UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES

Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales

Cátedra de Biología Celular y Molecular (Bqca)
Módulo de Bioquímica y Farmacia.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Fundamento teórico

La reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica que ha revolucionado el

modo de manipular, clonar y detectar fragmentos de DNA, lo que le ha valido a su
descubridor K.B. Mullis el Premio Nobel, trabajando para la Cetus Corporation.
Después de su descubrimiento en 1983, se ha convertido en una de las técnicas básicas
de Biología Molecular, ampliamente utilizada debido a su rapidez, especificidad,
flexibilidad y aplicabilidad, y sobre todo porque no es necesario contar con DNA
extremadamente puro para amplificar. Entre sus aplicaciones generales encontramos la
generación de sondas, clonación, secuenciación, diagnóstico clínico y tipificación de
individuos y microorganismos, siendo entonces muy utilizada en medicina forense y
en estudios filogenéticos.
La PCR parte de la premisa de que el DNA bicatenario puede desnaturalizarse, de
manera que en cada una de sus hebras pueden alinearse unos oligonucleótidos
diseñados para ser complementarios a porciones de cada una de las cadenas. Cuando
éstos oligonucléotidos se sitúan en extremos opuestos de una región particular, pueden
servir como cebadores para una DNA polimerasa, lo que permite formar una porción
de DNA bicatenario definida por éstos dos cebadores, también denominados “primers”.
La repetición de los ciclos de desnaturalización (ó “melting” en inglés), alineamiento
(hibridación o “annealing” en inglés) y polimerización es capaz de producir cantidades
crecientes del producto, resultando una amplificación de órden exponencial de la
secuencia enmarcada por los cebadores. Por lo tanto, bastaría una cantidad muy
pequeña de DNA molde para obtener una gran masa de copias de la región
seleccionada luego de la PCR. El número de copias de dicha región seleccionada
(amplicones) se puede estimar según:

N= N0 x (1-R)c

donde N es el número de copias obtenidas

No es el número de copias que se han depositado en la reacción inicialmente
R es el rendimiento de cada ciclo expresado en tanto por uno (normalmente debe
oscilar entre 0,7 y 0,85)
c es el número de ciclos.

Un ciclo de PCR comienza con un calentamiento inicial que desnaturaliza el DNA

objetivo o blanco (“target”) a 94 - 95ºC o más. Éste primer paso del ciclo dura entre 15
segundos y 2 minutos. En el proceso de desnaturalización, las dos cadenas del DNA se
separan una de la otra y permiten que la matríz (“template”) se encuentre como cadena
simple, necesario para las actividades llevadas a cabo por la polimerasa termoestable
durante los pasos de amplificación.
En el siguiente paso del ciclo, la temperatura se reduce a un valor que oscila en el
rango de los 40ºC a los 60ºC. A ésta temperatura, cada uno de los oligonucléotidos
(“primers”) hibridan (“anneal”) con la secuencia complementaria en cada una de las
cadenas simples de DNA, que se han separado en el paso anterior, y sirven como
cebadores para la síntesis, utilizando una polimerasa termoestable.
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La síntesis de DNA se inicia cuando la temperatura de la reacción llega al valor óptimo

