en la
secuencia respectivamente.
✓ Formula de Wallace (mas precisa)

Tm= 64.9 +41*(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC)
Existen varios programas para calcular la Tm en la red

(http://eu.idtdna.com/calc/analyzer)

2.2.-Temperatura de hibridación: “annealing temperatura”
Tm= 4(G + C) + 2(A + T)ºC
Tª hibridación (annealing)= Tm-(5/10) ºC
➢ Si la Tm de hibridación es demasiado baja se pueden

obtener productos inespecíficos, especialmente a partir de
muestras complejas.
➢ Si es demasiado alta puede no obtenerse producto

http://www.mcb.uct.ac.za/pcroptim.htm
2.3-Diseño de cebadores o “primers”

2.4.-Amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE)
El ARN no se puede clonar directamente, por lo que se

debe hacer una molécula de ADN complementario
(ADNc) utilizando la TRANSCRIPTASA INVERSA
Es posible que no se conozcan los extremos de una

molécula de ARN, como con el splicing alternativo
La amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE)

es un procedimiento de PCR modificado que permite
determinar los extremos de las moléculas de ARN.
En 3 'RACE, un cebador con una región poli (T) (verde) y

una secuencia de elección (rosa) se hibrida en la cola del
ARNm poli (A) (1)
1.La transcripción inversa crea ADNc (2) y la segunda

cadena de ADN se hace por extensión desde un cebador
interno (azul) (3)
2.El cebador interno (azul) y el primer cebador (rosa) se

pueden usar en una PCR estándar (4)

Copyright © Oxford University Press 2015 19.3: Amplification of DNA and RNA Sequences Figure 19-19
En 5 'RACE, un cebador interno (rosa) se extiende por la
polimerasa inversa (1):
1.La terminal transferasa se usa luego para agregar

una cola de poli (A) (2)
2.Luego se elimina el ARN y se agrega un cebador de

poli (T) (3)
3.Los pasos restantes son como en 3 'RACE

Copyright © Oxford University Press 2015 19.3: Amplification of DNA and RNA Sequences Figure 19-19
3.-CLONAJE DEL DNA: INTRODUCCIÓN PARA INGENIERÍA GENÉTICA
CONCEPTOS:
A. CLONAR: OBTENER MUCHAS COPIAS DE UNA SECUENCIA DE INTERÉS
B. SECUENCIA DE INTERÉS: SECUENCIA QUE NECESITO TENER EN GRAN
CANTIDAD PARA FUTUROS ANÁLISIS O GEN DE INTERÉS PARA
EXPRESAR
C. VECTOR: FRAGMENTO AUTORREPLICANTE DE DNA DONDE SE
INTRODUCE EL DNA DE INTERÉS. HAY DE VARIOS TIPOS: EXPRESIÓN O
CLONAJE ETC (OTROS CURSOS)
D. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN: ENZIMAS UTILIZADAS PARA CORTAR EN
SECUENCIAS ESPECÍFICAS Y OBTENER EL FRAGMENTO DESEADO

Copyright © Oxford University Press 2015 19.4: DNA Cloning Figure 19-20
3.-CLONAJE DEL DNA: INTRODUCCIÓN PARA INGENIERÍA GENÉTICA
A.-Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción (RE) son proteínas bacterianas que cortan
secuencias de ADN palindrómicas cortas específicas:
1.Hay cientos de RE, de muchas bacterias diferentes, que tienen diferentes

secuencias de reconocimiento
2.Diferentes RE varían en la secuencia y la longitud de la secuencia de

reconocimiento y si dejan extremos romos (por ejemplo, HpaI), cohesivos en
3'(por ejemplo, KpnI) o cohesivos en 5' (por ejemplo, HindIII)

B.-Vectores
La mayoría de los vectores pueden acomodar fragmentos de
ADN de hasta 15 kb de largo, pero los vectores bacterianos
especiales llamados "cromosomas artificiales bacterianos" (BAC)
pueden tener insertos de cientos de kilobases de longitud
1.El marcador de selección en la mayoría de los plásmidos es

un gen de resistencia a los antibióticos.
2.Algunos vectores pueden crecer en múltiples organismos; estos

se denominan vectores lanzadera. Los vectores de lanzadera
necesitan un origen de replicación para cada organismo en el
que pueden crecer y también a menudo tienen un marcador de
selección diferente para cada organismo

Copyright © Oxford University Press 2015 19.4: DNA Cloning
C.-Transformación bacteriana
E. coli es el organismo más utilizado para la clonación.

