PCR Parte 1

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U.D.

4 Las técnicas de PCR


Biología Molecular y Citogenética
LAS TÉCNICAS DE PCR

1. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR

3. PCR A TIEMPO FINAL

4. PCR A TIEMPO REAL


1. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Polymerase chain reaction

DEFINICIÓN:

Es una técnica in vitro de amplificación de ADN

Permite obtener millones de copias iguales de un fragmento concreto de


ADN, a partir de una cantidad mínima de ADN molde.
1. REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Ø Existen diferentes variantes de la técnica.

Ø Todas ellas tienen claras ventajas sobre otras técnicas usadas en BM:

Ø Ahorro de tiempo.

Ø Completamente automatizada.

Ø Cantidad de muestra necesaria mucho menor.

Ø Mejor especificidad y sensibilidad. Problema: la contaminación por aerosoles,

microorganismos ambientales, PCR anteriores…

Ø Hoy día, la PCR es una técnica básica en cualquier laboratorio de BM.

Ø Aplicaciones innumerables en biología, medicina y paleontología.


2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR

■ La PCR fue ideada por el bioquímico norteamericano Kary


Mullis en 1983 (Premio Nobel).

Sin el hallazgo de la enzima Polimerasa


de la bioquímica Margarita Salas,
tampoco hubiese sido posible la PCR
2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR

■ La PCR es un proceso enzimático, catalizado por una ADN polimerasa.


■ Se basa en la replicación del ADN: repetimos secuencialmente ciclos de
replicación in vitro de ADN, de forma que obtenemos múltiples copias a partir
de una única molécula de ADN molde.

http://www.biologia.edu.ar/adn/adntema1.htm
2. BASES TEÓRICAS DE LA PCR

¿Cómo imitamos la replicación del ADN?


■ Sustituimos la función de las enzimas topoisomerasas y helicasas (desenrrollan el
ADN) con calor: desnaturalización del ADN.
■ ADN polimerasa (polimeriza la cadena del ADN): necesitamos una que resista la
T de desnaturalización del ADN (ADN pol termoestable).
■ Añadimos también los 4 dNTPs (Desoxirribonucleótidos-trifosfato: A, G, T, C).
■ En la replicación del ADN, el principal cebador para la síntesis de ADN es una cadena
corta de ARN. Este ARN lo produce una ARN polimerasa. En la PCR no usamos ARN pol
sino que añadimos el cebador ya sintetizado:
Para copiar sólo el fragmento que nos interesa, utilizamos primers/cebadores
específicos que diseñamos expresamente para ese fragmento.
2.1. COMPONENTES DE LA PCR
1. Primers o cebadores:

Ø Son oligonucleótidos monocatenarios (18 – 24 bases) de ADN cuya secuencia es complementaria


de las regiones que flanquean el fragmento que se quiere amplificar.

Ø Son los iniciadores de la reacción: sirven como punto de inicio para comenzar la síntesis de
ADN.

Ø Se diseñan por parejas y cada uno es complementario de una secuencia adyacente a la región de
interés, pero en extremos y cadenas opuestas:
- Primer F o forward (hacia adelante): cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene
dirección 3’-5’.
- Primer R o reverse (al contrario): es el que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 5’- 3'.

Delimitan el fragmento a amplificar


2.1. COMPONENTES DE LA PCR

Ø El cebador unido a su hebra molde es el sustrato idóneo para la actividad enzimática


de la ADN polimerasa.

Ø Un juego de cebadores define y delimita la región diana de una molécula de ADN que
se quiere a amplificar, la cual será la comprendida entre ambos.

Ø Así, hacen posible la amplificación exclusiva de un fragmento de ADN concreto de


entre una mezcla compleja de moléculas.

Ø Para ello, la secuencia del ADN que se estudia debe ser única.

El amplicón incluirá los cebadores más el fragmento que se amplifica.


