FINFORME PRACTICA 1

EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDO ASCÓRBICO.

Luisa Beatriz Leon Diaz.’ ​[email protected]

Thomas Santiago Benavides Acosta.’’ [email protected]
Grupo 3.
Laboratorio de Principios de Bioquímica.
Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá
2019.

Resumen:
El objetivo principal del presente artículo fue cuantificar el contenido de ácido ascórbico
(AA) contenido en un limón por medio del análisis de la variación de la absorbancia.
Primero, la molécula fue estabilizada y puesta en disposición por medio de su reacción con el
ácido oxálico, posteriormente se añadieron una serie de reactivos para poder observar y
analizar la coloración en diferentes concentraciones, tanto en las muestras patrón para la
construcción de la curva de calibración como a las muestras del zumo de limón para
interpolar su concentración en la curva. La concentración de AA en el zumo de limón fue de
2,4 mg/mL, su masa total en el limón fue de 63 mg y su p/p del 0,089%, estos valores
difieren de los establecidos como generales por la literatura pero se sabe de numerosas
investigaciones en las que las concentraciones de AA son diferentes dependiendo de la
variedad de la planta su crecimiento, disposición de nutrientes, entre otros factores así como
puede variar por diferentes tratamientos en esta molécula oxidable.

Palabras claves: Ácido ascórbico, espectrometria, Ley de Lambert- beer

Introducción:

El ácido ascórbico (AA) o vitamina C, es una vitamina esencial e hidrosoluble, sintetizada

químicamente de la glucosa en procesos catalizados por enzimas donde la L-gulono-y-lactona
oxidasa (GNO) es la última enzima involucrada en el proceso. En los primates, el cobaya,
algunos murciélagos frugívoros y en algunas aves esta enzima no está presente por lo que
tienen una incapacidad para sintetizar como si lo hacen la gran mayoría de los animales
(Serra et al, 2007).

Al ser una vitamina esencial debe consumirse regularmente pues interviene en la síntesis del
colágeno, lípidos, proteínas, norepinefrina, serotonina, L-CARNITINA Y EN el metabolismo
de tirosina, histamina y fenilalanina (Latham, 2002), por lo que su deficiencia en el
organismo lleva al desarrollo de síntomas y enfermedad como el escorbuto que según Serra et
al, 2007, es una enfermedad en la que el principal problema es la falta de síntesis de colágeno
después de tres semanas de no ingestión de AA donde las manifestaciones clínicas incluyen
fatiga, hemorragias, pérdida de dientes, deficiencia en la cicatrización entre otras.

Entre sus numerosas funciones en el organismo se tiene que el AA facilita la absorcion,

distribucion y almacenamiento del hierro en el tracto digestivo, regenera la vitamina E,
protege la oxidación de las lipoproteinas de baja densidad (LDL) y se incorpora a ellas para
cumplir sus funciones antioxidantes en las que el AA tiene mayor protagonismo a través de
todo el organismo (Serra et al, 2007).

El ácido ascórbico (C6H8O6) tiene un peso molecular de 176,13, es hidrosoluble y posee

propiedades ácidas y fuertemente reductoras debidas a su estructura enediol y a la posibilidad
de ionizar el hidroxilo situado sobre el carbono 3, formando un anión que queda estabilizado
por resonancia (FIGURA 1). Pero es esta misma estructura la responsable de que el AA en
los alimentos sea particularmente sensible a las reacciones de oxidación, destruyéndose con
gran facilidad durante el procesado de los alimentos. Esta oxidación, es dependiente del pH,
la concentración de oxígeno y las enzimas entre otros factores. Esta degradación consiste en
esencial una hidrólisis del anillo (figura 2) después de una pérdida de electrones en la que se
vuelve altamente inestable desencadenandose a la degradación por descarboxilación
perdiendo su valor nutricional. (Serra et al, 2007).

Aunque las células tengan una incapacidad para sintetizar AA, existen unas células de
algunos órganos que han adquirido la capacidad de extraerlo de la sangre y concentrarlo para
su posterior disposición, aún así numerosas investigaciones han llegado a la conclusión de
que la dosis requerida para adultos es de 100mg diarios. Ésta vitamina se puede encontrar en
las frutas cítricas, guayabas, verduras verdes y muchos más alimentos y en diferentes
concentraciones (Serra et al, 2007).

.
Figura 1. Forma estructural del AA
Espectrometria:

Es un método científico utilizado para medir cuanta luz absorbe una sustancia química,
midiendo la intensidad, de la luz cuando un haz luminoso pasa a través de la solución
muestra, basándose en la ley de Beer-Lambert.

El principio básico es que cada compuesto absorbe o transmite luz sobre un cierto rango de
longitud de onda.

Ley de Lambert:

Esta establece que cuando pasa luz monocromática por un medio homogéneo, la disminución
de la intensidad del haz de luz incidente es proporcional al espesor del medio, lo que equivale
a decir que la luz transmitida disminuye exponencialmente al aumentar aritméticamente el
espesor del medio absorbente.

P0: intensidad de la incidente.

K: constante, cuyo valor depende de la longitud de onda
de la luz incidente del espesor del medio absorbente y de
la naturaleza del mismo.
P: Intensidad de la luz transmitida.
B: Espesor del medio absorbente.

Ley de Beer:
La intensidad de un haz de luz monocromática disminuye exponencialmente al aumentar
aritméticamente la concentración de la sustancia absorbente cuando este haz pasa a través de
un medio homogéneo.

P0: intensidad de la incidente.

C: Concentración de la solución
P: Intensidad de la luz transmitida.
K: constante, cuyo valor depende de la longitud de onda
de la luz incidente del espesor del medio absorbente y
de la naturaleza del mismo.

