MANUAL TEÓRICO DE PROCESO DE TEJIDOS

Beatriz E Vieco Duran

Bacterióloga y Laboratorista
Colegio Mayor de Antioquia

TECNOLÓGICO DE ANTIOQUIA
Facultad de Derecho y Ciencias Forenses
Programa: Tecnología en Histocitotecnologìa
2015
 1. GENERALIDADES

HISTOTECNOLOGIA: Técnicas y secuencias de manipulación para analizar los

tejidos vivos.

MATERIAL HISTOLOGICO: Proviene de organismos normales.

MATERIAL ANATOMOPATOLOGICO: Proviene de organismos enfermos.

MUESTRAS: Tejido fresco

Tejido fijado y procesado
Extendidos
Improntas
Preparados celulares
Necropsias (autopsias)
Cultivos celulares

BIOPSIA (BX): Porción de tejido de un individuo sano para el estudio

anatomopatológico.

BIOPSIA DIAGNOSTICA: Sirve para concretar el diagnóstico clínico de una

enfermedad. Es de tamaño pequeño, y se realiza por la punción de un órgano.
Ejemplos: bx renales, gástricas, pulmonares, de médula ósea.

PIEZA QUIRURGICA: Es el órgano entero. Se realiza para confirmar

diagnóstico y para tratamiento y pronóstico.

PREPARACION HISTOLOGICA: Tejido pequeño, delgado, fijado, incluído,

cortado, etc.

EXTENSION O FROTIS: Extendido de células independientes.

IMPRONTA: Capa de células

TEJIDO FRESCO: Sin ningún tipo de fijación.

TEJIDO PROCESADO. Tejido fijado, deshidratado, aclarado, impregnado,

incluído.

AUTOPSIA: Se realiza para esclarecer la causa de la muerte, y es de dos tipos:

a. Clínica ( muerte natural)
b. Médico- legal: (muerte violenta).

BEATRIZ EUGENIA VIECO DURÁN

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 2. FIJACION

DEFINICION: Cuando un tejido es extraído del cuerpo, comienzan dos

procesos :
a. La autolisis, que es provocada por la digestión enzimática
celular.
b. La putrefacción, que es producida por las toxinas y las
enzimas bacterianas.
Estos dos procesos, llevan a la descomposición o degradación del tejido,
haciendo imposible su análisis.
“ La fijación , es la interrupción de los procesos de degradación que aparecen
después de la muerte celular, tratando de conservar la arquitectura,
composición tisular, propiedades fisicoquímicas y antigénicas de las células, lo
más parecido a cuando estaban en el organismo vivo.”
El objetivo de los fijadores en histopatología, es la conservación de las
estructuras y la estabilización de las proteínas.

PRINCIPIOS DE FIJACION: 1. No hay un fijador universal

2. No todos los fijadores fijan indefinidamente.
3. La fijación es IRREVERSIBLE.
4. No intentar nada en un tejido mal fijado.
5. La fijación debe ser INMEDIATA.
TIPOS DE FIJACION: 1. Histológica- citológica: para conservar la arquitectura
y las estructuras.
2. Histoquímica: para conservar la composición molecular y bioquímica.

CLASES DE FIJADORES: Los fijadores se clasifican en físicos y químicos.

FIJADORES FISICOS: utilizan un medio físico para realizar la fijación, y son de

tres subclases:
a) Congelación: Se congela el tejido para detener la autolisis. Es instantánea y
forma cristales por la rapidez con que se realiza. Ejemplo: Isopentano a -50
grados Celsius.
b) Liofilización: Se hace primero una congelación con Nitrógeno líquido a -70
grados Celsius, y después se extrae el agua congelada utilizando una bomba
de vacío.
c) Criosustitución: Se congela el tejido en Nitrógeno líquido o en Isopentano .
Se extrae el agua congelada con una bomba de vacío y luego se reemplaza el
agua, por un líquido fijador como el etanol o la acetona.
d) Calor: utilizando microondas para acelerar la fijación química.

FIJADORES QUIMICOS: Desnaturalizan las proteínas titulares, bloqueando la

autolisis.
Existen varios factores que influyen en la fijación química, y son los siguientes:

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1. Velocidad de penetración del fijador: es la rapidez con que un fijador químico
se difunde en el interior de un tejido.

2. Velocidad de fijación: Es el tiempo que tarda el fijador en precipitar y

estabilizar los componentes de un tejido.

3. La presión osmótica: a) Si es mayor la del fijador que la del órgano, produce

hinchamiento del mismo.
b) Si es menor, produce retracción en el tejido.
Lo ideal es la presión isotónica.

4. La fijación debe ser INMEDIATA, para garantizar la preservación del tejido.

5. Concentración de Iones de Hidrógeno (ph): El ph de los fijadores varía

mucho.
El ph ideal de un fijador está entre 6 y 8. Fuera de este rango, hay cambios que
ocasionan detrimento del tejido. Este es considerado el rango general.
Algunos tejidos se fijan mejor a otro valor de ph, como la mucosa gástrica que
se fija mejor a un ph de 5,5, pero estos casos son excepcionales.

6. Tamaño de la muestra: No es lo mismo fijar una muestra de milímetros, que

un órgano entero. Esto es importante tanto para el volumen de fijador, como
para el recipiente en el que se envía la muestra.

7. Volumen del fijador.: debe ser 10 veces el tamaño de la muestra.

8. Temperatura: La mayoría de las reacciones químicas, se pueden acelerar

con altas temperaturas.
Los tejidos sometidos a temperaturas por encima de los 60 grados Celsius,
pueden deteriorarse y lo que es peor aún, perder irremediablemente su
antigenicidad..
Solamente para biopsias muy urgentes, la fijación puede realizarse a 40 grados
C, para acortar el tiempo.

9. Penetración del fijador: En este factor es muy importante tener en cuenta el

tamaño del tejido, ya que un fragmento de un cm y delgado, se fijará más
rápido que uno más grande.
Hay que asegurarse además de que se dispone de muy buena cantidad de
fijador.
Los especímenes grandes como el útero y las mamas, deben ser cortados
macroscopicamente en fragmentos y deben colocarse nuevamente a fijar.

