TEMA 4: HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: Unión de dos moléculas monocatenarias de AN originando una molécula híbrida bicatenaria.

Se utiliza para detectar secuencias concretas o dianas en los AN.

CONCEPTOS FACTORES QUE INFLUYEN EN LA HIBRIDACIÓN (cont.)
Secuencias diana. Secuencia concreta de bases nitrogenadas que se pretende detectar en la muestra problema.  Presencia de agentes desnaturalizantes. La presencia de
Sonda. Secuencia de bases complementaria a la secuencia diana. agentes desnaturalizantes y solventes orgánicos, como el
DIFERENCIAS ENTRE DISTINTAS TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DMSO y la formamida, desestabilizan los puentes de
 Tipo de ácido nucleico a detectar. hidrógeno entre las bases complementarias por lo que se
 Tipo de sonda. requiere menos energía para desnaturalizar los híbridos y la
 Soporte o medio en que se realiza la hibridación (sólido, líquido o in situ). curva de fusión se desplaza hacia la izquierda y disminuye
BASES TEÓRICAS DE LA HIBRIDACIÓN la Tm.
La hibridación se basa en los fenómenos de desnaturalización y renaturalización de las moléculas de ADN.  % de bases no complementarias o mismatch
DESNATURALIZACIÓN Dependiendo de las condiciones de hibridación una sonda
Separación de las dos cadenas por medio de elevación de la Tª o del pH (pH alcalino). se puede unir a su secuencia diana o a secuencias
Curva de fusión del ADN parecidas formando híbridos imperfectos. El porcentaje de
Se mide la absorbancia a 260nm de una molécula bicatenaria de ADN en función de la temperatura obteniéndose una curva de fusión. pares de bases no complementarias del híbrido o mismatch
 Primera zona (zona A). Tramo recto, sin pendiente que equivale al valor basal de absorbancia de la molécula de ADN que depende exclusivamente de la concentración de ADN. No se influye en la Tm: a mayor mismatch menor Tm. La influencia
alcanza una Tª suficiente para romper los puentes de hidrógeno (0% de desnaturalización. del mismatch en la Tm del híbrido es mayor cuanto menor
 Segunda zona (zona B). Se observa aumento de absorbancia a medida que aumenta la Tª, primero lenta (cóncava) y después rápidamente (recta con pendiente elevada). El valor máximo de es la longitud de la sonda. Para sondas de gran tamaño, la
absorbancia corresponde con el 100% de desnaturalización. El efecto de aumento de la absorbancia se denomina efecto hipercrómico. Tm del híbriso disminuye 1ªC por cada 1% de mismatch.
 Tercera zona (zona C). Corresponde con una zona de pendiente prácticamente nula. Aunque se aumente la Tª no aumenta la absorbancia ya que todo el ADN está desnaturalizado. Para sondas pequeñas una única base desapareada puede
Temperatura de fusión o Tm (temperatura de melting) disminuir en varios grados la Tm del híbrido. Este fenómeno
Temperatura a la cual la desnaturalización de una molécula de bicatenaria de ADN es del 50%. En la curva de fusión es la temperatura a la que el valor de absorbancia es la mitad entre el valor justifica el empleo de sondas pequeñas para detectar
basal y el valor máximo. mutaciones puntuales por hibridación.
Para moléculas pequeñas (menos de 500 pb) la Tm aumenta con la longitud. Para moléculas más grande el factor que más influye en la Tm es la proporción de pares GC (a mayor proporción SONDAS
GC mayor Tm).
CARACTERÍSTICAS GENERALES
RENATURALIZACIÓN
 Pueden ser mono o bicatenarias.
Proceso por el que las dos cadenas de una molécula de ADN separadas vuelven a unirse al bajar la Tª. Este fenómeno se caracteriza por la disminución de la absorbancia a 260nm.