Ambas leyes se combinan en una sola, generando la Ley de Lambert- beer

Log P0/P = abc ó A=abc

A= log P0 / P = -LogT

a: Absortividad b: Longitud o espesor del medio (cubeta)

c: concentración de la solución. P/P0: T= transmitancia.

MATERIALES Y MÉTODOS en minuscula

Para realizar la cuantificación de ácido ascórbico se utilizaron los siguientes materiales e

instrumentos:

- Zumo de medio limón (Citrus aurantifolia).

- Ácido oxálico 0,15% (p/v).
- Etanol absoluto
- NaOH 20% (p/v).
- 2-nitroanilina 0,16% (p/v).
- Nitrito de sodio 0,08% (p/v).
- Patron de vitamina C 0,2 mg/mL

- Probeta de 100 mL
- Suficientes tubos de ensayo
- Papel filtro
- Embudo
-
- Pipeta micrometrica

Para construir la curva de calibración:

 - En seis tubos de ensayo se adicionó en orden decreciente los reactivos de la Tabla 1.
- Terminado el paso 2, se dejaron las mezclas cinco minutos en reposo y se continuó
con el paso 3.
- Se mezcló bien el contenido de cada tubo de ensayo y se hizo la lectura de estos en el
espectrómetro a 540 nm.

Paso Reactivos en mL Blanco P1 P2 P3 P4 P5 P6

1 2-nitroanilina 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

Nitrito de sodio 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

2 Etanol absoluto 1 1 1 1 1 1 1

Patron vitamina C 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Ácido oxálico 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

3 NaOH 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6

Agua destilada 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6

Tabla 1. Reactivos adicionados para la construcción de la curva de calibración.

Para determinar el contenido de ácido cítrico en el limón:

1. Se dividió un limón en dos partes aproximadamente iguales y se pesó su masa.

2. Se exprimió manualmente su contenido, filtrando las partículas más grandes y se
midió su volumen.
3. En un tubo de ensayo se mezcló 1 mL del zumo con 4 mL de ácido oxálico 0,15%
(p/v).
4. En tubos de ensayo se adiciono de forma ascendente el contenido de la Tabla 2.
5. Luego de agitar correctamente el contenido de cada tubo de ensayo se procedió a
determinar su absorbancia a 540nm en el espectrómetro.

Paso Reactivos en mL Blanco M1 M2

problema

1 2-nitroanilina 0.1 0.1 0.1

Nitrito de sodio 0.2 0.2 0.2

2 Etanol absoluto 1 1 1

Zumo de limon 0.3 0.3 0.6

 Ácido oxálico 0.6 0.3 0

3 NaOH 0 0.6 0.6

Agua destilada 2.9 2.6 2.6

Tabla 2. Adición de reactivos para la determinación de ácido cítrico en el limón.

RESULTADOS

TABLA 3. Datos de las muestras analizadas

MUESTRA PESO(g) VOLUMEN DE ZUMO
(mL)

½ Limón 35,835 13,0

TABLA 4. Datos registrados a partir de análisis espectrofotométricos.

Blanco Blanco P1 P2 P3 P4 P5 P6 M1 M2
problema

Absorbanci 0 0 0,113 0,209 0,301 0,388 0,457 0,591 0,452 0,945

a inicial
540 nm

TABLA 5. Concentración de vitamina C en los patrones.

P1 P2 P3 P4 P5 P6

Concentraci 0,004 0,008 0,01 0,01 0,02 0,02

ón (mg/mL)

Teniendo en cuenta los valores reportados en la tabla 4 y 5, se obtuvo la gráfica del espectro
de absorcion.
 Figura 3. Curva de calibración de una disolución de ácido ascórbico.

CONCENTRACIÓN DE AA EN LA MUESTRA

Ecuación 1. La recta de tendencia.

y = 24,043x + 0,0113

Ecuación 2. Concentración despejada de la ecuación general de la recta.

(y − 0,0113)
x = 24,043

TABLA 6. Concentración de AA en las muestras.

Muestra Volúmen de zumo Absorbancia Concentración
(mL)

1 0,3 0,452 0,0183

2 0,6 0,945 0,0388

Promedio: 0,5 0,699 0,0286

Ecuación 3. Concentración de vitamina C en el limón. FD: Factor de dilucion.

 [AA] x F D1 x F D2 = [AA en el zumo]

5,10 5,0
[0, 0286] x 0,30 x 1,0
= 2, 5mg/mL

Ecuacion 4. Masa total de la vitamina C en el zumo del limón.

[AA en el zumo] x volumen total del zumo = M asa total de AA en el zumo

2, 5mg/mL x 26, 0mL = 63mg

Ecuación 5. Porcentaje peso a peso de la vitamina C en el zumo del limón.

masa de la muestra
% p/p = masa total x 100

63mg
71670mg
x 100 = 0, 089%

Análisis de la curva de calibración:

Respecto al análisis de la recta de calibración generada, hay una relación lineal entre la
absorbancia (Y) y la concentración del analito (X), cuando la ley de Beer-Lambert se cumple,
establecida como Y: mx + b.
Cualquier desviación de la línea recta de los puntos individuales es resultado de un error de
medición (Hess, Kask , 1973). Se ve en esta gráfica, una ligera dispersión de los puntos, lo
que siempre es de esperar que suceda, teniendo en cuenta los errores sistemáticos del equipo
así como los errores personales en las medidas; pero la linealidad general es buena, lo que
indica que la ley de Beer-Lambert es aplicable en este sistema (Ramette, 1983).
Una medida de linealidad es el coeficiente de correlación al cuadrado R2,que se determinó
con la función de estimación lineal en Excel. Obteniéndose un resultado de 0,9953 que al ser
mayor que 0,995 (Harris, 2003) indica un buen ajuste de los datos experimentales respecto a
la línea recta obtenida por mínimos cuadrados.