4.-DETECCIÓN DE LAS MOLÉCULAS BIOLÓGICAS: LEY DE LAMBERT BEER
Las diferentes moléculas biológicas absorben la radiación
electromagnética de diferentes longitudes de onda. Cada
molécula tiene un espectro de absorción característico.
Estos espectros tienen varios picos y formas, que se
pueden usar para identificar y cuantificar diferentes
moléculas:
1.El ADN y el ARN tienen una absorbancia máxima a ~ 260
nm. Las proteínas tienen absorbancia máxima a ~ 280 nm.
2.El cofactor de nucleótidos flavin adenine dinucleotide
(FAD) tiene picos distintivos a 380 y 450 nm. Las proteínas
unidas a estos cofactores se pueden controlar midiendo
estos picos de absorbancia. Los cofactores que absorben la
luz visible pueden dar color a las proteínas incoloras. Estos
cofactores se llaman cromóforos.

Copyright © Oxford University Press 2015 19.6: Detection of Biological Molecules Figure 19-36
La absorbancia óptica se puede medir usando
un espectrofotómetro.
La luz pasa a través de una muestra líquida

que contiene la muestra de interés. A medida
que el haz de luz pasa a través de la muestra,
la luz se absorbe, por lo que sale menos luz (I)
de la muestra que la que incidió al principio (I0)
Aλ = ε l c
La cantidad de luz absorbida por la muestra es
where:
controlada por:
Aλ= absorbance at a specific 1.La concentración de la molécula de interés.
wavelength, 2.La longitud de la cubeta.
ε = extinction coefficient 3.El coeficiente de extinción de la molécula.
l = path length 4.Esta relación puede ser descrita por la ley de
c = pigment concentration Beer (Aλ = ε l c)
IMPORTANTE: LA ABSORBACIÓN DEBE SER MENOR DE 2,00. EN CASO DE SER
IGUAL O MAYOR A 2 HAY QUE DILUIR LA MUESTRA Y TENER EN CUENTA EL
FACTOR DE DILUCIÓN PARA LOS CÁLCULOS
Las proteínas también se pueden detectar uniéndolas a moléculas específicas
que fluorescen o absorben a longitudes de onda específicas
El ensayo de Bradford se usa comúnmente para cuantificar las

concentraciones de proteínas.
A medida que aumenta la concentración de proteínas, también lo hace el

color azul de la solución. Este color se cuantifica midiendo la absorbancia a
595 nm
Se usa la BSA para hacer una curva patrón

5.-AISLAMIENTO Y SEPARACIÓN DE LAS MOLÉCULAS BIOLÓGICAS
Los experimentos a menudo se realizan en componentes celulares específicos. Estos
componentes se pueden separar aprovechando sus propiedades físicas: masa;
cargar; forma; etiqueta.
5.1.-Métodos de extracción de biomoléculas
(a) Moliendo (b) (c) Pasando células (d) Tratamiento de células

con un Sonicación a través de un con detergente suave
mortero pequeño orificio a que crea pequeños
alta presión agujeros en la membrana
Copyright © Oxford University Press 2015 19.7: Separation and Isolation of Biological Molecules Figure 19-41
5.2.-Centrifugación
Una vez que las células se rompen, los diferentes componentes se pueden
separar mediante centrifugación. Los componentes más pesados sedimentan
más rápido que los componentes ligeros.
Al elegir una velocidad y un tiempo de centrifugación particulares, se pueden

