FUNDAMENTOS DEL PROCESO DE FIJACIN TISULAR FIJACIN TISULAR Fundamento: Consiste en interrumpir los procesos degradativos que aparecen

tras la muerte celular, tratando de conservar la arquitectura y composicin lo ms proxima posible a como se encontraba en el organismo vivo. Los procesos degradativos son: AUTOLISIS Y PUTREFACCIN AUTOLISIS: Es el proceso por el cual despus de la muerte, se produce la autodigestin enzimtica celular, tras la salida del contenido lisosmico al citoplasma por rotura de las membranas de estos orgnulos. INTRINSECO (propio). PUTREFACCIN: Efecto ejercido por determinadas toxinas y encimas bacterianas sobre los tejidos. Los microorganismos que originan esta accin son de carcter saprofito y complementan el efecto ltico de la autolisis hasta conseguir la total destruccin celular. EXTRINSICO. Sobre ambos procesos influyen diversos factores que dependen: a) Naturaleza del tejido: ej, el pncreas es un tejido rico en enzimas digestivas, o el intestino que contiene gran cantidad de grmenes. b) De la temperatura: A mayor temperatura ambiente, mayor velocidad de autolisis y putrefaccin. Los puntos clave de un fijador son: Preservacin de las estructuras celulares y tejidos con minima o nula alteracin de su estado natural. Proteccin ante los siguientes procesos de inclusin y seccin. Preparacin para los procesos de tincin y visin tanto con el microscopio ptico como con el electrnico, para resistir el haz de fotones. Como regla general la fijacin se realiza tomando una seccin de un tejido o material biolgico que se coloca en un lquido fijador (inmersin), de forma alternativa y en casos de experimentacin pueden realizarse otros sistemas de fijacin como la perfusin del lquido fijador a travs del sistema vascular.

Habitualmente se realiza primero la fijacin de la pieza, a ser posible (siempre que no se vayan a realizar tcnicas que requieran su manejo en fresco) en el mismo lugar donde se ha realizado la extraccin, quirfano, sala de puncin etc. Por estos motivos casi siempre se utilizan fijadores standard tanto para microscopa ptica como electrnica y solo en casos especiales se utilizan otros fijadores. En los cadveres el problema del tiempo no es con respecto a la fijacin de la muestra, pero si lo es el tiempo que ha transcurrido entre la muerte y la autopsia, ya que este tiempo marca la intensidad de autolisis que presenten los rganos. Para microscopia ptica el tiempo en que la imagen histolgica no muestra prcticamente alteraciones es de aproximadamente hasta 4-6 horas postmortem. (Si pasan ms horas, aparecen cambios morfolgicos importantes). El proceso de fijacin es una interaccin entre el fijador y grupos qumicos del material a fijar. Es muy difcil definir exactamente como se realiza este proceso. Los fijadores que se utilizan habitualmente en microscopia se basan en la desnaturalizacin (rotura de uniones qumicas, es decir, se rompen los puentes de hidrogeno de las protenas) y polimerizacin (reaccin entre el fijador y el material a fijar formando uniones estables entre compuestos qumicos). En la microscopia ptica se utilizan fijadores cuyo mecanismo de accin es tanto desnaturalizar como polimerizar. La parafina no se lleva bien con el agua y el alcohol, por los tanto hay los pasos previos a la inclusin. Para quitar el agua, deshidrataremos el tejido para eliminarla, esto lo haremos con OH, no se puede pasar de agua a OH Abs porque el tejido sufriria una retraccin muy fuerte (aguaOH 50C OH 70C OH 96C OH Abs). Una vez eliminada el agua, hay que eliminar el OH, esto lo haremos con un aclarado de Xilol. PRINCIPIOS GENERALES DE LA FIJACIN 1. No existe un mtodo universal de fijacin (un agente fijador adecuado para un tejido, puede no serlo para otro). 2. No todos los fijadores conservan indefinidamente el tejido, ya que fijacin no es equivalente a conservacin tisular. 3. Un defecto en la fijacin jams puede ser corregido. 4. Es intil realizar un estudio histolgico sobre un material con graves defectos en la fijacin.

CLASES DE AGENTES FIJADORES SEGN SU MECANISMO DE ACTUACIN Los clasificamos en dos grupos: Fijadores por mtodos fsicos: Se emplea el enfriamiento por congelacin del tejido como mtodo para retrasar los procesos de autolisis y putrefaccin tisular. Se usa en las biopsias intraoperatorias. Fijadores por mtodos qumicos: Los agentes fijadores generalmente en forma lquida, actan desnaturalizando e insolubilizando las protenas tisulares, lo cual bloquea la autolisis por inactivacin enzimtica. Adems algunos impiden el crecimiento bacteriano.

La fijacin por mtodos fsicos es el mtodo de eleccin para realizar estudios morfolgicos y funcionales en los que se quiere conservar intacta la estructura antignica del tejido. Para ello el material mas adecuado es el que no est fijado. De ah que se proceda a la congelacin de las piezas en fresco, al objeto de conservarlas hasta el momento de realizar la tcnica y adems darles la consistencia adecuada para su corte en secciones microscpicas. El sistema de congelacin es muy importante ya que congelaciones inadecuadas alteran la conservacin antignica, afectan notablemente la morfologa, dificultan el corte y en conclusin pueden conducir a alteraciones tales que impidan la valoracin de las tcnicas inmunohistoqumicas. El mejor mtodo es la congelacin en nitrgeno lquido mediante bao de isopentano. Esto da lugar a una congelacin adecuadamente rpida (que impide la formacin de los cristales de hielo tpico de los mtodos lentos), a muy baja temperatura (por debajo de los 100C) y sin contacto directo del nitrgeno con material a congelar. El material ha de estar en fresco y baado completamente en suero fisiolgico. La seccin no ha de ser mayor que 1x1 cm, con un grosor de 0,2 cm.

CARACTERISTICAS DE LOS FIJADORES POR MTODOS QUMICOS CARACTERISTICAS QUE DEBE POSEER EL LQUIDO FIJADOR IDEAL: 1. Bloquear de inmediato la autolisis: Este efecto depende principalmente de su poder para producir la desnaturalizacin de las proteinas, de forma que la actividad enzimatica del tejido queda paralizada. Esta capacidad est relacionada fundamentalmente con la velocidad de penetracin y de fijacin que posea el agente fijador. a. Velocidad de penetracin: Es la rapidez con la que un fijador se infunde en el interior de un tejido. (1mm/h) Recuerda que puedes alterar la velocidad de penetracin haciendo piezas mas pequea. Influye en el tamao de la pieza. Velocidad es directamente proporcional al tamao de la pieza.

b. Velocidad de fijacin: No tiene que ser coincidente con la velocidad de penetracin, por ejemplo la formalina tiene una velocidad de penetracin rpida pero fija con cierta lentitud. Ello explica que el proceso de la fijacin es un fenmeno qumico determinado por el tiempo que cada fijador tarda en precipitar y estabilizar los componentes qumicos de los tejidos (lo que tarda en romper los puentes de hidrogeno). 2. Efecto microbicida: Impide o retrasa la accin bacteriana desencadenante de la putrefaccin. 3. No provocar en el tejido retracciones ni distorsiones, que determinen anomalas en su arquitectura. Va a depender principalmente de los cambios inducidos de presin osmtica. 4. Induccin de cambios de textura y composicin tisular, que favorezcan la inclusin, corte y coloracin. Con lo cual podemos decir que no existe un fijador ideal, o lo que es lo mismo, todos los fijadores actualmente disponibles ofrecen ventajas e inconvenientes que los harn indicados para cada tipo de muestras. *No se puede usar formalina pura para fijar un tejido, ya que esta lo daara gravemente, as que hay que reducirla*

REGLAS GENERALES A CONSIDERAR EN EL EMPLEO DE LQUIDOS FIJADORES 1. Colocar el tejido en el lquido fijador lo ms rpidamente posible. 2. El tejido debe estar seccionado en lminas de hasta 4mm de grosor mximo. Si se realiza en un rgano entero se deben realizar incisiones sobre superficie y apertura de cavidades, para que el lquido fijador penetre rpidamente en su interior. 3. El volumen necesario de fijador est determinado por el tejido que se va a fijar. La relacin de volumen / pieza es de 20/1. (recipiente adecuado). 4. La presin osmtica del lquido fijador y el tejido sern equivalentes, si es necesario debe compensarse la del primero utilizando soluciones salinas como agente de disolucin. 5. El pH del lquido fijador debe aproximarse al pH fisiolgico, salvo que su composicin deba contener cidos. El pH estar entre 7 y 8. 6. El tiempo de fijacin es especfico para cada fijador, pero existe un tiempo mximo de fijacin que no debe ser sobrepasado. FORMALDEHIDO O FORMOL (CHOH) Es el fijador ms clsico para microscopia ptica, es el tipo ms simple y pequeo de los aldehdos, su peso molecular es de 30. Para microscopa electrnica el fijador no podr ser un formaldehdo, sino glutamato. La solucin comercial de formaldehdo (formalina) es al 40%, se acompaa de cantidad considerable de metanol, entre un 11 y 16% que potencialmente puede actuar como fijador coagulante y desnaturalizador de las protenas, el agente induce la rotura masiva de los puentes e hidrogeno, determinantes de la estructura helicoidal de las molculas proteicas dando lugar a la formacin de una red o malla reticular polipeptdica por asociacin de los grupos activos desenmascarados por el fijador. Recuerda que el formol a 37-38% es al 100% La formalina es una mezcla de formol, alcohol y agua y si queremos potenciar la velocidad de fijacin cambiaremos el alcohol por metanol. VENTAJAS: Es el fijador mas barato que existe (utilizado en los trabajos de rutina de los laboratorios de AP).

Es un buen fijador nico (moderada conservacin de la estructura tisular) pero podramos decir que no va demasiado bien con todas pero tampoco va demasiado mal.

Buen desinfectante y no endurece excesivamente los tejidos (conservar y almacenar biopsias y piezas quirurgicas).

Provoca escasa retraccin tisular, ya que su presin osmtica es muy parecida a la del tejido, por lo tanto no expulsar mucha agua fuera del tejido.

Velocidad de penetracin intermedia (aproximadamente 1mm/h apenas altera la coloracin tisular por ello es el agente de eleccin para fijar grandes piezas quirrgicas

Excelente fijador para el tejido adiposo y lpidos en general. Fijacin del tejido nervioso (con formol salino). Impregnaciones argenticas (tcnicas de coloracin).