Análisis de la muestra problema

La curva de calibración permite determinar la concentración de soluto en una solución

problema, para ello a esta solución desconocida se le mide experimentalmente su
absorbancia, en este caso fue para la muestra uno, 0,452, la muestra dos, 0,945 y como
medida promedio 0,699 y se puede utilizar la ecuación de regresión y=mx+b para despejar la
concentración, así: x=(y-b)/m siendo x la concentración, y la absorbancia, m la pendiente y b
el intercepto con el eje y, al reemplazar se obtiene que la concentración para m1 es de
0,0183, m2 0,0388 y el promedio entre las dos 0,0286.
La concentración de la m1 es la única a la cual se le puede ubicar dentro de la gráfica e indica
una fuerte coherencia con la curva de calibración ya que al observar las coordenadas en la
gráfica se puede determinar que la concentración desconocida está en el intervalo de 0,0154 y
0,0156 mg/mL. Respecto a la otra muestra no se le puede ubicar dentro de la gráfica por las
concentraciones menores comparativamente de la curva pero se sabe que basta con interpolar
los resultados de la absorbancia para ubicarla dentro de ella, así mísmo con el promedio
calculado.

Por otra parte, la concentración del AA en el zumo después de tener en cuenta las diluciones
realizadas en total, es de 2,5 mg/mL, su masa total en el limón es 63 mg y el porcentaje
peso/peso es 0,089% resultados mucho mayores que los reportados por la literatura los cuales
corresponden a 0,5 mg/mL (UNAL, 2017) y un % p/p de 0,053 (Laat, 1954). Estas
diferencias pueden ser debidas a la variedad de los ejemplares pues como se ha visto en
diversos estudios, es un factor determinante de producción de AA, también se puede suponer
que son debidas al tiempo de cada experimento o las concentraciones de ácido oxálico pues
como ya se ha dicho dispone y conserva la vitamina, así como otros factores de exactitud y
precisión en los experimentos.

Según UNAL, 2017 el AA puede presentarse en forma libre (ácido ascórbico) o en forma
combinada (ácido ascorbígeno), ésta última forma no puede ser detectada a menos que se
hidrolice a su forma libre y el método para hacerlo es hirviendo el material con ácido oxálico,
de la misma forma la naturaleza química oxidable del AA requiere un compuesto que lo
estabilice.

Conclusiones:

- El ácido oxálico es un componente esencial para determinar las concentraciones del

AA al estabilizarlo y evitar su oxidación.
- La absorbancia de las diluciones están directamente relacionadas con la
concentración y la linealidad de la recta resultante es buena si se realizan
correctamente las prácticas y se tienen en cuenta las diluciones y cálculos lo que es un
buen indicador de lo adecuado de la práctica bajo este método.
- Aunque los resultados difieren de los reportados por la literatura, son confiables por la
gran diversidad de variedades vegetales que existen o por el crecimiento y
maduración en la planta, además de verse afectadas las concentraciones por el trato
durante la experimentación.

Referencias:

Harris, D. (2003). Análisis químico cuantitativo . Barcelona : Reverté S.a.

Hess G. Kask U. (1973). Química general experimental. Compañía editorial continental, S.A.
Laat, 1954. Estudio comparativo del contenido de ácido citrico y vitamina C en algunas
variedades de Citrus de uso popular. Rev. BioÍ. Trop. 2 ( 1 ) :45-58.

Latham, 2002. Nutricion humanan en el mundo en desarrollo. Organizacion de las Naciones

Unidas para la agricultura y la alimentacion. Roma. Disponible
en:​http://www.fao.org/3/w0073s/w0073s00.htm#Contents

Ramette R. (1983) Equilibrio y análisis químico. 153-155, Fondo educativo interamericano.

Serra et al, 2007. Ácido ascórbico: desde la química hasta su crucial función protectiva en
ojo. Bioquímica Clinica. Universidad Nacional de Cordoba. Argentina. Disponible en:
https://www.redalyc.org/pdf/535/53541410.pdf
 INFORME PRACTICA 2.
ESTUDIO DE LA ​ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA

Luisa Beatriz Leon Diaz​2​ ​[email protected]

Thomas Santiago Benavides Acosta.​1 ​ [email protected]
Grupo 3.
Laboratorio de Principios de Bioquímica.
Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá.

Resumen:
En esta práctica de laboratorio se realizaron 4 pruebas experimentales que se veían
implicadas con el comportamiento de la actividad enzimática de la catalasa, donde se
analizó cómo interfieren de forma favorable o no el pH, la concentración enzimática, la
cantidad del sustrato mL y efecto del inhibidor ​c​ianuro de sodio ​ (NaCN) el cual se
descarto para dejar actuar a la enzima a temperatura ambiente en diferentes intervalos de
tiempo. las cuales se ven implicadas fue expuesta
Se encontró que la actividad enzimática de la catalasa es afectada por los anteriores
factores mencionados en los cuales tres de ellos favorecen a un mejor desempeño de la
enzima caso contrario en el cual al descartar el uso del NaCN y exponer la muestra a
temperatura ambiente durante la reacción los resultados no fueron los esperados, pues no
se descarta la posibilidad de que el proceso se vio afectado por la baja temperatura del
medio ambiente o un mal procedimiento experimental.

Palabras claves: Catalasa, pH, concentracion, sustrato, ​c​ianuro de sodio (​NaCN ​),
temperatura ambiente.

Introduccion:

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA

Las enzimas poseen un pH característico donde su actividad es máxima: por encima o debajo
de ese pH la actividad disminuye. La relación pH - actividad enzimática, constituye un factor
de regulación intramolecular de la actividad enzimática.

