21 de Septiembre 2020

Actividad enzimática en procesos de transformación

Laura Valentina Buendia​ ; ​Michelle Ramirez Buitrago
Estudiantes de pregrado ingeniería química. Universidad de la Sabana. Chía, Colombia

Abstract

The principal objective in this practice is to analyze the behavior of the enzyme, acid
phosphatase, by varying different conditions and factors such as optimal time, optimal pH,
optimal temperature, concentration of substrate and enzyme, taking into account enzymatic
kinetics and different models. Also the behavior is analysed in presence of a mixed inhibitor
justifying the results obtained by means of linear models and the values of Km and Vmax.

Introducción

Las reacciones metabólicas son necesarias para que los seres vivos cumplan sus funciones
biológicas, son aquellas que ocurren en condiciones muy particulares y cuando se presenta
una ausencia de un catalizador no se generan productos a la velocidad requerida. Las
proteínas han evolucionado como catalizadores biológicos conociéndose con el nombre de
enzimas las cuales son encargadas de aumentar la velocidad de las reacciones químicas en los
seres vivos mediante la disminución de la energía de activación de los reactantes. (Joyce,
1960 )

La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas las
cuales son moléculas proteicas que tienen la capacidad de catalizar reacciones químicas, por
su naturaleza proteica son inestables y se desnaturalizan. La actividad de la enzima se afecta
por factores como la concentración de sustrato, cofactores, coenzimas, enzimas, la
temperatura, la presencia de inhibidores, el pH del medio, donde su medida se debe realizar
en condiciones óptimas de dichos factores. Estos estudios proporcionan información de la
especificidad de la enzima y del mecanismo de la reacción catalítica ​(​Cinética Enzimática​,
2010).

La ecuación de Michaelis-Menten es aquella que explica el comportamiento cinético de las

enzimas. Para explicar la relación entre la velocidad de la reacción (V) y la concentración de
sustrato ([S]) propusieron que las reacciones catalizadas por una enzima ocurren en dos
etapas. Primero se da la formación del complejo enzima-sustrato y posteriormente dicho
complejo da lugar a la formación del producto. (Michaelis-Menten, 2020).
 (1)

(2)

(3)

A nivel experimental los valores de Km y Vmáx se pueden estimar a partir de gráficas

linealizadas siguiendo el modelo de Lineweaver-Burk mediante la gráfica de 1/ V Vs 1/ [S]
se obtiene una recta cuya intersección con el eje y da la inversa de la Vmáx y cuya pendiente
es equivalente a Km/Vmáx. ​(Barman, 1985)

(4)
También se pueden estimar siguiendo el modelo de Eadie y Hofstee mediante la gráfica de
velocidad de reacción Vs coeficiente entre dicha velocidad y la [S] se obtiene una recta cuya
intersección con el eje y es directamente el valor de Vmáx y cuya pendiente es -Km.
(Barman, 1985)

(5)
Para esta práctica de laboratorio es necesario analizar acertadamente la velocidad de reacción
de la fosfatasa ácida extraída de la muestra bajo diferentes condiciones mediante el cálculo de
los parámetros cinéticos como la constante de Michaelis-Menten y la velocidad máxima a
partir de los datos con y sin inhibición. Asimismo, es necesario justificar de manera correcta
los factores experimentales que afectan directamente las características cinéticas de la enzima
para finalmente interpretar los resultados obtenidos con los conceptos de cinética enzimática
y compararlos con los resultados esperados y con los reales mediante la literatura.

Las fosfatasas ácidas son un grupo de enzimas de amplia distribución y especificidad. Se

encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo. Para medir su actividad se
realiza mediante la cuantificación del fosfato liberado por medio del método colorimétrico de
Fiske-Subbarow. Donde se hace reaccionar al fosfato con ácido molíbdico para obtener ácido
fosfomolíbdico el cual reacciona como reductor en medio alcalino formando una mezcla de
óxidos de molibdeno dando una coloración azul. ​(Roberts, 1957)
El germen de trigo es un alimento rico en ácidos grasos los cuales ayudan a reducir el nivel
de colesterol en sangre y fortalece el sistema cardiovascular, su consumo recomendado es
entre dos y cuatro cucharadas diarias. También, se destaca por su alto valor en proteínas las
cuales ayudan a la recuperación y desarrollo de los músculos. El germen de trigo presenta
propiedades antioxidantes que retrasan los síntomas de envejecimiento (La vanguardia,
2019).