2.1. COMPONENTES DE LA PCR

Ejemplo:

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

3’ 5’
2.1. COMPONENTES DE LA PCR

Ejemplo:

5’ 3’

3’ 5’

5’ 3’

5’ 3’ Primer R
Primer F
3’ 5’ (reverse)
(forward)

3’ 5’
2.1. COMPONENTES DE LA PCR

■ El diseño de los primers se realiza mediante programas de bioinformática.


■ Para ello, necesitamos conocer exactamente el fragmento que queremos
amplificar y también la región que lo flanquea.
■ Requisitos que deben cumplir los cebadores:
ü Longitud óptima: 18-30 nucleótidos.
- Por debajo de 15 carece de especificidad à productos amplificados no
específicos.
- Por encima de 35 nucleótidos se unen peor al ADN molde à disminuye el
rendimiento de la reacción.
ü Composición de bases: mejores resultados con un contenido en G + C entre el
40 – 60 %.
ü La concentración aproximada de cada cebador suele ser de
200-400 nM.
2.1. COMPONENTES DE LA PCR

ü Secuencia: no deben tener secuencias complementarias intra e


intermoleculares , para evitar la formación de estructuras secundarias de
tipo horquillas:
2.1. COMPONENTES DE LA PCR

ü T de fusión (Tm) 1:
- La T óptima a la que hibridan los primers coincide con su Tm.
- Debe estar entre 52 a 65ºC.
- La diferencia de Tm entre ambos cebadores F y R debe ser menor de 5 ºC
para que la eficiencia de la unión al ADN sea similar.

1Tm: T a la que el 50% del ADN de una mezcla se encuentra desnaturalizado.


El ADN de distintos orígenes tiene diferentes valores de Tm.
2.1. COMPONENTES DE LA PCR

2. ADN polimerasas
Recuerda: las ADN polimerasas:
• Siempre necesitan un molde.
• Solo pueden agregar nucleótidos al extremo 3' de la cadena de ADN nueva (solo “leen” la hebra molde
en dirección 3’-5’ y sintetizan la nueva hebra en 5’-3’).
• No pueden comenzar una cadena de ADN desde cero, sino que requieren de una cadena preexistente
o segmento corto de nucleótidos llamado cebador.

ADN polimerasas termoestables:


- En los primeros experimentos se trabajaba con ADN pol termolábiles (se tenían que
añadir en cada ciclo, siendo una técnica costosa y larga).
- Se descubrieron las ADN polimerasas termoestables, que son enzimas aisladas de
arqueobacterias extremófilas, con actividad polimerasa a T elevadas.

* Las ADN polimerasas termoestables se nombran de acuerdo con el


organismo en el que se han aislado, con la 1ª letra mayúscula del género y las 2
primeras letras minúsculas de la especie. Por ejemplo:
Thermus aquaticus ® Taq ADN polimerasa (es la más utilizada)
2.1. COMPONENTES DE LA PCR

Características principales de las ADN polimerasas:

- Catalizan la incorporación de nucleótidos en dirección 5’ à 3’.


- Necesitan ADN monocatenario (molde) y Mg2+ (cofactor).

- Incorporan los dNTP al extremo 3’ OH del cebador .


- Se necesita una T óptima de trabajo de esas enzimas, entre 70-75 ºC. Nos marcará
la fase de elongación.

- Mantienen la actividad polimerasa tras tiempos prolongados de incubación a 95ºC,


lo que garantiza que no se va a inactivar durante las fases de desnaturalización del
ADN.
2.1. COMPONENTES DE LA PCR

Tipos de ADN polimerasas termoestables:


• Con actividad exonucleasa 5’-3’, pero sin actividad exonucleasa 3’-5’. Al no tener
actividad exonucleasa 3’-5’ no son capaces de corregir errores (eliminar nucleótidos
mal incorporados). Es el caso de la Taq ADN polimerasa que tiene una tasa de error
de aproximadamente 1 por cada 100.000 nucleótidos incorporados.
• Actividad exonucleasa 5’-3’ y actividad exonucleasa 3’-5’. Son enzimas con actividad
correctora, ya que detectan la incorporación de un nucleótido erróneo, lo eliminan y
continúan la elongación de la cadena incorporando el nucleótido correcto. La tasa de
error es mucho menor (1 por cada millón de nucleótidos incorporados).
• Actividad transcriptasa inversa. Algunas ADN polimerasas termoestables tienen
capacidad para utilizar ARN como molde, por lo que pueden utilizarse para sintetizar
y amplificar ADNc a partir de ARN.

