PCR Parte 1
PCR Parte 1
PCR Parte 1
DEFINICIÓN:
Ø Todas ellas tienen claras ventajas sobre otras técnicas usadas en BM:
Ø Ahorro de tiempo.
Ø Completamente automatizada.
http://www.biologia.edu.ar/adn/adntema1.htm
2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR
Ø Son los iniciadores de la reacción: sirven como punto de inicio para comenzar la síntesis de
ADN.
Ø Se diseñan por parejas y cada uno es complementario de una secuencia adyacente a la región de
interés, pero en extremos y cadenas opuestas:
- Primer F o forward (hacia adelante): cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene
dirección 3’-5’.
- Primer R o reverse (al contrario): es el que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 5’- 3'.
Ø Un juego de cebadores define y delimita la región diana de una molécula de ADN que
se quiere a amplificar, la cual será la comprendida entre ambos.
Ø Para ello, la secuencia del ADN que se estudia debe ser única.
Ejemplo:
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’ 5’
2.1. COMPONENTES DE LA PCR
Ejemplo:
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
5’ 3’ Primer R
Primer F
3’ 5’ (reverse)
(forward)
3’ 5’
2.1. COMPONENTES DE LA PCR
ü T de fusión (Tm) 1:
- La T óptima a la que hibridan los primers coincide con su Tm.
- Debe estar entre 52 a 65ºC.
- La diferencia de Tm entre ambos cebadores F y R debe ser menor de 5 ºC
para que la eficiencia de la unión al ADN sea similar.
2. ADN polimerasas
Recuerda: las ADN polimerasas:
• Siempre necesitan un molde.
• Solo pueden agregar nucleótidos al extremo 3' de la cadena de ADN nueva (solo “leen” la hebra molde
en dirección 3’-5’ y sintetizan la nueva hebra en 5’-3’).
• No pueden comenzar una cadena de ADN desde cero, sino que requieren de una cadena preexistente
o segmento corto de nucleótidos llamado cebador.
- El resultado final de cada ciclo es la síntesis de una molécula de ADN nueva por cada
cadena de ADN molde presente en la mezcla de reacción.
- Esta molécula de ADN nueva servirá también de molde en el siguiente ciclo.
- Los productos obtenidos de la amplificación de la PCR se llaman amplicones.
2.2. ETAPAS DE LA PCR
1. Desnaturalización:
- La fase debe ser suficientemente larga y a una T suficiente para desnaturalizar todo el
ADN molde (por rotura de los puentes de H) pero sin prolongarse excesivamente para
evitar desnaturalizar las ADN pol.
1.1. Desnaturalización inicial: habitualmente la PCR uOliza un ciclo de desnaturalización inicial, por lo
general entre 94 y 96 °C durante 5-10 minutos.
1.2. En los ciclos sucesivos: es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente.
Para lograrlo de manera adecuada se recomiendan temperaturas de 94 ºC durante 30 segundos a
1 minuto.
Desnaturalización
(95ºC)
2.2. ETAPAS DE LA PCR
2. Hibridación o annealing:
- Al disminuir la T de incubación, los primers se unen al ADN molde en las zonas 3’
complementarias.
- La T óptima es la T de fusión (Tm) de cada primer y es específica de este.
- En la práctica, la T de hibridación oscila entre T de 50-70 ºC durante un tiempo entre 30
segundos y 1 minuto. El t estándar de esta fase es de 30 seg.
Hibridación cebadores
(50-70ºC)
2.2. ETAPAS DE LA PCR
3. Extensión o elongación:
- A cada una de las cadenas de ADN se van añadiendo nucleótidos dNTP al extremo
3’ mediante la acción de la Taq polimerasa, que actúa a 72 ºC.
- El tiempo de la fase de extensión está condicionado por la velocidad de
polimerización de la enzima y la longitud del fragmento que se va a amplificar.
La Taq polimerasa, por ejemplo, tiene una velocidad de polimerización de unos 60
nucleótidos/segundo. Aproximadamente, necesitará:
- Entre 30-45 segundos para amplificar fragmentos de 1-1,5 kb
- y 2 minutos para fragmentos de entre 1,5-3 kb.
Esquema de la secuencia:
El ciclo básico de una PCR:
1 molécula de
ADN
boicatenaria
Desnaturalización (95ºC)
Extensión (72ºC)
2 moléculas de
ADN boicatenarias
El ciclo básico de una PCR:
Moléculas: 1 2 4 8
................................máx. 40
El ciclo básico de una PCR:
■ Después del primer periodo de síntesis de ADN, las tres fases se repiten
sucesivamente de 25 a 30 veces (25-30 ciclos).
■ Por encima de 40 ciclos aumenta la posibilidad de que aparezcan productos
no deseados.
■ En cada nuevo ciclo, el ADN de la muestra y las cadenas formadas en el ciclo
anterior sirven de molde.
■ La progresión al final de cada ciclo es exponencial, de modo que el número
de copias que obtenemos es, aproximadamente, 2n . Donde n es el número
del ciclo.
■ Las copias del gen de interés se llaman amplicones.
■ El equipo en el cual llevamos a cabo la PCR es el termociclador
(establecemos el nº de ciclos y las condiciones de T y tiempo para cada ciclo).
ACTIVIDADES PCR 1
Entregar en AULES
3. PCR A TIEMPO FINAL
- la PCR anidada,
- la PCR múltiple
- y la RT-PCR.
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL
Para llevar a cabo una PCR estándar, los pasos a seguir son los siguientes:
El MIX, mezcla de rección contiene todos los reactivos necesarios que deben estar
presentes en el medio de reacción:
▪ Agua ultrapura: para diluir los reactivos hasta la concentración de trabajo.
▪ Tampón que disolverá los reactivos: Tampón Tris con KCl, mantiene un pH entre 8,3 y
9 (pH y concentración salina óptima para que la actividadADN pol sea de máxima
efectividad).
- Algunos fabricantes de ADN pol suministran directamente el tampón de reacción adecuado con la
concentración óptima de MgCl2.
■ Resultado positivo:
Esperamos una banda específica de una longitud determinada.
➢ Pero ¿cómo estar seguros de que no se trata de una falso positivo?
Para ello se procesa un control negativo o blanco. No contiene ADN, su
volumen es sustituido por agua.
En el blanco o control negativo no debe aparecer ninguna banda.
Si aparece una banda en C-, indica que hay contaminación de ADN en algún
reactivo o pipeta. El resultado de toda la tanda no es válido.
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL