Principios fisicoquímicos de los colorantes utilizados en microbiología

Los colorantes son sustancias que tienen la capacidad de teñir células, estructuras o te-jidos; y
de acuerdo con su origen, permiten hacer visibles los objetos microscópicos y transparentes,
conocer su forma y tamaño, así como sus estructuras internas y exter-nas. Los colorantes
hacen parte de reaccio-nes químicas específicas y de acuerdo con su origen, se pueden
clasificar en naturales, aquellos que son extraídos de plantas o ani-males, y artificiales, los que
se extraen de minerales y son procesados en el laborato-rio. En cuanto a su estructura
química los colorantes están constituidos por un grupo funcional cromóforo y un auxócromo.

En un colorante, el cromóforo es un grupo funcional que cuenta con una alta densidad electrónica
y por lo tanto se pueden clasifi-car de la siguiente manera:

• Dobles y triples enlaces carbono-carbono

• Anillos aromáticos

•Grupos carbonilos, imino, diazo y nitro.

-Estructuras que presenten enlaces entre el carbono y átomos con pares de electrones libres. Por
su parte, los auxocromos, son sustitu-yentes del cromóforo y alteran los valores de las
longitudes de onda en las que se pre-sentan las absorciones de la luz. General-mente, los
auxocromos son grupos mucho más sencillos que los cromóforos, como es el caso de grupos
metilo (-CH3), halógenos (-X), hidroxilos (-OH), y amino (-NH2).Dependiendo de la sustitución
en el cro-móforo y el sustituyente o auxocromo, los efectos que se logran en la molécula del
co-lorante se han clasificado de acuerdo al des-plazamiento de la banda de absorción en el
espectro.Si el auxocromo causa una absorción del cromóforo hacia longitudes de onda mayo-
res se denomina batocrómico.Si el auxocromo causa una absorción del cromóforo hacia
longitudes de onda meno-res se denomina hipsocrómico.

los res-ponsables de los colores en los compuestos son los cromóforos y sus colores se inten-
sifican o modifican por la presencia de los auxocromos. La alta densidad electrónica presente
en al-gunos grupos funcionales explica por qué son considerados cromóforos por excelencia.

En el grupo AZO, cada átomo de nitrógeno posee 5 electrones de valencia de los cuales comparte
2 con el otro átomo de nitrógeno y uno queda disponible para enlazarse bien sea con un radical
aromático o alifático. Esto quiere decir que el grupo funcional cuenta con alta densidad electrónica
aportada por pares de electrones libres que no intervie-nen en los enlaces; y además,
existen elec-trones en orbitales “p” que constituyen en-laces “pi” entre los dos átomos. Lo
anterior facilita la movilidad de los electrones y las absorciones de energía que, como ya se
esta-bleció ocasionan el color (8). La presencia o no de este grupo ha permitido clasificar
los colorantes en azoicos y no azoicos.

De otro lado, en los grupos NITRO y NI-TROSO, la configuración electrónica del nitrógeno en
los grupos es: 1s22s22p3 , y la configuración del oxígeno en éstos mismos grupos es:
1s22s22p4.En las asociaciones moleculares, entre el átomo de nitrógeno y el de oxígeno se
con-jugan altas densidades electrónicas de estos elementos electronegativos. Con el fin de
alcanzar la estabilidad química, puede ocu-rrir que se presenten enlaces con uno o dos átomos
de oxígeno en los que intervienen electrones procedentes de orbitales “p”.Una situación
similar ocurre en los grupos funcionales “TIO” en los que se presentan enlaces covalentes entre
el átomo de azufre y el de carbono e igualmente la densidad elec-trónica es muy alta alrededor
de los núcleos de los átomos mencionados, presentando cada uno de los átomos las siguientes
distri-buciones electrónicas: carbono: 1s22s22p2 y azufre: 1s2 2s2 2p6 3s2 3p4.

n factor que aumenta la concentración de electrones en estos cromóforos está rela-cionado

con que usualmente se encuentran asociados a anillos aromáticos que aportan electrones a las
nubes electrónicas; y por ende, a las transiciones en los niveles atómi-cos, ocasionando
alteraciones en el espectro visible, que como ya se anotó, originan el fenómeno del color.Por
su parte, las estructuras de los auxocro-mos corresponden a grupos menos comple-jos y con
menores densidades electrónicas. Tal es el caso de los grupos hidroxilo (-OH); metoxi (-OCH3);
amino (-NH2) y los haló-genos (Cl, I, Br).