Cinética de renaturalización  Pueden se pequeños oligonucleótidos hasta grandes
Cuanto mayor sea el nº de cadenas en la solución (concentración) mayor es la probabilidad de que dos cadenas complementarias se encuentren y, por tanto, mayor velocidad de moléculas de miles de nucleótidos.
renaturalización. La elección de unas u otras depende de:
Una vez que las dos cadenas complementarias se encuentran la reasociación se produce en dos fases:  La especificidad: capacidad para discriminar la secuencia
1. Primera fase o fase de nucleación. Fase lenta en la que se aparean secuencias cortas de bases complementarias. diana con la que tiene que hibridar. Secuencias inferiores a
2. Segunda fase o fase de “cierre en cremallera”. Fase rápida en la que se produce el cierre de las secuencias vecinas originando la doble hélice. 16 bases tienen una probabilidad elevada de hibridar
La velocidad de renaturalización viene determinada por la fase de nucleación C/C0=1/1+k*C0t. Donde C es la concentración de ADN monocatenario en un tiempo t determinado. C0 es la inespecíficamente con dianas repartidas al azar por todo el
concentración inicial a t=0 y k es la constante de reasociación. genoma (baja especificidad).
Curvas de renaturalización. Se representa el % de ADN renaturalizado frente al logaritmo de C0t. Esta curva será diferente en función de la complejidad del ADN y, por tanto, de si el genoma  La sensibilidad: capacidad de distinguir cantidades
es de procariota o de eucariota. mínimas de híbrido sonda-diana. Está relacionado con el
 Curvas de renaturalización de genomas procariotas. Curva sigmoide en la que se puede definir el punto C0t1/2 o punto medio. C0t1/2 es el punto en el que se ha renaturalizado el 50% del ADN nº de marcadores que admite la sonda.
(es mayor cuanto mayor es la complejidad). TIPOS DE SONDAS
 Curvas de renaturalización de genomas eucariotas. Es una curva escalonada debido a que estos genomas tienen tres tipos de secuencias, altamente repetidas, moderadamente repetidas y  De ADN recombinante. Se obtienen mediante un proceso
secuencias únicas (para realizar estas curvas de grandes moléculas, el ADN se fragmenta y, por tanto, hay menor número de fragmentos de secuencias únicas y decenas o cientos de de clonación y amplificación por cultivo:
fragmentos del resto de secuencias. En la curva se observan tres fases correspondientes a: 1. Se inserta en un plásmido bacteriano (vector) el
 Componente rápido. Secuencias altamente repetidas que están en mayor concentración. fragmento de ADN que queremos utilizar como sonda.
2. Se introduce el plásmido recombinante en una
 Componente intermedio. Secuencias moderadamente repetidas que renaturaliza más lentamente porque su concentración es menor que el anterior.
bacteria y se cultiva.
 Componente lento. Correspondiente a las secuencias únicas y cuya concentración es muy baja.
3. Se extrae el plásmido amplificado y se emplea como
Cada parte de la curva correspondiente a cada componente tiene forma sigmoide y pueden estar separados por mesetas o solaparse, según la composición de las moléculas en estudio.
sonda entero o solo el framento de interés separado
Permiten estimar la complejidad global del genoma y la proporción relativa y complejidad media de cada tipo de secuencias.
con enzimas de restricción.
HIBRIDACIÓN
Características.
Los híbridos sonda/secuencia diana desnaturalizan y renaturalizan de la misma manera que una molécula de ADNds.
Son bicatenarias por lo que necesitan desnaturalización
Las sondas usadas suelen reconocer regiones de ADN o ARN de secuencia única (cinética de hibridación similar a la de renaturalización de ADNds de secuencias únicas.
para hibridar.
Curva de fusión, aumentando la Tª, se utilizan soluciones de baja fuerza iónica y se mide la absobancia a 260nm. Es de tipo sigmoide y permite definir la Tm del híbrido que depende de la
Son de gran tamaño (cientos/miles de pb) por lo que:
concentración de CG y no de la concentración pero que puede variar en función de la composición del solvente en el que se efectúa la hibridación.
- Admiten gran nº de moléculas marcadoras, mayor
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA HIBRIDACIÓN
sensibilidad.
 Fuerza iónica. Cuanto mayor es la concentración de cationes monovalentes (rodean los híbridos neutralizando la carga negativa y dismiuye la repulsión electrostática - Gran especificidad.
entre las dos cadenas) en la solución más calor hay que aportar para desnaturalizarlo desplazándose la curva hacia la derecha y aumentando la Tm.