recoger diferentes orgánulos en el fondo del tubo
Hay dos tipos comunes de rotor centrífugo: rotor oscilante (a) y ángulo fijo (b)
La separación de componentes se puede mejorar
utilizando gradientes de azúcar o sal. La
densidad de la solución es mayor en el fondo del
tubo. La velocidad de sedimentación se mide en
unidades de Svedberg (S).
Ejemplo: en un experimento de velocidad de

sedimentación, se mide la velocidad a la que
diferentes componentes se mueven hacia abajo
del gradiente. A medida que las partículas se
mueven hacia abajo por la columna, se mueven
gradualmente más lentamente a medida que
aumenta la concentración de sacarosa
Ejemplo: en un experimento de equilibrio de
densidad, las partículas se mueven hacia abajo en
el gradiente de cloruro de cesio hasta que
alcanzan un punto en el gradiente donde la
densidad de la solución es la misma que la
densidad de la partícula
Nota: estas técnicas son útiles para purificar

orgánulos

5.3.-Cromatografía
Las proteínas se pueden purificar mediante diversos tipos de

cromatografía. Para ello, se pasa una solución de proteína por una columna
que contiene resina. Los diferentes tipos de resina ralentizan el paso de
proteínas al aprovechar las diferentes propiedades de las proteínas: tamaño,
carga e hidrofobicidad.
La solución se pasa a través de diferentes soportes:

✓ Si se hace en columna y a alta presión, lo que aumenta la resolución,
denomina por cromatografía líquida de alta presión (HPLC).
✓ Si se hace en una placa de aluminio o vidrio recubierto por la resina se

denomina cromatografía de capa fina (TLC). Son muy utilizadas las
recubiertas por silice o celulosa. El fondo de una placa se coloca en un
disolvente adecuado. A medida que el solvente sube por la capa
absorbente, se separan sus diferentes componentes dependiendo de sus
propiedades químicas

Copyright © Oxford University Press 2015 19.7: Separation and Isolation of Biological Molecules Figure 19-44a
A.-Cromatografía de exclusión por tamaño
(a). Se utilizan perlas porosas donde:
✓ Las proteínas grandes no pueden entrar en

los poros y, por lo tanto, pasan rápidamente a
través de la columna.
✓ Las proteínas pequeñas pueden entrar en los

poros y se ralentizan a medida que pasan a
través de la columna.

B.-Cromatografía de intercambio iónico (b)
La matriz con perlas cargadas se unen a proteínas que tienen la carga opuesta a las
perlas. La alteración de la concentración de sal de la solución de lavado libera las
proteínas unidas.

Copyright © Oxford University Press 2015 19.7: Separation and Isolation of Biological Molecules Figure 19-44b
C.-Cromatografía de afinidad
Las proteínas también se pueden
aislar usando etiquetas en la :
✓ La etiqueta es una secuencia de

aminoácidos adicional añadida
experimentalmente en el extremo
N o C de la proteína.
✓ La etiqueta se une a una molécula

específica que se incorpora en la
matriz de la columna,
manteniendo la proteína en la
columna.
✓ Para eluir la proteína etiquetada

de la columna, se introduce una
molécula competidora. Esta
molécula se une a la matriz con
más fuerza que la proteína
etiquetada, lo que hace que la
proteína etiquetada se libere
D.-Cromatografía en fase reversa
Los péptidos pequeños se separan en fase reversa. La columna

consta de una matriz que contienen cadenas de alquilo
hidrófobas.
Las moléculas pequeñas forman interacciones hidrófobas con la

matriz y se eluyen al aumentar las concentraciones de solventes
orgánicos.
E.-Cromatografía en fase normal
Solo se utilizan para compuestos muy apolares, no se utilizan ni

para proteínas ni para los ácidos nucleicos

Copyright © Oxford University Press 2015 19.7: Separation and Isolation of Biological Molecules
5.4.-Electroforesis
Las moléculas de ARN y ADN pueden separarse por tamaño usando electroforesis en
gel.
El ARN y el ADN tienen carga negativa, por lo que se moverán hacia el electrodo
positivo cuando se coloquen en un campo eléctrico.
Una matriz de gel hecha de agarosa o poliacrilamida ralentiza el movimiento de las

moléculas. Las moléculas más grandes se mueven más lentamente a través del gel
que las moléculas más pequeñas (b)

Las proteínas se pueden separar por tamaño con electroforesis en gel de
poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE):
1.El SDS se une a las regiones hidrofóbicas de las proteínas,
desnaturalizándolas y dando a las proteínas una carga negativa uniforme. La
desnaturalización completa también requiere la adición de un agente reductor
que rompa los enlaces disulfuro.
2.Los geles de proteínas están formados por dos regiones: un gel
concentrador y el gel de separación.

