INTRODUCCIÓN

Parece factible que, si deseamos estudiar una célula o una asociación de ellas, para
conocer su estructura morfológica microscópica y deducir, en lo posible sus funciones,
bastaría examinarlas a través de los instrumentos que amplían imágenes de los objetos
observados (microscopios fotónicos y electrónicos); este procedimiento no es factible
de realizar; al intentar hacerlo se presentan serias dificultades en la manipulación de los
especímenes y el inicio de los procesos propios de desarreglo molecular (autólisis) y
celular que suelen presentarse después que las células y los tejidos abandonan su
hábitat natural. Por lo tanto, es necesario utilizar una serie de procedimientos y artificios
que nos permitan describir, comprender y analizar la estructura microscópica de las
células, tejidos y órganos.

Se denomina TÉCNICA HISTOLOGICA al conjunto de procedimientos aplicados a un

material biológico (animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las
condiciones óptimas para poder observar, examinar y analizar sus componentes
morfológicos a través de los microscopios fotónicos y electrónicos
 TÉCNICA HISTOLÓGICA ESTÁNDAR

PROCEDIMIENTOS INMEDIATOS O VITALES

Permiten la observación y el estudio de protozoarios, células sanguíneas, células

descamadas o disociadas, células en cultivo de tejidos; estructuras muy delgadas y
translúcidas como la membrana peritoneal de animales pequeños o epidermis de
vegetales, granos de polen etc. suspendidas en los líquidos de su hábitat natural o
solución salina balanceada. Para una observación óptima suele utilizarse tipos
especiales de microscopios fotónicos como el de campo oscuro o el de contraste de
fases: observación al estado fresco.

En ciertos casos, cuando se requiera destacar alguna estructura celular o tisular se

pueden emplear colorantes inocuos para la vida de las células, no modifican la
estructura de ellas ni interfieren en sus funciones. A este procedimiento se le conoce
como coloración vital. Para el estudio de las manifestaciones vitales de las muestras
suelen emplearse una serie de microinstrumentos que facilitan la introducción, al interior
de las células, de sustancias o la extracción de ciertos componentes mediante
microinyectores, micropipetas, microelectrodos o instrumentos que emiten haces
sumamente delgado de radiaciones de alta energía (rayos laser).

Este examen puede ser de dos tipos: El Mediato y el Inmediato.

• Examen Mediato: se realiza en cortes de órganos de un animal muerto

recientemente, o frotises de sus células.

• Para Los frotises.

• Para Los cortes histológicos.

• Examen Inmediato: Se realiza en el animal o las células en vivo de la siguiente

manera.

• Examen al estado fresco sin recurrir a reactivos modificatorios.

• Examen en coloración Intravital.

• Examen en coloración Supravital.

Líquidos fisiológicos más usados:

• Líquido de Ringer, para animales invertebrados.

• Líquido de Locke, para animales vertebrados.

• Líquido de Tyrone, para animales vertebrados.

 PROCEDIMIENTOS MEDIATOS O POSTVITALES

Tienen por finalidad preparar células, tejidos y órganos procedentes de seres en los que
los procesos vitales se han detenido y es necesario conservar la estructura que tenían
en vida. De manera general, para alcanzar este objetivo es necesario realizar los
siguientes pasos:

 -Toma de la muestra:
- Fijación
- Inclusión
 -Microtomía :
- Coloración o tinción
- Montaje
A) TOMA DE LA MUESTRA
La calidad y la fidelidad con que una célula o un tejido muestren una imagen al
microscopio, con las características morfológicas que poseían cuando estaban
con vida, dependen esencialmente de la prontitud y el cuidado que se aplicó para
obtener la muestra a ser procesada mediante los pasos mencionados
anteriormente. Existen diversos procedimientos que permiten obtener muestras
de tejidos y órganos para conseguir preparaciones histológicas de buena
calidad. Estos son:

a) Mediante la biopsia:

Consiste en la toma de un fragmento de tejido u órgano de un ser vivo. Realiza

a través de una operación quirúrgica hecha exprofesamente o durante la
intervención quirúrgica efectuada en pacientes y corroborar así un diagnóstico
de una determinada lesión. La biopsia puede ser:

o incisional
o excisional
o por sacabocados
o por punción y absorción  por raspado
o por trepanación
 El estudio de células de superficies epiteliales de renovación constante
(mucosas bucal, gástrica, vaginal, uretral), se realiza a través de la Citología
Exfoliativa. En otros casos células obtenidas mediante punción (células
sanguíneas o de la médula ósea) se extienden en una lámina portaobjetos para
hacer los “frotis”, colorearlas y examinarlas.