 TEMA 4: HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS (continuación)
SONDAS
TIPOS DE SONDAS (cont.) MARCAJE DE LAS SONDAS Marcaje terminal.
SONDAS DE ADN Es el procedimiento de marcar las sonda utilizada en las Para ADNds o ss de pequeño o mediano tamaño. Marcaje
Son las más utilizadas por la facilidad de obtención de grandes cantidades y ser versátiles en cuanto a tamaño y métodos de técnicas de hibridación. radiactivo, con fluorocromo o con haptenos.
marcaje. Según el proceso de obtención pueden ser. TIPOS DE MARCADORES Marcaje único en el extremo 3’.
 De síntesis química. Se obtienen por condensación química secuencial de los nucleótidos que queremos incorporar. Es un Marcadores para la detección directa del híbrido. La desoxinucleotidil transferasa incorpora un único
proceso automatizado en el que se ancla a una fase sólida el primer nucleótido y se van añadiendo nucleótido a nucleótido  Isótopos radiactivos. marcaje con 32P o el tritio 3H, dideoxinucleótido (nucleótido sin –OH en C 3’) marcado en el
mediante ciclos de reacciones químicas. introduciendo nucleótidos marcado con uno de estos extremo 3’.
Características isótopos. Incorporación de una cola de nucleótidos marcados.
Son monocatenarias, por lo que no requieren desnaturalización. Son sondas muy sensibles pero su uso requiere Se pone una proporción de desoxinucleótidos y
Son pequeñas (<200 nucleótidos) siendo las más habituales de 40-50 nucleótidos, por lo que: instalaciones especiales y personal formado. didesoxinucleótidos marcados. Cuando se incorpora un
- Pueden utilizarse en las técnicas de hibridación in situ (penetran fácilmente en el tejido) sobre todo para detectar ARN. Se utilizan en técnicas de hibridación en filtro (… blot) didesoxinucleótido se detiene la síntesis.
- Baja sensibilidad porque admite un nº reducido de moléculas marcadoras. La detección del híbrido se realiza mediante el revelado de Marcaje por PCR
- Hibridan fácilmente de forma inespecífica por lo que la hibridación se hace en condiciones estrictas. la autorradiografía realizada en película de rayos X. Se utiliza el termociclador con nucleótidos marcados
 PCR. Se amplifica un fragmento mediante PCR  Fluorocromos. Emiten luz al ser excitados por luz UV. radiactivamente o con haptenos para obtener sondas
Características Tradicionalmente se han utilizado derivados de la marcadas por PCR.
Son bicatenarias. fluoresceína y la rodamina, pero actualmente se han Marcaje de sondas de ARN
Tamaño intermedio (cientos de pb). desarrollado multitud de marcadores fluorescentes que se Se obtienen mediante transcripción con una ARN polimerasa.
SONDAS DE ARN (ribosondas) acoplan bien a los nucleótidos sin alterar la especificidad Purificación de la sonda marcada
Menos utilizadas que las de ADN. de la sonda, como cianinas y la familia de Alexa-flúor. Se eliminan los nucleótidos marcados libres para evitar el
Características Se utilizan principalmente para FISH. Para la detección del ruido de fondo o interferencias en las técnicas de hibridación.
Son siempre monocatenarias. híbrido se necesita microscopio de fluorescencia Cromatografía de exclusión por tamaño.
Los híbridos de ADN/ARN son ligeramente más estables que los de ADN/ADN. Marcadores de detección indirecta. En una microcolumna con un gel (por ej., de poliacrilamida)
Son sensibles a ARNasas. Haptenos (digoxigenina y biotina). Moléculas pequeñas que acoplada a un tubo colector eppendorf se carga la mezcla de
Tipos: se acoplan a los nucleótidos y no alteran la especificidad de la reacción y se centrifuga quedando los nucleótidos libres
 De síntesis química. Mismas ventajas e inconvenientes que las de síntesis química de ADN. sonda pero que a diferencia de los fluorocromos se detectan retenidos y las sondas marcadas en el tubo colector.
 Transcripción. Se transcribe un vector que contiene el fragmento de interés a ADNc. Son de tamaño mediano. por métodos indirectos de revelado basados en afinidad Cromatografía de adsorción.