Metodología

Extracción de la fosfatasa ácida

Se pesaron 10 gramos de germen de trigo y se agregaron 50 mL de agua fría, se agitó

hasta tener una suspensión uniforme. Se dejó en reposo por 30 minutos de manera
seguida se decantó por 15 minutos y se filtró la solución descartando los residuos. Se
denominó esta solución como el extracto crudo de fosfatasa ácida y se mantuvo en
hielo.

Preparación de curva de calibración de fosfato inorgánico

Se realizaron las soluciones descritas en la tabla 1 (ver anexos 1). Se agitaron bien los
tubos y se dejaron en reposo y se dejaron en reposo por 3 minutos, se adicionaron 0,5
ml de la solución de ácido ascórbico a cada tubo. Posteriormente se agitaron los tubos
y se dejaron en reposo por 10 minutos. Al desarrollarse el color se determinó la
absorbancia a 660 nm.

A.1 Procedimiento para determinación de cantidad de fosfato producido por

acción de fosfatasa ácida

En todos los casos se preparó la mezcla de reacción como se indica en la tabla 2 (ver
anexos 2). Se agitó bien y se dejó reposar por 3 minutos, después se adicionan 0,5 ml
de ácido ascórbico. Se agitó nuevamente y se dejó en reposo por 10 minutos para leer
la absorbancia a 660 nm. Estos valores se emplearon para la elaboración de la curva
de calibración.

Determinación del tiempo óptimo de incubación

Se prepararon las reacciones de la tabla 3 (ver anexos 3). Se agitó bien y se incubó a
temperatura ambiente, sin embargo el blanco de buffer (BB) y el blanco de sustrato
(BS) se dejaron reaccionar por 30 minutos. En este tiempo se tomaron muestras de 1
ml de blanco enzima (BE) y del tiempo de reacción (TR) a diferentes tiempos, (2, 5,
10, 15, 20, 30 minutos) y estas se recibieron en tubos que contenían 1 ml de ácido
tricloroacético al 10%, se agitó y se centrifugó a 4000 rpm durante 3 min. Pasado el
tiempo (30 min de incubación) se tomaron alícuotas de 1 ml y se llevaron ácido
tricloroacético al 10% incluyendo las de BB y BS. Se determinó la cantidad de
fosfato producido en el sobrenadante ajustando el 100% de T con el tubo BB,
siguiendo el procedimiento A1.

Efecto del pH, determinación del pH óptimo

Se realizaron las reacciones descritas en la tabla 4 (ver anexos 4) con los reactivos
específicos para esta prueba (ver anexos 4). Se mezcló de manera correcta y se agregó
enseguida la enzima a intervalos de 30 segundos, completando lo indicado en la tabla
4 (En la fila de enzima). De nuevo, se mezcló el contenido de cada tubo y se dejó
incubar por 10 minutos, al pasar este tiempo se le agregó a cada tubo 2 ml de ATA
10%, se mezcló y se centrifugó 4000 rpm durante 3 minutos. El precipitado se
descartó y en el sobrenadante se aplicó el procedimiento A1.

​​Efecto de la temperatura, Determinación de la temperatura óptima

Se realizaron las reacciones descritas en la tabla 6 (ver anexos 6) con los reactivos
específicos para esta prueba (ver anexos 6), las temperaturas utilizadas para la prueba
se especifican en la tabla 5 (ver anexos 5). Se mezcló de manera correcta y se agregó
enseguida la enzima a intervalos de 30 segundos, completando lo indicado en la tabla
6 (En la fila de enzima). De manera seguida, se mezcló el contenido de cada tubo y se
dejó incubar por 10 minutos, al pasar este tiempo se le agregó a cada tubo 2 ml de
ATA 10%, se mezcló y se centrifugó 4000 rpm durante 3 minutos. El precipitado se
descartó y en el sobrenadante se aplicó el procedimiento A1.