b) Mediante la necropsia, las muestras se obtienen de seres muertos:

En este caso es recomendable que los tejidos y órganos se obtengan
inmediatamente después de producida la muerte.
Recomendaciones para la toma de las muestras. Los tejidos y los
órganos provenientes de biopsias y necropsias se seccionar empleando
bisturís o navajas de afeitar nuevos, sin hacer presión sobre ellos. No es
recomendable el uso de tijeras para cortar los tejidos pues éstas ocasionan
compresiones y jalonamientos de los tejidos y órganos que distorsionar su
estructura microscópica. El tamaño de las muestras no debe exceder de 10
mm por lado con un grosor de 5 mm.

B) FIJACION.
Es un procedimiento cuya finalidad, al aplicarlo es Detener la vida de las células
e impedir las modificaciones post morten que pueda sufrir la célula (procesos
autolíticos), manteniendo la estructura morfológica de células y tejidos sin que
ocurran cambios notables en ellos. Esto se consigue inmovilizando (por
coagulación o precipitación) las moléculas proteínicas e inhibiendo
principalmente las enzimáticas haciéndolas insolubles. Esta acción garantiza la
integridad de las células y tejidos; se efectúa por mediante agentes químicos
denominados fijadores.
LOS FIJADORES SE CLASIFICAN EN DOS GRANDES GRUPOS:

a) Oxidantes: el tetraóxido de osmio (ácido ósmico), el bicromato de potasio, ácido

crómico, bicloruro de mercurio o “sublimado corrosivo”, ácido pícrico, ácido acético.

b) Reductores: el formaldehído, el glutaraldehído, el alcohol etílico, el alcohol metílico.

La acción oxidante o reductora de los fijadores le confieren a las células ciertas
condiciones que posibilitan una mejor aplicación de las sustancias colorantes, por
ejemplo: el alcohol etílico absoluto conserva el glucógeno, el bicloruro de mercurio
provoca que las anilinas coloreen de manera más brillante a las fibras colágenas, el
bicromato de potasio facilita la coloración de las mitocondrias, el ácido acético permite
una mejor tinción de los núcleos, el cloruro de calcio conserva e insolubiliza parcialmente
a los lípidos.

Los fijadores son:

a) Gaseosos: como el formaldehído

b) líquidos: como el ácido acético, al alcohol etílico, la acetona, etc.

c) sólidos: como el bicloruro de mercurio, el bicromato de potasio, etc.

Condiciones de un buen fijador. Una sustancia fijadora para que ejerza de manera
eficiente y adecuada sus funciones debe poseer las siguientes condiciones:

 Matar inmediatamente a las células, impidiendo la aparición de los procesos

autolíticos. Para tal fin el fijador debe poseer:
 Un buen poder de penetración, que en contados instantes se introduzca con
rapidez en el espesor de la muestra Un buen poder de difusión, que no fije sólo
la porción superficial de la muestra sino que alcance las porciones más
profundas de la misma.
 Producir cierta dureza a los tejidos sin que se provoque excesiva retracción
o hacerlos quebradizos y friables.
 Debe de ser de fácil manipulación.
 No debe disolver componentes celulares.
 Que sea fácil de conseguir y que sea barato.

Las soluciones fijadoras suelen ser fijadores simples, o fijadores compuestos (mezclas
fijadoras) en las que utilizan más de una sustancia fijadora.

Ejemplo de fijador simple:

FORMOL O FORMALINA.
Está considerado como la sustancia fijadora de mayor uso en los laboratorios que
realizan técnica histológica. El formol comercial consiste en una solución acuosa del
gas formaldehido al 39 - 40%. Se presenta como un líquido claro, incoloro, que emite
vapores sumamente irritantes para la conjuntivas y la mucosa respiratoria. Su acción
fijadora se ejerce coagulando las proteínas.

Es un fijador que posee un buen poder de penetración y difusión. Mantiene de manera

adecuada la estructura y facilita la coloración posterior de los componentes celulares y
tisulares. Endurece bien las muestras. Conserva bastante bien a las grasas. Se le
emplea en una solución al 10% (10 del formol comercial y 90 partes de agua) El
tiempo de fijación de las muestras, dependiendo del tamaño de ellas, debe ser de 24 a
48 horas como mínimo y si es posible, en refrigeración.