SONDAS QUÍMICAS SINTÉTICAS DE AN química de moléculas o en métodos inmunológicos. En una microcolumna con matriz de lana de vidrio o sílice
Son sondas sintetizadas con modificaciones químicas sintéticas de AN. Se pueden utilizar en casi todas las técnicas de hibridación. acoplada a un tubo colector eppendorf se hace pasar la
 Sondas de ácidos nucleicos peptídicos o PNA. Son oligómeros sintéticos formados por esqueleto de unidades de Su sensibilidad ha sido menor que la de las sondas mezcla de reacción. Mismo principio que en la cromatografía
aminoetil-glicina unidas por enlaces amida. A cada residuo de aminoacil-glicina se le acopla una base nitrogenada acetilada radiactivas, pero actualmente se emplean métodos de de adsorción.
por el grupo acetilo. amplificación de señal que aumentan la sensibilidad. FASES DE LA HIBRIDACIÓN
las sondas PNA hibridan con cadenas de ADN y ARN por medio de puentes de hidrógeno entre bases complementarias. Métodos de marcaje. Preparación de la muestra y soporte (prehibridación)
Características Desplazamiento de mella (Nick translation) Múltiples pasos según la técnica.
No tienen carga eléctrica por lo que: Se usa para marcar sondas de ADNds de gran tamaño y tb Hibridación.
- Los híbridos obtenidos son más estables que los de ADN/ADN o ARN/ARN (Tm más elevada). genomas completos. Máxima eficiencia entre Tm-32 y Tm-16 (Tm-25). Tª prefijadas
- La fuerza iónica del medio no influye en la estabilidad de los híbridos. Se incuba una cantidad de sonda (aprox.1µg) con ADNasa I a estándar 37º, 42º o 65ºC.
No las degrada las polimerasas. bajas concentraciones en presencia de Mg y rompe enlaces Se realiza la ibridación en condiciones relajadas:
Hibridan más rápidamente que las de ADN o ARN. fosfodiester entre nucleótidos al azar de ambas cadenas de la Alta [cationes+] proporcionados por SSC y baja [formamida].
Son muy específicas. sonda (Nick). Con sondas de gran tamaño se forman híbridos imperfectos.
Son mucho menos solubles que las sondas ADN o ARN de similares características y esta solubilidad disminuye con el La ADN polimerasa I repara las mellas eliminando Lavado de poshibridación.
tamaño por lo que no suelen sobrepasar las 30 bases. (exonucleasa) y poniendo (polimerasa) nucleótidos en sentido Para eliminar híbridos imperfectos se usan condiciones de
Solo se pueden obtener por síntesis química. 5’-3’ utilizando uno de los nucleótidos marcados. rigurosidad (stirngency), Tm-X. Cuanto menor sea X mayor
Se utilizan en hibridación in situ. Cebado al azar o cebado aleatorio (random priming). rigurosidad (X<15 disminuye sensibilidad).
 Sondas de ácidos nucleicos bloqueados o LNA Para sondas de ADN bicatenario de gran tamaño o genomas En ocasiones es necesario mantener cierto grado de
Son oligómeros sintéticos de ribonucleótidos en los que se han modificado químicamente algunas ribosas mediante la completos marcados con isótopos radiactivas o haptenos. mismatch, condiciones de rigurosidad relajadas.
formación de un puente de hidrógeno entre el carbono 2’ y el carbono 4’. Desnaturalizamos la sonda y usamos hexámeros de todos Detección del híbrido.
Características los oligonucleótidos posibles como cebadores que se van a Marcaje radiactivo. Autorradiografía. Positivo: marcas
Presentan mayor sensibilidad y especificidad que su contrapartida de ARN sin modificar. unir al azar en distintas zonas de ambas cadenas. Con la oscuras.
Se obtienen solo por síntesis química. ADN polimerasa I, fragmento Klenow (actividad polimerasa Fluorocromos. Microscopio de fluorescencia.
Son de pequeño tamaño y se usan principalmente en técnicas de hibridación in situ. 5’-3’ sin actividad exonucleasa) se sintetiza la cadena de Haptenos. Métodos inmunohistoquímicos con un Ac
ADN complementaria incorporando uno de los nucleótidos antihapteno marcado con fluorocromo. Con enzima que
marcado. produce un producto coloreado.