Efecto de la concentración de la enzima en la velocidad de reacción

Se realizaron las reacciones descritas en la tabla 7 (ver anexos 7) con los reactivos
específicos para esta prueba (ver anexos 7). Se mezcló de manera correcta y se agregó
enseguida la enzima a intervalos de 30 segundos, completando lo indicado en la tabla
7 (En la fila de enzima). De nuevo, se mezcló el contenido de cada tubo y se dejó
incubar por 10 minutos, al pasar este tiempo se le agregó a cada tubo 2 ml de ATA
10%, se mezcló y se centrifugó 4000 rpm durante 3 minutos. El precipitado se
descartó y en el sobrenadante se aplicó el procedimiento A1.
 Efecto de la concentración de sustrato, determinación de la constante de
Michaelis (Km)

Se realizaron las reacciones descritas en la tabla 8 (ver anexos 8) con los reactivos
específicos para esta prueba (ver anexos 8). Se mezcló de manera correcta y se agregó
enseguida la enzima a intervalos de 30 segundos, completando lo indicado en la tabla
8 (En la fila de enzima). De nuevo, se mezcló el contenido de cada tubo y se dejó
incubar por 10 minutos, al pasar este tiempo se le agregó a cada tubo 2 ml de ATA
10%, se mezcló y se centrifugó 4000 rpm durante 3 minutos. El precipitado se
descartó y en el sobrenadante se aplicó el procedimiento A1.

Efecto de la presencia de un inhibidor en la velocidad de reacción

Se realizaron las reacciones descritas en la tabla 9 (ver anexos 9) con los reactivos
específicos para esta prueba (ver anexos 9). Se mezcló de manera correcta y se agregó
enseguida la enzima a intervalos de 30 segundos, completando lo indicado en la tabla
9 (En la fila de enzima). De nuevo, se mezcló el contenido de cada tubo y se dejó
incubar por 10 minutos, al pasar este tiempo se le agregó a cada tubo 2 ml de ATA
10%, se mezcló y se centrifugó 4000 rpm durante 3 minutos. El precipitado se
descartó y en el sobrenadante se aplicó el procedimiento A1.

Resultados y cálculos

Análisis

La cinética enzimática es aquella que estudia la velocidad de las reacciones que son
catalizadas por enzimas ( Dua , 2019), sin embargo el comportamiento de estas se ve afectado
por diversos factores, tales como la temperatura, el pH, la presencia de inhibidores, la
concentración de sustrato, entre otras. (Rodriguez, 2020). En primer lugar es necesario aclarar
los datos expuestos en la tabla 1, de los cuales se realizó la curva de calibración que se
observa en la figura 1, donde se representaron los valores de concentración y absorbancia,
tomando la en la ordenada la absorbancia, mientras que en la abscisa la concentración molar.
La gráfica nos permitió determinar una ecuación de la recta, donde “Y” es la absorbancia,
“X” la concentración, es de esta manera como fue posible hallar en las diferentes pruebas la
concentración de las muestras. A su vez es posible asegurar que la curva contó desde un
principio con un valor de coeficiente de determinación aceptable, por lo cual no fue necesario
la eliminación de datos.

En cuanto a la primera prueba realizada, tiempo óptimo de incubación, se buscó

analizar a qué tiempo es posible observar una mejor formación de producto es decir hasta que
tiempo (minutos) es óptimo mantener en incubación la enzima con una concentración de
sustrato. De manera adicional es posible asegurar que a mayor tiempo de incubación de la
enzima con el sustrato, se espera una mayor formación de producto, ya que a mayor
concentración de reactivos la formación de los productos aumentará conforme pasa el tiempo
( ​Rezeki, 2011). Es de esta manera que en la figura 2 se observa que conforme aumenta el
tiempo aumenta la velocidad de la reacción, sin embargo se nota una disminución pasado 20
minutos, esto se pudo haber presentado por errores experimentales al momento de tomar el
valor de las absorbancias, por consiguiente se genera una disminución de la velocidad de
reacción permitiendo así asegurar, que el tiempo óptimo de incubación, siguiendo los datos
obtenidos en la figura 2, es de 20 minutos.