FIJADORES COMPUESTOS.

Una sola sustancia fijadora difícilmente reúne todas las condiciones para ejercer una
buena fijación, por lo tanto es aconsejable usar mezclas fijadoras a través de las cuales
se acrecientan las cualidades de un fijador y se atenúan sus defectos y desventajas.

A continuación se presentan algunos ejemplos de fijadores compuestos o mezclas

fijadoras que se emplean con mayor frecuencia:

 Formol - fosfato (formol tamponado):

- solución de formaldehído (37% a 40%)--------------100 ml

- agua destilada ------------------------------------------- 900 ml

- fosfato de sodio monobásico (NaH2PO4 - H2O)-----4.0 gr

- fosfato de sodio dibásico (Na2HPO4)------------------6.5 gr

Suele emplearse como un fijador de rutina, al igual que el formol al 10%. Posee un pH
de 6.8 a 7.0 aproximadamente. Es ligeramente hipotónico.

 Formol- bicloruro de mercurio.

- solución de formaldehído (37% a 40%)--------------150 ml

- agua destilada--------------------------------------------850 ml

- bicloruro de mercurio-------------------------------------50
Es recomendable usarlo para fijar tejidos hematopoyético y linfático reticular. El material
nuclear se fija de manera precisa y nítida. Facilita la tinción de fibras colágenas y células
conjuntivas mediante el empleo de colorantes que tienen como base a las anilinas. Se
utiliza para los tejidos en los que se aplicará técnicas inmunohistoquímicas. Los tejidos
no deben mantenerse mucho tiempo en fijación (no más de 48 horas) porque se
endurecen demasiado. HgCl2 es una sustancia que corroe el instrumental metálico.
Antes de aplicar una tinción es necesario eliminar los pigmentos precipitados del
bicloruro de mercurio en los tejidos.

 Formol - cloruro de calcio.

- solución de formaldehido (37% a 40%)---------------100 ml

- cloruro de calcio--------------------------------------------10 gr

- agua destilada----------------------------------------------900ml

Se recomienda fijar las muestras en esta solución cuando se desean preservar lípidos,
especialmente fosfolípidos: Antes de obtener los cortes, las muestras se incluyen en
gelatina o se congelan directamente para seccionarlas con empleando microtomos de
congelación o el criostato.

 Líquido fijador de Boüin.

- solución acuosa saturada de ácido pícrico-------------750 ml

- solución de formaldehido (37% a 40%)---------------250 ml

- ácido acético glacial--------------------------------------- 50 ml

Es un buen fijador de uso rutinario. Tiene un buen poder de penetración y de difusión.

Ofrece resultados satisfactorios con ciertos tricrómicos como el de Masson. Pueden
fijarse piezas de un centímetro de grosor y dos o tres centímetros de longitud. Se le
emplea con resultados óptimos en la fijación de embriones y fetos pequeños pues ejerce
cierto poder descalcificante. Dependiendo del volumen de la muestra, el tiempo de
fijación será de 12, 24 a 48 horas. Antes de la inclusión, es conveniente eliminar el ácido
pícrico de las muestras (tiñe de color amarillo intenso a los tejidos) El lavado se hace
con una solución de alcohol etílico al 70% a la que se añaden algunas gotas de una
solución al 5% de carbonato de litio. El lavado finaliza cuando el alcohol litinado ya no
muestra color amarillento.

 Líquido fijador de Zenker ( Solución madre o stock)

- bicloruro de mercurio-------------------------------------50 gr
- bicromato de potasio--------------------------------------25 gr

- agua destilada ------------------------------------------1000 ml

La solución “madre” se puede guardar durante mucho tiempo. Cuando a ella se le

añade ácido acético forma el

 Líquido de Zenker (solución de trabajo):

- solución madre (stock) de Zenker-----------------------95 ml

- ácido acético glacial-----------------------------------------5 ml En cambio, si a la solución

“madre” de Zenker se le agrega formol comercial se convierte en Líquido fijador de Helly

- solución madre (stock) de Zenker-----------------------90 ml

- solución de formaldehido (37% a 40%)-----------------10 ml

El formol se debe agregar antes de usar la mezcla, pues la acción reductora del formol
inhibe la actividad fijadora del bicromato de potasio. Las muestras deben ser pequeñas
y fijarse por un lapso no mayor de 24 horas, porque se endurecen en exceso, se
disminuye la basofilia de los núcleos y se incrementa la acidofilia del citoplasma. Tiene
una ventaja: preserva muy bien a los eritrocitos y a los gránulos de las células de
glándulas endocrinas.