El proceso de fijacin puede ser acelerado o retrasado, modificando la temperatura. o A temperatura ambiente se consigue fijacin en 24h-36h o A 35C 12-24h

o A 55C 3h Las protenas se desnaturalizan y se produce una retraccin del tejido provocando una gran deshidratacin, por lo tanto no es aconsejable. Es compatible con la mayor parte de las tinciones. Relativa capacidad de fijacin de las protenas, pigmentos que contienen hierro y derivados. (hemoglobina y hemoxiderna (destruccin de glbulos rojos)

INCONVENIENTES Por accin de la luz se transforma en cido frmico para evitar este inconveniente se deben guardar en frasco topacio o emplearse en forma de soluciones neutras o tamponadas. Debido a su incorporacin progresiva al tejido en forma de puentes metilicos, el formaldehdo se consume durante el proceso de fijacin, por lo cual debe encontrarse siempre en exceso. (20/1)

Por esto y por su baja presin osmtica (1800s), incorpora agua en los espacios intratisulares y el volumen del tejido disminuye una vez fijado. (disminuye el volumen y aumenta el peso) Para evitar esto se utiliza formol salino o amortiguado con tampones o solucin de sacarosa.

Produce vapores irritantes sobre la mucosa nasal y conjuntiva. Tras la utilizacin prolongada de formalina y por su conversin en cido frmico puede producirse una reduccin masiva de la hemoglobina hasta originar un precipitado cristalino birrefringente de color pardonegruzco dificulta la observacin al microscopio, y recibe el nombre de pigmento formlico. (se produce una degradacin y destruccin de la hemoglobina, por lo tanto se destruye el tejido).

SOLUCIONES FIJADORAS SIMPLES QUE CONTIENEN FORMALDEHIDO a) FORMOL SALINO (Tejido nervioso, similar al formol taponado). Se utiliza para prevenir el efecto osmtico que provoca el empleo de soluciones de formaldehido en agua destilada. (Las muestra aguantan menos en formol salino)

COMPOSICIN:

Formol al 10% . 100ml Cloruro sdico. 9g

1 parte de formol comercial y 9 partes de H2O Se parte del formol comercial al 100% b) FORMOL TAMPONADO (Todo) Es la solucin mas empleada hoy da para prevenir el choque osmtico que provoca la disolucin de formalina en agua destilada, as como el deposito de pigmento formlico que ocurre a pH inferior a 6.

COMPOSICIN: Como amortiguador se emplea el tampn fosfato calibrado a pH 7,0 7,2. Formalina comercial (formol) al 100%.....................100ml Fosfato sdico monobsico.4g

Fosfato sdico dibsico..6,5g Agua destilada...900ml 1L de formol al 10% formalina + agua destilada c) FORMALINA CIDA (es muy parecida al formol salino) Se emplea para fijar el tejido nervioso en la preparacin de algunas tcnicas de impregnacin argntica. COMPOSICIN: cido actico glacial.1cc Formalina al 10%..................... 99cc (partes) d) FORMOL CALCICO DE BAKER (Tecnicas histoenzimatolgicas) Aadir CaCl2 al 1% a una solucin de formalina neutra o tamponada al 10% COMPOSICIN 10 ml solucin ClCa2 al 1% 990 ml de formol tamponado

MEZCLAS FIJADORAS QUE NO CONTIENEN FORMOL

LQUIDO DE ZENKER (Biopsias de medula sea, ya que es descalcificante) Preparacin: Solucin stock de Zenker. 95ml cido actico glacial 5ml Solucin stock: Cloruro de mercurio 5g

Dicromato potsico. 2,5g Sulfato sdico. 1g Agua destilada 100ml

LIQUIDO DE CARNOY (para el msculo y el hgado, se puede ver el glucogeno) Es el mejor fijador para el glucgeno, y en general para los hidratos de carbono simple y para protenas fibrilares pero sobre todo para las miofibrillas. Sin embargo, produce una excesiva retraccin histica as como hemlisis de los eritrocitos y pobre conservacin estructural de las protenas globulares y del ADN. Preparacin: Etanol absoluto. 60ml Cloroformo.. 30ml cido actico glacial... 10ml El mayor endurecimiento se produce al prolongar el tiempo de deshidratacin en alcohol se puede prevenir sustituyendo el etanol por metanol y produce menos retraccin.

MEZCLAS FIJADORAS Se clasifican en dos grandes grupos, dependiendo de que contengan o no formaldehdo en su composicin.

a) Mezclas fijadoras que contienen formol + otros fijadores LIQUIDO DE BOUIN (piel, rganos endocrinos, testculos) Es una mezcla utilizada como alternativa a la formalina, velocidad de penetracin y fijacin rpida.

Preparacin:

Solucin saturada de cido pcrico.. 750ml (cido pcrico al 1-2% en agua destilada) Formalina comercial 40%................................ 250ml cido actico glacial 50ml pH final aproximado. 2,2

tiempo de fijacin: de 2 a 24h OBSERVACIONES: Tras la fijacin, lavar abundantemente con alcohol de 70 hasta la decoloracin de la muestra para asegurarse la completa desaparicin del cido pcrico.

BOUIN ALCOHOLICO: (Dubosq-Brasil) Constituyen una alternativa vlida a la mezcla clsica de Bouin cuando la pieza que se va a fijar es voluminosa (velocidad de penetracin ms elevada) y cuando se precisa una fijacin especifica de sustancias hidrosolubles como el Glucogeno, ya que evita su disolucin. Preparacin: Alcohol etilico al 80. 75ml cido pcrico 0,5g Formalina concentrada 40%......... 30ml cido actico glacial 7,5 ml OBSERVACIONES: mezclar antes de su uso.

TCNICA DE DESCALCIFICACIN (hay calcio en los huesos y en los tumores)

MATERIAL: LIQUIDOS DESCALCIFICANTES 1) MEZCLA DE CITRATO SDICA CIDO FRMICO SOLUCIN A: Citrato sdico al 20% SOLUCIN B: cido frmico al 50%

Ambas soluciones se mezclan al 50%, aadiendo la B sobre la A en el momento de usarla. VENTAJAS: 1. No deteriora los tejidos 2. Descalcifica de 24 48 horas

2) FORMOL FRMICO AL 20 %

VENTAJAS: 1. 2. etc. 3) CIDO NTRICO AL 5% Conserva la estructura Su relativa lentitud (40 -50h) lo hace idneo para descalcificar en fines de semana largos,

VENTAJAS: Es muy rpido. INCONVENIENTES: Deteriora los tejidos y no debe emplearse mas de 10 24h. Hay que tener mucho cuidado. DESCALCIFICACIN

Se denomina descalcificacin a la completa eliminacin de las sales de calcio presentes en los tejidos tras haber realizado su fijacin. Habitualmente este procedeimiento tcnico se realiza de forma sistematica sobre tejidos mineralizados (dientes y huesos) y espordicamente, sobre material anatomicopatologico con calcificaciones que dificulten o impidan la observacin macroscopica de las lesiones. SOLO EST DESACONSEJADO DESCALCIFICAR EL TEJIDO EN LAS ENFERMEDADES METABOLICAS. En este caso se realizarn cortes de tejido sin descalcificar empleando un microtomo motorizado especfico para seleccionar tejidos duros incluidos en plastico. Los principales agentes descalcificadores estan formados por acids fuertes o dbiles , empleados aisladamente o en conjuncin con distintos lquidos fijadores. METODO

1. Fijarlos en formol 24h. 2. Lavado de 15-30 minutos en agua. 3. Cortar bloques de 1,5 x 1,5 x 0,5 cm de dimensiones mximas. 4. Introducirlos en lquido descalcificante en proporcin 50/1, procurando que todas las superficies estn en contacto con el mismo. (contra mas lquido mas facilidad) 5. Vigilar la descalcificacin cada 12 -24h probando su dureza con aguja o bistur. 6. Cambiar cada vez el lquido. (2-3 veces). 7. Una vez descalcificadas, lavar con agua corriente las piezas antes de incluirlas en parafina.

METODOS Y TCNICAS DE INCLUSIN Con excepcin de los tejidos destinados a congelacin, la mayor parte de las muestras para estudio histopatologico requiere da la inclusin en un medio slido.

La finalidad es proporcionar a la pieza anatmica homogeneidad y dureza suficiente para que se puedan obtener secciones finas de calidad. Aunque es posible realizar la inclusin en muy diferentes medios, algunos de ellos hidrosolubles, el mtodo de eleccin sigue siendo la inclusin en parafina. El tejido fijado se somete siempre a: deshidratacin aclaramiento infiltracin

A excepcin de la inclusin en un medio hidrosoluble que o requiere de los dos primeros pasos. En los modernos laboratorios, se realiza de forma automtica mediante procesadores de inclusin. (Formolaguaalcohol) 1) DESHIDRATACIN La deshidratacin tiene por finalidad la eliminacin completa de agua de la muestra tisular para que se pueda embeber adecuadamente el tejido en aquellos medios de inclusin que no sean hidrosolubles. La deshidratacin podr realizarse utilizando cualquier reactivo que sea capaz de absorber el agua de los tejidos. Las principales condiciones de un agente deshidratante son dos: a. No debe alterar las estructuras tisulares b. Debe poder mezclarse con el reactivo intermediario o agente aclarante. El proceso de deshidratacin se suele realizar mediante el empleo de alcohol etlico, empleando una serie de baos de graduacin ascendente hasta llegar al alcohol absoluto, ya que la accin brusca de un alcohol de elevada graduacin sobre el tejido provocara una elevada retraccin de este. (fuerte choque osmtico) El etanol es el que mejor deshidrata, es barato, no produce cambios estructurales importantes y es miscible con los aclaradores. Adems del alcohol etlico, puede emplearse como agente deshidratante: El alcohol metlico/metanol Acetona Alcohol butlico

Dioxano Alcohol isoproplico Tetrahidrofurano

H2O

OH 50

OH 70

OH 96

OH Abs

2) ACLARAMIENTO / PASO INTERMEDIO Es el proceso por el cual se consigue la sustitucin del agente deshidratante por una sustancia miscible con el medio de inclusin que va a utilizarse. Con ello se pretende que toda la pieza histopatolgica se encuentre embebida en un agente qumico lquido, en el que pueda disolverse el medio de inclusin, y de ste modo penetrar en el tejido. Los agentes aclarantes tambin reciben la denominacin genrica de lquidos intermediarios. El xileno es el agente aclarante de empleo habitual. Tambin son agentes aclarantes: El tolueno Benceno Cloroformo Tetracloruro de carbono Dioxano

El alcohol no es soluble con la parafina.