10. Concentración del fijador: El fijador debe utilizarse a su óptima

concentración para evitar daños en los tejidos. Además este factor influye
mucho en la coloración.

11. Tiempo de fijación: La fijación con formol que es el más utilizado, no debe
excederse de las 24 horas teniendo en cuenta para este tiempo, si el primer
paso del procesador de tejidos es el formol.
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Tiempos superiores de fijación hacen que el tejido se vuelva quebradizo, se
inhibe la actividad enzimática,y se disminuye la antigenicidad ( especialmente
en los virus como el de la Hepatitis).
Tiempos prolongados de la fijación, pueden producir lo que se conoce como
pigmento formólico que se aprecia como un precipitado negruzco, que puede
confundirse con el pigmento malárico.

12. Adición de sustancias: Idealmente no deben adicionarse sustancias a los

fijadores, excepto cuando el estudio especial de algún componente lo requiera.
Los detergentes como la saponina, pueden producir daño en la membrana
celular.

CLASIFICACION DE LOS FIJADORES QUIMICOS

1. AGENTES OXIDANTES: Es todavía desconocido el mecanismo por el cual

los agentes oxidantes reaccionan con las proteínas. Sin embargo es imperioso
mencionar algunos de los más utilizados en Anatomía Patológica (AP):
a) Tetraoxido de Osmio: forma reacción cruzada con las proteínas. Es muy
utilizado en microscopía electrónica . pero altera la antigenicidad. Se presenta
en forma de cristales amarillentos y es muy volátil , tóxico y costoso.
b) Dicromato de Potasio: Es un polvo rojo amarillento.
Se utiliza al 2%, y es utilizado en la fijación de lípidos y Sistema Nervioso
Central ( SNC).
c) Permanganato de Potasio : es el menos efectivo de los tres.

2. AGENTES DESNATURALIZADORES DE PROTEINAS O COAGULANTES :

Son sustancias que actúan eliminando el agua del tejido rápidamente, y por lo
tanto, pueden alterar la organización y estructura celular, además de endurecer
los tejidos.
Los más utilizados, son:
a) Acido acético: Es un líquido transparente de olor avinagrado, que se utiliza al
5%.
En su forma pura, recibe el nombre de ácido acético glacial y es un excelente
fijador para ácidos nucleicos y nucleoproteínas.
Puede formar cristales tóxicos y explosivos y destruír las mitocondrias.
b) Alcohol etílico (etanol): Es un líquido transparente,inflamable y volátil de
agradable olor. Se usa al 70% y es controlado por la ley, puesto que se emplea
en la fabricación de cocaína.
Es el fijador más utilizado en citologías; además fija el glucógeno y las
enzimas.
Fija y deshidrata al mismo tiempo, pero puede llegar a endurecer el tejido.
Se gasta durante el proceso de fijación, y por lo tanto no se debe reciclar.
c) Acetona: Es un líquido transparente, inflamable, volátil y de olor dulzón.
Preserva muy bien la estructura antigénica y la actividad enzimática de las
céulas.
Se utiliza pura y fría y el tiempo máximo de fijación es de 2 horas.

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3. FIJADORES ALDEHIDOS: Estos fijadores no actúan como precipitadotes de
las proteínas, sino rompiendo los enlaces de hidrógeno de ellas, formando una
malla reticular entre ellas. Los principales fijadores aldehídos son:
a) Glutaraldehído: Es muy utilizado en microscopía electrónica. Se usa al 3% y
tiene muy poco poder de penetración, lo que hace que se emplee solamente en
muestras pequeñas.
b) Formaldehído, formol o formalina: Es considerado el “fijador general”.
Es líquido, incoloro y tóxico, de olor fuerte que irrita instantáneamente los ojos,
la nariz y garganta.
Se requiere de adecuada ventilación y observación de las medidas de
bioseguridad.
Su presentación comercial es al 38% y de esta manera es considerado puro.
Se usa tamponado al 10% con ph neutro.
Es el más barato, es desinfectante, no endurece los tejidos ni altera la
coloración.
Se altera con la luz transformándose en ácido fórmico perdiendo su poder de
fijación. Por este motivo, debe almacenarse en frasco oscuro.
Se consume durante el proceso de fijación y por lo tanto no se debe reciclar.
Cuando se dejan las muestras en formol durante mucho tiempo, se produce un
pigmento formálico que es birrefringente, y de color pardo negruzco.

FORMOL TAMPONADO AL 10% ph 7.0

Formol puro (37-40%) 100 ml

Fosfato de Sodio Monobásico 4 gr
Fosfato de Sodio dibásico anhidro 6.5 gr
Agua destilada 900ml
El ph de esta solución debe ser de 7.0

MEZCLAS FIJADORAS: Es la combinación de varios fijadores simples en

solución, aprovechando las ventajas de unos y amortiguando los
inconvenientes de otros.
Las mezclas fijadoras más utilizadas, son:

1. Líquido de Bouin: Se utiliza en lugar de la formalina tradicional, para evitar el

endurecimiento o distorsión de los tejidos.
El tiempo de fijación es de 4 a 24 horas. Se utiliza para fijación de piel y tejidos
embrionarios, y no es recomendable en la fijación de biopsias renales.
Posteriormente a la fijación, debe lavarse el tejido con alcohol al 70%, hasta
que se decolore el ácido pícrico.
Preparación: Acido pícrico saturado 750ml
Formol concentrado 250 ml
Acido acético glacial 50 ml
El pH final de la solución es de 2.2

2. B5-Zenker: Proporciona muy buena tinción nuclear, y por lo tanto se utiliza

para la fijación de sistema linfoide, hematopoyético, y biopsias renales.

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Preparación: a) Solución madre
Cloruro de Mercurio 12 gr
Acetato Sódico 205 gr
Agua destilada 200ml

b) Solución de trabajo
Solución madre 20 ml
Formol puro 2.0 ml
Después de la fijación debe realizarse un lavado posterior con lugol durante 10
minutos, seguido de Tiosulfato de Sodio al 5% durante dos minutos. Finalmente
lavar con agua corriente.