El gel concentrador es ligeramente ácido y el gel de
resolución es ligeramente básico y ligeramente más denso:
1.Running buffer contiene glicina, Es neutro en el gel

concentrador pero cargado negativamente en el gel de
separación.
2.Este cambio de carga junto con las diferentes concentraciones
en las dos regiones hace que la muestra de proteína se
concentre en una única banda al comienzo del gel de
separación. En el gel de separación las proteínas migran a
diferentes velocidades de acuerdo con el tamaño del péptido.
3.Las proteínas se pueden visualizar con varios métodos
diferentes, incluido el azul de Coomassie o el nitrato de plata

Al cambiar la concentración de agarosa o poliacrilamida, se
puede controlar el tamaño de poro del gel para que se pueda
alterar la velocidad de movimiento a través del gel para
moléculas de diferentes tamaños.
▪ Los geles de poliacrilamida funcionan bien para moléculas

de ácido nucleico entre dos y varios cientos de bases de
longitud
▪ Los geles de agarosa funcionan mejor para ácidos nucleicos

entre varios cientos y 250,000 bases de longitud
▪ El ADN y el ARN se pueden visualizar mediante la adición de

bromuro de etidio o mediante el radiomarcaje de las
moléculas antes de colocarlas en un gel
Copyright © Oxford University Press 2015 19.7: Separation and Isolation of Biological Molecules
Las proteínas se pueden separar en
función de su carga utilizando el
enfoque isoeléctrico (ISF):
a) El punto isoeléctrico de una

proteína es el pH al que una
proteína no tiene carga total.
b) Se construye un gel con un

gradiente de pH.
c) La proteína se mueve hasta que

la carga de la proteína se vuelve
neutral (el punto isoeléctrico)

Copyright © Oxford University Press 2015 19.7: Separation and Isolation of Biological Molecules Figure 19-48a
La electroforesis 2D es una forma útil de
separar proteínas en función del tamaño y
la carga de las proteínas:
a) La muestra se procesa primero en un

gel IEF y luego se procesa en un gel
SDS (b)
b) Los puntos marcados con un círculo

son proteínas individuales que pueden
extraer para su posterior análisis.
c) Estas proteínas solo se pueden

distinguir entre sí después de la
electroforesis 2D, ya que tienen
tamaños similares o cargas similares.
Copyright © Oxford University Press 2015 19.7: Separation and Isolation of Biological Molecules Figure 19-48b&c
5.5.-Secuenciacion La secuencia de ADN se puede determinar
usando secuenciación por didesoxi-nucleótidos
a) Un primer cebador se hibrida a la secuencia

de interés y extensión con ADN polimerasa I
(a).
b) La mezcla de reacción contiene las cuatro
bases desoxi (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) y
una pequeña cantidad de bases didesoxi
(ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada una
marcada con un fluocromo diferente.
c) La extensión se detendrá si se incluye un
didesoxi nucleótido en la cadena ya que no
habrá un grupo 3 'OH disponible en el azúcar.
d) La reacción genera un conjunto de moléculas
de diferentes tamaños, cada una de las
cuales termina en un didesoxinucleótido (b)
Craig et al: Molecular Biology 19.8: Identifying the Composition of

Copyright © Oxford University Press 2015 Figure 19-50 a&b
Biological Molecules
Originalmente, los fragmentos marcados radiactivamente se corrían en geles y se
leían a simple vista (c)
Los métodos actuales utilizan un secuenciador para separar los polinucleótidos

marcados por tamaño con electroforesis en gel capilar y medir el color de cada
fragmento de tamaño con un láser (d)
Los resultados se muestran en un cromatograma (e)