Teniendo en cuenta las estructuras químicas generales de los colorantes y la densidad electrónica
que en ellos se presenta, la propiedad de teñir depende principalmente del carácter ácido o básico
del grupo funcional (cromóforo) (11). De acuerdo con lo anterior, la clasificación según la acidez
de los colorantes es de especial importancia en el trabajo con dichos compuestos en el campo de
la microbiología. Colorantes neutros: se obtienen a partir de los precipitados provenientes de
soluciones acuosas en las que se encuentran disueltos cromóforos con características ácidas y
básicas (8, 10). El colorante se produce disolviendo el precipitado en alcohol, tal es el caso de la
Giemsa.

En la tinción de Giemsa, se combinan el carácter básico de los colorantes azul de metileno, Azure
A y Azure B y el carácter ácido de la eosina, lo que ofrece un espectro amplio de colores
dependiendo de los ajustes de pH.

Colorantes básicos: la acción colorante está a cargo del catión, mientras que el anión no tiene esa
propiedad. Un ejemplo es el azul de metileno (cloruro de metiltionina). El grupo amino (básico) es
el grupo funcional activo en la molécula (12)

Colorantes ácidos: la sustancia colorante está a cargo del anión, mientras que el catión no tiene
esa propiedad. Un ejemplo es la Eosina o Eosinato de sodio. El grupo carboxilo (ácido) es el grupo
funcional activo en la molécula.

Al momento de la coloración, ocurre una combinación de procesos físicos y reacciones químicas: la

solubilidad y las interacciones moleculares son claves para explicar el fenómeno de tinción.

Al contacto con el colorante ocurre un fenómeno de absorción, similar al que tiene lugar en las
materias porosas, dicho compuesto penetra al interior del sustrato aprovechando los espacios
intersticiales y la cohesión molecular, sin que ocurra enlace químico. Es un proceso que se explica
similar a la solubilidad de una sustancia en otra.

Las células microbianas contienen compuestos entre los cuales se encuentran los ácidos nucleicos.
Debido a la presencia de los grupos fosfato en dichos ácidos, se concentran en las moléculas
cargas negativas, las cuales facilitan combinaciones con los colorantes de tipo básico catiónicos.
De otra parte, los colorantes ácidos, aniónicos, no tiñen la célula y por esto, se emplean como
colorantes de contraste, como, por ejemplo: el azul de metileno o la eosina que no colorean al
microorganismo, pero si el fondo del campo microscópico. Las coloraciones pueden ser simples
cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se utiliza un sólo colorante: es el caso de azul de
metileno de Löeffler o tinta china. De otra parte, la coloración diferencial ocurre cuando se
visualiza más de un color porque se utiliza un colorante primario y otro de contraste. En algunos
casos también se emplean mordientes y sustancias decolorantes, como en la coloración de Gram
o Ziehl-Neelsen; o en coloraciones cuando se utilizan anticuerpos marcados con una molécula
fluorescente para identificar estructuras celulares específicas, denominadas coloraciones
inmunocitoquímicas. Algunas preparaciones biológicas requieren antes de su proceso de
coloración, la fijación de las muestras, con el propósito de preservar la geometría estructural y
química de las células que se desean visualizar, y esta fijación se puede realizar por métodos
físicos o químicos. Entre los procesos de fijación físicos se encuentran la desecación, calor seco,
calor húmedo, ultrasonido y microondas; y en los de fijación químicos se encuentran procesos de
oxidación en los que se utilizan compuestos que tienen la propiedad de comportarse como
oxidantes, tales como el óxido crómico (Cr2 O3 ), ácido acético (CH3 COOH), ácido pícrico (C6 H2
OH(- NO2 )3 , acetona (CH3 COCH3 ), dicromato de potasio (K2Cr2O7) y reductores como
aldehídos y alcoholes entre los que se encuentran: el formaldehído (CH2 O), glutaraldehído
(OHC(CH2 )3 CHO), etanol (C2 H5 OH), metanol (CH3 OH) y paraldehído (C6 H12O3 ) (15).