OH Abs

Xilol

Xilol

Xilol

Xilol

TALLADO Para realizar un tallado, necesitamos a un patlogo (que har el tallado) un tcnico, una mesa de tallado (tijeras, bisturs, agujas histolgicas, plancha de mrmol, sondas, pinzas con dientes y sin dientes, cinta mtrica, cuchillos de autopsia), lquidos (fuente de formol, agua), flujo laminar de gases, un dictafono para

una descripcin macroscpica, equipos de proteccin personal (bata, guantes, mascarilla, gafas), hojas de peticin y los botes, los casets debidamente identificados del modo que el patlogo indique. Recuerda que las placas se cortaran cuboidalmente (1,5 x 1,5 x 0,5 cm) El patlogo decide el mtodo de corte segn la estructura de la pieza, es decir, la orientacin. El resultado sern un nmero de casets identificados con las muestras ya talladas, fijadas y listas para procesar. 3) INFILTRACIN, IMPREGNACIN, O INCLUSIN PRPIAMENTE DICHA. Tiene por objeto rellenar o infiltrar completamente la muestra histopatolgica con el medio que se va a utilizar para embeber el tejido. El medio de inclusin ocupar por completo los espacios intra y extracelulares inicialmente rellenos por el agua intratisular. Para conseguir ste efecto, casi siempre es imprescindible eliminar todos los restos aclarantes residuales en el tejido. INCLUSIN EN PARAFINA Para la infiltracin en parafina se usan habitualmente parafinas con punto de fusin de 56 a 58 grados centgrados. Se realiza mediante baos sucesivos en parafina fundida. Estos baos deben renovarse frecuentemente, porque se cargan de medio de aclaramiento y ello provoca descenso en el punto de fusin de la parafina, volvindola ms blanda y menos apropiada para el corte. Adems, por evaporacin del solvente despus de la inclusin, se produce la desecacin y retraccin de la pieza lo que le da un aspecto tpico de cuero curtido de las inclusiones defectuosas. Para procedimientos no rutinarios es posible realizar la infiltracin en el vaco, que produce una infiltracin ms rpida. La inclusin en parafina de un tejido se puede realizar: de forma manual automtica El procedimiento manual ha sido desplazado por sistemas automticos, pero sigue siendo vlido para el procesamiento de muestras que por su volumen, por ejemplo: piezas quirurgicas completas, o por su extrema delicadeza no pueden ser incluidas en el procesador automtico. Cuando hay que hacer una

inclusin rpida en parafina, el procesamiento manual puede ser acelerado realizando tambin en caliente la deshidratacin. En el procesamiento automtico se emplean automticos que contienen multiples vasos para realizar los baos y un sistema mecnico de transporte a travs de ellos regulado por un programador horario. Estos sistemas poseen tres ventajas fundamentales: o Procesar simultneamente gran cantidad de muestras distintas o Economizar la cantidad de lquidos empleados en el proceso o Realizar el procesamiento a lo largo de la tarde/noche, pudiendo elaborarse los bloques y hacerse los cortes en la siguiente jornada de trabajo. Para obtener buenos resultados es fundamental renovar a menudo los lquidos contenidos en los baos: su enturbamiento o el olor a lquido aclarante en el ltimo bao de parafina, indica la necesidad de cambiarlos.
TIEMPO PARA

BAOS Formol 10% lquido de lavado postfijacin Etanol al 70% Etanol al 96% Etanol absoluto Etanol absoluto Etanol absoluto Xileno o tolueno Xileno o tolueno Xileno o tolueno Parafina lquida Parafina lquida Parafina lquida TIEMPO TOTAL

PROCESAMIENTO

MANUAL 2 horas 2 a 4 horas 2 a 4 horas 1 a 2 horas 1 a 2 horas 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 2 horas 16 a 22 horas

AUTOMTICO 2 horas 2 horas 2 horas 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 1 hora 2 horas 16 horas

TIEMPO PARA BAOS Formalina tamponada Etanol al 70% Etanol al 96% Etanol absoluto PROCESAMIENTO RPIDO 30 min a 60C 30 min a 60C 30 min a 60C 30 min a 60C

Etanol absoluto Etanol absoluto Etanol acetona Acetona Xileno o tolueno Xileno o tolueno Xileno o tolueno Parafina lquida Parafin lquida Parafina lquida TIEMPO TOTAL DESHIDRATACIN

15 min a 60C 15 min a 60C 15 min a 60C 15 min a 60C 15 min a t. ambiente 15 min a t. ambiente 15 min a t. ambiente 15 min a 60C 30 min a 60C 1 hora a 60C 5 HORAS 30 MINUTOS

sucio H2O X 2 PF H2O X 5 min 15 min PF OH 50 PF OH 70 PF OH 96 45-60 45-60 45-60 PF OH Abs 45-60 PF

interme.

limpio

OH Abs PF OH Abs 45-60 45-60

ACLARAMIENTO

Xilol 1 60-90 PARAFINA

PF

Xilol 2 60-90

PF

Xilol 3 60-90

Parafina 1 45-60

Parafina 2 45-60

Parafina 3 45-60

FUNCIONES DEL TCNICO Tiene a su cargo la programacin del procesador automtico el recambio peridico de sus lquidos y la colocacin en su interior de las canastillas que contienen los casetes. L inclusin se inicia al final de la jornada y se completar durante la tarde/noche. Cuando la demanda de inclusiones es muy elevada, tambin es competencia del tcnico establecer las prioridades: en primer lugar se procesan las pequeas biopsias de

diagnstico, en segundo lugar las piezas quirrgicas procedentes de ciruga, y por ltimo el material de autopsias e investigacin. La primera tarea diaria del tcnico de AP, ser la fabricacin de los bloques de parafina correspondientes a la inclusin del da anterior, una vez extradas las muestras del procesador automtico de tejidos. En las piezas que requieren orientacin especial, es conveniente que participe el tcnico que ayud al patlogo. Tambin es competencia del tcnico el mantenimiento y limpieza del material empleado.

OTROS MTODOS DE INCLUSIN Se aplican muy raramente en la prctica diaria, pero son de gran inters para investigacin o en determinadas tecnologas especiales, sobre todo en microscopia electrnica. Es el caso de la inclusin en: Medios hidrosolubles, como la gelatina y el polietilenglicol y su derivados. La inclusin en celoidina. La inclusin en plstico (resinas)

La principal ventaja de la gelatina es que no se precisa deshidratar el tejido, ya que es soluble en agua, por ello se emplea cuando los compuestos a determinar no resisten el alcohol ni otros disolventes. Slo se emplea en casos muy especiales, y como mtodo previo cuando hay que mantener unidos los diferentes elementos de objetos heterogneos que deben cortarse por congelacin. El polietilenglicol y sus derivados se emplean fundamentalmente para la demostracin de enzimas, lpidos y cuantos elementos tisulares puedan ser desnaturalizados por el calor deshidratantes y aclarantes. La inclusin en celoidina es recomendable para materiales de grandes dimensiones o excepcionalmente duros por ej: centros nerviosos de animales grandes o tejido oseo, y tambin para materiales muy heterogneos por ej: el globo ocular. Con este procedimiento se obtienen bloques de gran dureza. La mayor limitacin es el mucho tiempo necesario para completar el procesamiento, dias e incluso semanas, y por otra parte los cortes obtenidos a partir de celoidina no pueden ser inferior a 10 micras de grosor, por lo general sern de 15 micras. o por el tratamiento con agentes

TIEMPO BAOS Formalina tamponada Etanol al 70% Etanol al 96% Etanol absoluto Etanol absoluto Etanol absoluto Etanol acetona Acetona Xileno o tolueno Xileno o tolueno Xileno o tolueno Parafina lquida Parafin lquida Parafina lquida TIEMPO TOTAL RPIDO 30 min a 60C 30 min a 60C 30 min a 60C 30 min a 60C 15 min a 60C 15 min a 60C 15 min a 60C 15 min a 60C

PARA

PROCESAMIENTO

15 min a t. ambiente 15 min a t. ambiente 15 min a t. ambiente 15 min a 60C 30 min a 60C 1 hora a 60C 5 HORAS 30 MINUTOS

PROCESADOR 2) Panel de control Palanca de encendido : ON/OFF. (Piloto ON) Selector. 3 posiciones: Manual auto OFF. o Manual: No activa movimiento oscilante de los cestos. Se mover de recipiente en recipiente hasta que se ponga en OFF. o Auto: Activa el movimiento de oscilacin de los cestos. No ontrola el movimiento de la cpula hasta que los stops del disco estn situados. (Piloto. Excepto si est en operacin retardada) Control para operacin retardada. (piloto, cuando el selector est en auto) Disco: periodo de 24 horas, 12 stops.

2) 3) Derecha izquierda.

Al lado derecho, receptores para los enchufes de los potes de parafina. Los potes Fusibles a la izquierda

tienen unos pilotos que se encienden cuando la palanca ON. 4) Palanca de control manual, debajo de la campana PULL. Usar solo cuando la campana esta elevada. 5) Campana de seguridad, si hay solidificacin en los potes de parafina, un microinterruptor corta el circuito. 6) Parada automtica en la parafina, se para el movimiento de rotacin de la cpula. Continua el movimiento oscilante de los cestos hasta que la palanca OFF. 7) Los potes de parafina estn ajustados para control automtico de la temperatura en un rango de 37 62 grados C.

CONFECCIN DE LOS BLOQUES Para confeccionar bloques en el laboratorio de anatomia patologica y citologia usamos la estacion de inclusin. Esta consta de los elementos necesarios para confeccionar un bloque de parafina que contenga una o varias muestras de tejido dentro de ella. El fundamento de la confeccin es obtener un soporte idneo para el tejido que permita cortarlo con la precision que requiera. Las estaciones de inclusin constan de diferentes partes: Dispensador de parafina lquida Placa caliente (debao de la boquilla de vertido de parafina) donde se calentara el molde de acero y se pone a la misma temperatura que la parafina lquida. Placa fria: para solidificar la parafina (0C) Piscina de parafina caliente

Aparte de la estacion de inclusin necesitamos: Un mechero bunsen para calentar la aguja histologica y las pinzas Aguja histologica Pinzas con y sin dientes (Mejor una pinza atraumatica) Moldes de acero

PROCEDIMIENTO Y TECNICA:

Sacar las muestras de la ultima parafina del procesamiento y meterlas en la piscina de parafina caliente/dispensador Encender la placa caliente y ponerla a temperatura de fusin (56-58C) Colocar el molde de hacer debajo del grifo de parafina en la placa calefactora. Dejar al menos 3 minutos. Echar una pequea cantidad de parafina sobre el molde asegurandonos que este a la temperatura adecuada (0 opacidad). Sacar el casset de la piscina de parafina caliente/dispensador y colocarlo sobre la placa caliente. Abrimos el casset, cogemos los tejidos con una pinza y los ubicamos en el molde de acero. Para ello utilizamos la pinza de diseccin sin dientes y la aguja histolgica previamente calentadas con el mechero bunsen para evitar el choque fuerte de temperatura.