Copyright © Oxford University Press 2015 Figure 19-50 c, d & e
El análisis BLAST se puede usar
para comparar secuencias
▪ En este ejemplo, BLASTP, que

compara secuencias de
proteínas, se usó para comparar
dos transposasas
▪ Cuando se usa BLAST, una

secuencia deseada
(query=consulta) se compara
con una base de datos de
secuencias
▪ Se identifican las secuencias

que tienen similitud con la
consulta (Subject=asunto) y se
les asigna un % de similitud
▪ + indica aminoácidos
similares, pero no idénticos. -
indica huecos de secuencia
Copyright © Oxford University Press 2015 Figure 19-53
Las secuencias de proteínas pueden determinarse por
degradación de Edman. El péptido se fija a un soporte
a través del C-terminal. El aminoácido en el N-terminal
es modificado por fenilisotiocianato (PITC) en
condiciones ligeramente básicas.
✓Este aminoácido modificado se corta por tratamiento
con un ácido suave, liberando un nuevo aminoácido N-
terminal para una segunda ronda de tratamiento con
PITC.
✓El aminoácido modificado liberado se identifica
mediante cromatografía en columna o espectrometría
de masas.
✓Este método está limitado por dos factores:
a)Algunos residuos son resistentes a la modificación por
PITC
b)La capacidad de identificar un aminoácido disminuye
con cada ciclo.

Copyright © Oxford University Press 2015 Figure 19-51
6.-DETECCIÓN DE SECUENCIAS DE DNA ESPECIFICAS
6.1.-Enzimas de restricción y electroforesis
Las enzimas de restricción cortan el ADN en secuencias específicas, cortando

fragmentos de longitud característica que se pueden comparar con fragmentos de
tamaño conocido mediante electroforesis en gel.
Ejemplo: el plásmido (a) proporciona diferentes patrones de digestión cuando se corta

con diferentes enzimas (b): EcoRI (1), AclI (2), AclI con un inserto de 1 kb (3)

Copyright © Oxford University Press 2015 19.9: Detection of Specific DNA Sequences Figure 19-54
6.2.-Southern Blot
Una secuencia de ADN específica dentro de una muestra de ADN se puede identificar
con un análisis de transferencia Southern o Southern Blot:
a) El ADN se corta con endonucleasas de restricción específicas y los diferentes
fragmentos se separan por tamaño con electroforesis en gel.
b) Los fragmentos de ADN se desnaturalizan en álcali y se transfieren a una
membrana.
c) La membrana se incuba con una molécula de ADN monocatenario marcada
radiactivamente (sonda) que tiene una secuencia complementaria al ADN diana o
problema.
d) La sonda se hibrida con cualquier fragmento de ADN que contenga la secuencia
diana. Estos fragmentos pueden identificarse a partir de un autorradiograma
6.3.-Hibridación de colonias
En un procedimiento similar, llamado hibridación de
colonias, se puede identificar un clon específico de una
libreria bacteriana cultivada en placas:
a) Se coloca una membrana de nitrocelulosa en la placa

para que parte de cada colonia se transfiera a la
membrana
b) Las células se lisan y el ADN se desnaturaliza.
c) La membrana se incuba con la sonda como en el

análisis Southern. Se identificarán todas las colonias que
contengan el clon deseado.
d) Debido a que la membrana es una copia de la placa, las

colonias positivas pueden identificarse en comparación
con el autorradiograma y subcultivarse según sea
necesario.
6.4.- Hibridación in situ fluorescente (FISH)
También puede ser útil identificar una secuencia

específica dentro de un cromosoma para
identificar cualquier anomalía cromosómica
asociada con enfermedades específicas. La
hibridación in situ fluorescente (FISH) es el
método utilizado:
a)Las células se fijan a portaobjetos y se incuban
con una sonda de ADN como en el análisis
Southern.
b)Las sondas tienen etiquetas fluorescentes de
colores, no etiquetas radiactivas.
Por ejemplo, en las células sanas, dos secuencias

diana se encuentran en diferentes cromosomas,
pero en un tipo de leucemia, ocurre una
translocación cromosómica (se muestra)