El método de fijación más utilizado en microbiología es el físico, por medio del calor seco, que
consiste en exponer directamente la lámina con la preparación a la llama del mechero. Este
procedimiento detiene los procesos vitales de los microorganismos sin alterar sus estructuras.
Parece sencillo, pero hay que tener en cuenta que la sobreexposición al calor, o la exposición en
una zona incorrecta de la llama (zona fría, zona caliente y zona de fusión) incide en el efecto
deseado; así, es muy común provocar alteraciones morfológicas y destrucción celular. El tiempo
de preservación del extendido por este método es corto. De otro lado, los métodos químicos
ofrecen mejores resultados para la fijación, ya que son líquidos-solventes con potencial alto de
difusión intracelular y detienen procesos enzimáticos que provocan autolisis. Estos fijadores
tienen la capacidad de interactuar con biomoléculas como proteínas, glicoproteínas,
peptidoglucanos, lípidos, glicolípidos, lipoproteínas, pigmentos, ácidos pépticos y nucleicos;
además preservan la arquitectura de la pared celular y evitan la sobre coloración.

Examen microscópico de muestras clínicas sin tinción

Es el montaje directo húmedo o examen en fresco, en el cual las muestras se extienden

directamente sobre la superficie de un portaobjetos para su observación. Este tipo de preparación
se emplea para detectar trofozoítos móviles de parásitos intestinales como Giardia, Entamoeba,
huevos y quistes de otros parásitos, larvas y gusanos adultos, Trichomonas, hifas de hongos o
vaginosis causada por Gardnerella vaginalis

Examen microscópico de las muestras clínicas con tinciones.

Como se mencionó anteriormente, los colo-rantes pueden ser básicos o ácidos, depen-Fotografía
1.Nemátodo en solución salina. /L. Corrales.diendo de si la carga es positiva o negativa; entre los
primeros se encuentran el azul de metileno, cristal violeta y safranina, mien-tras que en el
segundo grupo se encuentra además de la eosina, la nigrosina.

Tinción simple

En estas se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tiñen con
la misma tonalidad (tinta china, azul metileno de Löeffler, azul de lactofenol). Se basa en el
hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo
que ambos se compor-tan de forma diferente frente al colorante

inción diferencial o compuestaEn estas se utilizan varios colorantes com-binados, las

estructuras celulares se diferen-cian en función de los colorantes que fijan. Se basan en el hecho
de que distintos tipos de células tienen distinta composición quí-mica; y por lo tanto, reaccionan
de forma diferente frente a una tinción, lo que per-mite clasificar los microorganismos en
dife-rentes grupos. Los ejemplos clásicos serían la tinción de Gram o la de Ziehl-Neelsen

Tinción selectiva

Se basan en el hecho de que existen estructu-ras celulares con una composición química
determinada afín por uno de los colorantes que se aplican en la tinción, de modo que se tiñen
selectivamente como las esporas, los flagelos y los gránulos metacromáticos, en-tre otros

Coloración de Echyo Riv

Es una técnica de coloración simple que permite observar la morfología bacteriana, sea
esta respectivamente de cocos, bacilos, espirilos o espiroquetas. Todas las estructu-ras se
tiñen de la misma tonalidad. Para esta coloración se usa la fucsina y el bicarbona-to de sodio
(NaHCO3). Es una coloración simple, por lo que las células se teñirán de un mismo color.La bacteria
tiene una carga negativa confe-rida por el citoplasma y los ácidos nuclei-cos, mientras que
la fucsina tiene una carga básica (catiónica); por lo tanto, por atrac-ción electrostática se
atraen; y el bicarbona-to ayuda en la estabilización de cargas (20, 22).