Por otro lado, es conocido que el pH del medio afecta directamente la actividad de la
enzima, ya que la gran mayoría de la enzimas son muy sensibles a cambios en este factor, ya
que un pequeño alejamiento, ya sea por encima o por debajo del pH óptimo generan un gran
impacto sobre la enzima (Urquijo,2020) ya que cambia la forma del ciclo activo, generando
que la enzima no pueda catalizar de manera correcta la reacción puesto que no se puede unir
al sustrato. Adicionalmente, los efectos el efecto del pH son de gran relevancia también por
ser capaz de desnaturar la enzima, es decir que la enzima pierde sus estructuras cuaternaria,
terciaria y secundaria al alterar el carácter iónico de los grupos amino y carboxilo de la
superficie proteica (Rodriguez,2019). Como se puede observar en la figura 3, el pH óptimo
de la enzima se encuentra entre 5 y 5,2 puesto que en estos dos puntos es posible observar la
mayor velocidad de reacción (​0,018 mg/ ml min) ​, sin embargo se observa que a mayor pH
hay una decadencia de velocidad así como a pH bajos donde la velocidad contaba con valores
muy pequeños, sin embargo cabe resaltar que se trata de la enzima fosfatasa ácida por lo que
se espera que su pH óptimo se encuentre en un rango ácido. De manera adicional se observa
en la tabla ciertos valores negativos, la explicación matemática se basa en que al restarle a la
concentración antes de añadir ATA de las muestras, la concentración antes de añadir ATA
del BE (Blanco enzima) y BS (Blanco sustrato). Se presentan mayores valores de
concentración de BE y BS, por lo tanto, al generar la resta se presentan valores negativos, lo
cual siguiendo con la desnaturalización tiene bastante sentido ya que a valores tan alejados
del pH óptimo la actividad se debe observar bastante afectada, llegando al punto de observar
una velocidad negativa. Al comparar con la literatura, es posible hallar que el valor del pH
óptimo para la fosfatasa alcalina se encuentra entre 5 y 5,5 (Hernandez, 2001), es asi como el
valor obtenido es acertado ya que se encuentra dentro del rango, apoyando el comportamiento
expresado en la figura 3.

La temperatura es otro factor que afecta el poder catalítico, es decir, la actividad ​de la
enzima. En la mayoría de los casos la velocidad aumenta a medida que aumenta la
temperatura. Sin embargo, a temperaturas muy altas la enzima tiende a desnaturalizarse
donde, como se ha mencionado antes, la enzima pierde su forma y de esta manera deja de
trabajar perdiendo su actividad catalítica ​(Khan Academy, n.d.). ​Como se puede observar en
la figura 4, la temperatura óptima se encuentra a 37 ºC con una velocidad de 0,08435
mg/mLmin que es el punto más alto de la gráfica, en dicha temperatura se encuentra la
actividad catalítica máxima. La temperatura óptima varía mucho de acuerdo a la enzima que
se esté estudiando ​(Martínez Guerra, n.d)​. En la tabla 4 se puede observar un valor negativo
de velocidad a una temperatura de 0ºC, a nivel matemático esto se presentó por las mismas
razones explicadas anteriormente en el análisis de pH, ya que se realizó casi el mismo
procedimiento para el cálculo de la velocidad. Al comparar con la literatura, se encuentra que
dependiendo de las condiciones del medio la temperatura óptima varía entre 45-62 ºC ​(Guija,
2007), los valores teóricos y experimentales se acercan pero no están dentro del mismo rango,
esto se pudo haber presentado por diversos factores como el tiempo de reacción y los valores
de absorbancia tomados.

Por otro lado, respecto a la concentración de la enzima se estima que a mayor

concentración de enzima mayor será la velocidad de reacción, siempre y cuando se cuente
con sustrato al cual adherirse. Este comportamiento se observa en la figura 5, donde a pesar
de tratarse de una gráfica velocidad versus volumen, se observa un comportamiento
ascendente, por lo tanto, a mayor volumen de enzima agregado, mayor es la velocidad de
reacción ya que el sustrato puede interactuar de una mejor manera generando mayor cantidad
de productos, es decir que la actividad enzimática es directamente proporcional a la
concentración de enzima. Además esto se logra exponer en la cinética michaeliana en la
ecuación 4.

Adicionalmente se midió el efecto de la concentración de sustrato. Siguiendo el

modelo cinético de Michaelis-Menten, en una curva de concentración de sustrato se pueden
resaltar tres partes. En la primera parte a bajas concentraciones de sustrato, la velocidad es
proporcional a la concentración, siendo una reacción de primer orden (Hestrin, 1955). En la
segunda parte de la curva, concentraciones intermedias, la velocidad no aumenta como en la
primera parte con el incremento de la concentración, iniciando alrededor de un medio de
Vmax. Y finalmente en la última parte de la curva a altas concentraciones de sustrato, la
velocidad es independiente de la concentración de sustrato, siendo una reacción de orden
cero, alcanzando así la Vmax. (Bennet,1973) Este comportamiento se puede ver representado
en la figura 6 ya que se tiene una dependencia hiperbólica (forma de parábola) ya que al
agregar mayor concentración de sustrato la enzima podrá catalizar menores cantidades,
disminuyendo la velocidad,al y como plantea el modelo mencionado anteriormente además
aunque no es exacta la gráfica, representa a su vez la ecuación 2.