3. Carnoy: Es el mejor fijador para glucógeno. También se utiliza en la fijación

de biopsias por congelación.
Preparación: Etanol puro 60 ml
Cloroformo 3 ml
Acido acético glacial 10 ml

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 3. CORTE MACROSCOPICO

Es el procedimiento que se realiza a los tejidos después del proceso de fijación.

Comienza con la corroboración de los datos de la orden médica con los que
debe tener el recipiente con la muestra:

1. El corte macroscópico debe ser realizado por el médico patólogo con el

apoyo del histocitotecnólogo.
2. Se debe utilizar delantal plástico, gafas protectoras, guantes, tapabocas, y
de ser necesario guantes anti-corte.
3. Se hace un descripción de la forma, consistencia, color, aspecto, medida
tridimensional (largo, ancho, espesor) y peso cuando se trata de riñón,
corazón, páncreas, hígado, pulmones, próstata, útero, bazo, placenta, etc.
4. Se utiliza tinta china (con vinagre como mordiente), para marcar los bordes
de resección (por donde pasó el bisturí). Se debe aplicar la tinta antes de
cortar.
5. El tejido graso como las mamas debe cortarse inmediatamente y colocarse
de nuevo en el fijador. Para el corte de mama deben utilizarse los guantes anti-
corte .
6. Se considera material grande el que mide más de 5 centímetros. Los que
miden menos se consideran material pequeño, como las biopsias renales,
gástricas de piel, médula ósea, etc.
7. A los intestinos se les debe lavar la materia fecal antes del corte.
8. Pulmones: hay que insuflarlos, inyectándoles formol. Cuando el tejido se va
al fondo del recipiente está sin aire. Si flota, no está bien insuflado.
9. Quistes de ovario: Tomar la medida y el peso inicial. Abrir el quiste, y
describir el líquido interior.
10. Músculo: Se debe colocar sobre un bajalenguas grapándolo por cada
extremo estirado, par impedir que las fibras musculares se encojan. De este
modo, sumergirlo en el fijador seleccionado.
11. Las muestras muy pequeñas, deben colorearse con Eosina y empacarse en
papel de filtro, antes de procesar.
12. El desinfectante utilizado en Histopatología, es el Hipoclorito de Sodio al
3,3%.

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 4. DESCALCIFICACION

DEFINICION: El la eliminación total de las sales de calcio de un tejido,

“después de haber sido fijado”
Se realiza sobre tejidos mineralizados como dientes y hueso y
esporádicamente sobre material anatomopatológico con calcificaciones que
dificultan o impiden el estudio de una lesión.

AGENTES DESCALCIFICADORES

La escogencia de un agente descalcificador, depende del grado de urgencia

del exámen, del estado de mineralización y de la coloración que va a ser
utilizada.
Hay que tener en cuenta que mientras más rápido se realice el proceso de
decalcificación, más se puede dañar el tejido.
La descalcificación, se realiza con sustancias ácidas, que son de dos clases:
1. Acidos Fuertes: Nítrico, clorhídrico.
2. Acidos débiles: Fórmico, acético, pícrico y EDTA ( Acido etilén
diaminotetracético).

OBSERVACIONES:
1. Se pueden realizar mezclas de ácidos fuertes y débiles según la necesidad.
2. Las soluciones de trabajo de los ácidos pueden prepararse tanto en medio
acuoso con formol, de acuerdo a la preferencia de cada laboratorio.
3. El descalcificador más suave es el EDTA, pero también es el más lento:
tarda de 6 a 8 semanas.
4. La temperatura acelera la eliminación del calcio, pero puede dañar mucho
los tejidos.
5. El tiempo de descalcificación depende del grado de mineralización de la
muestra y de su tamaño.
6. Existen descalcificadores comerciales preparados, listos para su uso,
costosos, muy buenos que evitan la manipulación de los ácidos.
( precauciones).
7. Cuando el paciente ha recibido quimio o radioterapia, la decalcificación es
más difícil.
8. Se debe cambiar diariamente la solución de descalcificador, para que sea
efectiva.

PRUEBAS DE DESCALCIFICACION COMPLETA: Si se pasa el tiempo de

decalcificación de un tejido, es muy probable que se deteriore. De igual modo,
es imposible procesar un tejido incompletamente descalcificado. Existen tres
pruebas diferentes para saber el estado de descalcificación de una muestra:

1. RAYOS X: Consiste en tomar radiografía al tejido en estudio para observar la

ausencia o presencia de Calcio. Es muy costosa.

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2. FISICA: Consiste en doblar el espécimen, o chuzarlo con un alfiler o pinza,
pero puede producir agujeros y resquebrajar el tejido.
Se puede constatar la rigidez de la muestra al tacto, utilizando siempre
guantes.
Lavar muy bien la muestra con agua bicarbonatada después de concluír la
descalcificaión, para neutralizar la acidez.

3. QUIMICA: (CALCIO RESIDUAL):

a) Solución madre de Hidróxido de Amonio al 5%
Hidróxido de Amonio 28% 5 ml
Agua destilada 95 ml
b) Solución Madre de Oxalato de Amonio al 5%
Oxalato de Amonio 5 gr
Agua destilada 95 gr
c) Solución de trabajo: Tomar de a) y b) a partes iguales.
d) Tomar 5 ml del líquido descalcificador donde está la muestra, y colocarlos en
un tubo de ensayo.
e) Agregar 10 ml de la solución de trabajo, mezclar bien y dejarla reposar toda
la noche.
f) Si en dos días no se produce ningún precipitado, quiere decir que la
descalcificación se ha completado.

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 5. PROCESO DE TEJIDOS

Tiene como propósito, lograr que la muestra de tejido sea apta para ser incluida
, cortada y coloreada sin deterioro de ella.
Comprende tres procesos: Deshidratación, aclaración e impregnación.

DESHIDRATACION

Tiene como objetivo, la eliminación total del agua del tejido.

Existen numerosos agentes deshidratantes (AD) y siempre son utilizados en
concentraciones ascendentes para evitar que el cambio sea brusco y dañe el
tejido.

CARACTERISTICAS DE UN AD:
1. No alterar las estructuras titulares.
2. Debe mezclarse muy bien con la sustancia aclaradora.
3. Debe actuar rápido.
4. No debe endurecer los tejidos.
5. Debe ser lo menos tóxico posible (no emitir vapores).
6. Debe ser lo menos inflamable posible.
7. Deben utilizarse graduados.
8. Deben cambiarse con frecuencia.