para la actividad de la polimerasa. Para la mayoría de las polimerasas ésta temperatura
se encuentra en, aproximadamente, los 72ºC. Luego se permite la síntesis durante uno
o dos minutos. Éste paso completa UN CICLO, y el SIGUIENTE CICLO se inicia con
el retorno a los 94-95ºC para la desnaturalización.
La cantidad de amplificado resultante va a depender de la disponibilidad de sustrato
para la reacción. Por eso, los oligonucléotidos (“primers”) y los desoxirribonucleótidos
trifosforilados (dNTP’s) se añaden en exceso respecto al DNA a amplificar. Como es
fácil inferir, la concentración de DNA, oligonucleótidos, desoxirribonucleótidos y DNA
polimerasa activa disminuyen después de cada ciclo debido a la síntesis que se está
produciendo, por lo que la reacción llega a un máximo de amplificación, luego del cual
el rendimiento y el número de copias obtenidas no aumentan. A esto se lo conoce como
el efecto “Platteau”.
Inicialmente se utilizaron DNA polimerasas que no eran estables a altas temperaturas y
se desnaturalizaban junto al DNA, haciendo necesario añadir nueva enzima tras cada
ciclo. La aparición de DNA polimerasa termoestables ha facilitado en gran medida la
metodología gracias a su estabilidad para resistir los repetidos ciclos a altas
temperaturas necesarios para desnaturalizar el DNA.
Una PCR ideal debería ser altamente específica, fiel y de gran rendimiento. Cada uno
de éstos parámetros está influido por varios componentes de la propia reacción por lo
que ajustando las condiciones para la máxima especificidad no se obtiene buen
rendimiento, u optimizando para la fidelidad no se obtiene buena eficiencia. En
consecuencia, cada vez que se optimiza una PCR hay que tener en cuenta cual de éstas
características es la que más interesa.
Aunque el concepto de la PCR es simple, el desarrollo de una reacción exitosa depende
de un número de factores. Algunos de ellos son:

a) Diseño de los oligonucleótidos (“primers”): un prerrequisito esencial para una

reacción exitosa es el diseño de pares óptimos de “primers”. En el diseño de los
mismos algunas reglas se han demostrado como útiles, por ejemplo:
I. Cada “primer” individual debe contar con 18 a 24 bases. Primers de mayor
longitud se desempeñan de modo similar comparados con primers más cortos.
II. Los dos “primers” del par deben tener temperaturas de fusión (Tm) cercanos,
dentro de los 5ºC.
III. Se debe mantener un contenido de G:C (guanina : citosina) entre 40 y 60% (o sea
4 a 6 bases de cada 10 que forman cada uno de los oligonucleótidos del par deben
ser guaninas o citosinas)
IV. La secuencia de los “primers” individuales debe iniciarse y terminarse con 1 ó 2
bases púricas

b) Concentración de Magnesio: en ausencia de concentraciones adecuadas del ión Mg ++

libre, la DNA polimerasa es inactiva. Por lo tanto, la concentración de magnesio es un
factor crucial que afecta el desarrollo de la PCR. Muchos de los componentes de la
reacción unen magnesio, incluyendo la matríz de DNA, agentes quelantes presentes en
la muestra (EDTA ó citrato), dNTP’s y proteínas. Como resultado se puede ver
afectada la cantidad de magnesio libre presente en la reacción. Por otro lado, el exceso
de magnesio disminuye la fidelidad de la enzima y puede incrementar el nivel de
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amplificación no específica. Por lo tanto, para cada reacción de PCR se deben optimizar
las concentraciones de Cl2Mg.

c) Elección de la enzima: la elección de la enzima correcta para ser usada en la PCR

depende de varios factores, pero por razones de automatización es preferible usar las
termoestables. Sin embargo, no todas ellas son igualmente eficaces a la hora de
amplificar. Taq no posee la actividad correctora 3’-5’ con lo que se tasa de error es del
órden de 10-4 errores por par de bases incorporada, Vent del órden de 10 -5 y Pfu del
órden de10-7, siempre considerando que una polimerasa normal tiene una tasa de error
de 10-6 errores por par de bases incorporada.

d) Molde de DNA: tendremos que cuantificar el DNA para conocer la masa de ácidos
nucleicos disuelta, además de tener indicios acerca de su pureza.
Varios autores indican la cantidad de matríz de DNA a agregar a la reacción,
expresándola en micro, nano o picogramos.

e) Termocicladores: se hallan disponibles un gran número y cantidad de modelos de

termocicladores y también de tubos para PCR. Sin embargo, todos los termocicladores
se caracterizan por poseer un bloque metálico, que se calienta ó enfría, alcanzado
temperaturas que son controladas por un programa de computación y determinadas
por un sensor que las regula y mantiene de acuerdo al programa. Pero a pesar de todo,
los diferentes termocicladores tienden a obtener y mantener temperaturas de un modo
levemente diferente, por lo que los resultados de la reacción pueden llegar a variar
levemente. Por ello es necesario apropiar los programas de ciclado a nuestros propios
“primers” y condiciones. Actualmente contamos con tubos delgado de 0,2 mL cuya
forma y estrechez de pared, permiten un contacto perfecto entre los tubos y el bloque
metálico del termociclador. Recordemos que el intercambio no uniforme de calor entre
el termociclador y el tubo de PCR puede provocar significativas variaciones en la
amplificación.
Con todo, las condiciones óptimas de la PCR siempre acaban por determinarse
empíricamente.