Los inhibidores son aquellas moléculas o iones que afectan la actividad o la afinidad
de una enzima, se encuentran de manera natural en las células para controlar la velocidad de
una reacción metabólica. La interacción entre un inhibidor y una enzima varía de acuerdo a la
naturaleza química del inhibidor y a la reacción que la enzima cataliza (Bennet,1973). En
cuanto al comportamiento de la enzima en presencia de inhibidor se puede ver en la figura 6
y la figura 7, cómo varía la velocidad de reacción sin inhibidor y con inhibidor. Al estar
presente el inhibidor la velocidad de cada muestra disminuye tal como se esperaba según el
fundamento teórico. En la muestra 1 sin inhibidor se presenta una velocidad de 0,0794
mg/mLmin y con inhibidor se obtiene una velocidad de 0,0433 mg/mLmin.

Finalmente se realizó la linealización de Lineweaver-Burk para concentración de

sustrato y concentración de sustrato con inhibidor, como se observa en la figura 8. Esta
gráfica presenta el comportamiento esperado, ya que siguen el comportamiento lineal
expresado en la literatura. La finalidad de la linealización es determinar de qué tipo de
inhibidor se trata siguiendo con la ecuación 4 y la ecuación de la recta (y=mx+b), de esta
manera se determinó que se trata de un inhibidor mixto ya que al realizar los cálculos el km
de sin inhibidor da un valor aproximado de 6,182 mientras que el de de con inhibidor es
aproximadamente 10,37, es decir que aumenta significativamente el km, disminuyendo la
afinidad, por lo tanto la Vmax de sin inhibidor es mayor que con inhibidor (0,142 mg/ml min
y 0,112 mg/ml min respectivamente) siguiendo el comportamiento mixto donde aumenta el
Km y disminuye la Vmax (Lira,2013).

Conclusiones

En primer lugar, el tiempo óptimo de incubación es de 20 minutos donde se presenta una

mayor formación de producto, por lo tanto, hasta este tiempo es óptimo mantener en
incubación la enzima con cierta concentración de sustrato.

En cuanto al pH óptimo, se tomaron los valores que se encontraban a una velocidad de 0,018
mg/ ml min, encontrándose el pH entre 5 y 5,3. Al comparar con la literatura se encontró que
el pH de esta enzima se encuentra entre 5 y 5,5 por lo tanto la prueba fue exitosa pues el
valor experimental se encuentra dentro del rango y además se justifican estos valores al
tratarse de la enzima fosfatasa ácida, cuyo nombre indica que se desempeña mejor en
entornos ácidos.
La temperatura óptima se encuentra a 37 ºC con una velocidad de 0,08435 mg/mLmin que es
el punto más alto de la gráfica. Al comparar con la literatura se encontró que la temperatura
de esta enzima varía entre 45-62 ºC, se puede observar que estos valores ​se acercan pero no
están dentro del mismo rango por diversos factores como el tiempo de reacción y los valores
de absorbancia tomados.

Por otro lado se pudo demostrar por medio de la figura 5 el comportamiento cinético de la
enzima ajustado al modelo de Michaelis-Menten expresado en la ecuación 3, donde se
expone que la concentración de enzima es directamente proporcional a la velocidad de
reacción.

En cuanto a la concentración de sustrato, la gráfica 6 sigue la dependencia hiperbólica

expuesta en la literatura, siguiendo el comportamiento cinético del modelo de michaelis
menten, donde claramente se observa que a mayor concentración de sustrato la enzima llega
aun punto de saturación, donde la velocidad simplemente se mantiene constante.

Finalmente se determinó que el Km sin inhibidor es de 6,182 mientras que con inhibidor es
de 10,37. Para la velocidad máxima se determinó que sin inhibidor es de 0,142 mg/ ml min y
con inhibidor es de 0,112 mg/ ml min, por lo tanto se asocia el inhibidor con uno mixto
puesto que la velocidad disminuye, al igual que la afinidad al aumentar el valor de Km.