PRINCIPALES AD:
1. Alcohol Isopropílico (Isopropanol): Es el más utilizado, por su bajo costo y no
es controlado por la ley.
2. Alcohol Metílico (Metanol): Es muy costoso, y muy tóxico. Es muy poco
usado.
3. Alcohol etílico (Etanol): Es el mejor de todos, pero es muy costoso,
inflamable y controlado por estupefacientes. En nuestro medio solamente se
utiliza para Microscopía electrónica (ME).
4. Acetona: Actúa muy rápido, pero tiene poca penetración. Es muy volátil e
inflamable. Además puede volver el tejido muy quebradizo. Debe utilizarse
solamente en procesos muy urgentes.
5. Alcohol butílico (Butanol): Muy lento.
6. Dioxano: Muy tóxico.

ADITIVOS: En algunas ocasiones se pueden adicionar algunas sustancias al

AD, como:
1. Fenol: Se añade al AD, para suavizar tejidos como las uñas, tendones y
masas queratinizadas. Se utiliza al 4%, y se añade a cada uno de los
recipientes al 95%.
2. Sulfato de Cobre Anhidro: Se utiliza como indicador de que el AD está
saturado.
Se le agrega al último alcohol al 100% de 1 a 2 gramos de Sulfato de Cobre y
se cubre con un papel de filtro.
Si hay agua presente en el alcohol, el Sulfato de cobre se volverá de color azul,
indicando la saturación de agua, y el alcohol deberá reemplazarse por uno
nuevo.
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Este aditivo, no puede ser empleado en procesadores al vacío.

ACLARAMIENTO O DESALCOHOLIZACION

Consiste en sustituír el agente deshidratante por una sustancia miscible con el

medio de impregnación, que es el paso siguiente en el proceso de tejidos.
Después de este proceso, el tejido toma una apariencia transparente, y de ahí
que reciba el nombre de aclaración.

CARACTERISTICAS DE UN ACLARADOR:
1. Debe tener buena velocidad para remover el agente deshidratante.
2. Debe remover también fácilmente el impregnador.
3. Debe dañar lo menos posible el tejido.
4.Debe ser poco inflamable y tóxico.
5. Debe tener bajo costo.

AGENTES ACLARADORES:
1. Xilol o xileno (Dimetil-benceno):
a) Es el más rápido.
b) Endurece poco.
c) Se elimina fácilmente del medio de inclusión.
d) Por ser derivado del Benceno, es muy tóxico.
e) Blanquea el tejido.
f) Si se utiliza por largos períodos de tiempo, endurece el tejido.
g) Tiende a acidificar el medio.

2. Tolueno: Sus características son similares al xilol, pero es muy costoso.

3. Benceno: Es muy rápido y no endurece los tejidos, pero es demasiado tóxico
e inflamable.

4. Cloroformo: A pesar de que no afecta el tejido, es demasiado lento, difícil de

eliminar, muy tóxico y de olor poco agradable.

5. Dioxano y Tetracloruro de Carbono: Son muy buenos pero demasiado

tóxicos.

IMPREGNACION O INFILTRACION

Pretende rellenar o infiltrar completamente con el medio que se va a utilizar en

la inclusión, todos los espacios intra y extracelulares que estaban inicialmente
ocupados por el agua, luego por el agente deshidratante, y después por el
aclarador.
El resultado de este proceso será una pieza de tejido homogénea y de
consistencia dura para obtener micrométricos de buena calidad.
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La parafina sigue siendo el medio de impregnación e inclusión más utilizado en
Histotecnología, porque es barata, de fácil manejo y la producción de cortes,
óptima.

PARAFINA: Es una mezcla de Hidrocarburos Saturados derivada del petróleo

que se solidifica a temperatura ambiente. Es blanca y sin olor.
Se clasifica según su punto de fusión en:
1. Blandas: con punto de fusión de 35 grados Celsius.
2. Duras: Punto de fusión entre 54 y 58 grados Celsius.

Para medir el punto de fusión de la parafina se emplea un equipo llamado

fusiómetro, por medio del cual se observa con lupa el momento y la
temperatura exacta en que se derrite la parafina.
Parafinas con punto de fusión superior a los 60 grados Celsius, NO se deben
utilizar en Histotecnología.

ADITIVOS: En ocasiones se adiciona cera de abejas, goma, cera dental, o

dietilén glicol estearato para mejorar la calidad y el punto de fusión de la
parafina, pero no es lo ideal, porque no se sabe su interferencia en la calidad
de los cortes, la coloración o la antigenicidad de los tejidos.
Hoy en día lo mejor es el Paraplast que es una parafina sintética con punto de
fusión de 54 a 58 grados C.

FACTORES IMPORTANTES EN EL PROCESO DE TEJIDOS

1. Agitación: Es muy importante para garantizar que todos los líquidos durante
el proceso estén en contacto e impregnen todos los especímenes
uniformemente.
El procesador automático tiene incorporado un mecanismo de agitación ya sea
de forma horizontal o vertical.
En el proceso manual garantizar la agitación es más difícil.

2. Calor: El calor, aumenta la rata de penetración de los líquidos en los tejidos,

pero la mayoría de las sustancias empleadas en el proceso son inflamables,
resultando en que hay que extremar las precauciones y cuidados.
Solamente es seguro procesar tejidos a una temperatura máxima de 45 grados
C.
Temperaturas superiores afectan la coloración y la Inmunohistoquímica ( IHQ).
El calor debe ser utilizado solamente cuando se trata de un espécimen muy
urgente.
Sin embargo permanece en discusión el proceso de tejidos en micro- ondas.

3. Vacío: Algunos procesadores de tejidos, tienen incorporado un sistema de

vacío, que presenta ventajas en la deshidratación y el aclaración, porque las
acelera.
Sin embargo, la influencia del vacío en la impregnación, permanece en
discusión.

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4. Los recipientes para el proceso de tejidos, deben estar a un nivel correcto
para garantizar que las muestras estén cubiertas durante TODO el
procedimiento.