* La más utilizada dada su efectividad, es la Taq ADN polimerasa. Esta polimerasa es


idónea para la PCR por su resistencia a las altas temperaturas que se utilizan en el
proceso.
2.1. COMPONENTES DE LA PCR

3. Desoxirribonucleótidos trifosfato (d-NTP): dATP,dTTP, dCTP y dGTP.


- Son el sustrato que emplea la ADN polimerasa para incorporarlos a las
cadenas en crecimiento.
- En la mezcla, los 4 tipos de dNTP deben añadirse en una
concentración similar (suele ser de 200 micromolar).
4. Buffer o tampón: medio acuoso tamponado.
- Es la solución amortiguadora que se usa en la reacción y generalmente está
compuesta de Tris y KCL (pH = 8). Mantiene el pH de la mezcla durante la reacción.
5. Cloruro de magnesio (MgCl2):
- Cofactor enzimático importante para que la ADN polimerasa desarrolle su
actividad.
La concentración de ClMg2 en la mezcla suele ser de 1,5 micromolar.
2.1. COMPONENTES DE LA PCR

6. Agua: se utiliza agua estéril en grado de BM (libre de ADNasas y ARNasas).

7. ADN molde: donde se encuentra el fragmento de interés que queremos


amplificar (ej. especímen obtenido de la muestra del paciente).
- Debe tener un elevado grado de integridad y estar libre de contaminantes.
- La cantidad idónea suele ser de 100-300 ng.

8. Aditivos o potenciadores: sustancias potenciadoras de la PCR que aumentan


su rendimiento o disminuyen la aparición de productos no deseados. Gelatina,
glicerol, sulfato amónico…
- Deben limitarse a casos problemáticos.
2.1. COMPONENTES DE LA PCR

Mastermix o mix de reactivos: mezcla de reactivos para el mix de la PCR


convencional. No se añade aquí el ADN problema ni el ADN control.
Existen mezclas comerciales que contienen todos los reactivos
necesarios para la PCR.
2.2. ETAPAS DE LA PCR

■ La PCR se basa en la repetición secuencial de ciclos de amplificación (replicación)


del ADN. Cada ciclo consta de tres fases:

1. Desnaturalización del ADN molde.


2. Hibridación o annealing de los primers con el ADN molde.
3. Extensión/elongación de los cebadores o primers.

- El resultado final de cada ciclo es la síntesis de una molécula de ADN nueva por cada
cadena de ADN molde presente en la mezcla de reacción.
- Esta molécula de ADN nueva servirá también de molde en el siguiente ciclo.
- Los productos obtenidos de la amplificación de la PCR se llaman amplicones.
2.2. ETAPAS DE LA PCR

1. Desnaturalización:
- La fase debe ser suficientemente larga y a una T suficiente para desnaturalizar todo el
ADN molde (por rotura de los puentes de H) pero sin prolongarse excesivamente para
evitar desnaturalizar las ADN pol.
1.1. Desnaturalización inicial: habitualmente la PCR uOliza un ciclo de desnaturalización inicial, por lo
general entre 94 y 96 °C durante 5-10 minutos.
1.2. En los ciclos sucesivos: es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente.
Para lograrlo de manera adecuada se recomiendan temperaturas de 94 ºC durante 30 segundos a
1 minuto.