Objetivo: Familiarizar al alumno con una de las técnicas más poderosas de la Biología
Molecular actualmente, comprendiendo sus ventajas y limitaciones.

Equipamiento:
Termociclador
Tubos para PCR nuevos o esterilizados
Micropipetas automáticas
Puntas (“tips”) azules y amarillas nuevas o esterilizadas
Puntas “cristal”
Recipiente conteniendo hielo

Reactivos
Tampón de PCR conteniendo KCl 10 veces concentrado (“10 X”)
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Solución de MgCl2 100 mM

Taq polimerasa 0,5 U
Par de oligonucleótidos ó “primers”(preparados según
indicaciones del fabricante)
Solución de dNTP’s (desoxirribonucléotidos) concentración 200
uM ó 2 mM
Agua destilada esterilizada

PROTOCOLO

Es sumamente importante recordar que es ABSOLUTAMENTE necesario…….

Colocarse guantes antes de iniciar la práctica. Recodemos la presencia de DNAsas y

RNAsas, tanto en el ambiente, como en las manos del operador. Además se debe tratar
imperiosamente de evitar la contaminación cruzada de ácidos nucleicos, por ello
generalmente la extracción de DNA se realiza en un cuarto separado al lugar en el que
se encuentra el termociclador, y donde se llevan adelante reacciones de PCR.

CÁLCULO DE LA MASTER MIX

Cuando se realizan reacciones de PCR, se parte de una solución que contiene todos los
elementos que requiere la Polimerasa para sintetizar el DNA, excepto el DNA matríz, o
sea el “blanco” o “target” de amplificación. Por ello se parte de una solución que
contiene un buffer, MgCl2 (que es el cofactor de la enzima), el par de “primers”, dNTP’s
en exceso y la enzima Taq polimerasa. Luego de tener lista ésta “Master Mix”
(MEZCLA MAESTRA) se reparten en los tubos correpondientes el DNA matríz y se le
adiciona la Master Mix, para luego llevarlos al termociclador.

Antes de preparar la Master Mix……

Para preparar la “Master Mix” tenemos que conocer EL VOLUMEN FINAL DE

REACCIÓN que deseamos. Normalmente, las reacciones de PCR se llevan adelante
en un volumen final de 50 a 25 ul, pero pueden elegirse volúmenes finales menores.
EL EJEMPLO QUE VAMOS A BRINDAR CORRESPONDE A UNA REACCIÓN DE
PCR DE 25 μL DE VOLUMEN FINAL.

Componentes de la Master Mix

Buffer de PCR: es una solución que contiene KCl y en también un detergente. Como
imaginamos el buffer cumple la función de estabilizar el pH en el volumen de la
reacción, pero también ayuda a disminuir la contaminación exógena, debido a la
presencia del detergente.
Ésta solución es provista por el fabricante de las enzimas recombinantes, y suele venir
en un valor de concentración que se representa por X (equis; que en este caso significa
“VECES”). Así un buffer que es enviado con la Taq polimerasa, y en cuya etiqueta
leemos “10 X”, es un buffer 10 veces concentrado respecto a la concentración final que
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requerimos en la reacción. LA CONCENTRACIÓN FINAL DE BUFFER EN EL

VOLUMEN DE LA REACCIÓN ES SIEMPRE “1 X”. Si nuestra PCR tiene un
volumen final de 25 ul, nuestra Master Mix contendrá 2,5 μl de buffer por cada
reacción. (o sea es diluir 10 veces el buffer en el volumen de reacción de PCR, para que
su concentración sea de “1 X”)

MgCl2: la solución de MgCl2 también suele ser provista por el fabricante. Como se
desprende de la discusión teórica, la concentración de Mg ++ es una variable importante,
y debe determinarse empíricamente.
Por otro lado, la solución recibida se halla en una dada concentración, así que debemos
calcular el volumen a utilizar.
En nuestro ejemplo, se llevará adelante una PCR donde se requiere un valor de 1 mM
de concentración de Mg++ por reacción, en tanto que el fabricante nos ha enviado un
vial conteniendo 1 ml de una solución 25 mM de Cl 2Mg. Si nuestro volumen final de
reacción es 25 ul, tenemos que agregar 1 μl de dicha solución a nuestra Master Mix por
cada reacción.