5. Revisar para asegurarse del orden correcto de los líquidos del procesador,
garantizando la calidad del proceso.

6. La acumulación de parafina residual en los contenedores, impide

removerlos. En consecuencia debe mantenerse muy limpio y despejado el
procesador.

7. Los baños de parafina deben estar por lo menos tres grados por encima del
punto de fusión de la misma. Asegurarse de que la parafina esté líquida.

8. Ensayar el mecanismo de movimiento de la canastilla en el procesador antes

de programarlo, para evitar accidentes y deterioro de las muestras.

9. Revisar los tiempos del programador del procesador, de acuerdo a los

parámetros establecidos por el laboratorio.

PROCESO MANUAL

Mediodía
Alcohol 70% 1 hora
Alcohol 80% 1 hora
Alcohol 90% 1 hora
Alcohol 100% 1 hora
Alcohol 100% 1 hora

Al día siguiente:
Xilol 45 minutos
Xilol 45 minutos
Xilol 45 minutos
Parafina a 58 grados C. 1 hora
Parafina a 58 grados C. 1 hora

Notas:
1. Para pasar de un líquido a otro, escurrir muy bien.
2. Agitar manualmente y con frecuencia las muestras.
3. Mantener los recipientes herméticamente cerrados para evitar la evaporación
de los líquidos.

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PROCESO AUTOMATICO

Formol al 10% 1 hora

Alcohol 70% 1 hora
Alcohol 80% 1 hora
Alcohol 90% 1 hora
Alcohol 100% 1 hora
Alcohol 100% 1 hora
Alcohol 100% 1 hora
Xilol 1 hora
Xilol 1 hora
Xilol 1 hora
Parafina 58 grados C. 1 hora 30 minutos
Parafina 58 grados C. 1 Hoa 30 minutos

PROCESO DE TEJIDOS EN MICROONDAS

AGENTE POTENCIA TIEMPO

Formol 10% 3 minutos 25%
Alcohol 70% 5 minutos 25%
Alcohol 96% 5 minutos 25%
Xilol 5 minutos 25%
Parafina 5 minutos 50%
Parafina 10 minutos 50%

NOTA: en ningún momento debe producirse ebullición.

PROBLEMAS EN EL PROCESO DE TEJIDOS

1. Cuando el procesador se pasa de la parafina al paso número 1 del formol,

hay que secar los tejidos y escurrir el formol con papel secante.
Luego calentar los tejidos durante 15 a 20 minutos y reversar así: Xiloles,
alcoholes y formol. Entonces volver a procesar los tejidos. Este procedimiento
recibe el nombre de “reproceso”, pero hay que tener en cuenta que estas
muestras no sirven para inmunohistoquímica y debe registrarse.

2. Cuando los tejidos se secan por quedar suspendidos en el aire durante el

proceso (el mecanismo del procesador está dañado, o los niveles de los
líquidos del procesador no son adecuados), es posible “restaurar” las muestras,
aunque el tejido quedará quebradizo, y nunca será normal. Además estas
muestras tampoco servirán para inmunohistoquímica.
Los tejidos deben colocarse en la siguiente solución “restauradora”:
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Etanol 70% 70 ml
Glicerol 30 ml
Dithionita 1 gramo

Se colocan los tejidos en la solución restauradora durante varias horas

(generalmente toda la noche) y después se procesan comenzando en la
deshidratación.

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 6. INCLUSION

Es el proceso de rodear un tejido con una sustancia firme, para poder obtener
cortes delgados.
El medio de inclusión GENERAL es la parafina, pero existen otros medios de
inclusión que se escogen por una de las siguientes razones:

1. Si el proceso remueve o destruye el objeto de investigación.

2. Si se requieren cortes muy delgados.

3. Si el uso del calor, afecta el tejido.

4. Si el medio de inclusión, no proporciona suficiente soporte para un tejido en

especial.

OTROS MEDIOS DE INCLUSION

PARAPLAST: es una mezcla de polímeros sintéticos de plástico con punto de

fusión entre 56 y 57 grados Celsius.
Se solidifica rápidamente y proporciona muy buen soporte para los tejidos
duros como los huesos.
La limitación para su uso es su alto costo.

RESINAS: juegan un papel muy importante en la microscopía electrónica, para

realizar cortes de alta resolución y muy delgados (en nanómetros).

GELATINA: se utiliza en la inclusión de órganos enteros y en cortes por

congelación.

CELOIDINA: es un colodión purificado que se obtiene de la nitrocelulosa.

Se utiliza para inclusión de órganos enteros, tejidos muy grandes y en el
estudio de embriones.
Es muy buena porque evita el encogimiento de los tejidos, pero es muy lenta
porque necesita de tres a cinco días para infiltrar la muestra.
Es útil en cortes gruesos hasta de 10 micras de espesor y proporciona
excelente soporte tejidos duros.
Atrae la humedad y por lo tanto es difícil realizar los cortes porque los bloques
se ablandan.
El éter necesario en su preparación, es muy inflamable.

OCT (COMPUESTO DE TEMPERATURA OPTIMA): es hidrosoluble y se utiliza

para demostrar sustancias que se disuelven en el xilol o en el alcohol o que se
inactivan con el calor.
Es el medio de inclusión utilizado para cortes por congelación en críostato.
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TECNOLÓGICO DE ANTIOQUIA
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PROCEDIMIENTO DE INCLUSION:
1. Equipos y materiales:
Parafina a 58 grados C.
Tejidos procesados
Pinzas
Mechero de Bunsen
Moldes de inclusión metálicos de varios tamaños.
Histocéter
Sistema de enfriamiento

2. Calentar la pinza y escoger el molde adecuado al tamaño de la muestra.

3. Llenar con parafina el fondo del molde metálico.

4. Calentar la pinza, tomar el tejido y colocarlo en el fondo del molde

orientándolo correctamente, y haciendo suave presión con las pinzas para
asentarlo bien en el fondo del molde, antes de que la parafina se solidifique.
Este procedimiento es más fácil de realizar si se dispone de cámara de
enfriamiento.

5. Colocar la tapa plástica y llenarla completamente con parafina.

6. Colocar el número correspondiente y pasarlo a la plancha de frío hasta que

se endurezca totalmente.