 Fijador de Carnoy,

- alcohol etílico absoluto------------------------------------60 ml

- cloroformo--------------------------------------------------30 ml

- ácido acético glacial---------------------------------------10 ml Posee un excelente poder de

penetración y de difusión. Las muestras delgadas de tejidos y órganos se fijan en dos o
tres horas. Produce lisis de los eritrocitos. Es el fijador adecuado cuando se desea
demostrar glucógeno y la tinción de núcleos y especialmente cromosomas.
CRITERIOS PARA OBTENER UNA BUENA FIJACIÓN.

a) Elección del fijador. La solución fijadora a utilizar depende del estudio que se
quiere realizar. Para las preparaciones de tejidos y órganos, en las que interesa un
estudio topográfico de los mismos, deben usarse fijadores con un buen poder de
penetración y de difusión. Para estos casos se recomienda utilizar los líquidos de
Zenker, Boüin o Helly. En caso contrariose empleará la solución de formol al 10% ó
15% que permite obtener resultados satisfactorios. Líquido considerado como el
“fijador universal” pues facilita el empleo posterior de cualquier otro fijador
(postfijación) capaz de complementar su acción.

b) Tamaño de las muestras. El tamaño y grosor de las muestras deben ser pequeñas
y delgadas, de 1cm2 a 2 cm2 y con un espesor de 2 mm a 5 mm, especialmente si se
emplean fijadores con escaso poder de penetración y de difusión.

c) Volumen del fijador. Una proporción que es necesario emplear será de 1 a 20

(muestra – fijador). Será la más adecuada para garantizar una buena fijación.

d) Tiempo de fijación. El tiempo en la fijación es importante en dos aspectos.

I. El intervalo que media entre la interrupción del aporte sanguíneo y la

inmersión de las muestras en la solución fijadora. Lo deseable es que las
muestras se fijen inmediatamente después de obtenidas mediante una biopsia o
que la necropsia se efectúe al poco tiempo de producida la muerte. Mientras más
largo es este lapso, los procesos autolíticos que sufran los tejidos serán más
evidentes.

II. Debe tenerse en cuenta el tiempo que permanecerán las muestras sumergidas
en los fijadores. Este tiempo varía con relación al tipo de fijador que se utiliza; al
tamaño y la naturaleza de la muestra y la temperatura de fijación. Por lo tanto los
lapsos de fijación varían en rangos muy amplios. En cualquier circunstancia,
siempre deben respetarse los tiempos recomendados para cada tipo de fijador
para garantizar la conservación de una buena estructura celular y tisular de los
tejidos.

e) Temperatura de la fijación. Es recomendable efectuar la fijación a bajas

temperaturas (40° C.) dentro de un refrigerador y con la solución fijadora enfriada
previamente. Este procedimiento retardará el tiempo de fijación pero disminuirá de
manera notable la autólisis de los tejidos.
f) Fijación por perfusión. Un método de fijación casi instantáneo es aquel que consiste
en perfundir los tejidos y órganos de un animal con una solución fijadora. Este
procedimiento se utiliza frecuentemente para fijar tejidos que serán procesados y
examinados mediante el microscopio electrónico. La perfusión consiste en anestesiar el
animal y, mediante un sistema especial de inyección y drenaje, reemplazar la sangre
con una solución salina y después se inyecta el fijador. La fijación se hace en contados
instantes para garantizar que los tejidos se fijaron rápidamente.

g) Almacenamiento de las muestras. En ciertos casos los tejidos fijados no necesitan

ser procesados inmediatamente para aplicarles otros pasos de la técnica histológica.
Por lo tanto es conveniente almacenar y conservar los tejidos fijados para un uso
posterior. Después de eliminar el fijador mediante un “lavado”, se guardan en una
solución de alcohol al 70%. Así los tejidos pueden guardarse por un tiempo bastante
largo sin que sufran modificaciones morfológicas notorias.