Ponemos la tapa del casset y llenamos el molde hasta arriba (ver que la parafina sube por encima de la rejilla del casset). Traslado de ese molde a la placa fria donde se dejar aproximadamente durante 5 y 10 minutos. Desmoldar, desbastar y cortar.

MICROTOMOS. TCNICAS DE CORTE DE LOS TEJIDOS El microtomo es un instrumento mecnico con el que se realizan secciones tisulares de espesor micromtrico y, por tanto, lo suficientemente delgadas para permitir su posterior observacin microscpica. Tipos fundamentales de microtomos: microtomo de rotacin o tipo Minot microtomo de deslizamiento Microtomo de congelacin Criostato o criotomo Ultramicrotomo

Todos tienen los mismos principios bsicos de funcionamiento; un portabloques en el que se apoya el material que se va a cortar se hace incidir de forma periodica sobre una cuchilla, obteniendose secciones tisulares con un espesor equivalente al que previamente se seleccion en el tornillo micromtrico que controla el mecanismo de avance.

El portabloques qiene un dispositivo de orientacin que garantiza su paralelismo con la cuchilla y es posible cambiar la posicin del portacuchillas para variar el ngulo de inclinacin de la mismo. a) MICROTOMO DE ROTACIN O TIPO MINOT El portabloques est colocado en posicin vertical, y se mueve arriba y abajo delante del filo de la cuchilla. El movimiento de rotacin del brazo del microtomo produce adems el avance automtico y constante del portabloques. Es un instrumento de gran precisin que permite obtener secciones seriadas muy finas. b) MICROTOMO DE DESLIZAMIENTO Se le llama as debido a los carriles de que va provisto. Existen dos tipos fundamentales de microtomos de deslizamiento, segn que se movilice el portabloques sobre la cuchilla, permaneciendo esta fija, o viceversa. En ambos casos, el movimiento que produce el corte es el avence y retroceso de la porcin mvil del microtomo sobre unas guias metlicas. Un tipo de microtomo de deslizamiento es el TETRANDER, de gran tamao, que permite realizar secciones de rganos completos. Se emplean para efectuar cortes sobre tejido incluido en celoidina. c) MICROTOMO DE CONGELACIN (Antiguo y obsoleto) La congelacin del material se realiza haciendo circular por el interior de su portabloques hueco, una corriente de anhdrio carbnico procedente de una bombona a presin. De esta manera, el gas, al expandirse en su interior, produce el enfriamiento progresivo de la superficie donde se coloca el tejido. Una vez congelado el material, las secciones se practican con una cuchilla que pivota sobre un eje fijo, de forma que el avance lo realiza el portabloques por un mecanismo directo de tornillo. Este tipo de mirotomo ha sido desplazado por el criostato debido a sus inconvenientes: o dependencia del gas carbnico para mantener la congelacin. o Espesor de los cortes, superior a 10 micras o Dificultad para estirar los cortes realizados. d) CRIOSTATO O CRIOTOMO Consta de un microtomo de tipo Minot incluido en una cmara de congelacin. El volante que controla la realizacin del corte se encuentra en el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance

estn situados dentro de la cmara fria (normalmente a -20C). La cuchilla se encuentra en posicin horizontal y pueden obtenerse secciones seriadas grcias a la existencia de un sistema antienrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie de la cuchilla. REALIZACIN DE CORTES CON EL CRIOSTATO o Muestra en fresco humedecida con suero salino 0,9%. o Entrega al patologo. o Fijar, procesar e incluir la muestra en fro (colocaremos el tejido en la platina y le pondremos gel OCT, lo colocamos en la pieza del criostato por donde pasar el Nitrogeno lquido para congelar la muestra) La muestra se pone tal cual viene. Una vez engarzada en el portamuestras se congela y se corta entre 4-6 micras. El resultado es un porta con tejido congelado.

o Se le da un bao de OH 96 y dos baos de para rehidratarlo. o Se prepara la tincin y se tie (preferiblemente Hx).

e) ULTRAMICROTOMO (microscopia electrnica) Es un microtomo bsicamente derivado del tipo Minot, aunque dotado de numerosas mejoras tcnicas que permiten efectuar secciones de hasta unas pocas decenas de nanmetros de espesor a partir de material incluido en plstico (hepoxiresinas).

TIPOS DE CUCHILLAS PARA EL MICROTOMO En la actualidad se emplean fundamentalmente cuchillas desechables. Hay 4 tipos bsicos de cuchilas: Bicncava: Parafina blanda + tejido blando (glandulas) Planoconcavas: Tejidos Blandos (casi no se usan) o Tipo Ay B. Biplana estndar: tejidos blandos y duros Biplana con faceta: Tejidos extremadamente duros o Evitan la vibracin.

o Traquea, zonas de pulmon, zonas cartilaginosas, msculo Desechables: Uso limitado y caro.

TCNICAS DE CORTE SOBRE BLOQUES DE PARAFINA Es una de las labores de mayor trascendencia que debe realizar el tcnico de laboratorio. Consta de 6 pasos: Retallado y enfriamiento del bloque. Fijacin al portabloques. Orientacin del bloque. Orientacin de la cuchilla y desbastado del bloque. Seleccin del espesor del corte. Realizacin de las secciones. RETALLADO Y ENFRIAMIENTO DEL BLOQUE Retallar un bloque es el eliminar el exceso de medio de inlusin que rodea la pieza. Con los actuales moldes esta maniobra es innecesaria. Antes de colocar el bloque en el microtomo debe enfriarse para conseguir la consistencia ptima de la parafina. La temperatura ideal en el momento de realizar los cortes se encuentra entre 5 y 10 grados centigrados. El enfriamiento ms adecuado se obtiene almacenando los bloques en una cmara frigorifica a 4C. FIJACIN AL PORTABLOQUES Hoy en dia en la confeccin de los bloques de parafina se emplean soportes plsticos que se adaptan al portabloques. ORIENTACIN DEL BLOQUE Una vez colocado el bloque en el portabloques, se hace descender el brazo del microtomo hasta que la superficie del bloque entra en contacto con la cara interna de la cuchilla de desbastado. En este momento se comprueba el paralelismo entre ambas, en caso necesario se restablece mediante manipulacin del portabloques. ORIENTACIN DE LA CUCHILLA Y DESBASTADO DEL BLOQUE

Se denomina orientacin de la cuchilla a la inclinacin de sta con relacin a la superficie del corte. El ngulo de inclinacin debe encontrarse entre 10 y 15 C. o Si es mayor de 15C, la cuchilla estar excesivamenteperpendicular al bloque, el filo tiende a introducirse profundamente en la parafina del bloque, arrancando parte de esta y provocando una fuerte vibracin de la cuchilla. Todo ello origina pequeas ondulaciones en la superficie del bloque y cortes de espesor muy irregular. o Cuando el angulo de inclinacin es menor de 10C, la cuchilla estar excesivamente paralela al bloque, el filo no incide sobre la superficie del bloque, se desliza sobre . De esta manera no es posible obtener una seccin hasta que el bloque ha avanzado lo suficiente. Esto trae como consecuencia la obtencin de cortes discontinuos de gran espesor. Una vez orientada la cuchilla sobre el bloque, se procede al desbastado de este, eliminando las cpas de parafina situadas sobre el tejido. El desbastado termina cuando se obtiene en cada corte la superficie completa del tejido. SELECCIN DEL ESPESOR DE LOS CORTES Las secciones obtenidas a partir del tejido incluido en parafina suelen tener un espesor de entre 2 y 6 micras. El tejido incluido en parafina no puede ser cortado don un grosor mayor de 20 micras porque los cortes se enrollan de manera irreversibles. En caso de que sea necesario, la inclusin del material se debe realizar en CELOIDINA. REALIZACIN DE LAS SECCIONES Se sustituye la cuchilla de desbastado por la que vamos a emplear para los cortes finos. Iniciaremos el movimiento rotatorio del brazo del microtomo hasta obtener una cinta de cortes (5-6 cortes). E conveniente sujetarla segn se vaya formando. Cuando el tejido tiende a quebrarse o desmoronarse por estar demasiado frio, ser heterogeneo (coagulos, tejido oseo, etc) o estar cargado de electricidad estatica, suele ser muy util exhalar vaho de la respiracin sobre el bloque de parafina. o ESTIRADO DE LOS CORTES Y CONFECIN DE LAS PREPARACIONES Se estiran en un bao con agua caliente a temperatura entre 50-56C gracias a las fuerzas de tensin superficial que se generan en la mina de parafina y tejido al hacerla flotar sobre el lquido. Las posibles arrugas y pliegues que suelen producirse pueden ser eliminadas mediante

la manipulacin de los cortes, una ves que estn sobre el agua, con dos pinceles de pelo fino o con dos agujas histoogicas. Las burbujas de aire que se formadebajo de los cortes son difciles de eliminar son producir artefactos sobre el tejido, por ello evitaremos que se formen desprendiendolas peridicamente de las superficies del bao, cuando ste se encuentra libre de cortes. Por ltimo se capturan los cortes elegidos, introduciendo verticalmente el portaobjetos en el bao hasta tocar la seccin por uno de sus bordes, el corte va quedando adherido al portaobjetos segn se retira del agua lentamente. Se deja drenar el aguador gravedad. Antes de colocar en el bao seccions nuevas, eliminaremos cualquier vestigio de las anteriores para evitar contaminaciones accidentales. Esto se consigue pasando sobre la superficie del agua un pauelo de papel de filtro. o SECADO DE LAS PREPARACIONES HISTOLOGICAS Se deben secar meticulosamente para evitar su desprendimiento. Se puede realizar de forma rpida, colocando los portaobjetos en la estufa a 60C durante 30-60 minutos SOLUCIONES ADHERENTES PARA PORTAOBJETOS Para los procedimientos ms rutinarios, la adhesin del tejido al portaobjetos queda garantizada con el proceso de desengrasado. Pero hoy en dia se realizan muchas tcnicas histoqumicas, de base inmunolgica y de biologa molecular, que causan con gran frecuencia el desprendimiento de los cortes, y por ello es imprescindible impregnar los portaobjetos con sustancias fijadoras que dificulten ste fenomeno. Para ello se han empleado sustancias naturales como la albumina de huevo o la gelatina, pero actualmente estn siendo sustituidas por materiales sintticos como la polo-L-lisina, que aunque es mucho ms cara, proporciona la masima adhesividad. Los portaobjetos impregnados en esta sustancia, se emplearn para tcnicas inmunohistoquimicas con multilpes pasos, y sobre todo para biologa molecular, donde se requieren incubaciones prolongadas a 100C de temperatura. FUNCIONES DEL TCNICO

Como norma general, cada tcnico tiene asignado un nmero diario de bloques para seleccionar. El nmero de tcnicas solicitadas. Adems de los cortes, tiene a su cargo la supervisin y el mantenimiento de los aparatos utilizados.