6.5.-Northern Blot
La expresión génica a menudo se controla a nivel de

transcripción, por lo que es útil examinar los niveles de ARN y
detectar si está presente. Se pueden identificar secuencias de
ARN específicas con transferencias de Northern o Northern Blot,
que son similares a las transferencias de Southern
Las transferencias de Northern se realizan de la misma manera

que las transferencias de Southern, pero no es necesario
desnaturalizar el ARN antes de cargar el gel
Copyright © Oxford University Press 2015 19.10: Detection of Specific RNA Molecules Figure 19-61

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HERRAMIENTAS Y TÉCNICAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

La mayoría de los organismos modelo clave han sido ampliamente estudiados

Diferentes organismos modelo tienen diferentes ventajas. Por ejemplo, las

Los procesos eucariotas deben estudiarse en eucariotas. Los procesos

Craig et al: Molecular Biology

▪ El tiempo de divergencia (en millones de años) se muestra en las ramas

• Polymerase Chain Reaction-Reacción en cadena de la

• Permite la amplificación masiva de una secuencia específica

• Rápida, robusta, adaptable, y simple*

• Para obtener material para clonar y secuenciar,

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1. Un molde de DNA que contiene la secuencia a

2. Primers: oligos que definen los extremos de la

3. DNA polimerasa estable

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1. Desnaturalización: desnaturalizar las hebras (94°C durante 2-5 minutos).

2. Hibridación o Annealing: la temperatura por defecto es de 55ºC. Esta

3. Extensión: generalmente a 72°C, esta es la temperatura óptima para la

4. Número de ciclos: Depende del número de copias del DNA y la cantidad

Hay varias formulas para calcular la Tm de los cebadores

✓ Formula de Wallace (mas precisa)

Existen varios programas para calcular la Tm en la red

Craig et al: Molecular Biology

Tm= 4(G + C) + 2(A + T)ºC

Tª hibridación (annealing)= Tm-(5/10) ºC

➢ Si la Tm de hibridación es demasiado baja se pueden

Craig et al: Molecular Biology

Craig et al: Molecular Biology

El ARN no se puede clonar directamente, por lo que se

Es posible que no se conozcan los extremos de una

La amplificación rápida de extremos de ADNc (RACE)

En 3 'RACE, un cebador con una región poli (T) (verde) y

1.La transcripción inversa crea ADNc (2) y la segunda

2.El cebador interno (azul) y el primer cebador (rosa) se

Craig et al: Molecular Biology

1.La terminal transferasa se usa luego para agregar

2.Luego se elimina el ARN y se agrega un cebador de

3.Los pasos restantes son como en 3 'RACE

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A. CLONAR: OBTENER MUCHAS COPIAS DE UNA SECUENCIA DE INTERÉS

B. SECUENCIA DE INTERÉS: SECUENCIA QUE NECESITO TENER EN GRAN

CANTIDAD PARA FUTUROS ANÁLISIS O GEN DE INTERÉS PARA

C. VECTOR: FRAGMENTO AUTORREPLICANTE DE DNA DONDE SE

INTRODUCE EL DNA DE INTERÉS. HAY DE VARIOS TIPOS: EXPRESIÓN O

CLONAJE ETC (OTROS CURSOS)

D. ENZIMAS DE RESTRICCIÓN: ENZIMAS UTILIZADAS PARA CORTAR EN

SECUENCIAS ESPECÍFICAS Y OBTENER EL FRAGMENTO DESEADO

Craig et al: Molecular Biology

1.Hay cientos de RE, de muchas bacterias diferentes, que tienen diferentes

2.Diferentes RE varían en la secuencia y la longitud de la secuencia de

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1.El marcador de selección en la mayoría de los plásmidos es

2.Algunos vectores pueden crecer en múltiples organismos; estos

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La luz pasa a través de una muestra líquida

El ensayo de Bradford se usa comúnmente para cuantificar las

A medida que aumenta la concentración de proteínas, también lo hace el