h) Lavado de las muestras fijadas. Al concluir la fijación, el fijador debe ser eliminado
de las muestras. Para tal fin se procede al lavado de los tejidos mediante agua o alcohol.
Se evita, así, que los tejidos se endurezcan demasiado o que ciertos componentes del
fijador introduzcan modificaciones en los tejidos e impidan una adecuada obtención de
secciones delgadas o la coloración correcta de sus componentes celulares.

i) INCLUSION:
Los tejidos fijados adquieren cierta consistencia y dureza, pero no la suficiente para que,
de ellos, se obtengan secciones delgadas. Estas secciones, del orden de algunas
milésimas de milímetro (5 a 10 m), se conseguirán cuando los tejidos se infiltren con
sustancias denominadas “de inclusión” y adquieran tal dureza que sometidos al filo de
una navaja produzcan secciones, cortes o láminas sumamente delgadas y
transparentes. Las sustancias de inclusión tienen la propiedad de incorporarse e
infiltrarse al interior de las células y tejidos con la finalidad de servirles de soporte. Así
los tejidos y la sustancia de inclusión forman un bloque homogéneo en dureza y
consistencia, a pesar que sus componentes tuvieron originalmente distinta dureza.
Existen una serie de sustancias de inclusión que se han empleado o se utilizan
actualmente. Unas son solubles en agua (gelatina, carbowax, glicol metacrilato) otras,
solubles en solventes orgánicos (parafina, celoidina, resinas epóxicas).

Cualquiera que sea el medio de inclusión a emplear es condición indispensable que la

muestra a incluir se encuentre embebida en la sustancia que disuelve al medio de
inclusión

j) Inclusión en parafina.

Después de la fijación y el “lavado” de las muestras, éstas se encuentran embebidas

en agua o en alcohol, por lo que resulta imposible que se infiltren con parafina, medio
de inclusión insoluble en agua y alcohol. Por lo tanto, para que los tejidos puedan ser
incluidos en parafina se requiere deshidratarlos e infiltrarlos con el solvente de la
sustancia de inclusión. Los pasos a seguir para la inclusión de las muestras en parafina
son:

a) Deshidratación

b) Impregnación en el solvente (a este paso también se le denomina aclaración o

diafanización)

c) Inclusión y formación del bloque de parafina

a) Deshidratación.

Significa extraer o remover el agua de los tejidos fijados. La deshidratación debe ser
completa porque, de lo contrario, el solvente no actúa de forma adecuada y el bloque
de inclusión no alcanza la dureza requerida. Para tal fin se utilizan líquidos
deshidratadores en los cuales se sumergen los tejidos. Los deshidratadores más usados
son el alcohol etílico, el alcohol isopropílico, el dioxano y el cloroformo. En el caso de la
inclusión en parafina, las muestras se deshidratan en baños sucesivos en soluciones de
concentración crecientes de alcohol etílico. El procedimiento de rutina es el siguiente:

1) alcohol etílico al 70 % ------------------- 12 horas

2) alcohol etílico al 70 % ------------------- 12 horas

3) alcohol etílico al 95 % --------------------- 1 hora

4) alcohol etílico al 95 % --------------------- 1 hora

5) alcohol etílico al 100 % (absoluto) --------1 hora

6) alcohol etílico al 100 % (absoluto)---------1 a 1.5 horas.

Nota: En cada caso es necesario agitar de vez en cuando los frascos que contienen las
muestras Los tiempos indicados son los que se aplicarán a las muestras de tamaño
mediano (1 cm2 x 0.5 cm. de grosor). Los tiempos pueden disminuirse o incrementarse
si las piezas son más pequeñas o más grandes. La deshidratación incompleta de los
tejidos se comprueba cuando éstos al sumergirse en el líquido diafanizador muestran
un aspecto turbio blanquecino

c) Diafanización. Las muestras deshidratadas se encuentran totalmente

embebidas en alcohol etílico absoluto; pero la parafina tampoco es soluble
en alcohol por lo que es necesario reemplazarlo por sustancias que sean
capaces, simultáneamente, de mezclarse con el alcohol y disolver la
parafina. Estas se denominan líquidos diafanizadores o intermediarios.
Ejemplos: xilol, tolueno, benceno, y el cloroformo. El líquido diafanizador
de uso más frecuente es el xilol

A actividad aclaradora o diafanizadora del xilol se emplea también en el procedimiento

de coloración. La diafanización de los tejidos deshidratados se debe a que estas
sustancias poseen un alto índice de refracción y al interactuar con los tejidos los vuelven
transparentes. El procedimiento de diafanización se realiza de la siguiente manera:

7) alcohol absoluto (50%) - xilol (50%)--------1 hora

8) xilol-----------------------------------------------1 hora

9) xilol-----------------------------------------------1 hora

Nota: las muestras deben agitarse continuamente para permitir la renovación de los
líquidos.
c) Inclusión y formación del bloque de parafina.