TRATAMIENTO DE LOS CORTES PREVIO A LA COLORACIN DESPARAFINACIN

Xilol 1 En caliente (40-45C) 10-15 min

PF

Xilol 2 En frio 10-15 min

o Desparafinacin fsica: En la estufa a 60C entre 25-45 min (evapora el agua y quita la parafina). o Desparafinacin qumica: Si ponemos en contacto la parafina con el xilol este la elimina. HIDRATACIN

OH Abs PF X2 5 min COLORACIN

OH 96 PF 3-5 min

OH 70 3-5 min

PF

OH 50 3-5 min

PF

H2Od x2 5 min

Los tiempos dependern de cada colorante utilizado. FUNDAMENTOS GENERALES DE LA COLORACIN GENERALIDADES El principio general de las coloraciones se basa en la propiedad que tienen los tejidos o formaciones celulares de incorporar o fijar de modo variable determinadas sustancias llamadas colorantes.

TIPOS DE COLORANTES Segn su origen: Colorantes naturales: Son relativamente escasos, se obtienen en forma de extractos a partir de ciertas plantas o insectos. En histotecnologa de rutina son ampliamente utilizados, siendo los ms conocidos como colorantes nucleares: Hematoxilina, Carmn. Colorantes citoplasmaticos: Safranina, orceina. Colorantes artificiales: La mayor parte son derivados de la anailina. Hoy en dia constituyen la base de la mayor parte de las coloraciones histolgicas. Inicialmente se obtenian del alquitran de carbn. Hoy en dia se sintetizan en los laboratorios, por lo que su numero crece continuamente.

NATURALEZA QUMICA DE LOS COLORANTES Podemos definir al colorante, como una sustancia que puesta en contacto con un soporte adecuado, se une a el de forma perdurable transmitindole un color. El soporte qumico de la mayor parte de los colorantes naturales y de la totalidad de los artificiales es el BENCENO (estable qumicamente) (C6H6). Este hidrocarburo aromtico es incoloro. Cuando el benceno se pone en contacto con distintos radicales, se forman derivados bencnicos, los cuales absorben las radiaciones luminosas dentro del aspecto visible y muestran color. A estos radicales se les llama CROMFOROS y al derivado bencnico que se forma recibe el nombre de CROMGENO. * Si unimos los bencenos con los cromforos, formamos cromgenos que tienen capacidad de coloracin* Existen varios radicales cromforos entre ellos: azoico (-N=N-), Etileno (>C=C<) Para que el cromogeno se transforme en colorante, se tiene que adicionar a otros grupos atomicos que tienen la propiedad de disociarse electrolticamente o de formar sales en los tejidos. A estos grupos se les denomina AUXOCROMOS o potenciadores de color. Estos pueden tener carcter cido o bsico, siendo los responsables de que si el colorante tenga mayor o menor afinidad por la estructura que va teir.

CLASIFICACIN

DE

LOS

COLORANTES

SEGN

SUS

GRUPOS

AUXOCROMOS

APETENCIA TISULAR COLORANTES CIDOS: Son aquellos compuestos cuyo principio activo es el acido, como por ejemplo la Eosina, Eritrosina, Fucsina cida, Naranja G, Azul de Anilina Utilizando principalmente para el citolpasma celular y los compuestos bsicos en general (protenas celulares, organulos citoplasmaticos) COLORANTES BSICOS: Estn compuestos por una base colorante y un cido indiferente, como por ejemplo la Fucsina Bsica, Azul de Metileno, Hematoxilinas, Verde de Metilo Se emplean principalmente para colorear los ncleos celulares, pero tambin colorean en ciertas condiciones, otras estructuras cidas (ADN). COLORANTES NEUTROS: Se pueden considerar como sales, que resultan de la unin de un cido colorante y una base colorante. Pueden colorear conjunta o separadamente diversas estructuras, pero casi no se utilizan. COLORANTES INDIFERENTES: No poseen carcter cido ni bsico, por lo que simplemente colorean los tejidos por un mecanismo de impregnacin (impregnacin argentica). Estos colorantes no poseen polaridad. COLORANTES METACROMTICOS: La mayor parte de los colorantes tien los tejidos de forma ORTOCROMATICA, comunicandoles los distintos tonos del colorante. Sin embargo algunos colorantes comunican a ciertos tejidos un color diferente del que le es propio a esto se le llama METACROMASIA. Los colorantes metacromticos son bsicos del tipo de la anilina, como por ejemplo el Azul de Toluidina, Violeta de Metilo, Cristal Violeta, PAS, etc. La metacromasia va a depender de: o Las particularidades del colorante: grupo auxocromo, cromogeno y el pH. o Caracteristicas del tejido o sus componentes, que se unen con el colorante para dar la propiedad mencionada. o El color primario del colorante se debe a que predomina en la solucin la variedad monomrica (molcula simple). En la prctica, los colorantes metacromaticos se utilizan en concentraciones de 0,1 % en p/v. Debe evitarse el exceso de tincin suele estar entre 5-20 minutos, en la mayor parte de los metodos. MECANISMOS GENERALES DE LA COLORACIN

Existen tres mecanismos de coloracin que se dan entre la materia colorante y los tejidos. MECANISMO FSICO: Es el que se produce por dilucin o por impregnacin. El colorante al ponerse en contacto con el sustrato a teir no sufre cambios qumicos, ninguno de los dos. o Dilucin: El colorante es ms soluble en el tejido que en el disolvente que le sirve de vehiculo como el colorante de las grasas (con alcohol la grasa se deshace, por lo tanto se utiliza SUDAN). o Impregnacin: El colorante por su gran volumen molecular o por precipitacin en forma de agregados solubles, queda atrapado entre la malla de clulas y fibras que constituyen el tejido. MECANISMO FISICOQUMICO: Estas coloraciones tisulares son las que se producen por la atraccin electroestatica entre las distintas sustancias que se van a colorear y los colorantes propiamente dichos. Son el caso de los colorantes cidos que tien estructuras bsicas y viceversa. Uno de los 2 o los 2 puede sufrir cambios qumicos. MECANISMO HISTOQUIMICO: Es un mecanismo puramente qumico en el cual se produce una reaccin qumica entre el colorante y la estructura objeto de tincin, de forma que cuando interaccionan forman un nuevo cromgeno que es el responsable del color obtenido. Los dos van a cambiar, adems se forma una nueva molcula. COLORANTES NUCLEARES La mayor parte de las coloraciones que se utilizan en histopatologa contienen colorantes que tien de manera especifica el ncleo celular, definiendo su contorno y realzando su contenido cromtico. Por ello se utilizan colorantes bsicos con apetencia por los grupos fosfricos cidos del ADN. Entre estos tenemos: Verde metilo, Fucsina Bsica, Violeta de Cresilo Entre los naturales tenemos: Hematoxilinas, Safarina, Carmn COLORANTES CITOPLASMTICOS En general son menos especificos que los nucleares, se fijan a los componentes extracelulares de los tejidos provocando su tincin simultanea. Los ms utilizados son: Eosina, Eritrosina

Colorean los tejidos en diversas tonalidades de ROJO y ROSA, se difunden fcilmente entre las estructuras msticas, siendo fcilemte atradas hacia los radicales bsicos. Se puden emplear en solucin acuosa o alcoholica siendo ms solubles en la primera, la eosina Y es mejor. TRATAMIENTO DE LOS CORTES TRAS LA COLORACIN DESHIDRATACIN

H2Od 5 min

OH 50 PF 5 min

OH 70 PF 5 min

OH 96 PF 5 min

OH Abs PF X2 5 min

Xilol X2 10 min

ACLARADO Pasaremos los cortes al xileno, liquido que nos ca a servir como aclarante de la preparacin, haciendola transparente y eliminando todo el alcohol, al mismo tiempo se utilizan estos solventes organicos ya que son miscibles con el medio de montaje que tenemos que utilizar.

MONTAJE Y CONSERVACIN DE LAS PREPARACIONES Est destinado a facilitar el examen microscopio y especialmente a conservar los cortes durante muhos aos. Montar una preparacin consiste en impregnarla de una sustancia inactiva, secarla y recubrirla con una lamina fina de cristal llamada cubreobjetos. o Medios de montaje Un buen medio de montaje debe ser qumicamente neutro, perfectamente transparente y desprovisto de color, no alterarse con el tiempo y sobretodo peseer un indice de refraccin elevado a fin de revelar al mximo las diferencias de refringencia entre el medio y las estructuras a estudiar. o Medios no miscibles con el agua Estos son los ms utilizados, su empleo es fcil, su conservacin ilimitada y su indice de refraccin es elevado (no produce distorsin). Actualmente se emplea el Eukitt, Histomount

Una vez que el corte est totalmente transparente se efectua el montaje depositando en el centro del portaobjetos una buena gota de este medio. Este cubreobjetos es depositado rpidamente en el centro de la preparacin impregnada de Xilol. La sustancia de montaje se disuelve inmediate, se extiende y generalmente aprisionan algunas burbujas de aire, que trataremos de eliminar con mucho cuidado con la ayuda de una aguja histolgica. Con un trapo limpio y con un poquito de xileno trataremos de limpiar los bordes del cristal sin pasar este por encima de la preparacin. Las preparaciones montadas las colocaremos en una bandeja portamuestras, hasta que estn secas para etiquetar y archivar. o Medios miscibles con el agua (criostato, grasa) Estos medios son de uso menos corriente que los precedentes, ya que su empleo es mas delicado, sus propiedades conservadoras limitadas y su rendimiento ptico dbil. Solo sirven prcticamente para montar cortes por congelacin conteniendo sustancias y vcolorantes alcohol-solubles. Entre estos tenemos: Glicerina gelatinizada (la mas utilizada) Gelatina. 15 gr Agua destilada.. 100 ml Fenol.. una gota Glicerina 100 ml

FUNDAMENTOS DE LA TINCIN CON HEMATOXILINA La hematoxilina es un colorante natural que se extrae del rbol Haematoxilon Campechanum, se exporta en palos de alrededor de un metro (palo de Campeche) se cortan en trozos pequeos para la extraccin y el colorante obtenido se utiliza no solamente para microscopia sin tambin para teir la seda y la lana, pero el colorante natural no es un colorante activo, no genera color, ya que es un precursor de un cromoforo. OXIDACIN DE LA HEMATOXILINA