7. Separar el molde del histocéter.

8. Cortar el bloque de tejido, preferiblemente conge

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 7. MICROTOMIA

MICROTOMO: Aparato mecánico para realizar cortes de tejido de tamaño

micrométrico.

CLASES DE MICROTOMOS

1. MICROTOMO DE BALANCEO: es el precursor de todos y ya está en

desuso.

2. MICROTOMO DE ROTACION. (Minot) 1885. Es el más utilizado, ya que se

pueden obtener cortes seriados que van desde una hasta 25 micras de
espesor.
Es costoso, pero sigue siendo utilizado en los laboratorios de Histotecnología.

3. MICROTOMO DE DESLIZAMIENTO:
a) Leitz: la cuchilla es fija, el bloque es el
que se mueve. Se utiliza en bloques de gran tamaño como los de cerebro.
b) Reichert- Jung.: Tiene la cuchilla móvil, y se utiliza para lo mismo del
anterior.
c) Tetrander: se usa para realizar cortes macromicroscópicos de órganos
completos.

4. MICROTOMO DE CONGELACION: Se usa para tejido congelado.

El portabloques tiene un orificio por donde circula anhídrido Carbónico,
proveniente de una bomba a presión. Es el precursor del críostato.

5. CRIOSTATO: Es un micrótomo de Minot contenido en una cámara de

refrigeración mecánica que está entre -20 y -30 grados Celsius.
Se introdujo en 1954, y desde entonces ha sido incorporado de rutina en el
laboratorio de Histopatología.

Usos del críostato:

1. En el proceso de biopsias intraoperatorias rápidas.
2. Estudios histoenzimáticos
3. Estudio de lípidos
4. Inmunohistoquímica (Inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa).
Los actuales tienen control electrónico de avance, temperatura, de retroceso y
de velocidad del corte. Permite sacar cortes delgados.
Tiene un mecanismo de descongelación automático.
Todos los utensilios que se van a utilizar durante el corte, deben estar
congelados.
Mantenimiento: Las partes móviles, deben estar limpias, ajustadas y lubricadas
con un lubricante de baja temperatura.
Las temperaturas deben ser observadas, corregidas y registradas diariamente.
El hielo acumulado puede removerse con etanol absoluto.
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Debe limpiarse completamente el críostato después de cada uso, para evitar
contaminaciones entre las muestras.
El tejido para cortar debe ser fresco, sin fijación y congelado lo más
rápidamente posible.
Los cortes se realizan generalmente a 4 micras de espesor, y el críostato
facilita el corte porque posee sistema de anti- enrrollamiento.
Pueden utilizarse cuchillas desechables o de acero inoxidable, siempre
congeladas con anterioridad.

PRINCIPIO DE CONGELACION: Cuando un tejido se congela, el agua que

tiene se convierte en hielo y de esta forma
adquiere firmeza. El hielo actúa como medio de inclusión, permitiendo realizar
el corte.
La congelación, está dada por varios agentes, siendo los más comunes:
1. Nitrógeno líquido: es el agente congelador más rápido, y también el más
utilizado.
Sin embargo el tejido puede cristalizarse por la velocidad de congelación.
2. Isopentano
3. Dióxido de Carbono
4. Aerosoles.
La fijación de los cortes por congelación se puede realizar con Carnoy (ver
mezclas fijadoras), o pueden utilizarse láminas cargadas, sialinizadas,
gelatinizadas o con Poli-L-Lisina.
Las láminas gelatinizadas, se preparan de la siguiente forma:
Gelatina 1% 5 ml
Formol 2% 5 ml.
Se cubren las láminas con la mezcla y se dejan secar a 37 grados C. durante
toda la noche, antes de pescar los cortes.
El problema es que con el tiempo, pierden su efectividad.
El tejido cortado por congelación, debe descongelarse, marcarse y enviarlo
para que sea fijado, procesado incuído y cortado como un bloque de rutina.
Cada tejido funciona a temperatura diferente, pero es imposible cambiar cada
vez de temperatura. Por eso, la temperatura promedio es de -20 grados C.

ULTRAMICROTOMO: Se usa en microscopía electrónica, y en investigación.

Es derivado del Minot y se utiliza para cortes en plástico o en parafina muy
delgados (en nanómetros).

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 8. CORTE

Es el procedimiento que se realiza al tejido incluido, generalmente en parafina,

utilizando el micrótomo de rotación, para obtener cortes histológicos de 4
micras de espesor.

EQUIPOS Y MATERIALES

Micrótomo de rotación
Cuchilla (desechable o de acero inoxidable)
Pincel de pelo de camello o de marta
Cuchillo
Hielo o aerosol para enfriar
Láminas portaobjetos
Lápiz de diamante o de grafito, según las láminas utilizadas.
Bloques de tejido incluidos en parafina
Baño de flotación
Papel para limpiar
Canastillas de coloración

PROCEDIMIENTO

1. Pulimiento del bloque: eliminar con el cuchillo la parafina sobrante, para

evitar desniveles y arrugas en el corte.

2. Orientación del bloque: colocar el bloque con el tejido en el portabloques,

ajustándolo y orientándolo de modo que quede completamente paralelo a la
cuchilla

3. Angulo de la cuchilla: La inclinación de la cuchilla, es muy importamte, con

relaciòn a la superficie del corte.

El ángulo debe ser correcto, para que no quede muy vertical y vibre, haciendo
que los cortes salgan unos finos y otros gruesos.

Si queda muy horizontal, roza el bloque sin cortarlo y eso lo deteriora. La

inclinación depende del bisel de la cuchilla utilizada.

4. Rebanar el tejido en cortes gruesos, hasta que este expuesta la totalidad de

la extensión del tejido, con las dos manivelas.

5. Enfriar con hielo o spray el bloque de tejido o la cuchilla (o ambos), debido a

que la fricción creada en el rebajamiento, calienta la parafina y dificulta la
obtención del corte

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6. Cuando la muestra es quebradiza o hemorrágica, puede ablandarse
empapándola con una solución de hidróxido de amonio al a10%.