Primers: para obtener la secuencia sintética deseada de los primers, debemos solicitarla
a casas comerciales, las cuales nos proveerán los oligonucléotidos liofilizados en un
vial. Junto a los oligos se adjunta una cartilla donde constan las características de los
mismos, como Tm, peso molecular, etc. Además, el fabricante indica cual es el volumen
de agua destilada estéril o solución de Tris-HCl/EDTA (TE) que debemos agregar para
alcanzar una determinada concentración.
En éste ejemplo imaginaremos que el fabricante nos indica que debemos agregar 655.5
μl de agua, para obtener una concentración de 100uM de primers.
Una vez que los primers son reconstituidos, deben ser almacenados a -20ºC. Como
luego de la reconstitución, la concentración alcanzada es elevada, suele guardarse un
stock, en tanto que se utilizan diluciones del mismo.
Recordemos que no es conveniente congelar y descongelar los primers demasiadas
veces. Es mejor alicuotar la solución concentrada y luego elegir una alícuota y realizar las
diluciones, para evitar el descongelado frecuente.

Taq polimerasa: cuando adquirimos la Taq polimerasa, el fabricante indica el número

de unidades. Al ser una enzima no hablamos de concentración sino de actividad,
siendo ésta indicada en UNIDADES DE ACTIVIDAD/LITRO (U/l). Para el caso de la
Taq polimerasa, la definición de unidad es la siguiente: “Una UNIDAD de enzima
cataliza la incorporación de 10 nanomoles de desoxirribonucleótidos a una fracción
polinucleotídica (adsorbida a una columna) en 30 minutos a 70ºC”.
Recordemos que para el caso de la medición de actividad enzimática es sumamente
importante indicar la temperatura a la que se lleva a cabo dicha medición, ya que los
valores varían de modo importante ante variaciones de temperatura.
La Taq polimerasa es provista en un vial conteniendo glicerol, que evita que se congele
pero también vuelve más densa a la solución, por lo que tendremos que tener la
precaución de observar que levantemos el volumen requerido de solución al pipetear.
El número de unidades de Taq polimerasa a utilizar también termina siendo una
variable que se debe ajustar. En general se recomienda utilizar 1 ó 2 unidades por
reacción de PCR. Sin embargo en volúmenes finales menores podemos utilizar menor
número de unidades de polimerasa ya que el exceso de enzima no asegura un aumento
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de rendimiento y por otro lado un exceso importante puede llevar a un aumento en la

frecuencia de presentación de artefactos.
En nuestro ejemplo (de volumen final igual a 25 ul) utilizaremos 0,5 Unidades. Si el
vial comprado indica “5U/ul”, para alcanzar 0,5 Unidades en 25 ul, debemos agregar
0,1 μl por reacción de PCR.

Matríz de DNA: la amplificación exitosa de la región de interés depende de la cantidad

y calidad del DNA molde. El DNA aislado debe estar libre de inhibidores potenciales
de polimerasas de DNA. Frecuentemente los inhibidores suelen estar representados
por reactivos utilizados en la purificación de DNA como solventes orgánicos,
proteasas, SDS y otros.
Como indicamos anteriormente, la cantidad de matríz de DNA que tenemos que
agregar a la reacción es una variable, que tendremos que optimizar. Sin embargo, los
autores recomiendan una cantidad de matríz. Ésta cantidad suele ser citada en masa
(por ejemplo microgramos, picogramos o nanogramos), por ello es necesario saber la
masa de DNA en el volumen de aislado.
Supongamos que luego de cuantificar el DNA obtenemos una concentración de 1
ug/ul. Por otra parte, un autor asegura que, utilizando los mismos primers y al mismo
volumen final que nosotros, lleva adelante una reacción de PCR con excelente
rendimiento utilizando 1 ug de DNA. Para basarnos en la idea de dicho autor,
debemos agregar 1 μl de la solución cuantificada de DNA (ya que contiene 1 ug de
DNA por cada μl de solución). Un cálculo tan sencillo como éste puede ser utilizado en
todas las ocasiones.
Eventualmente tendremos que tener en cuenta la cantidad de matríz de acuerdo al
volumen final deseado, pero como indicamos antes, usualmente la cantidad de DNA
que debe agregarse a una reacción de PCR suele determinarse empíricamente.