Desnaturalización
(95ºC)
2.2. ETAPAS DE LA PCR

2. Hibridación o annealing:
- Al disminuir la T de incubación, los primers se unen al ADN molde en las zonas 3’
complementarias.
- La T óptima es la T de fusión (Tm) de cada primer y es específica de este.
- En la práctica, la T de hibridación oscila entre T de 50-70 ºC durante un tiempo entre 30
segundos y 1 minuto. El t estándar de esta fase es de 30 seg.

Hibridación cebadores
(50-70ºC)
2.2. ETAPAS DE LA PCR

3. Extensión o elongación:
- A cada una de las cadenas de ADN se van añadiendo nucleótidos dNTP al extremo
3’ mediante la acción de la Taq polimerasa, que actúa a 72 ºC.
- El tiempo de la fase de extensión está condicionado por la velocidad de
polimerización de la enzima y la longitud del fragmento que se va a amplificar.
La Taq polimerasa, por ejemplo, tiene una velocidad de polimerización de unos 60
nucleótidos/segundo. Aproximadamente, necesitará:
- Entre 30-45 segundos para amplificar fragmentos de 1-1,5 kb
- y 2 minutos para fragmentos de entre 1,5-3 kb.

**Extensión final: al terminar los ciclos,


se realiza una úlnma extensión de
aproximadamente 5 minutos a 72 ºC
para perminr que la polimerasa termine Extensión (72ºC)
de sintenzar todos los fragmentos que
pueden haber quedado incompletos.
2.2. ETAPAS DE LA PCR

**Enfriamiento (fase de mantenimiento):


- Al terminar los ciclos, la programación del termociclador finaliza con una incubación a 4 ºC
para conservar las muestras, anulando la actividad de la enzima.

Esquema de la secuencia:
El ciclo básico de una PCR:

1 molécula de
ADN
boicatenaria

Desnaturalización (95ºC)

Hibridación cebadores (50-70ºC. P.ej.,


55ºC)

Extensión (72ºC)

2 moléculas de
ADN boicatenarias
El ciclo básico de una PCR:

Moléculas: 1 2 4 8

................................máx. 40
El ciclo básico de una PCR:

■ Después del primer periodo de síntesis de ADN, las tres fases se repiten
sucesivamente de 25 a 30 veces (25-30 ciclos).
■ Por encima de 40 ciclos aumenta la posibilidad de que aparezcan productos
no deseados.
■ En cada nuevo ciclo, el ADN de la muestra y las cadenas formadas en el ciclo
anterior sirven de molde.
■ La progresión al final de cada ciclo es exponencial, de modo que el número
de copias que obtenemos es, aproximadamente, 2n . Donde n es el número
del ciclo.
■ Las copias del gen de interés se llaman amplicones.
■ El equipo en el cual llevamos a cabo la PCR es el termociclador
(establecemos el nº de ciclos y las condiciones de T y tiempo para cada ciclo).
ACTIVIDADES PCR 1
Entregar en AULES
3. PCR A TIEMPO FINAL

3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL


3.2. OTRAS TÉCNICAS DE PCR A TIEMPO FINAL:
3.2.1. PCR ANIDADA
3.2.2. PCR MÚLTIPLE
3.2.3. PCR CON TRANSCRIPCIÓN INVERSA
(RT-PCR)
3. PCR A TIEMPO FINAL

- En la PCR a tiempo final (la original) el resultado de la reacción no se


conoce hasta que se termina y se analizan sus productos mediante
electroforesis.

- En esta categoría de PCR se incluyen:


- La PCR estándar
- Otros tipos de PCR desarrolladas posteriormente:

- la PCR anidada,
- la PCR múltiple
- y la RT-PCR.
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL

Es la forma más simple de PCR, en la que:

- se amplifica un único fragmento de ADN,


- con un único par de cebadores
- y en un único proceso de amplificación a tiempo final.