Tinción de Gram

Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular
de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microor-ganismo. La
pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de
péptidoglicano y una membra-na celular externa, mientras que las bacte-rias Gram positivas
poseen una pared celu-lar gruesa constituida por péptidoglicano, pero no cuentan con
membrana celular ex-terna. Así pues, la composición química y el contenido de péptidoglicano
en la pared celular de las bacterias Gram negativas y estructurales que presentan las
bacterias se pueden clasificar en Gram positivas y Gram negativas, de acuerdo con la
composición de su pared (24). La pared bacteriana, co-rresponde a la estructura que da
forma a la célula y la protege de lisis osmótica, acción de sustancias tóxicas y es el lugar sobre
el cual actúan varios antibióticos

Reactivo de Lugol

Lo primero que hay que aclarar con respecto al reactivo de Lugol es que no corresponde a una
sustancia pura; es decir, no es un com-puesto con una formula química específica, sino que su
acción se debe precisamente a la mezcla en forma homogénea y en solución acuosa de Yoduro
de Potasio (KI) y Yodo. Se utilizó esta solución para tratar la escrófula (conocida comúnmente
como la enferme-dad de las paperas). El proceso infeccioso es causado por el Mycobacterium
tuberculosis. El doctor en mención realizó publicaciones en las que resaltaba el tratamiento para
di-cha enfermedad utilizando una solución en la que se mezclaban Yodo (I) con Yoduro de Potasio
(KI). Posteriormente, y con base en estas investigaciones, se implementó el uso del elemento
yodo en el tratamiento de la enfermedad del bocio

Alcohol–Acetona

Estos dos compuestos actúan en forma de solución y dan origen a un reactivo que, al
igual que el lugol, no corresponde a una sustancia pura. La solución alcohol-aceto-na, tiene
propiedades deshidratantes que permiten en primera instancia la captura de las moléculas
de agua de la membrana, debido a interacciones moleculares que se explican por la
formación de dipolos entre las moléculas. De esta manera, se entien-de el efecto decolorante
en las paredes de las bacterias gramnegativas, teniendo en cuenta que el alcohol-acetona
desorganiza dichas membranas constituidas principal-mente por lipoproteínas y
lipopolisacáridos lo que permite la salida del colorante pri-mario (cristal violeta). La fuscina
básica, como colorante de con-traste, corresponde al reactivo denominado Violeta Ácido 19,
que a su vez es identifica-do por la fórmula química condensada de: C20N3H17O9S3Na2. La
función específica de contraste se explica por la presencia tanto de los anillos como del grupo
NH2 y su fun-ción es hacer visibles a las bacterias Gram negativas debido a la formación de
un com-plejo coloreado “rojo” (31).La pared celular de las bacterias Gram posi-tivas logra la
retención del primer coloran-te, debido al espesor aproximado de 80nm del entramado de varias
capas de péptido-glicano, por lo cual, no toma la fuscina.

Tinción negativa o Burry

Este tipo de tinción fue diseñada para mi-croscopía de luz con el fin de rodear y de-linear las
bacterias no teñidas. Este método es muy útil, de bajo costo y valioso por la información
que provee sobre las bacterias que pueden presentar cápsula, ya que pro-porciona un
resultado presuntivo . La cápsula está compuesta por una capa adicio-nal de polisacáridos, los
cuales se encuentran fuertemente unidos a la pared celular y ofrecen permeabilidad a la misma
(33, 34).El fundamento es simple: se tiñe el exterior, pero no el interior de células; es decir, no se
colorean sus estructuras. Adicionalmente, sólo requiere tinta china como colorante: las
partículas de carbono de la tinta no lo-gran penetrar la cápsula, la cual se ve clara sobre el fondo
oscuro que provee la tinta china.