Agua: para conocer el volumen de agua que tendremos que agregar tenemos que tener
presente la siguiente información:
 Tener cuantificado el DNA aislado.
 Conocer el volumen final de la reacción de PCR

La cantidad de agua a agregar a la Master Mix surge según:

(volumen final de reacción X número de reacciones) - (vol de buffer + vol de Cl2Mg

+ vol de dNTP’s + vol de “primers” + vol de Taq polimerasa + vol de DNA molde) =
vol de agua destilada estèril a agregar a la master mix.
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Pasaremos ahora a imaginar un caso ABSOLUTAMENTE FICTICIO, pero muy

demostrativo…..

En un publicitado film, que se desarrolla en la ciudad de Los Ángeles, John Constatine

es un hombre que tiene el (no muy envidiable) “don” de poder ver a los demonios que
habitan en ésta Tierra en donde, según el argumento de la película, Dios y Lucifer se
juegan a la Humanidad como premio. Como ni Dios ni Lúcifer pueden intervenir
directamente, debido a su “Pacto de Equilibrio” sólo pueden influenciar a las personas
a que tomen un camino, a través de mensajeros “híbridos” que son mitad ángel y
mitad humanos, o bien mitad demonios y mitad humanos. Cuando alguno de estos
“rompe el Pacto de Equilibrio”, John Constantine debe enviarlos de nuevo al Cielo o al
Infierno. El problema es que él mismo, no es recibido ni el Estado Celestial, ni tampoco
en el Reino de las Sombras Infernales, debido a que actúa como Mediador. Debido a
esto, John Constantine lo contrata a Usted ya que ha recibido muy buenas referencias y
sabe que se ha formado en Biología Molecular. Él le comenta la situación y cree que el
problema por el que no puede ir al Cielo (o al Infierno) se encuentra en su genoma.
Después de que Ud. cavila un rato (imaginando lo descabellado de lo que acaba de oír)
decide ayudarlo. (Por supuesto que del tema dinero se ha hablado
profuuuuundamente!!). Como Ud. investiga para la “Equilibrium Pact Corporation”
tiene disponible un lindo laboratorio de Biología Molecular……
Por otro lado una página de Internet (de investigadores pertenecientes a una religión
muy devota) acaba de publicar el “PROYECTO GENÓMA HÍBRIDO ANGELICAL”,
donde consta la secuencia de un individuo “híbrido” mitad humano, mitad ángel.

-¿Qué puedo hacer?- se pregunta Usted…..

a) enviarlo a la clínica psiquiátrica de su amigo

(“porque este hombre esta re-loquito!!”).
b) intentar secuenciar su genoma y compararlo
con el publicado en la página anterior.
c) buscar bibliografía por Internet.

Como no se decide por nada, va a una Iglesia a rezar un rato y mientras lo hace se
percata de que a su lado se encuentran varias plumas de ala de ángel!!! Y con tanta
suerte, que se hallan adheridas varia células de “híbrido” angelical!!!! Luego de
felicitarse por su buena estrella, se decide a buscar información en Internet.
Allí consta que varios Mediadores anteriores, tenían una extraña mutación en el locus
5q 21 (o sea un locus ubicado en el brazo largo del cromosoma 5, y en la subregión 21)
que los inhabilita para salir de la Tierra e irse al Cielo (o al Infierno). Luego de entrar a
bases de datos internacionales y de hallar bibliografía, Ud. encuentra que se trata de
una secuencia minisatélite.
¿ Que podría hacer con una cuantas células de “híbrido” angelical para ayudar a
Constantine?
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a) congelarlas en nitrógeno líquido para que no se pierdan y dedicarse a estudiar

y recibirse de, por ejemplo, periodista de historias de ciencia ficción.
b) Provocar mutaciones en las células para diseñar una línea de cultivo celular, a
través de la inmortalización de las células, aunque le puede llevar algunas
décadas obtenerla.
c) Aislar el DNA de “híbrido angelical”, amplificar el locus 5q.21 y compararlo
con el de John Constantine para conocer la posible mutación que lo afecta