Para que la hemaoxilina puede ser empleada como colorante en histotecnologia, (capacidad de tincin muy limitada) ha de ser oxidada previamente a Hemateina (Cromforo de la hematoxilina). Este proceso de oxidacin ha de ocurrir espontneamente en contacto con el oxigenos del aire a lo largo de 4 a 6 semanas o de forma arificial a traves de agentes oxidantes actuando como Cromforo, le confiere la capacidad de teir. La hematoxilina as obtenida tiene una carga dbilmente cida y una coloracin rojo vinosa. o Oxidacin fsica: Cuando entra en contacot con el aire ambiental (CO2). o Oxidacin qumica: Cuando entra en contacto con agentes qumicos como el oxido de mercurio. OXIDACIN CROMFORO CROMGENO A este proceso se le conoce como MADURACIN DE LA HEMATOXILINA puede ser acelerado mediante agentes oxidantes artificiales artificiales como: Oxido de mercurio 0,5 gr Yodato de Sodio 0,05gr Permanganato potasico.. 1,77 gr Dicromato potsico 0,28gr Clorato potsico.. 0,11gr Yodato potsico.. 0,20gr

Todas estas cantidades estn referidas a 1gr de hematoxilina. La oxidacin demasiado prolongada (sobremaduracin) da lugar a compuestos casi todos incoloros y sin utilidad, por lo tanto es fundamental utilizar en la preparacin de los colorantes de hematoxilina la cantidad correcta de oxidante. Estas soluciones de hematoxilina suelen estar influidas por el tipo de disolvente que se utiliza. As las soluciones acuosas neutras se sobreoxidan con facilidad por lo que son relativamente inestables (Harris).Las alcoholicas glicerinadas tienen mayor duracin (Carazzi). LACAS DE HEMATOXILINA

Tras la oxidacin, normalmente se debe incrementar su capacidad tintorial agregando grupos auxocromos, que ademas le confiere un carcter fuertemente bsico y son los respnsables de su especificidad por los ncleos celulares. Los auxocromos que se emplean son sales metlicas bivalentes o trivalentes, por lo general en forma de alumbres de tal forma que se originan diversas lacas de hematoxilina de carcter bsico y tonalidad azulada o negruzca dependiendo de la sal metalica utilizada. La ms utilizada es la Aluminica potsica conocida como hemalumbre. Estas sales englobadas dentro de los mordientes, actuando como nexos de unin entre el colorante y los tejidos a travs de la formacin de un quilato en forma de precipitado insoluble. Como regla general para la preparacin de las lacas de hematoxilina debe tenerse en cuenta que todos los componentes de la formula han de agregarse en el orden establecido y deben estar totalmente disueltos antes de aadir el siguiente. Hx + O2 HEMATENA(cromoforo) + GRUPO AUXOCROMO BSICO (SAP) (Mordiente)

TECNICA HEMATOXILINA EOSINA

Es una tincin topogrfica de conjunto del tejido de forma que es posible separar todos sus componentes (separar lo cido de lo bsico). Es una coloracin indirecta (uso de mordientes) y es progresiva o regresiva. HEMATOXILINA DE CARAZZI (500mL): Hematoxilina.. 500mg Sulfato aluminico potsico (mordiente).. 20g Yodato potsico (oxidante). 100mg Glicerina..... 100ml Agua destilada.... 400ml

La hematoxilina de Carazzi es un colorante progresivo (aquella que a una mayor exposicin, ms intensidad de color tendr)

o Resultados Coloracin violeta

Tcnica: o Se recogen los cestillos llenos de portaobjetos (con sus muestras o cortes correspondientes) y se colocan en la estufa para eliminar la parafina del portaobjetos. o Una vez realizada la desparafinacin, se procede a empezar la hidratacin. Para realizar la hidratacin, se preparar una batera en la campana extractora de gases, en la cual situaremos unas cubetas identificadas.

OH Abs

OH Abs

OH 96

OH70

X2 H2Od

o Una vez se ha hecho la hidratacin se pasa a la coloracin con la Hematoxilina Carazzi durante 5 y 15 minutos. o Una vez acabada la coloracin con carazzi, se pasara el cestillo a una cubeta con agua del grifo, cambindola hasta que esta salga limpia. o Se le da un lavado con agua destilada de 5 o 10 pases. o Como ultima coloracin se hace bao en eosina alcohlica de entre 2 y 3 minutos de duracin. o Un paso opcional es aadir amoniacal despus de la eosina alcohlica. o Por ltimo se deshidrata, se aclara y se monta.

HEMATOXILINA HARRIS La hematoxilina de Harris es una tincin regresiva (lo que se ha teido no se puede retirar ni quitar los restos, pero usando alcohol clorhdrico se pueden quitar los residuos bsicos) por lo que hay que tener un control exhaustivo del tiempo. Reactivos o Hematoxilina 1gr o Alcohol absoluto.. 10 ml o Alumbre potsico o frrico. 20 gr o Agua destilada.. 20 ml

o Oxido de mercurio 0,5 gr Resultados o Coloracin azulada Tcnica Se disuelve la hematoxilina en el alcohol y el alumbre en agua caliente. Mezclar y hervir rpidamente, se aparta de la llama y se le aade el xido de mercurio, se mezcla por movimientos suaves de rotacin. Una vez enfriada la solucin, se le aade de 2 a 4 cc cada 100 mL de disolucin de cido actico glacial para reducir su capacidad tintorial, adems le podemos aadir los 10 ml de alcohol ya que todo se habr evaporado durante la ebullicin. Esta tincin tiene un inconveniente, tiene una duracin determinada de entre 6 y 12 meses. EOSINA Es el colorante citoplasmtico por excelencia que posee una polaridad cida, es el mas utilizado en histotecnologa de forma conjunta con la hematoxilina. Existen dos formas de presentacin, la acuosa y la alcohlica. Ambas poseen una concentracin de eosina al 1%, siendo el disolvente en la acuosa el agua destilada y en la alcohlica el alcohol de entre 80 y 96 . La eosina se vuelve ms intensa y selectiva si se le aade entre 0,5 y 1 cc de acido actico glacial por cada 100 ml de disolucin. Reactivos: o OH 80. 100 ml o Eosina alcohlica ... 1 gr o Acido actico glacial 1 ml

HEMATOXILINA-EOSINA Reactivos: o Hematoxilina Harris/Carazzi

o Eosina alcohlica Resultados: o Ncleos... Pardo negruzco/azul negro o Eritrocitos, msculos, grnulos eosinfilos.. Rojo brillante o Citoplasma. Rosa plido o anaranjado. Tcnica Se desparafina e hidrata el corte ya realizado previamente. Se hacen 5 pases de agua + amoniaco. Se hacen 5 pases de OH 96 + HCl Dependiendo de la hematoxilina que usemos: o Hematoxilina de carazzi de entre 5 y 15 minutos. o Hematoxilina de Harris de entre 3 y 5 minutos. Se hace un lavado en agua del grifo hasta que esta salga limpia. Se hace un lavado de agua destilada para acabar de limpiar los cortes Bao en la tincin de eosina alcohlica durante 2 o 3 minutos. Opcionalmente se puede hacer un paso por agua amoniacal para preparar los citoplasmas y fibras antes de la eosina. Por ltimo se deshidrata, se aclara y se monta el corte.

HEMATOXILINA FRRICA DE WEIGHERT Colorante nuclear tricromico (1 nuclear y 2 citoplasmticos) Solucin A: Hematoxilina.. 1gr Alcohol de 96 100 ml

Solucin B: Agua destilada.. 95 ml Cloruro frrico al 29%.......... 4 ml Acido clorhidrico al 25 %..... 1 ml

B sobre A en proporcin 1:1, una vez constituida, la duracin mxima es de 2 semanas.

TECNICAS DE TINCIN ESPECIFICAS

COLORACIONES PARA FIBRAS DEL TEJIDO CONECTIVO Todos los tipos de tejido conectivo o conjuntivo poseen dos elementos constituyentes principales: Las clulas La matriz extracelular: Componente fundamental que determina las propiedades fsicas de cada tipo de tejido conectivo. Est formado por: o Un material amorfo y transparente denominado sustancia fundamental. o Diversos tipos de fibras que se encuentran enclavadas en el interior de la sustancia fundamental. Las fibras del tejido conectivo (con base de protena) son de tres tipos principales: Colgeno Reticulina Elastina

FIBRAS DE COLGENO Es el principal tipo de fibra que se encuentra en la matriz extracelular de la mayoria de los tejidos conectivos. Tienen una funcin bsica de soporte. Se han descrito cuatro tipos principales de fibras de colgeno. Cada uno de ellos presenta ligeras variaciones en al composicin de las cadenas polipeptidicas que constituyen las fibras. Estos elementos poseen afinidad por los colorantes cidos. El colageno tipo I constituye cerca del 90 por cien del colgeno total del organismo y se dispone formando haces gruesos. Las tecnicas para tincin de fibras de colgeno se agrupan clsicamente bajo la denominacin de COLORACIONES TRICRMICAS. FUNDAMENTO DE LAS COLORACIONES TRICROMICAS En general se basan en los mismos principios tericos. Se emplean tres tipos de colorantes: Un colorante nuclear: Por lo general una laca de hematoxilina frrica de weighter , ya que los demas son muy cidos.

Dos colorantes cidos, que se diferencian en sus propiedades fsico qumicas: o Uno de ellos se encontrara en disolucin verdadera (disolucin homogenea en que todos sus iones se disuelven por completo) de particulas pequeas, finamente dispersas, puede emplearse (teira el citoplasma): Acido Pcrico Naranja G Naranja de Metilo

o El otro estar en solucin coloidal, de particulas gruesas. Derivan del anillo del trifenilmetano (grupo auxocromo) (teira el colgeno): Fucsina cida Azul de anilina Verde luz

En el proceso de fijacin tisular, las proteinas de los citoplasmas celulares se agrupan para formar una malla de poro muy fino. En cambio, las fibras del tejido conjuntivo forman una malla menos densa. El colorante que se encuentra en solucion finamente dispersa puede penetrar en poco tiempo en todas las estructuras, incluidas las mas finas (colorantes citoplasmticos). El colorante que se encuentra en solucin coloidal de particulas gruesas, solo penetra en ese periodo entre las mallas estructurales poco densas, todava no habr penetrando en las mallas estructurales finas. Si la coloracin con los derivados del trifenilmetano (colorante cido) se prolonga demasiado, se origina una sobrecoloracin de todos los elementos tisulares. En estas coloraciones es un factori importante el valor del pH a que se utilizan los colorantes, ya que tienen mayor apetencia por las fibras colgenas en medio fuertemente cido (2,5). Por lo que respecta a la coloracin nuclear empleada, el bajo pH con que se realiza la coloracin diferencial hace aconsejabe utilizar lacas de hematoxilina que no sean decoloradas en el proceso de tincin, las mas indicadas las lacas de hematoxilina frrica. Tambin desempean un papel importante los cidos fosfotungstico o fosfomolibdico, que al parecer bloquean selectivamente los residuos bsicos existentes en el tejido a excepcin de las fibras de colgeno, donde luego se acoplaran los colorantes cidos derivados del trifenilmetano. FIBRAS DE RETICULINA