7. Girando solamente la rueda de mano derecha uniforme y lentamente

obtener cintas de tejido a 4um. Si se gira muy rápida la rueda, saldrán cortes
disparejas.
8. Extender la cinta en el baño de flotación, evitando la formación de burbujas y
de arrugas.
Las arrugas se pueden eliminar, tocándolas suavemente con un pincel de pelo
de camello

9. Permitir que los cortes se estiren en el agua y cortar por donde se desee la
cinta.

10. Recoger los cortes en las láminas, marcadas y dejarlas escurrir

verticalmente, para evitar las burbujas, que hacen el corte irregular y ocasionan
artefactos en la coloración, haciendo difícil la lectura al microscopio.

11. Colocar las láminas en una canastilla de coloración.

12. Desparafinar en la estufa a 58 ºC durante media hora

13. Realizar la coloración

14. Los bloques cortados deben sellarse con parafina liquida, para evitar que
se retraigan, se sequen y se tornen quebradizos, facilitando realizar nuevos
cortes, semanas, mese o años después.

CORTES ESPECIALES

1. Cortes seriados: Son cortes consecutivos de un mismo bloque; por lo

general se sacan 3 ó 4 placas
2. Corte en niveles: Profundizar, sacar el corte; volver a profundizar, sacar otro
corte y así, sucesivamente, según el número de niveles requeridos.
3. Ganglio Centinela: Es el primer ganglio donde drena un tumor. Se inflama y
haciéndole biopsia se pueden detectar rápidamente las células tumorales. Si es
positivo para cáncer, se debe realizar vaciamiento axilar para detectar
metastasis ocultas.
Si hay duda con la coloración Hematoxilina –Eosina (HE), se realiza
Inmunohistoquímica (IHQ).

Procedimiento:
1. Desparafinar, sacar 5 laminas; entre cada placa, debe haber 250 um (Se
coloca el microtomo en 25 um y se dan 10 vueltas).
Las 5 placas se marcan así:
1.HE
2.IHQ
3.HE
4.IHQ
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5.HE

CUCHILLAS

Existen cuchillas para corte en micrótomo de varios materiales:

1. Acero inoxidable para cortes en parafina: Requieren afilador ya sea manual o
automático y una serie de abrasivos para garantizar un buen afilado.
Prácticamente han desaparecido del mercado

2. Desechables: Revolucionaron el arte de cortar en parafina y en congelado.

Requiere de un portacuchillas, que también tiene varias presentaciones. Vienen
en estuches de a 50 hojas, en un practico dispensador con un compartimiento
para descartar las cuchillas usadas.

Son cubiertas con una silicona o aceite especial, que facilita el corte, y pueden
salir algunas con amelladuras, pero aun así justifica su uso. Las más
modernas son magnéticas.
Teóricamente una cuchilla es suficiente para 50 cortes.
Evita la búsqueda del ángulo de inclinación apropiado, por que su bisel es
prácticamente estándar.

3. Tungsteno: Resina

4. Diamante y zafiro: Resina – ME

5. Vidrio: ME

Nota: el ángulo de inclinación de la cuchilla depende del filo o bisel. El rango

promedio esta entre 5 y 10º

BAÑO DE FLOTACIÓN

Es un baño de agua a 50ºC, que tiene una solución de gelatina al 1% para

adherir el corte de tejido a la lámina.
El agua destilada, ayuda a evitar la formación de burbujas. Después de realizar
cada corte, debe limpiarse muy bien con papel la superficie del agua, para
evitar la contaminación de una lamina, con el tejido cortado anteriormente.

Limpieza: Los adhesivos promueven la proliferación de bacterias y hongos, por

lo que debe ser limpiado diariamente con hipoclorito de sodio al 3,3%.

ADHESIVOS:
Son sustancias que sirven, como su nombre lo indica, para adherir el corte de
tejido a la lámina, evitando así que se desprendan de ella. Los adhesivos más
utilizados en Histopatología, son:

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1. Gelatina al 1% (la más común)
2. Caseina al 10%
3. Láminas con Poli-L-Lisina
4. Láminas Sialinizadas
5. Láminas cargadas eléctricamente.
6. Albúmina de Meyer: Sirve para procesar huesos, tejidos hemorrágicos,
tejidos duros y en cortes por congelación.
Preparación:
Clara de huevo filtrada 50 ml
Glicerina 50 ml
Cristales de timol.
Se unta con un aplicador sobre la lámina y se pesca el corte de tejido.

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 COLORACION

Los tejidos son incoloros y solamente se observa el núcleo y los límites de la

célula. Por eso se introdujeron los métodos de coloración, para tratar de hacer
visibles los componentes del tejido y diferenciarlos entre sí.
Los colorantes tienen diferentes afinidades por las células y sus componentes.
La tinción, permite ver las características físicas de los tejidos y las relaciones
entre las células que los constituyen.

CLASIFICACION DE LOS COLORANTES

1. SEGÚN SU ORIGEN
a. Naturales
b. Artificiales

2. SEGÚN SUS PROPIEDADES

a. Acidos
b. Básicos
c. Neutros

COLORANTES NATURALES

a. NUCLEARES: Hematoxilina
Carmín

b. CITOPLASMATICOS: Orceína
Azafrán
Safranina

COLORANTES ARTIFICIALES: son sustancias cromáticas artificiales

preparadas a partir del alquitrán de hulla, derivadas de la anilina. Ejemplos:
eosina, cristal violeta, azul de toluidina.

COLORANTE BASICOS: la sustancia activa, es una base. Colorea estructuras

ácidas, como los núcleos, y tienen carga eléctrica positiva. Ejemplo:
hematoxilina.

COLORANTES ACIDOS: la sustancia activa, es un ácido. Colorean los

citoplasmas, y tienen carga eléctrica negativa. Ejemplo: eosina.

COLORANTES NEUTROS: son mezclas de ácidos y básicos.

HISTORIA: 1714: Antón Van Leeuwenhoek, descubre que el azafrán colorea el

músculo estriado.
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1863: Waldeyer descubre la Hematoxilina.

1856: se descubren las anilinas artificiales, con lo que se desarrolla mucho la

histotecnología.

SUSTANCIAS QUE INFLUYEN EN LA COLORACION

1. MORDIENTES: facilitan la fijación del colorante sobre los tejidos. Ejemplos:

sales de Aluminio, Hierro, Cromo, Sulfatos y Cloruros.
Alumbres: de Potasio, Aluminio Hierro y Amonio.