Las parafinas son hidrocarburos saturados provenientes de la destilación del petróleo.

Generalmente son sustancias sólidas a temperatura ambiente. Existen diferentes tipos
de parafina que se caracterizan por sus puntos de fusión. Estos oscilan entre 40o y 60o
C. La parafina hierve a 300o C. y emite vapores que son muy inflamables. Las parafinas
se clasifican en:

Blandas: Tienen un punto de fusión de 45o C - 52o C. Son recomendables para incluir
tejidos en los se detectarán antígenos mediante inmunohistoquímica.

Semiduras: Sus puntos de fusión son de 54 o C - 58o C. Es la parafina que se emplea

con mayor frecuencia en los laboratorios donde se realiza técnica histológica. De
acuerdo a la temperatura del medio, se recomienda su uso pues se pueden obtener
secciones de 5 a 7 de m.

Duras. Tienen un punto de fusión de 60o C - 65o C. Son parafinas que deben usarse
en ambientes con climas de temperaturas altas.

La penetración de la parafina al interior de los tejidos se efectúa cuando ésta se

encuentre en estado líquido. En el comercio las parafinas se expenden en forma de
bloques discoidales, escamas, tabletas rectangulares o en forma de grumos pequeños.
Las parafinas, se disuelven usando estufas que las mantienen en ese estado. Las
estufas permanecen a una temperatura constante, generalmente de 2 o C a 4o C por
encima del punto de fusión de la parafina a emplear. La parafina diluida se coloca en
tres recipientes dentro de la estufa. El primero, con una capacidad de 1000 a 1500 cc,
recibirá a las muestras embebidas en xilol; la parafina reemplazará el xilol de las
muestras y se infiltrará al interior de las mismas. Los otros dos recipientes son más
pequeños (500 cc. de capacidad) y, de manera consecutiva recibirán a los tejidos. El
último de ellos servirá para contener a las muestras antes del proceso de formación de
los “bloques” de parafina. En el interior de la estufa debe existir otro recipiente
conteniendo parafina líquida pura, que se empleará para la formación de los “bloques”.
El tiempo que permanezcan las muestras dentro de los recipientes de parafina
dependerá de la naturaleza del tejido y el tamaño de las muestras. Se sugieren los
siguientes lapsos:

10) Primer baño de parafina------------------1 a 1.5 horas

11) Segundo baño de parafina----------------1 a 1.5 horas

12) Tercer baño de parafina-----------------30 a 60 minutos

C) MICROTOMIA (OBTENCIÓN DE LOS CORTES)
En esta etapa, los tejidos y la parafina integran un solo bloque que, posee la
dureza y la consistencia suficientes para obtener secciones delgadas y
transparentes.
Las secciones delgadas o “cortes” se obtienen utilizando instrumentos
mecánicos diseñados para que en forma mas o menos automática, seccionen el
bloque de parafina en cortes delgados y de grosor uniforme. Los instrumentos
se denominan “microtomos”
El sistema de funcionamiento de los microtomos consta de cuatro mecanismos
principales:
 sujeción del bloque de parafina.
 sujeción de la navaja.
 El que permite que el filo de la navaja seccione al bloque en cortes delgados y
de grosor uniforme.
 El de avance del bloque en un número determinado de micrómetros después
que se ha obtenido un corte.

Los microtomos se clasifican de acuerdo a la manera como se desplaza el

bloque que contiene el tejido incluido; así, existen:

a) Microtomo de rotación tipo Minot. Mediante una manivela circular

denominada volante, el mecanismo que sujeta al bloque de parafina se
desplaza frente al filo de la navaja, de arriba hacia abajo y viceversa en
un movimiento vertical.

b) Microtomo de deslizamiento. El movimiento que se realiza para obtener

los cortes es horizontal, es decir de atrás hacia adelante y viceversa.
Generalmente el mecanismo que sujeta al bloque de parafina es el que se
desplaza y a la navaja permanece estática.
Microtomo Los microtomos tipo Minot son los de uso más frecuente en cualquier
laboratorio donde se realiza técnica histológica, especialmente cuando los tejidos
están incluidos en parafina.