La reacción de la catalasa sobre el H​2​O​2​, es: 2 H​2​O​2 ​ Catalasa 2 H​2​O +​ O​

​ 2

Metodología​:

Para realizar el estudio de la actividad enzimática de la catalasa se utilizaron los siguientes

materiales e instrumentos:
 - • Amortiguador fosfatos 20 mM, pH 4, 5, 6, 7 y 8
- 2 habichuelas frescas
- H2SO4 6N
- KMnO4 5 mM
- NaCN 0.05 nM
- Solución de H2O2 50 mM, recién preparada en amortiguador fosfatos pH 7
- Pipeta
- Mortero
- Tubos de ensayo
- Tubo Falcon

Preparación del extracto enzimático de la catalasa:

- Se tomó las habichuelas, se cortaron en pequeños trozos y se pesaron 5 g bien lavada

y picada, para luego amacerarla en un mortero frío adicionando 10 mL de agua
destilada fría hasta obtener un extracto coloreado uniforme.
- Luego se transfirió el extracto obtenido en un tubo Falcon y se centrifugó a 6000 rpm
por 5 minutos, se mezclaron al finalizar el centrifugado todas los extractos en un Vaso
de precipitado para que todos tuviesen el mismo extracto enzimático de la catalasa y
se mantuvo conservada a 4ºC. }

Los procedimientos de este laboratorio se dividieron por mesones a los cuales les
correspondió una de la cuatro pruebas del experimento:
Se procedió a realizar cada uno de los procedimientos asignados por mezon, donde para
los dos últimos procedimientos se estipulan tiempos para el Estudio del efecto de la
concentración de sustrato y Estudio del efecto del inhibidor NaCNsobre la actividad
enzimática de la siguiente manera:

TUBOS

T1 T2 T3 T4 T5 CONTROL

Minutos 0 1 5 10 20 0

Resultados y análisis:

La práctica fue repartida por 13 parejas de personas por lo que se muestra la totalidad de los
datos recogidos
Tabla 1. Resultados de la actividad enzimática de la catalasa respecto a las variaciones de su
pH, de diferentes concentraciones de enzima, de concentraciones de sustrato y en presencia
de inhibidores.

Efecto del pH sobre la actividad enzimática ​( Datos de grupo 3)

Tubo ml de µmoles µmoles µmoles H​2​O​2 µm

KMnO​4 H​2​O​2 H​2​O​2 Descompuestas descompuestas/min/ml
gastados Iniciales Residuales enzima.

1 8,5 100 106,3 -6,3 0​ ​(-1,26)

2 8,4 100 105 -5 ​0​(-1,0)

3 7,0 100 87,5 12,5 2,5

4 6,5 100 81,3 18,7 3,7

5 6,8 100 85 15 3,0

6 8,65 100 108 -8 ​0​(-1,6)

Tabla 2. ​Resultados experimentales del efecto del pH sobre la actividad enzimática, los diferentes cálculos se
describen posteriormente.

pH 4 5 6 7 8

Actividad 0 0 2,5 3,7 3,0

Enzimática
Tabla 3. ​Actividad enzimática vs pH. En esta tabla se resumen los datos que serán tenidos en cuenta para
graficar la actividad enzimática en relación al pH. Se excluye el ensayo del tubo 6 debido a que no tenía
ninguna concentración de enzima.
Gráfica 1. ​Actividad enzimática vs pH. Al graficar los datos es posible observar que existe una variación
significativa en los diferentes puntos.

Promedios de Efecto del pH sobre la actividad enzimática ​( Datos de todos los grupos)

Grupo / pH 4 5 6 7 8 7

1 8,85 8,65 7,3 5,85 5,5 8,9

2 9,05 8,9 8,9 7,85 8 8,45

3 8,5 8,4 7 6,5 6,8 8,65

4 8,65 8,6 8,3 7,1 7,7 8,7

Promedio 8,76 8,64 7,875 6,83 7 8,675

Tabla 4. Resultados de la actividad enzimática de la catalasa respecto a las variaciones de su

pH, de diferentes concentraciones de enzima, de concentraciones de sustrato y en presencia
de inhibidores. Se relaciona todos los datos de los grupos 1 al 4 y se realiza un promedio y los
respectivos cálculos para determinar la actividad enzimática ante las variaciones de pH.

Tubo ml de µmoles µmoles µmoles H​2​O​2 µm

KMnO​4 H​2​O​2 H​2​O​2 Descompuestas descompuestas/min/ml
gastados Iniciales Residuales enzima,

1 8,8 100 110 -10 0 ​(-2,0)

2 8,6 100 107,5 -7,5 0 ​(-1,5)

3 7,9 100 99 1,25 0 (0,25)

(​98,75​)
 4 6,8 100 85 15 3,0

5 7,0 100 87,5 12,5 2,5

6 8,7 100 109 -9 0 ​(​-1,8​)

(​108,75​)

Tabla 5. ​Se detallan los promedios resultantes de la suma y promedio de todos los resultados en cada muestra
por grupo con respecto al efecto del pH sobre la actividad enzimática, los diferentes cálculos se describen
posteriormente.

pH 4 5 6 7 8

Actividad 0 0 0 3,0 2,5

Enzimática
Tabla 6. ​Actividad enzimática vs pH. En esta tabla se resumen los datos que serán tenidos en cuenta para
graficar la actividad enzimática en relación al pH resultantes de la suma total de los diferentes datos en cada
grupo por cada muestra ​(​tubo​)​. Se excluye el ensayo del tubo 6 debido a que no tenía ninguna concentración de
enzima.

Gráfica 2. ​Actividad enzimática vs pH. Se grafica los datos obtenidos al sumar y promediar los datos de cada
grupo encargado de este procedimiento.