Sin dudarlo, elige la última opción por lo que posteriormente, utilizando un programa
de diseño informático de primers, disponible gratuito en Internet (por ejemplo el
programa Primer 3, www. ) obtiene un par de primers cuyas secuencias se
consignan:
Primer izquierdo: GTA GTT TGG CAT TAT TCC AGG G
Primer derecho: TGA TCT TGC CTC ACC CAT C

A través de Internet se pone en contacto con el representante de “LA Hibrid

Corporation”, que le vende un vial liofilizado incluyendo una carta descriptiva de los
mismos. Allí le indica que debe agregarle 655.5 μl al liofilizado de primer izquierdo y
539.6 μl al del primer derecho de tampón TE 1 (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA pH
8), para obtener una concentración de 100 μM de primers.

También compra Taq polimerasa a “Darkness Technologies”, y le llega un vial de 500

Unidades (5 unidades por μl). Además se incluye el buffer de PCR 10X conteniendo
KCl y 1 mL de una solución de Cl2Mg 25 mM.

Por otra parte compra el set de desoxirribonucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) y
los prepara según su necesidad. El fabricante (“HELL Molecules for Life Enterprises”), le
indica que se entregan 4 viales conteniendo cada uno de los dNTP’s por separado en
un volumen de 250 μl y en una concentración de 100 mM de cada uno de los mismos.

Si debe realizar 20 reacciones de PCR debe recordar que siempre se deben largar
controles (positivos, negativos ó ambos). Por eso decide trabajar con 18 muestras de
DNA obtenidas de diversos humanos y la muestra de Constantine, o sea, 19 muestras
en total más un control negativo.

De su bibliografía, el autor que Ud. habitualmente sigue le indica lo siguiente: “Para

una amplificación exitosa de la región 5q.21 se requiere buffer de PCR 1 X, 1 ug de DNA, 1
mM de Cl2Mg, 200 mM de solución de dNTP’s, 10 picomoles de primers, 0,5 unidades
de Taq polimerasa, para un volumen final de reacción de 25 μl por PCR”.

De todo lo indicado anteriormente Ud calculará la Master Mix así:

25 μl de volumen final de reacción X 20 reacciones = 500 μl de Master mix.

Además realizará el cálculo para cada uno de los componentes de la Master Mix:
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a) Tampón de PCR: como está 10 veces concentrado, debemos diluirlo 10 veces. Así
tendremos que agregar 50 μl del tampón 10 veces concentrado, a 500 μl de volumen
final, para obtener tampón 1 vez concentrado (1X) en la Master Mix.

b) Cl2Mg: su vial tiene una concentración de 25 mM y Ud desea que en cada reacción

vayan iones Mg++ en una concentración 1 mM.

Cuando nos encontramos frente a cálculos en los que deseamos saber cuanto
tenemos que tomar de una Solución Madre (volumen inicial), más concentrada
(concentración inicial), para diluirla (volumen final) a una determinada
concentración (concentración final) nos valemos de lo siguiente:

CONCENTRACIÓN INICIAL x VOLUMEN INICIAL = CONCENTRACIÓN FINAL x VOLUMEN FINAL

Ci x Vi = Cf x Vf

En éste ejemplo se procede según:

Concentración inicial= 25 mM
Volumen inicial = ¿? (es lo que tengo que tomar del vial provisto para luego diluirlo en
la Master Mix)
Concentración final = 1 mM (que es el valor de concentración que indica el autor)
volumen final = 500 μl (que es el volumen final de la Master Mix) (también podría
colocar el volumen final de la reacción de PCR que es 25 ul, pero luego habría que
multiplicar por 20 que es número de reacciones que se llevan adelante en éste
ejemplo)