Coloración de azul de metileno de Löeffler

El azul de metileno se reconoce como un colorante sencillo que puede ser utilizado para
fines diversos, tales como la determi-nación de la morfología bacteriana. El nitrógeno cargado
positivamente (ca-tión) se constituye en el centro activo de la molécula; y por tanto, desde allí
se explican las tinciones electrofílicas a partir de este compuesto, y la atracción hacia aniones
ta-les como los grupos fosfato (PO4)-3 (31).En este sentido, es el colorante preferido para
la identificación presuntiva de Cory-nebacterium diphtheriae, aunque también se utiliza
para la identificación de espiri-los y bacilos lácticos. Este microorganismo presenta dilataciones
regulares característi-cas de uno de sus polos, lo cual le da una apariencia de maso.
Dichas inclusiones co-rresponden a gránulos que contienen ácido polifosfórico, el cual es un
polímero inor-gánico del ácido fosfórico (HO(PO2OH)nH). La asociación en dichos gránulos
da lugar a un efecto metacromático que a su vez produce una tinción más intensa con
los colorantes de anilina, como es el caso del azul de metileno alcalino de Löeffler. Para
el resto del bacilo, la tinción es menos marcada con un azul más claro, obteniendo como resultado
de la tinción, una aparien-cia de rosario al teñirse. La parte interna de los cúmulos está cons-
tituida por un núcleo formado por molécu-las apolares de lípidos y proteínas; mientras que, en la
periferia, como se anotó anterior-mente, se encuentran los polímeros de po-lifosfato, dando
lugar a un mecanismo os-móticamente inerte de almacenamiento de grupos fosfato. El azul
de metileno también se utiliza como un complemento de la tinción de Gram, especialmente
para la tinción de bacterias Gram-negativas, tales como Haemophilus influenzae y especies
de Neisseria. El co-lorante puede revelar la morfología de las bacterias fusiformes y
espiroquetas (de in-fecciones orales, tales como la angina de Vincent) que apenas puede
distinguirse con la tinción de Gram (36). El colorante tam-bién se utiliza para detectar la
presencia de leucocitos en heces, que puede delatar la presencia de una enteropatía invasiva.
Coloración de Van Stoltemberg

También es una coloración específica para gránulos metacromáticos y tal como se es-
tableció anteriormente, estos gránulos están formados por polifosfato y polímeros linea-les del
ortofosfato, los cuales representan una asociación molecular osmóticamente inerte de
almacenamiento de fosfato, debi-do a que la parte central de los gránulos está constituida por un
núcleo de macromolécu-las de lípidos y proteína. Las inclusiones son cuerpos inertes en las
células. Muchas de ellas son materiales ali-menticios de reserva, dado que se acumu-lan
durante tiempo de aporte nutricional y disminuye la duración de la inanición. El carácter de
las inclusiones varía con el orga-nismo. En muchas especies bacterianas y en hongos, algas y
protozoarios aparecen grá-nulos de volutina, llamados gránulos meta-cromáticos. Se les colorea
intensamente con colorantes básicos debido a la alta concen-tración de ácido fosfórico
polimerizado, co-nocido como polifosfato. El colorante Van Stoltemberg está compuesto por
fucsina y verde de malaquita (colorantes catiónicos básicos). Su fundamento radica en que
la fucsina es tomada por el polifosfato y de esta forma se observan los gránulos de co-
lor rojizo y el verde de malaquita es tomado por el cuerpo del bacilo, viéndose de color verde

Coloración de Shaeffer Foulton

Las esporas son estructuras bacterianas constituidas por proteínas, calcio y ácido
dipicolinico (C10H2O4N). Este compuesto engloba el ADN y causa re-sistencia a factores
ambientales o condicio-nes adversas, tales como altas temperaturas, baja humedad, radiaciones
y agentes quí-micos. Según su localización, se distinguen tres tipos de esporas: centrales,
subtermina-les y terminales, que presentan en particular los géneros Bacillus y Clostridium. as
esporas son altamente impermeables a los colorantes, de manera que con las téc-nicas
de coloración comunes como la de Gram, se observan como regiones sin teñir dentro de las
células coloreadas y por esto se deben utilizar métodos especiales y selec-tivos de coloración.
Una vez coloreada, la espora resiste fuertemente la decoloración y el contraste. e fundamenta
en que el verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene una carga positiva débil)
y, por tanto, se une débilmente a la bacteria de tal forma que penetra en las células vegetativas
y cuando se calienta la preparación por cierto tiempo también penetra las esporas, ya que el
calor modifica la permeabilidad de estas y permite la entrada del colorante a través de sus
capas externas. Es utilizado como colorante primario y durante el lava-do con agua, el verde
malaquita se elimina de las células vegetativas, pero no de la es-pora. Aquí es donde entra el
colorante de contraste fucsina de Shaeffer Foulton, que solo puede teñir a las células
vegetativas de-coloradas por acción del agua.