Efecto de la concentración de la enzima ​( Datos de todos los grupos)

Tubos

1 2 3 4 5 C

grupo

[E] 5 5,4 5,5 3,4 2,25 2,15 13

 6 4 3,3 2 1,5 1,8 9,2

7 1,7 1,4 1,4 1,1 1,2 4,2

8 5,8 4,4 4,22 3,9 3,5 7,5

Promedi 4,23 3,65 2,76 2,1875 2,1625 8,475

o

Tabla 7. ​Se relacionan los datos obtenidos en cada grupo, para luego promediar por muestra con respecto a los
resultados experimentales del efecto de la concentración de la enzima​, los diferentes cálculos se
describen posteriormente​.

Tubo ml de µmoles µmoles H​2​O​2 µmoles H​2​O​2 µm descompuestas/min/ml

KMnO​4 H​2​O​2 Residuales Descompuestas enzima.
gastados Iniciales

1 4,23 100 52,8 47,2 9,4

2 3,65 100 45,6 54,4 10,8

3 2,76 100 34,5 65,5 13,1

4 2,19 100 27.4 72,6 14,5

5 2,16 100 27 73 14,6

Tabla 8. ​Se realizan los distintos cálculos a partir de los datos promediados obtenidos en cada grupo con
referencia al ​efecto de la concentración de la enzima​, los diferentes cálculos se describen posteriormente.

Cantidad de 0,5 1 1,5 2 2,5

enzima (mL)

Actividad
Enzimática 9,4 10,8 13,1 14,5 14,6

Tabla 9. Cantidad de la enzima vs actividad enzimática. Se resumen los datos que serán tenidos en
cuenta para graficar la actividad enzimática con respecto a la cantidad de enzima presente.
Gráfica 3. ​Actividad enzimática vs ​cantidad de la enzima. En la gráfica es posible observar un crecimiento
significativo en presencia de 1 mL de enzima, posteriormente la actividad aumenta y nuevamente crece en
presencia de 2 mL de la enzima. Con lo anterior es posible inferir que la actividad de la enzima es un factor
importante en la descomposición del peróxido de hidrógeno.

Efecto de la concentración del sustrato

Tabla 10. Relación de los distintos datos por grupo en cada muestra con referencia a la concentración del
sustrato

Tubo ml de µmol µmoles µmoles H​2​O​2 µm Tiempo

KMnO​4 es H​2​O​2 Descompuesta descompuestas sugerido para
gastados H​2​O​2 Residuale s /min/ml el experimento
Inici s enzima. en intervalos
ales de minutos

1 1,95 25 24,4 0,6 1,2

-
2 3 50 37,5 12,5 2,5 1

3 4,98 75 62,2 12,8 5,1 5

4 6,05 100 75,6 24,4 4,8 10

5 8 125 100 25 2,5 20

 cont 10.96 125 137 -12 0 ​(​-2,4​)
rol -
Tabla 11. ​Resultados experimentales para el efecto de la concentración del sustrato.

Cantidad de 0,5 1 1,5 2 2,5

sustrato
(mL)

Actividad 1,2 2,5 5,1 4,8 2,5

Enzimática
Tabla 12. cantidad de sustrato vs actividad enzimática. Se resumen los datos necesarios para ver la actividad
enzimática en contraste con la cantidad presente de peróxido de Hidrógeno.

Gráfica 4. ​Actividad enzimática vs cantidad de sustrato. Es posible observar que la gráfica tiene una
fluctuación de la actividad enzimática en presencia de 1 mL de peróxido de Hidrógeno, posteriormente la
actividad enzimática disminuye.

Efecto de inhibidores sobre la concentración de la enzima

T°C 13 5 7,5 8,9 7,5 9,7 7,5

14 5,4 8,8 8,8 9,1 9,6 0

promedio 5,2 8,15 8,85 8,3 9,7 3,75

Tabla 13. ​Se relacionan los datos obtenidos en cada grupo, para luego promediar por muestra con respecto a
los ​resultados experimentales del efecto ​de inhibidores sobre la concentración de la enzima​, los
diferentes cálculos se describen posteriormente​.
 Tubo ml de µmol µmoles µmoles H​2​O​2 µm Tiempo
KMn es H​2​O​2 Descompuesta descompuestas sugerido para
O​4 H​2​O​2 Residuale s /min/ml el experimento
gasta Inici s enzima. en intervalos
dos ales de minutos

1 5,2 100 65 35 7,0

-
2 8,15 100 102 -2 -4,0 1

3 8,85 100 110,6 -10,6 -42,4 5

4 8,3 100 103,7 -3,7 -7,4 10

5 9,7 100 121,2 -21,2 -21,2 20

control 3,75 100 46,8 53,2 10,6

-
Tabla 14. ​Resultados experimentales del efecto de los inhibidores sobre la actividad de la enzima​. ​*ensayo que
se tuvo que repetir.

Tiempo 0 1 5 10 20
(minut ).

Actividad 7,0 -4,0 -42,4 -7,4 -21,2

Enzimáti
ca
Tabla 15. ​Cantidad de sustrato vs actividad enzimática. Se resumen los datos que serán tomados en cuenta para
realizar la gráfica.

Gráfica 5. ​Actividad enzimática vs cantidad de sustrato. Es posible observar que la tendencia en ésta gráfica es
de un modo exponencial, sin embargo los resultados presentan una contradicción puesto que la actividad
enzimática aumenta cuando la cantidad de inhibidor es mayor.
Cuestionario
1. ¿Qué indica cada uno de los números del código enzimático de la catalasa?
2. En la práctica se estudiaron algunos factores que afectan la actividad enzimática de la
catalasa. ¿Qué otros factores tendrían qué evaluar para completar el estudio cinético de la
enzima? Explique.