Los microtomos de deslizamiento, en cambio, se emplean cuando los tejidos

están incluidos en celoidina o cuando la inclusión en parafina contiene porciones
voluminosas de tejidos y órganos. Los microtomos tipo Minot permiten obtener
secciones delgadas, del orden de 4 a 7m de espesor. Producen cortes seriados,
es decir, cuando se obtiene un corte, éste queda adherido por su borde anterior
al borde posterior del que lo precedió; formándose de esta manera una cinta de
cortes que va descendiendo por la superficie anterior de la navaja. Los cortes
seriados se emplean cuando se desea realizar reconstrucciones
tridimensionales del órgano procesado, cuando se requieren comparar
secciones vecinas, del tejido u órgano, coloreadas por diversas técnicas de
tinción o cuando se hace el estudio microscópico topográfico en embriones y
fetos. Existen dos condiciones indispensables que garantizan la obtención de
secciones delgadas, uniformes y seriadas:

a) Que la deshidratación, impregnación e inclusión hayan sido realizadas

correctamente.
b) El empleo de una navaja o cuchilla muy bien afilada y asentada y que el filo
de la misma ofrezca la inclinación adecuada hacia la superficie del bloque.

Las navajas o cuchillas de microtomía requieren de un afilado y un asentado

muy cuidadoso, pues el mantenimiento del filo de ellas depende que se
obtengan, con éxito, buenos cortes. Las navajas se afilan utilizando afiladores
automáticos que efectúan la operación en forma rápida y garantizan un afilado
uniforme. Para el afilado de las cuchillas se requieren una placa de vidrio
despulida finamente y sustancias abrasivas. Existen varios modelos de
afiladores automáticos, pero todos ellos funcionan bajo ciertos mecanismos:

a) Movimiento y deslizamiento de las cuchillas sobre la superficie del vidrio

despulido (movimiento rotatorio o de atrás hacia adelante y viceversa)

b) Movimiento y rotación periódica de las dos superficies de la cuchilla para

enfrentarse de manera alternativa y similar a la superficie del vidrio con el
abrasivo
 c) En ciertos modelos, la placa de vidrio también puede realizar movimientos
restringidos de rotación

Las sustancias abrasivas suelen estar disueltas en agua o en aceite.

Generalmente se emplean dos tipos de abrasivos:
Unos, de grano grueso, utilizados para desgastar algunas melladuras visibles
de las navajas y otros, de grano fino que sirven para afilar verdaderamente las
navajas.

La perfección del afilado se obtiene cuando el filo de las navajas se asienta

empleando, para tal fin, una superficie de cuero para “asentar”. Esta operación
se realiza momentos previos a la obtención de los cortes.

Se recomienda, para una misma cuchilla:

a) utilizar un solo afilador y si es posible la misma placa de vidrio despulido

b) marcarlas de tal manera que siempre deben sujetarse al mecanismo del afilador
conservando una posición y orientación determinadas

Esto impide que se formen facetas desiguales en el filo de la navaja produciéndose, con
ello, un afilado deficiente. Efectuado el afilado de las cuchillas, éstas deben limpiarse
prolijamente, pues cualquier partícula de abrasivo que se quede adherido al filo de la
navaja lo dañará y también al tejido, durante la microtomía.

. En la actualidad se expenden en el mercado cuchillas descartables. Se venden en gran

cantidad, generalmente por cientos, son relativamente baratas. Se emplean para
obtener algunos cortes y luego se descartan. Ofrecen dos ventajas: No se requiere
afilarlas y siempre el usuario tendrá un instrumento bien afilado.
Obtención de los cortes.

Para alcanzar este propósito se deben seguir los siguientes pasos

a) Sujetar firmemente el bloque con el sistema de abrazaderas y la muestra orientada

correctamente.

b) Alinear el sistema de sujeción de la navaja y el filo de la misma, con la superficie de

corte del bloque.

c) Desgastar la superficie del bloque de parafina hasta alcanzar el tejido y se tenga la

certeza de abarcar toda el área que se desea seccionar.

d) Marcar en el dial del microtomo, el número de micrómetros de grosor que deben

alcanzar los cortes.

e) Accionar la manivela que desplaza la abrazadera con el bloque de parafina para

obtener los cortes (aislados o seriados). Obtenidos los cortes se recogen
cuidadosamente con unas pinzas o pinceles finos. Microtomo, cinta transportadora,
Baño de flotación.