Esta foto de Autor desconocido está bajo


Herascientific.com/termociclador
licencia CC BY-NC-ND
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL

I. PROCEDIMIENTO DE UNA PCR ESTÁNDAR

Para llevar a cabo una PCR estándar, los pasos a seguir son los siguientes:

1. Elaborar el diseño de la PCR decidiendo el volumen final de mezcla en el que


se llevará a cabo la reacción (generalmente, es de 25 a 50 microlitros).
2. Calcular los volúmenes de reactivo teniendo en cuenta la concentración final
a la que irán en la mezcla (nos lo dará el protocolo).
3. Preparar la mezcla de reacción con todos los reactivos excepto la ADN
polimerasa y el ADN molde.
4. Preparar un control positivo (con ADN que contiene el fragmento que
queremos amplificar) y un control negativo (sin ADN molde).
5. Añadir la cantidad adecuada de enzima Taq-polimerasa en cada tubo de
reacción.
6. Programar el termociclador e introducir las muestras para iniciar la PCR.
7. Analizar los productos de reacción mediante electroforesis.
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL
II. LA PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

■ Preparamos la mezcla de reacción Mix o mastermix: Es la mezcla de reactivos


(todos excepto el ADN molde y ADN pol) que son necesarios para hacer la PCR a
la concentración de trabajo indicada.
■ Los reactivos se compran concentrados y los diluimos con agua ultrapura para
alcanzar la dilución de trabajo deseada para un volumen final determinado (25 o
50 microlitros).
■ Utilizaremos la fórmula de las diluciones: Vo x Co = Vf x Cf
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL

El MIX, mezcla de rección contiene todos los reactivos necesarios que deben estar
presentes en el medio de reacción:
▪ Agua ultrapura: para diluir los reactivos hasta la concentración de trabajo.
▪ Tampón que disolverá los reactivos: Tampón Tris con KCl, mantiene un pH entre 8,3 y
9 (pH y concentración salina óptima para que la actividadADN pol sea de máxima
efectividad).
- Algunos fabricantes de ADN pol suministran directamente el tampón de reacción adecuado con la
concentración óptima de MgCl2.

▪ Cloruro magnésico MgCl2 : proporciona el Mg necesario para que actúe la


polimerasa.
- Cada ADN pol tiene una concentración óptima de iones Mg; como referencia, la Taq ADNpol tiene una
concentración final estándar de MgCl2 de 1,5mM.

▪ dNTP desoxinucleótidos trifosfato: Los 4 tipos de dNTPs deben encontrarse en


la misma concentración.
- Se suministran a una concentración total de 10 mM (milimolar), con 2,5 mM de cada dNTP. La
concentración final en la mezcla debe ser 200 micromolar de cada nucleótido.
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL

▪ Cebadores: Añadir los cebadores F y R a la misma concentración, entre 200-400


nM.
▪ ADN pol: se suministra concentrada y en glicerol.
- La concentración óptima es entre 1 – 2,5 unidades para un V final de 50 µlitros.
§ ADN molde. Contiene el fragmento de interés que se quiere amplificar.
- No se incluye dentro del Mastermix, se añadirá en el último momento a los
microtubos de PCR, pero su volumen debe tenerse en cuenta al hacer los cálculos de
las diluciones.
- Usar un ADN purificado.
- Es importante la calidad y cantidad del ADN molde.
*Calidad: alto grado de integridad, de alto peso molecular, no degradado, ni
fragmentado, libre de proteínas y de inhibidores de la PCR.
*Cantidad necesaria: dependerá de la complejidad del ADN que se estudia.
ADN genómico humano: 100 – 300 ng. No sobrepasar los 500 ng de ADN
para un vol final de 50 µl.
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL
■ Una vez optimizados todos los componentes básicos de la mezcla de reacción, lo
esperado es obtener un buen resultado. Pero puede ser que el rendimiento de la
PCR sea bajo o que aparezcan productos no deseados.
■ En determinados casos nos puede interesar añadir potenciadores de la PCR,
como DMSO (dimetilsulfóxido), glicerol.
■ Son inhibidores de la PCR : gr hemo, anticoagulantes, etanol.
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL
■ ¿Por qué preparar el Mix de reaccvos?
Como las canndades que se requiere pipetear de cada reacnvo son muy pequeñas (0,5 – 5
µlitros), los errores de pipeteo son elevados.
Si tengo que hacer la PCR de varias muestras de ADN disnntas, hacer un Mix de reacnvos
para todas las muestras y después alicuotar/reparnrlo en microtubos, es más eficaz y evita
errores de pipeteo.
§ Procedimiento: en un eppendorf de 1,5ml prepararemos el mix para un total de:

Nº muestras + C posicvo + C negacvo + 10 ó 20% Vol extra

Cuando tengamos preparado el mix, mezclamos bien y lo


repartimos a los microtubos de PCR.

En cada microtubo PCR pondremos:


■ Volumen de Mix de reactivos
■ Vol de ADN a analizar.

Prepararé también tubos para:


■ Control Positivo: Mix + ADN control
■ Control negativo: Mix + agua
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL

La preparación de las muestras requiere ajustar el volumen de la reacción, elaborar


la mezcla máster y establecer los controles positivo y negativo.
q Ajuste del volumen de reacción. Normalmente este es de 25 o 50
microlitros.
q Mezcla “master”. Como las reacciones de PCR se realizan en volúmenes muy
pequeños, los valores de pipeteo también y por lo tanto se pueden producir
errores. Para evitarlo y conseguir la mezcla homogénea se prepara una única
mezcla de reacción: mezcla máster mix, que incluye todos los componentes
menos el ADN molde.
q Control positivo y control negativo. Con cada tanda de la muestra problema se
prepara un control positivo y uno negativo.
Control positivo. En un tubo con mezcla máster se añade ADN molde
control con el fragmento que se quiere amplificar.
Control negativo o blanco. Se sustituye el ADN molde por un volumen
igual de agua estéril, por lo que no habrá ADN en la reacción.
Una vez que las muestras y controles ya están preparados, se llevan al
termociclador para iniciar la PCR.
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL
III. LA PROGRAMACIÓN DEL TERMOCICLADOR

■ Programamos el termociclador según las condiciones de trabajo y el


software del equipo correspondiente.
■ La programación incluye 4 etapas principales:
- Desnaturalización (inicial y posteriores)
- Ciclos de replicación
- Extensión (en cada ciclo y final)
- Mantenimiento.

Y DEJAMOS QUE LA PCR TENGA LUGAR


3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL

Ejemplo de programación de temperaturas en el termociclador:

TOTAL PCR : 2-4 HORAS

35-30 ciclos (máx. 40 ciclos).


1 ciclo: 3 fases (desnaturalización – hibridación – extensión).
*Al inicio y al fin del nº de ciclos programado, hay una fase de desnaturalización inicial y
otra de mantenimiento final (a 4 ºC), esta última para mantener las muestras hasta que
se retiren del termociclador.
IV. EL ANÁLISIS DE
LOS PRODUCTOS
AMPLIFICADOS

■ Para detectar los productos


amplificados se realiza una
electroforesis en agarosa 0,5 a
2,0% junto con un marcador
de pesos moleculares (size
standard)
■ Esperamos una única banda
para una muestra,
del tamaño adecuado/buscado.
■ Si encontramos varias bandas:
Indica que hay productos de
amplificación no deseados.
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL
■ Resultado negativo: (PCR CUALITATIVA: SÍ/NO HAY AMPLIFICACIÓN)
La ausencia de la banda específica es suficiente para afirmar que la
secuencia diana NO ESTÁ presente.
➢ Pero ¿cómo estar seguros de que no se trata de una falso negativo, algún
reactivo podría no haber funcionado?
Para ello se procesa un control positivo. Contiene ADN que sabemos que ha
amplificado en otras ocasiones. En el control positivo debe aparecer una banda para
estar seguros de que los reactivos están bien. Si no aparece una banda en el
control positivo, el resultado de toda la tanda no es válido.