3. ¿Cuáles diferencias existen entre la acción de la catalasa y la peroxidasa? Construir un

cuadro comparativo.

4. ¿Cuál es la función del H2SO4 durante la práctica? ¿Por qué no se aplica

simultáneamente con los demás reactivos? ¿Se podría sustituir el H2SO4 por hidróxido de
sodio (NaOH)? Justifique su respuesta.

Respuestas:

1.​Enzima 4: Catalasa (peróxido de ​hidrógeno​ peroxidasa). Reacción que cataliza: 2H2O2

ENZIMA 2H2O O2 Código E.C: 1. 11. 1. 6 Significado: Es una óxido-reductasa (clase 1), que usa
H2O2 como aceptor de electrones (subclase 11), y como donador a otra molécula de H2O2
(subsubclase 1). Le tocó el sexto lugar en la lista de enzimas.

Grupo Reacción catalizada Reacción Ejemplo de enzima

típica

EC 4 Adición o eliminación no hidrolítica RCOCOO Descarboxilasa

de grupos de los substratos. H→
Liasas Pueden romper los ​enlaces​ C-C, RCOH +
C-N, C-O o C-S. CO​2

2. Diferentes factores ambientales pueden afectar a la actividad

enzimática.Destacaremos dos: el pH y la temperatura.

Lista de factores que afectan la actividad enzimática

Concentración de enzimas
A medida que aumenta la concentración de enzimas, la velocidad de la reacción aumenta de
manera proporcional. Sin embargo, esto es así solo hasta cierta concentración, pues en un
momento determinado la velocidad se hace constante.

Esta propiedad se utiliza para determinar las actividades de las enzimas séricas (del suero
sanguíneo) para el diagnóstico de enfermedades.

Concentración de sustrato
Al aumentar la concentración de sustrato se incrementa la velocidad de la reacción. Esto se
debe a que más moléculas de sustrato colisionan con las moléculas de enzima, por lo que se
formará el producto más rápidamente.

No obstante, al superar cierta concentración de sustrato no habrá ningún efecto sobre la

velocidad de la reacción, pues la enzimas estarían saturadas y funcionando a su máxima
velocidad.

pH
Los cambios en la concentración de iones hidrógeno (pH) influyen considerablemente en la
actividad de las enzimas. Debido a que estos iones poseen carga, generan fuerzas de atracción
y repulsión entre los enlaces de hidrógeno e iónicos de las enzimas. Esta interferencia
produce cambios en la forma de las enzimas, afectando así su actividad.

Cada enzima tiene un pH óptimo en el que la velocidad de reacción es máxima. Así, el pH

óptimo para una enzima depende de dónde funciona normalmente.

Por ejemplo, las enzimas intestinales tienen un pH óptimo de aproximadamente 7.5

(ligeramente básico). En contraste, las enzimas en el estómago tienen un pH óptimo de
aproximadamente 2 (muy ácido).

Salinidad
La concentración de sales también afecta el potencial iónico y en consecuencia pueden
interferir en ciertos enlaces de las enzimas, los cuales pueden formar parte del sitio activo de
la misma. En estos casos, al igual que con el pH, la actividad enzimática se verá afectada.

Temperatura
A medida que aumenta la temperatura aumenta la actividad enzimática y, en consecuencia, la
velocidad de la reacción. Sin embargo, las temperaturas muy altas desnaturalizan las enzimas,
esto significa que el exceso de energía rompe los enlaces que mantienen su estructura
haciendo que no funcionen de manera óptima.

Así, la velocidad de la reacción disminuye rápidamente a medida que la energía térmica

desnaturaliza las enzimas. Este efecto se puede observar de manera gráfica en una curva en
forma de campana, donde se relaciona la velocidad de reacción con la temperatura.

La temperatura a la que se produce la velocidad máxima de reacción se denomina

temperatura óptima de la enzima, que se observa en el punto más alto de la curva.

Este valor es diferente para las distintas enzimas. No obstante, la mayoría de las enzimas en
el cuerpo humano tienen una temperatura óptima de alrededor de 37.0 °C.
En resumen, a medida que aumenta la temperatura, inicialmente la velocidad de reacción
aumentará debido al aumento de la energía cinética. Sin embargo, el efecto de la ruptura de la
unión será cada vez mayor, y la velocidad de reacción comenzará a disminuir.

Concentración del producto

La acumulación de los productos de reacción generalmente disminuye la velocidad de la
enzima. En algunas enzimas, los productos se combinan con su sitio activo formando un
complejo suelto y, por lo tanto, inhibiendo la actividad de la enzima.

En sistemas vivos, este tipo de inhibición generalmente se previene mediante una eliminación
rápida de los productos formados.

Activadores enzimáticos
Algunas de las enzimas requieren la presencia de otros elementos para funcionar mejor, estos
pueden ser cationes metálicos inorgánicos como Mg2+, Mn2+, Zn2+, Ca2+, Co2+, Cu2+,
Na+, K+, etc.

En raras ocasiones, también se necesitan aniones para la actividad enzimática, por ejemplo: el
anión cloruro (CI-) para la amilasa. Estos pequeños iones se denominan cofactores
enzimáticos.

También existe otro grupo de elementos que favorecen la actividad de las enzimas, llamados
coenzimas. Las coenzimas son moléculas orgánicas que contienen carbono, como las
vitaminas que se encuentran en los alimentos.

Un ejemplo sería la vitamina B12, que es la coenzima de la metionina sintasa, una enzima
necesaria para el metabolismo de las proteínas en el cuerpo.

Inhibidores enzimáticos
Los inhibidores enzimáticos son sustancias que afectan negativamente la función de las
enzimas y, en consecuencia, ralentizan o en algunos casos, detienen la catálisis.