Coloración de Ziehl Neelsen (BAAR)

Es una tinción diferencial utilizada para la identificación de bacterias que cuentan con la
propiedad fisicoquímica de ser ácidos al-coholes resistentes (BAAR); y por lo tanto, no son
reactivas con la fuscina básica. Un ejemplo lo constituye el género Mycobacte-rium. La pared
de estas bacterias está constituida por péptidoglicano unido mediante enlaces covalentes a un
polímero de ácidos micó-licos que a su vez se asocian a unidades de azúcar como galactosa-
arabinosa. A este tipo de macromoléculas se les ha asignado el nombre general de “
arabinogalactano”, el cual debido al tamaño y al efecto estérico le confiere carácter hidrofóbico
a la bacteria.

La coloración clásica de Ziehl-Neelsen se basa en el calentamiento inicial que permi-te

aumentar tanto la energía cinética de las moléculas del colorante (fuscina de Ziehl Nielsen),
como alcanzar rompimiento de las estructuras cristalinas de las ceras, fa-voreciendo así el
ingreso del colorante a la pared bacteriana y al interior de la célula. Al suspender el
calentamiento y enfriar con agua, se provoca una nueva solidificación de los ácidos grasos
(ceras) de modo que el colorante queda atrapado dentro de dichas estructuras cristalinas y ya
no puede salir de las bacterias (39, 45).Al normalizarse la temperatura de la pre-paración, el
compuesto lipídico impermea-biliza la pared a la acción del decolorante ácido, con lo cual
el microorganismo se mantiene teñido. Las bacterias que resisten la decoloración son de color
rojo y las que no, se ven de color azul con el colorante de contraste azul de metileno de Ziehl
Neel-sen. Así mismo, las células epiteliales y otras células, que no disponen de ácido micólico en
su pared o membrana, son decoloradas, después de teñidas por la fucsina, quedan-do incoloras
y posteriormente tiñéndose de azul

Tinción con fluorocromos

La fluorescencia y la fosforescencia corres-ponden a fenómenos relacionados con la

excitación de los átomos de ciertos mate-riales, la cual se evidencia en muchos casos con la
emisión de luz. La diferencia entre los dos radica en que, en el primero, la emi-sión cesa en el
momento en que se suspenda el estímulo, mientras que en el segundo, la emisión puede continuar
por largo tiempo inclusive horas después y en la oscuridad (48).Algunos colorantes
denominados “fluoro-cromos” poseen propiedades fluorescentes, las cuales se hacen
evidentes especialmente en el rango espectral correspondiente a la luz ultavioleta.

Rodamina-auramina

Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias poseen afinidad por los
fluorocromos auramina y rodamina. Estos colorantes se fijan a las bacterias, que apa-recen
de color amarillo o naranja brillante contra un fondo verdoso. El permanganato de potasio
(KMnO4), empleado como con-traste, evita la fluorescencia inespecífica. Todos los
microorganismos ácido-alcohol resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen
con estos colorantes.Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramina es que
luego los frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun
directamente so-bre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersión.
De esta forma, los resultados positivos pueden ser confirmados con las coloraciones
tradicio-En el estudio realizado por Zinserling y cols. (49) se demuestra la mayor sensibili-
dad de las coloraciones con fluorocromos frente a la de Ziehl Neelsen, concluyendo que “
...existe evidencia de la capacidad de las micobacterias para tener polimorfismo morfológico y
de la necesidad de aclarar la patogénesis de la tuberculosis”.Además del sistema óptico para
la identi-ficación morfológica de los microorganis-mos, también se cuenta con métodos que
hacen uso de microscopios electrónicos, los cuales, disponen de un flujo de electrones que
choca contra la muestra, creando una nales, que además permiten la diferenciación
morfológica