2. ACENTUADORES: aumentan la intensidad del color, la selectividad del

colorante, y la diferenciación de los elementos.
A diferencia del mordiente, no fija ni une el colorante al tejido. Ejemplos: la
Anilina para la Violeta de Genciana. El hidróxido de Potasio, para el azul de
Metileno.

3. ACELERADORES: se usan en la impregnación metálica de las fibras

nerviosas. Aceleran la coloración. Ejemplos: Veronal, Hidrato de Cloral.

4. DIFERENCIADORES: disuelven el exceso de colorante; no debe excederse

el tiempo de diferenciación, porque puede decolorar definitivamente el tejido.
Ejemplos: el alcohol ácido.

5. AZULEADORES: se utilizan para neutralizar la acidez de una coloración, por

medio de una solución alcalina. Ejemplos: Amoníaco, Bicarbonato de Sodio,
Carbonato de Litio.

METODOS DE COLORACION

DIRECTA: hay afinidad entre el tejido y el colorante. No requiere de

mordientes.

INDIRECTA: requiere de sustancias adicionales como los mordientes, para fijar

el colorante al tejido.

PROGRESIVA: hace actuar el colorante, hasta que alcance el punto óptimo de

coloración ( intensidad) deseada y se suspende con el lavado.

REGRESIVA: primero hay una coloración intensa y luego con la ayuda de los
diferenciadores, se elimina el exceso de colorante hasta lograr la intensidad
deseada. En este método de coloración, es muy importante la experiencia.

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HEMATOXILINA

Es un colorante natural, extraído del árbol Hematoxylin Campechanium, palo

de Campeche, o palo azul de Centroamérica.
Inicialmente fue utilizado para teñir seda y lona, y en 1862 se utilizó para la
coloración de tejidos animales.
Comercialmente se consigue en forma de cristales rosados o amarillentos
solubles en agua o en alcohol.
Para ser empleada en Histotecnología, debe ser oxidada a hemateína,
mediante el contacto con el Oxígeno (maduración de la Hematoxilina).
Esta maduración puede hacerse artificialmente usando óxido de Mercurio,
Yodato de Sodio, Permanganato de Potasio o Dicromato de Potasio.
El color final característico es rojo vinoso.
Debe almacenarse en frasco oscuro y filtrarse antes de usar.
800 ml de Hematoxilina, alcanzan para 200 placas.

HEMATOXILINA DE HARRIS

REACTIVOS:

Cristales de Hematoxilina 5 gr
Alcohol etílico puro 50 ml
Alumbre de Amonio o Potasio 100 gr
Agua destilada 1000 ml
Oxido rojo de Mercurio 2.5 gr

PREPARACION: Se requiere de olla que no contenga nada de aluminio

(peltre).
Disolver los cristales de Hematoxilina en el alcohol al calor, hasta que tome
calor caramelo.
El alumbre se disuelve en el agua caliente.
Juntar las dos soluciones así: la Hematoxilina sobre el agua con el alumbre,
dejando hervir y revolviendo.
Agregar el óxido de Mercurio rojo lentamente y revolviendo hasta que forme
una capa metálica en la superficie ( 20 a 30 minutos).
Bajarla del calor y dejar enfriar tapada.
Filtrar y luego agregar ácido acético glacial en una proporción de 2 ml por cada
100 ml de Hematoxilina filtrada.
Filtrar antes de usar y guardar en frasco oscuro.
Duración de 6 a 12 meses..

ALCOHOL ACIDO: Alcohol 70% 100 ml

Acido Clorhídrico Concentrado 1 ml

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AGUA ALCALINA: Bicarbonato de Sodio, Carbonato de Litio o Hidróxido de
Amonio al 1%

EOSINA AMARILLENTA

A. SOLUCION MADRE 1%
Eosina Yellow soluble en agua 1 gr
Agua destilada 20 ml
Disolver y agragar alcohol isopropilico 95% 80 ml

B. SOLUCION DE TRABAJO: Solución madre de Eosina 1% 1 parte

Alcohol Isopropílico 80% 3 partes
Acido Acético Glacial 0.5 ml por cada 100 ml

PROCEDIMIENTO : Desparafinar en estufa a 58 grados Celsius durante 30

minutos.
1. Xilol durante un minuto.
2. Hidratación: Alcohol Isopropílico 95% 1 minuto
Alcohol Isopropílico 70% 1 minuto
Alcohol Isopropílico 50% 1 minuto
3. Lavar en agua corriente.
4. Hematoxilina de Harris 5 minutos.
5. Lavar con agua corriente hasta que no suelte colorante.
6. Alcohol ácido para lavar el exceso de colorante por unos segundos.
7. Lavar en agua corriente.
8. Agua alcalina hasta color azul.
9. Lavar en agua corriente.
10. Eosina amarillenta durante un minuto.
11. Lavar muy bien hasta que no quede colorante.
12. Deshidratación: Alcohol Isopropílico 70% 1 minuto
Alcohol Isopropílico 80% 1 minuto
Alcohol Isopropílico 95% 1 minuto
Alcohol Isopropílico Puro 1 minuto
Alcohol Isopropílico Puro 1 minuto
13. Aclarar en Xilol un minuto
14. Aclarar en Xilol un minuto
15. Aclarar en Xilol un minuto
16. Montar con laminilla.

RESULTADOS: Núcleos color azul

Citoplasmas y otras estructuras de rosado a rojo.

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MEDIOS DE MONTAJE

DEFINICION: son sustancias que permiten cubrir con laminilla una preparación
histológica coloreada proporcionando el índice de refracción adecuado para
visualizar todas las estructuras. Se clasifican en solubles ( acuosas) e
insolubles en alcohol.

INSOLUBLES EN ALCOHOL
Bálsamo del Canadá
Permount
Entellán
Resinas Comerciales

SOLUBLES EN ALCOHOL
Cristalmount
Glicerel
Buffer glicerina

ARCHIVO : Los bloques positivos para cáncer se deben guardar por 10 años.
Las láminas positivas para cáncer se deben guardar por lo menos
20 años.

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