Hay tres tipos comunes de inhibición enzimática: competitiva, no competitiva e inhibición

del sustrato:

Inhibidores competitivos
Un inhibidor competitivo es un compuesto químico similar a un sustrato que puede
reaccionar con el sitio activo de la enzima. Cuando el sitio activo de una enzima se ha unido a
un inhibidor competitivo, el sustrato no puede unirse a la enzima.

Inhibidores no competitivos
Un inhibidor no competitivo también es un compuesto químico que se une a otro lugar del
sitio activo de una enzima, llamado sitio alostérico. En consecuencia, la enzima cambia de
forma y ya no puede unirse fácilmente a su sustrato, por lo que la enzima no puede funcionar
correctamente.

3.

CATALASA PEROXIDASA

La catalasa ​cataliza la es una enzima que cataliza la oxidación de

descomposición del peróxido de un amplio número de sustratos orgánicos e
hidrógeno​ (agua oxigenada) en inorgánicos, utilizando el poder oxidante del
peróxido de hidrógeno.Perteneciente a la
oxígeno y agua, según la siguiente
categoría de las ​oxidorreductasas​.
reacción química:
2 H2O2 + CATALASA → 2 H2O + O2 Donante + H​2​O​2​ Donante oxidado + H​2​O
Esta enzima utiliza como ​cofactor​ el grupo
La ​catalasa​ es una ​enzima​ perteneciente a la hemo​.
categoría de las ​oxidorreductasas​ que
cataliza​ la descomposición del ​peróxido de
hidrógeno​ (​H​2​O​2​) en ​oxígeno​ y ​agua​.2​​ ​ Esta ensayos para la determinación y
enzima utiliza como ​cofactor​ al grupo ​hemo​ y cuantificación de ​metabolitos​ como ​glucosa​,
al ​manganeso​.2​ ácido úrico​, ​colesterol​ o ​triglicéridos​ en fluidos
biológicos usan peroxidasa como enzima
acoplada.

También se utiliza en inmunoensayos para la

 detección de virus tan conocidos como el
virus de la inmunodeficiencia humana (​VIH​)
causante del ​sida​ o el ​herpesvirus​.

La peroxidasa también se utiliza como

biocatalizador para la generación de
productos de interés biotecnológico e
industrial como resinas fenólicas, ​adhesivos​,
antioxidantes​, antiestáticos y protectores de
radiación magnética, ​colorantes​ alimentarios
y componentes bioactivos de detergentes.

4.Se desnaturaliza la enzima mediante la alteración del sitio activo ya que el ácido sulfúrico
baja el pH. De esta manera la enzima ya no funcionará.

Discusión:

En esta práctica se ejecutó el proceso experimental para analizar la actividad de la

catalasa que es una enzima antioxidante presente en la mayoría de organismos
aerobios, mediante cuatro diferentes procedimientos donde se analiza el pH, la
concentración de la enzima, la concentración del sustrato y . Estudio del efecto de
inhibidores durante el proceso. Donde la enzima cataliza la dismutación del peróxido
de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno.

El peróxido de hidrógeno es uno de los productos del metabolismo celular en

diversos organismos, pero dada su potencial toxicidad, es transformado (González,
2010). ​En los diversos organismos existentes es posible la degradación del H2O2
mediante la acción de enzimas. Son conocidas dos enzimas que pueden realizar esta
acción: la catalasa (animales y protistas) y la peroxidasa (plantas). La peroxidasa es
una enzima que cataliza la oxidación de un amplio número de sustratos orgánicos e
inorgánicos, utilizando el poder oxidante del peróxido de hidrógeno (Bioprodin, s.f).
Cataliza reacciones bisustrato donde el peróxido es usado como oxidante y el
segundo sustrato es oxidado por el peróxido al tener características reductoras. La
reacción de la peroxidasa libera agua (Universidad Autónoma de Chiapas, 2009). Por
otro lado la catalasa cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno en
oxígeno y agua (Universidad Autónoma de Chiapas, 2009).

En esta práctica se pretende determinar la actividad enzimática de la catalasa sobre el

peróxido de hidrógeno presente en un extracto de habichuela, para tal fin en primer
lugar se extrajo la enzima catalasa a partir de la habichuela, posteriormente se realizó
la evaluación de 4 variables sobre la actividad de esta enzima.
La primera variable fue la influencia del PH sobre la actividad enzimática, al observar
la gráfica 1, en la cual se usaron los datos obtenidos en nuestro grupo 3, es posible
ver que existe una variación significativa en los diferentes puntos a medida que el pH
es mayor favorece la actividad enzimática de la catalasa . El óptimo de la curva se
observa en un pH de 7, de igual forma sucede en la gráfica 2 donde se incluyeron los
datos de cada grupo del mesón 1, el cual cada uno de ellos obtuvo datos
experimentales semejantes en el comportamiento de la enzima ante la presencia del
pH donde se promediaron los datos por muestra, dando como resultado que el pH en
el cual la actividad enzimática es óptima es en el pH 7. Se puede observar en la
gráfica 1 y 2 que la actividad enzimática de la catalasa varía según el pH al cual se
halle expuesta pues en pH menores a 7 la catalasa reacciona de forma creciente
mediante aumenta la concentración del pH, además en un pH de mayor concentración
a 7 su actividad decrece como se observa con el pH 8. Teóricamente a diferencia de lo
obtenido, el PH=7 es donde la catalasa tiene su óptimo (Lehninger, 2006), por lo que
este dato fue el empleado en el análisis de las siguientes variables.