Bibliografía

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Anexos 1

​Tabla 1: Volúmenes de reactivos utilizados en la preparación de la curva de calibración

Tubo Patrón de fosfato Agua (ml) Ácido molíbdico (ml)

mg/ml (ml)

B – 4.0 0.5

1 0.1 3.9 0.5

2 0.2 3.8 0.5

3 0.3 3.7 0.5

4 0.4 3.6 0.5

5 0.5 3.5 0.5

Anexos 2

Tabla 2: Volúmenes de sustancias utilizadas en mezcla de reacción para determinación de

fosfato

Sobrenadante de la reacción enzimática 0.5 ml

Agua destilada 3.5 ml

 Ácido molíbdico 0.5 ml

Anexos 3

Tabla 3: Volúmenes de reactivos para prueba de tiempo óptimo

Mezcle bien los
Tubo Buffer β-g​ licero Agua (ml) tubos y agregue Extracto enzimático (ml)
citráto 0.1 fosfato de a continuación
M de pH sodio (ml)
5.3 (ml)

Blanco 5.6 – 2.4 –

buffer
(BB)

Blanco 5.6 1.6 0.8 –

sustrato
(BS)

Blanco
5.6 – 1.6 0.8
enzima
(BE)

Tiempo 5.6 1.6 – 0.8

reacción
(TR)

Anexos 4

Sustrato: Solución de β​-g​ licerofosfato de sodio 0.1 M

Buffer: Soluciones de buffer de citrato 0.1 M, diferentes pHs

Enzima: Extracto enzimático crudo

Tiempo de reacción: 10 minutos

Tabla 4: Volúmenes de reactivos utilizados en prueba de pH óptimo

Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5 6

Sustrato – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4

(ml)

Buffer 2.0 1.6 1.8 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4
(ml)

pH del 5.3 5.3 5.3 3.0 4.0 5.0 5.3 5.6 6.2
buffer

Enzima – – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

(ml)

Anexos 5

Tabla 5: Temperaturas utilizadas en determinación de temperatura óptima

Temperatura, °C Medio

0 Agua – Hielo
 18 Temperatura ambiente

37 Termostato

60 Termostato

98 Agua en ebullición

Anexos 6

Buffer: Solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3

Sustrato: Solución de ​b-​glicerofosfato de sodio 0.1 M

Enzima: Extracto enzimático crudo

Tiempo de reacción: 10 minutos

Temperatura: ver tabla 5

Tabla 6: Volúmenes de reactivos utilizados en prueba de temperatura óptima

Tubo BB BS BE 1 2 3 4 5

Buffer (ml) 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4

Sustrato (ml) – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4

Agua (ml) 0.6 0.2 0.4 – – – – –

 Temperatura 18 18 18 0 18 37 60 92
°C

Enzima (ml) – – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Anexos 7

Buffer: Solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3

Sustrato: Solución de ​b-​glicerofosfato de sodio 0.1 M

Enzima: Extracto enzimático crudo

Tiempo de reacción: 10 minutos

Temperatura: temperatura ambiente

Tabla 7: Volúmenes de reactivos utilizados en la determinación del efecto de la

concentración de la enzima

Tubo B BS BE 1 2 3 4 5
B

Buffer 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2

(ml)

Sustrat – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4

o (ml)

Agua 0.8 0.4 0.7 0.35 0.3 0.2 0.1 –

(ml) 5 0 5 0
 Enzima – – 50 50 100 150 300 400
(µl)

Anexos 8

Buffer: Solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3

Sustrato: Solución de ​b-​glicerofosfato de sodio de diversas concentraciones en el rango 5 –

100 mM.

Enzima: Extracto enzimático crudo

Tiempo de reacción: 10 minutos

Temperatura: temperatura ambiente

Tabla 8: Volúmenes de reactivos para la determinación del efecto de la concentración del

sustrato en la velocidad de reacción
Tubo
BB BS BE 1 2 3 4 5 6 7 8

Buffer
(ml) 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4

Sustrato a
adicionar* – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8
(ml)

concen*
[S} mM – 5 – 5 10 20 40 60 80 100 100

Agua (ml)
1.0 0.6 0.8 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 –
 Enzima (ml) – – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Anexos 9
Buffer: Solución de buffer de citrato, 0.1 M, pH 5.3
Sustrato: Solución de –glicerofosfato de sodio de diversas concentraciones en el rango
5–100 mM.
Enzima: Extracto enzimático crudo
Tiempo de reacción: 10 minutos
Temperatura: temperatura ambiente
Inhibidor: HgCl2 5 mg/ml

Tabla 9: Volúmenes de reactivos para la determinación del efecto de la concentración del

sustrato con inhibidor en la velocidad de reacción
Tubo
BB BS BE 1 2 3 4 5 6 7 8

Buffer
(ml) 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2

Sustrato a
adicionar* – 0.4 – 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.8
(ml)

concen*
[ S ] mM – 5 – 5 10 20 40 60 80 100 100

Agua (ml)
1.2 0.6 0.8 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 –

Inhibidor
(ml) – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Enzima (ml) – – 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2