El colgeno tipo III da lugar al tipo de fibra conocido como reticulina, que antes se consider que representaba una especie distinta de fibra debido a su afinidad por las sales de plata con las que se tie de negro grisaceo. Las fibras de reticulina forman la delicada malla reticular de sostn en los tejidos muy celularizados tales como el higado y los organos linfoides. Para poner de manifiesto stas fibras se emplea la impregnacin argntica (plata metenamina). IMPREGNACION ARGENTICA Se basa en la reduccin del nitrato de plata (forma ms estable de la plata) AgNO 3 hasta obtener plata metlica, para conseguir que se deposite sobre los tejidos en forma de precipitado. Formas de impregnacin argentica o Impregnacin argentica por mecanismos predominantemente fsicos y fsico-qumicos: Hasta que no hayamos reducido la plata, la impregnacin no har nada, por eso necesitamos un agente reductor externo, ya que los tejidos tienen afinidad por la plata, son ARGILOFILOS (apetencia de un tejido o estructura por los iones de la plata metalica. Para que sea posible este tipo de impregnacin: Se necesitan varios agentes reductores externos (tejidos argentofilos pero no argentafines) Los tejidos a teir deben presentar argentofilia, que es la propiedad de unirse a los iones de plata derivados del nitrato de plata o de la plata amoniacal. Posteriormente los iones de plata atrados por el tejido (por fuerzas electroestticas) son precipitados a plata metlica por accin de un agente reductor externo. Este tipo de impregnacin puede realizarse por la reaccin de BIEL CHOWSKY, impregnacin argentica en dos tiempos: Impregnacin primaria: AgNO3 (5%) + Agente reductor 5 gotas al 40 % Ag2O (base fuerte OHNa, OHK) Ag2O + NH3 (gota a gota) Plata amoniacal Ag(NHO3)2

La plata amoniacal es soluble en agua pero inestable e inica Impregnacin secundaria: Plata amoniacal + Formol (10%) Plata metlica Esta impregnacin es para cuando el tejido no es argentafin * Si el tejido es argentafin, no haria falta seguir con la impregnacin secundaria * La plata metalica es la que se deposita sobre el tejido en forma de moleculas muy estable. No todos los tejidos tienen idntica apetencia por la plata, tanto la carga electrica como la textura de las clulas por teir, interviene de manera decisiva. * La reduccin es quitar electrones de una molcula usando sustancias oxidantes. * La oxidacin es coger electrones de una molcula mediante sustancias reductoras. * Un tejido argentofin ser argentofilo, pero un tejido argentofilo no ser siempre argentofin, ya que este necesita un agente reductor. En general , la plata metlica en forma de finos precipitados tiene especial apetencia por depositarse sobre estructuras fibrilares finas y pr superficies celulares dotadas de delgadas prolongaciones tales como clulas de la glia, neuronas, fibras reticulares del tejido conjuntivo, etc, que por este motivo reciben la denominacin de argirfilas. o Impregnacin argntica por mecanismo histoqumico: No requiere un agente reductor externo, ya que el tejido poseera sustancias argentofines (capaces de reducir la plata por si solas). Para que sea posible ste tipo de impregnacin, los tejidos deben presentar

ARGENTAFINIDAD, que es la propiedad de reducir la plata amoniacal a plata metlica sin la intervencin de agentes reductores externos. En este caso el tejido interviene activamente a travs de una reaccin qumica de reduccin. Esta propiedad es caracteristica de determinadas granulaciones citoplasmaticas presentes en clulas cutneas como los melanocitos que secretan melanina, y ciertas clulas de secrecin endocrina presentes en el tubo digestivo y que reciben el nombre de clulas argentafines (clulas calciformes).

MANIOBRAS COMPLEMENTARIAS A REALIZAR USUALMENTE EN LA IMPREGNACIN ARGENTICA

En la mayor parte de las tcnicas es conveniente realizar un tratamiento previo con un agente oxidante del tejido como el PERMANGANATO POTASICO, que hace que aparezcan en las estructuras, grupos qumicos que favorecen la coloracin. Cuando se emplea permanganato potasico deben blanquearse los cortes a continuacin con una solucin de METABISULFITO SDICO u ACIDO OXALICO.

Despus de la impregnacin argntica se puede realizar un viraje con una solucin de cloruro de oro, que dar un color negro azulado a los depositos pardo negruzcos de la plata.

Siempre hay que fijar la coloracin con TIOSULFATO SDICO (Hiposulfito), que retira la sal de plata no reducida y la plata metlica que no ha impregnado las estructuras.

La limpieza del material de vidrio que se emplea en este tipo de tincin debe de ser escrupulosa, cualquier impureza en l o en el agua destilada utilizada para lavarlo hace precipitar la plata amoniacal.

Uno de los principales problemas que plantean las tcnicas de impregnacin argntica es la fijacin del corte al portaobjetos. Es muy frecuante que se desprendan sobretodo si el grosor de los cortes es elevado y el portaobjetos no est impregnado de alguna sustancia adhesiva. Para evitarlo emplearemos los portaobjetos adecuados y los cortes sern lo mas delgado posible (no mas de 5 micras).

FIBRAS DE ELASTINA Las fibras elasticas del tejido conjuntivo se encuentran fundamentalmente en determinados rganos dotados de especial distensibilidad, vasos sanguineos, piel, pulmn, disponiendose en forma de fibras y hojas discontinuas en la matriz extracelular. Estn compuestas por un ncleo central de naturaleza proteica, rodeado

de elastomucina (carcter cido, es una capa protectora de la fibra). Esta capa parece esencialmente responsable de las afinidades por los colorantes de las fibras elasticas. El colorante ms empleado es la orceina (carcter cido aunque tie fibras cidas) que se fija selectivamente aunque sin especificidad absoluta sobre estos elementos. Tambien se puede emplear la TCNICA DE GOMORI que ya no se usa. MTODO TRICRMICO DE MASSON Reactivos: Hematoxilina de Harris (ncleos) Rojo Mallory (disolucin verdadera): o Fucsina cida. 1gr (colgeno) o Naranja G... 0,4gr (citoplasma) o Agua destilada 300ml o Acido cetico glacial.. 1cc (mordiente) cido fosfomolibdico al 1% (diferenciador) Verde luz (disolucin coloidal) o Agua destilada 100cc o Verde luz 1gr o Acido actico glacial. 1cc (mordiente) Tcnica Desparafinar e hidratar Hematoxilina de Harris ---- 5min Lavar con agua ---- paso ligero Rojo Mallory ---- 3 min Lavar con agua ---- paso ligero Acido fosfomolibdico ---- paso ligero Verde luz ---- 3 min Lavar con agua ---- paso ligero Deshidratar, aclarar y montar

Resultados Nucleos Azul

Citoplasmas. Queratina, fibras musculares y eritrocitos Rojo anaranjado Colgeno Verde, azul

MTODO TRICRMICO DE VAN GIESON PICROFUCSINA DE VAN GIESON: Es una coloracin tricrmica compuesta por una coloracin nuclear (hematoxilina frrica), una coloracin citoplasmtica por un colorante cido (cido pcrico) y una coloracin selectiva del colgeno por otro colorante cido (fucsina cida). Reactivos Hematoxilina frrica de Weighert Picro-fucsina de Van Gieson (solucin coloidal) o Solucin 1: Fucsina cida. 1gr Agua destilada 100 ml

o Solucin 2: Solucin acuosa saturada de cido pcrico (solucin verdadera)

o Solucin de trabajo: Solucin 1. 10 ml Solucin 2. 90 ml

La solucin actua mejor si se deja madurar durante algunas semanas. Si est recin preparada se le agrega inmediatamente antes de su uso, 0,25 ml/100ml de cido clorhdrio concentrado Tcnica Desparafinar e hidratar Hematoxilina frrica de weighert ---- 10/12 min Lavar en agua corriente ---- 5 min Aclarar en agua destilada Teir en la solucin de trabajo de Van Gieson ---- 30 segundos /1 min Secar con papel de filtro Lavar rapidamente en etanol al 70% Completar la deshidratacin con rapidez, aclarar y montar

Resultados

Nucleos azul negruzco Citoplasmas amarillo Colgeno rojo intenso

TCNICA DE WILDER (RETICULINA) Reactivos: Permanganato potsico al 0,5% (oxidante del tejido) Acido oxalico/metabisulfito de sodio al 1% (blanqueante adquirir color) Alumbre frrico al 2% (ayuda a las fibras colgenas) Formol al 10% (revelante) Hiposulfito sdico al 5% (retira la sal no reducida y la plata metalica no fijada) Plata Wilder/ Plata amoniacal o Hidroxido de sodio al 3%................................... 40 cc o Nitrato de plata al 10%....................................... 40 cc o Aadir amoniaco gota a gota hasta que la disolucin se vuelva transparente. o Aadir agua destilada 320 cc Tcnica: Desparafinar e hidratar Permanganato potasico al 0,5 % 5 min Lavar en agua destilada Acido oxalico al 1% hasta decolorar Lavar en agua destilada Alumbre frrica al 2%.................................................... 1 min (colorear fibras) Lavar en agua destilada Plata de Wilder/amoniacal,. 7 min (impregnacin primaria) Lavar en agua destilada Formol al 10% paso ligero hasta color tabaco (impregnacin secundaria) Lavar en agua destilada Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados Fibras reticulares negro (color lpiz)

Fibras colgenas amarillento rojizo

TCNICA DE ORCEINA VAN GIESON (FIBRAS ELASTICAS Y COLGENAS) Reactivos Solucin de Orceina: o Orceina. 1gr o Alcohol etilico al 70%............................. 100 ml o Acido clorhidrico concentrado ... 0,6 ml Alcohol cido: o Alcohol absoluto 100ml o 10 gotas de HCl concentrado Solucin nmero 2 de Van Gieson (Picrofucsina) o Solucin acuosa de fucsina cida al 1% 15 ml o Solucin acuosa saturada de cido pcrico . 50 ml o Agua destilada 50 ml Solucin de cido pcrico: o Alcohol etilico al 96% 1 parte o Solucin acuosa saturada de cido pcrico. 2 partes Tcnica solucin 2 de Van Gieson 5 min Hx frrica Lavado H2O grifo Lavado H2O destilada Acido pcrico- fucsina cida 5 min Deshidratar