Ci = 1 mM x 500 μl = 20 ul
25 mM

Del cálculo obtenemos que el volumen que debemos tomar de la solución provista por
el fabricante es 20 μl que serán adicionados a la Master Mix.

c) dNTP’s:

ANTES DEBEMOS VER LA PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN DE dNTP’S

Viales entregados = 4 (uno por cada dNTP)

Volumen de cada vial = 250 μl
Concentración de cada vial = 100 mM.
Éste cálculo se inicia “al revés”, por lo que tendremos dos cálculos . En el primero
nuevamente aplica la misma ecuación

Ci x Vi = Cf x Vf. ( La variable a calcular es Ci)

La explicación es la siguiente:
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Ci = representa cuan concentrada se debe preparar la disolución de los viales

adquiridos, para que al agregarle V i microlitros (decidido deliberadamente como 2 μl,
pero puede ser cualquier otro volúmen), obtengamos un valor C f de concentración (200
mM) en un volumen final de reacción Vf (25 μl).
Vi = representa cual es el volumen que tiene que agregar de la solución preparada de
dNTP’s a la Master Mix y es una variable que Ud puede decidir. Debe ser un volumen
fácil de medir, con relativamente poco error, por ejemplo 2 μl.
Cf = es la concentración dada por el autor al que sigue. En éste caso es 200 μM
Vf = es el volumen final de cada reacción de PCR (en éste caso 25 μl)

Del cálculo surge:

Ci = 200 μM x 25 μl = 2500 μM = 2,5 mM

2 μl

Entonces ahora sí podemos calcular cual es el volumen que tenemos que tomar a partir
del vial enviado:

Ci x Vi = Cf x Vf. ( La variable a calcular ahora es Vi)

Ci = representa la concentración a la que se adquieren los viales (en éste caso 100 mM)
Vi = representa cual es el volumen que tiene que tomar de los viales para obtener una
concentración Cf (en éste caso 2,5 mM, que fue obtenida con el cálculo anterior) en un
volumen Vf
Cf = es la concentración dada a la que se encontrará la disolución. En éste caso es de 2,5
mM y fue obtenida a partir del cálculo anterior.
Vf = es el volumen final de solución que deseamos preparar. Es un volumen que
nosotros decidimos, en éste caso será 250 μl.

Del cálculo surge:

Ci = 2,5 mM x 250 μl = 6,25 μl

100 mM

Esto significa que debemos agregar aproximadamente 7 μl de cada uno de los dNTP’s
(6,25 μl), es decir, 7μl de dCTP, 7 μl de dATP, 7 μl de dGTP y 7 μl de dTTP y 222 μl de
agua destilada estéril.
Como nosotros decimos que habíamos de pipetear 2 μl de ésta solución, y son 20
reacciones de PCR las que se llevan adelante, se deberán agregar 40 μl de dicha
disolución a la Master Mix.

d) Taq polimerasa:
Contenido del vial = 500 Unidades (5 unidades por μl).
Va a utilizar = 0,5 unidades

5U 1 μl
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0,5 U X = 0,1 μl
Si tiene 5 Unidades en 1 μl, entonces tiene 0,5 unidades en 0,1 μl. Como llevará
adelante 20 reacciones de PCR, deberá multiplicar 0,1 por 20, o sea agregará 2 μl a la
Master Mix.

e) Primers:
Éste es el cálculo para la situación de uno de los primers. Es análogo para el otro:

Según el fabricante, si agrega 655,5 μl de agua destilada estéril al liofilizado de primer

izquierdo se obtiene una concentración de 100 μM. Entonces tendrá 100 micromoles de
primer por cada litro de solución. Una concentración de 100 μM significa 100
micromoles por litro de solución. En un litro (1000 mililitros) hay 1 x 106 microlitros

En 1x106 microlitros (1 lt) hay 100 micromoles

En 655.5 microlitros (agregados según el fabricante) X = 0,0655 micromoles

Entonces tiene 0,0655 micromoles X 1x106 picomoles = 65.550 picomoles (masa)

1 micromol

Supongamos que desea pipetear 1 μl y que en ése volumen tenga 10 picomoles de

primers, eso significa una concentración de 10 picomoles por microlitro de solución,
que es equivalente a una concentración de 10 μM.