Por otro lado, en la segunda parte de la práctica, se evaluó la influencia de la

concentración enzimática con respecto a su actividad. En la gráfica 3 es posible
observar un crecimiento significativo de la actividad de la enzima de la catalasa a
medida que su concentración aumenta su actividad de manera exponencial. Con lo
anterior es posible inferir que la actividad de la enzima es un factor importante en la
descomposición del peróxido de hidrógeno, sin embargo ésta relación de acuerdo a
los datos puede llegar a variar según factores externos como la temperatura, entre
otros. Se obtuvo que la actividad enzimática se ve afectada por la cantidad de enzima
presente, en donde a mayor cantidad, mayor es la actividad enzimática, resaltando
una relación directa entre la cantidad de enzima y su actividad (Cuesta González,
2008).

Con relación a la tercera parte de la práctica, en la cual se evaluó el efecto de la

cantidad de sustrato sobre la actividad enzimática, se encontró una crecimiento de la
actividad enzimática en presencia de con referencia a la cantidad de sustrato desde
0,5 hasta 1,5 mL de peróxido de Hidrógeno, pero de igual manera posteriormente la
actividad enzimática disminuye como se observa en la gráfica 4. Es posible observar
que el óptimo de actividad enzimática es en presencia de 1,5 mL de peróxido de
Hidrógeno y posteriormente decrece ante la mayor presencia de sustrato desde 2
hasta 2,5 mL de peróxido de Hidrógeno (gráfica 4), es así que estas dos variables
dejan en debate la idea que muchos sostienen de que es una relación directa de a
mayor cantidad de sustrato aumenta la actividad enzimática, pues como se observa
en la gráfica 4 la actividad enzimática es favorecida a mayor cantidad de sustrato pero
llega un punto de saturación del mismo en el cual la actividad enzimática disminuye
ante mayor concentración del sustrato de peróxido de Hidrógeno, esto puede deberse
a factores externos que no favorecen a la misma actividad enzimática de la catalasa
como la baja temperatura.

Por último se analizó la actividad de un inhibidor no competitivo como lo es el

cianuro de sodio (NaCN) el cual no fue usado y sustituido por tiempo de reacción ante
la temperatura ambiente en intervalos de minutos con relación a los tubos 2, 3, 4 y 5,
con tiempo aplicado 1, 5, 10 y 20 minutos en orden consecutivo, donde el tubo 1 y
control no se expuso a temperatura ambiente manteniéndolos en baño de hielo. Los
resultados graficados no son los esperados pues se esperaba una mayor actividad
enzimática de la catalasa ante la T°C ambiente pues debido a las bajas temperaturas
la actividad enzimática fue muy baja dando cifras negativas por debajo a cero, aun así
en el intervalo de 10 minutos se observa un incremento exponencial pero no superior
a cero y vuelve a decrecer en el tubo de expuesto 20 minutos a ​T°C ambiente​. Se
descartó el uso del cianuro de sodio (NaCN) para experimentar los resultados de
someter la reacción enzimática de la catalasa a temperatura ambiente, pero el cual no
dio resultados favorables pues la actividad de la enzima fue muy lenta debido a la
temperatura ambiente, donde no se descarta que hubiesen interferidos otros factores
externos e internos durante la reacción o un mal procedimiento experimental.

En la práctica descrita anteriormente se tuvieron en cuenta 4 factores que afectan la

actividad enzimática, pero es de notar que además de ellos existen otros que de igual
manera los pueden afectar, tal es el caso de la temperatura, ya que al incrementar la
temperatura en el sistema aumenta la velocidad de la reacción, además de ello al
someterse la enzima a ciertas temperaturas es posible que esta se desnaturalice,
induciendo la pérdida de funcionalidad de la misma, referencias las cuales no se
reflejaron en ante la última prueba experimental. Además de ello existen algunos
mecanismos reguladores como el clivaje proteolítico y el alosterismo; en el primero
de ellos algunas enzimas son sintetizadas como precursores inactivos que se activan
posteriormente por el corte de uno o más segmentos de la cadena, por otro lado el
alosterismo es la forma de regulación en la que una molécula endógena, modulador
alostérico, se une a la enzima y modula su actividad de manera positiva (aumentan la
actividad de la enzima) o negativa (disminuyen la actividad de la enzima). Existen
casos de enzimas que para su funcionamiento adecuado requieren de cofactores
(activadores o coenzimas), para estas la concentración de estos cofactores
evidentemente afectan la actividad de la misma (Universidad Latina de Panamá, s.f).

Conclusiones:
● ​Es posible afirmar que los factores estudiados evidentemente alteran el comportamiento de
la catalasa, ya que en varias de las pruebas realizadas se observó un comportamiento
favorable de la actividad enzimática de la catalasa pero en el último no se obtuvieron los
resultados esperados debido a algunos factores externos, como la temperatura ambiente
no favorecio la actividad enzimática en los diferentes intervalos de tiempo al descartar el
uso del c​ianuro de sodio (NaCN) como se tenía previsto para la práctica.
● ​Se deben realizar los procedimientos en su totalidad con precaución para obtener los

resultados esperados pues no se puede descartar un mal procedimiento experimental en .

Estudio del efecto del inhibidor NaCN sobre la actividad
enzimática donde se descarto el mismo para exponer la actividad enzimática a
temperatura ambiente. Hizo uso observada
 ● ​Existen muchos factores externos e internos que alteran el comportamiento de las enzimas

además de los estudiados en esta práctica con referencia a la catalasa para animales y
peroxidasa para plantas y vegetales.

● Se pudo observar que la actividad enzimática de la catalasa se vio favorecida en un pH 7 el

cual es óptimo para la misma.
● La concentración de la misma enzima favorece la actividad de la misma de manera creciente a
mayor concentración mejor desempeño.
● La concentración del sustrato también juega un papel importante en la actividad enzimática de
la catalasa pues esta disminuye a una concentración mayor a 1,5 mL ​de peróxido de
Hidrógeno.

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