■ Resultado positivo:
Esperamos una banda específica de una longitud determinada.
➢ Pero ¿cómo estar seguros de que no se trata de una falso positivo?
Para ello se procesa un control negativo o blanco. No contiene ADN, su
volumen es sustituido por agua.
En el blanco o control negativo no debe aparecer ninguna banda.
Si aparece una banda en C-, indica que hay contaminación de ADN en algún
reactivo o pipeta. El resultado de toda la tanda no es válido.
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL

Electroforesis en gel de agarosa al 1,6 % de los productos amplificados por PCR de un


fragmento de 574 pb del gen que codifica para el ARN16S.
Calle 1) Patrón de peso molecular.
Calle 2) Control positivo (ADN de la cepa J99).
Calles 3 a la 7) ADN de 5 de las cepas cubanas aisladas.
Calle 8) Control negativo (mezcla de reacción sin ADN).
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL

V. PROBLEMAS QUE PUEDEN PRESENTARSE EN LA PCR

▪ Contaminación: provoca aparición de productos inespecíficos (en


electroforesis se observa una estela (smear) en lugar de una única banda).
▪ Mala calidad elADN extraído: por ej., por contaminación con proteínas, por
fragmentación,…
▪ Concentración inadecuada de la mastermix (mezcla de reacción):
- Exceso de Mg (inhibe a la Taq-polimerasa); inadecuada concentración de dNTP (en
concentración elevada se unen al Mg y la Taq-polimerasa no puede actuar
adecuadamente); buffer mal preparado.
▪ Un diseño inadecuado de los primers.
▪ La utilización de una secuencia de temperaturas no adecuada.
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL

Efectos de una temperatura inadecuada durante la PCR:


Temperatura de hibridación: influye sobre la especificidad del primer.
▪ Una temperatura demasiado alta da lugar a poco o nada de producto.
▪ Una temperatura demasiado baja da lugar a un annealing no específico, se
formará un producto incorrecto.
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL

➢ Recomendaciones para el control de la contaminación:


▪ Utilizar siempre “blancos de reacción” (sin DNA; agua) o controles negativos
(muestra de DNA de resultado negativo conocido. P.ej., DNA genómico humano si
busco DNA microbiano). En ambos casos, el resultado esperado es NEGATIVO.
§ Utilizar reactivos “grado biología molecular”. De esta forma se evita que se
introduzcan nucleasas, metales pesados y otros posibles contaminantes
inespecíficos.
▪ Adición controlada de agentes antimicrobianos (0.025% azida de sodio).
▪ Utilizar pipetas solo para PCR y puntas con filtro (para evitar el efecto
aerosol).
▪ Se trabajará en una habitación limpia, en la que se aplicará luz ultravioleta para
neutralizar el ADN extraño.
▪ La preparación de la mezcla de reacción se realizará en el área de
preamplificación.
▪ El flujo de trabajo será unidireccional, es decir, no se intercambian pipetas, agua,
tubos con el área de amplificación.
3.1. PCR ESTÁNDAR O CONVENCIONAL

VI. PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO DE PCR


▪ Una vez realizada la amplificación del fragmento de ADN es necesario
purificar el producto de la PCR:
• Hay que eliminar el exceso de nucleótidos y cebadores de la reacción
de PCR.
▪ Para ello existen varios reactivos comerciales, uno de ellos es el
PCR ExoSap-IT (reactivo para la limpieza enzimática del producto PCR amplificado.
Hidroliza el exceso de cebadores y nucleótidos en un solo paso).

Purificación del producto de PCR con ExoSap-IT


▪ Se añaden 2µl ExoSap-IT en 5µl de producto de la PCR.
▪ Incubación de 15 minutos a 37ºC
▪ Incubación de 15 minutos a 80ºC
▪ Se consigue neutralizar los primers y los nucleótidos son
convertidos en nucleósidos y fosfato.
➢ Purificación del producto de PCR
ACTIVIDADES PCR 2 y Protocolo PCR (lectura y cálculos)
Entregar en AULES
Continuará

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