Resultados Ncleos Marrn/Negro Colgeno Rosa

Musculo Amarillo

Tcnica Desparafinar e hidratar Solucin de orceina ---- 30/60 min Lavar en agua ---- 2/3 min Secar en papel de filtro Alcohol de 95 grados , lavar el exceso de colorante Alcohol absoluto ---- 5/30 min hasta decolorar, cuando aparece marrn plido examinar microscpio, las fibras eslasticas apareceran de color purpura. Completar la decoloracin del fondo con alcohol cido ---- 2/10 min observando a simple vista. Lavar en agua corriente por lo menos 5 minutos Colorear con la solucin de Van Gieson numero 2 ---- 2/3 min Diferenciar en la solucin de cido pcrico hasta que aparezca solo en rojo la colgena Deshidratar, aclarar y montar

Resultados Fibras elasticas marrn (concentracin de orceina + alta) Fibras colgenas rojo Citoplasmas y msculo amarillo plido

TCNICA DE LA ORCEINA (nuclear azul de metileno) Reactivos: Mordiente: o Permanganato potsico.. 0,15 gr o cido sulfrico.. 0,015 cc o Agua destilada... 100 cc cido oxlico al 2% Solucin de orceina: o Orceina 0,4 gr o cido clorhidrico 1 cc o Alcohol de 70 grados. 100cc Orceina cida

Alcohol cido: o Alcohol absoluto.. 100 cc o cido clorhidrico. 10 gotas

Tcnica Desparafinar e hidratar (opcional azul de metileno y agua) Mordiente ---- 3 minutos Lavar en cido oxalico ---- 5 min Lavar en agua corriente Solucin de orceina ---- 20/30 min Lavar en agua corriente Lavar y decolorar en alcohol de 96 grados y extraer el exceso de colorante Alcohol cido ---- 2/5 min Lavar en agua corriente ---- 5 min Deshidratar, aclarar y montar

Resultados: Fibras elasticas Negro- marrn Nucleo Azul Colgeno No teido

La solucin de orceina no dura mas de un mes en la nevera, a temperatura ambiente dura como maximo una semana. El azul de metileno tie los fibroblastos (sus ncleos)

COLORACIONES PARA ESTUDIOS NEUROHISTOLGICOS

La finalidad de las preparaciones neurohistolgicas es poner de manifiesto los tres elementos constitutivos fundamentales del sistema nervioso: las clulas nerviosas, las vainas de mielina que rodean a las fibras nerviosas y la glia o tejido de sostn. Se pueden realizar: COLORACIONES NO ARGENTICAS: o Coloraciones para neuronas y grumos de Nissl: Los grumos de Nissl, o sustancia tigroide, son acumulo de reticulo endoplasmatico rugoso que se encuentran en el citoplasma de las neuronas, y estan compuestos por RNA ribosmico y RNA mensajero. Para teirlos se emplean colorantes bsicos como: azul de metileno, azul de toluidina, tionina, violeta de cresilo Estos colorantes se unen a los cidos nucleicos por un mecanismo fsico qumico de atraccin electroesttica. Adems de colorear los grumos de Nissl tien los ncleos, ya que estos contienen ADN. Para que la coloracin sea adecuada se necesita un pH cido TCNICA DE NISSL Soluciones: Tampn acetato o Acetato sdico1 parte o Acido acetico.. 4 partes Solucin de cresilo extra: o Violeta de cresilo extra o tionina 0,5 gr o Tampn acetato.. 100 ml Resultados: Grumos de Nissl y ncleos Violeta Clulas nerviosas Azul tenue Estructuras restantes No se tien COLORACIONES PARA VAINAS DE MIELINA Determinadas fibras nerviosas van recubiertas por unas envolturas llamadas vainas de mielina que contienen sustancias lipoides. Poner de manifiesto estas grasas es importante, ya que en ciertas enfermedades se observa su desaparicin. El mtodo de Kluver- Barrera utiliza como coloranteel luxol Fast blue, segn ciertos autores se produce una atraccin fisico-quimica entre la mielina y el colorante,

para otros lo que sucede es que el luxol Fast blue tiene una gran apetencia por los fosfolpidos y la tincin tien lugar por una disolucin del colorante en la mielina. Con esta tecnica queda teida no solo la mielina, sino tambien las celulas nerviosas y sus ncleos por una tincin combinada con violeta de cresilo. En la actualidad la inmunohistoquimica est desplazando a las coloraciones clsicas, ya que mediante anticuerpos especficos se identifican con claridad la mielina y los oligodendrocitos que la producen. MTODO KLUVER- BARRERA Solucin: Luxol Fast blue al 0,1% o Luxol Fast blue.................................................................. 0,5 gr o Alcohol de 96 500 ml o Acido acetico glacial 10% 2,5 ml Violeta de Cresilo al 0,1 % o Violeta de Cresilo.. 0,5 gr o Agua destilada 500 ml o Acido acetico glacial al 10%............................................. 75 gotas Carbonato de litio al 0,5% o Carbonato de litio.. 0,25 gr o Agua destilada 500 ml Alcohol etilico al 70%................................................................... 500 ml

Resultados: Vainas de mielina Azul o verde azulado Neuronas y grumos de Nissl Violeta o rosado

HISTOQUMICA

La histoqumica es una rama de la histologa que sirviendose de reaccines qumicas estudia la localizacin microscpica de las sustancias que componen los tejidos o la actividad de las enzimas. La histoqumica es la aplicacin de reacciones qumicas en la tcnica histolgica con el fin de localizar y determinar de manera cientfica, ciertas sustancias y su actividad. En todas estas reacciones qumicas o bien se tie la sustancia que buscamos o los colorantes reaccionan con ella qumicamente. Tinciones para glcidos Tinciones para lpidos Tinciones para pigmentos Histoqumica enzimatica

TINCIONES PARA HIDRATOS DE CARBONO O GLCIDOS Los hidratos de carbono son polialcoholes oxidados (polihidroxialdehidos y polihidroxicetonas).

Si el grupo carbonilo se encuentra en posicin terminal (aldehido) y si el grupo carbonilo est incluido en la cadena por lo general en posicin 2 (cetona). Las moleculas ms sencillas de hidratos de carbono se denominan monosacaridos. Por condensacin de dos a diez moleculas de monosacridos se forman oligosacridos. Si el numero de moleculas de monosacaridos es superior a 10 se forman polisacaridos.

Se perderan tantas moleculas de agua como uniones se originen. Los monosacridos al igual que los oligosacridos son solubles en agua, disminuyendo su solubilidad con el grado de polimerizacin llegando a la total insolubilidad que suelen presentar los polisacaridos. Los glucidos

monmeros o poco polimerizables no se conservan en las preparaciones histolgicas ordinarias debido a su gran solubilidad. Slo los polisacaridos son detectables por mtodos histoqumicos. Entre los polisacaridos, podemos considerar: Los polisacaridos simples, como el glucogeno (glucosa + glucosa) musculo e higado Los polisacaridos complejos, que se subdividen en tres grandes grupos: o Mucopolisacaridos: Acidos (dependiendo de que presenten o no grupos cidos) Condroitina : Proteina de la sustancia fundamental del cartlago Sustancia fundamental del tejido cido hialurnico Clulas glandulares del epitelio respiratorio

Neutros (con frecuencia se hallan unidos a una proteina, formando glucoproteinas o mucoproteinas) Glndulas intestinales de duodeno y yeyuno principalmente (clulas calciformes que segregan mucina, moco) Revestimiento gstrico (pepsina, factor intrinseco) La queratina Tiroglobulina Heparina

o Mucoprotenas: Son complejos de protenas y polisacridos en los que predomina el primer componente. Si el contenido en hexosamina es superior al 4 % se denominan mucoproteinas, si es inferior se denominan glucoproteinas. o Mucolpidos: Son una mezcla de polisacaridos y cidos grasos complejos, que se encuentran generalmente en forma de cerebrsidos y gangliosidos (SNC y mielina). Para la demostracin histolgica del GLUCOGENO, pueden emplearse dos tipos de tcnicas: Tcnicas histoqumicas: reaccin del PAS

Los MUCOPOLISACARIDOS CIDOS son fciles de caraterizar por mtodos histoqumicos, fundamental se emplea: La tcnica del azul alcin La reaccin metacromtica (azul de toluidina)

Los MUCOPOLISACARIDOS neutros, MUCOPROTEINAS, GLUCOPROTEINAS Y MUCOLPIDOS constituyen un grupo homogneo, desde el punto de vista de su deteccin. A menudo se les designa con el nombre de compuestos mucides. La reaccin del PAS es uno de los mejores mtodos para su deteccin, se dice que son compuestos PAS +, a diferencia de los mucopolisacridos cidos que son compuestos PAS -. REACCIN DEL PAS Fundamento Consiste en oxidar los tejidos mediante el cido peridico para incrementar el nmero de grupos carbonilos presentes en ellos, de modo que puedan ser posteriormente demostrados por el reactivo de SCHIFF. Los hidratos de carbono contienen grupos carbonilos relativamente aislados, en una porcin aproximada de uno por molcula de monosacrido. Por ello es necesario oxidarlos, con el fin de incrementar dichos grupos, ya que solo pueden ser detectados por el reactivo de Schiff, si se encuentran situados en carbonos contiguos. El agente oxidante es generalmente el cido peridico, aunque en alguna variante puede utilizarse el cido crmico. Los mucopolisacaridos cidos no pueden ser oxidados por el cido perydico por presentar grupos cidos: carboxilicos o sulfatados, en lugar de grupos alcoholicos. TINCIN P.A.S Reactivos: Acido perydico 0,5% Bisulfito Sdico al 2% Hx Carazzi Reactivo de Schiff o H2O 200 cc o Fucsina bsica. 2 gr o Metabisulfito sdico o HCl concentrado. 1 cc o Carbono activado Preparacin: Se lleva a ebullicin el agua y se aade la fucsina. Se disuelve y se enfria a 50C. Filtrar y aadir metabisulfito y HCl (color rosa plido). Se deja reposar 24 h en un frasco opaco y se filtra (la solucin no

tiene que tener color, entre transparente y rosa plido). Aadir el Carbono ms o menos unos 8 gr cada 200 ml de solucin. Dejaremos reposar unas horas y lo filtraremos (en nevera y frasco topceo). Cuando coja un color rosadito lo tiramos. Tcnica: Desparafinar e hidratar Crear dobles enlaces con el acido peridico ---- 10 min. Lavado en agua ---- 2/10 min Reactivo de Schiff ---- 20/30 min Bisulfito sdico Lavado en agua ---- 10 min HX Carazzi ---- 3/5 min Lavado en agua del grifo ---- 2/4 min Deshidratar, aclarar y montar

Resultados: Nucleos Azul PAS + Rosa, rojo (a veces naranja) PAS - Incoloro