65. 550 picomoles X (1x106) μl X 1 μmoles = 100 μM (concentración)

655.5 μl 1 lt 1x106 picomoles

10 picomoles X (1x106) μl X 1 μmoles = 10 μM

1 μl 1 lt 1x106 picomoles

Conociendo todo esto puede aplicar la fórmula:

Ci x Vi = Cf x Vf ( La variable a calcular ahora es Vi)

Vi = 10 μM x 200 μl = 20 μl
100 μM

Ci = es la concentración inicial alcanzada tras reconstituir los primers según

indicaciones del fabricante, es decir 100 μM (obtenida luego de agregar 655.5 μl de
agua destilada estéril).
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Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales
Cátedra de Biología Celular y Molecular (Bqca)
Módulo de Bioquímica y Farmacia.

Vi = es el volumen que tenemos que agregar de la solución reconstituida de primers,

para alcanzar una concentración Cf en un volumen final, V f. Es la variable que
calculamos y en éste caso resultó 20 μl
Cf = es la concentración final que deseamos alcanzar. Según nuestros autores
necesitábamos una concentración de 10 μM (que es equivalente, según vimos
anteriormente, a tener 10 picomoles en 1 μl de solución reconstituida y diluida a V f).
Vf = es el volumen final de solución que decidimos deliberadamente preparar. En éste
caso se preparó 200 μl, pero se pueden preparar otros volúmenes.

En conclusión, luego de reconstituir los primers tenemos una “Solución Madre” (de
concentración 100 μM y volumen de 655.5 μl, preparada según el fabricante), a la que diluimos
convenientemente (por ejemplo para que contenga 10 picomoles en 1 μl), para que pipeteando
un volumen que nosotros queremos (1 μl) entreguemos a la Master Mix, la cantidad adecuada
de primers, según las indicaciones del autor que seguimos.
Entonces vamos a pipetear 1 μl de solución diluida por cada reacción, como realizamos 20
reacciones, deberemos agregar 20 μl de dicha solución a la Master Mix.

f) DNA molde: como cuantificó su DNA, Ud tiene un concentración de 1 μg/μl. Según

su autor, debe utilizar 1 μg de DNA, así que agregará 1 μl a cada uno de sus tubos, lo
que le resta 20 μl al volumen total de Master Mix.

En suma….luego de tantos cálculos (y sin ayuda divina!!) finalmente obtiene su

Master Mix:

Master Mix (para 20 reacciones; 19 muestras y un control negativo)

(Volumen final de cada reacción de PCR = 25 μl)

Tampón de PCR 10 X 50 μl (1X)

MgCl2 20 μl (1mM)
dNTP’s 40 μl (200 mM)
Primers sense 10 μl (10 picomoles)
antisense 10 μl (10 picomoles)
Taq polimerasa 2 μl (0,5 unidades)
349 μl (recuerde restar 20 μl que
Agua destilada estéril corresponden al volumen de DNA
molde cuantificado!!)

Luego de programar su termociclador según el programa de ciclado conveniente (2

min a 94 ºC, y 35 ciclos de tres segmentos: 30’’ a 94ºC, 40’’ a 55ºC y 60’’ a 72 ºC, más un
ciclo final de cierre de amplificación de 5’ a 72ºC) recibe un telegrama muy extraño!!!
Con cierto miedo y emoción (imaginando que luego de tanto trabajo se merece una
buena suma de dólares!!) lo abre lentamente y lo lee: “Arrepentidse y seraís
perdonados. John Constantine fue perdonado de todos sus faltas y ahora está en el
Cielo”.
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Cátedra de Biología Celular y Molecular (Bqca)
Módulo de Bioquímica y Farmacia.

- Con que sólo se tenía que arrenpentir de sus faltas y no hay ninguna mutación!!!- se
enoja Ud. pero para no perder su investigación (y dudando de que le vaya a poder
cobrar al nuevo habitante celestial) se dedica a obtener la línea contínua inmortalizada
de angeloblastos en la que tanto se había ilusionado!!!.