EXTENSIÓN Y ADHESIÓN DE LOS CORTES AL PORTAOBJETOS.

Los cortes obtenidos, aislados o en forma de cintas, generalmente se presentan

arrugados y muestran una área menor que la que poseen en la inclusión, por lo que es
necesario extenderlos y luego adherirlos a las láminas portaobjetos (esto facilita su
manipulación posterior). Los cortes se extienden al depositarlos sobre la superficie del
líquido extendedor contenido en un recipiente denominado “baño de flotación” (éste
mantiene la temperatura entre 40o a 45o C). Las secciones se depositan en el líquido
procurando que la superficie brillante (aquella correspondiente al filo de la navaja) se
ponga en contacto con el líquido caliente. En caso que ciertas arrugas persistan, se
emplean unas pinzas finas o un pincel de pelo de camello, para ejercer una ligera
tracción entre los extremos de los cortes y así desarrugarlos totalmente.

Baño de flotación Las secciones se extienden aisladas o formando cintas, estas se

recogen y adhieren al portaobjetos de la misma forma; en el caso que se requiera
recoger los cortes aislados, extendidos previamente como una cinta, deben separarse
utilizando las mismas pinzas finas o agujas de disección. Para garantizar una mejor
adhesión de los cortes a los portaobjetos, se recomienda incorporar sustancias
adherentes al líquido extendedor o, en ciertos casos, al portaobjetos. Estas sustancias
suelen emplearse de dos maneras:
a) Extensión previa de la sustancia adherente a una de las superficies de la lámina
portaobjetos, por ejemplo, la albúmina de Mayer, constituida por partes iguales de
glicerina y clara de huevo, a la mezcla se le añaden algunos cristales de timol como
ingrediente conservante. La mezcla se filtra y se guarda en refrigeración. Se le utiliza
extendiendo una gota de la mezcla en el portaobjetos y se deja secar. Los cortes se
recogen cuidadosamente sumergiendo, por debajo de ellos, el portaobjetos en forma
oblicua. Otra sustancia adherente que se emplea de la misma manera es la poli-lysina
(solución de 25 miligramos de la sustancia en 25 ml de agua destilada). Una gota de la
solución se extiende en el portaobjetos y éstos se secan a 50o - 55o durante toda la
noche y está lista para su uso.

b) Al líquido de flotación se le añaden sustancias adherentes. Uno de los procedimientos

más sencillos es el que consiste en disolver, en el agua ya caliente del baño de flotación
(dos litros) 0.5 g de gelatina.

El agua destilada se calienta a 60o C para disolver en ella la gelatina y el bicromato de

potasio, sucesivamente. Se filtra y está lista para su uso. Este líquido previamente
filtrado se puede utilizar varias veces. (Se recomienda guardarlo en el refrigerador).
Recogidos los cortes, éstos aún se pueden orientar aprovechando de la capa de líquido
que queda entre el portaobjetos y los cortes. Posteriormente las láminas se apoyan en
forma oblicua para que escurra el líquido sobrante y luego se colocan horizontalmente
dentro de una estufa o encima de una plancha caliente ( a 50o C aproximadamente).
Después de unas 3 a 4 horas, el líquido se habrá evaporado totalmente y la sustancia
adhesiva unirá firmemente el corte al portaobjetos.

COLORACION O TINCION.

Los cortes de los tejidos adheridos a los portaobjetos están listos para ser coloreados.
El procedimiento de coloración o tinción consiste en que una estructura celular o tisular
adquiere específicamente un color bajo la acción de una sustancia colorante. Se
considera que una estructura se ha coloreado o teñido cuando al ser lavada con el
líquido que disuelve al colorante, no se decolora. El proporcionar color a las estructuras
que constituyen un tejido o un órgano se hace con la finalidad de distinguirlas entre sí y
facilitar su observación. Si se examina al microscopio una sección de tejido sin colorear,
ya adherida al portaobjetos, se podrá constatar que no es fácil discernir sus
componentes, pues lo delgado de los cortes y la diafanización producida en los tejidos
igualan sus índices de refracción.
TEORÍA DE LA COLORACIÓN.

Existen dos teorías que explican el procedimiento de la coloración

a) Teoría física. Considera que la coloración es un proceso físico de adsorción. Así, las
partículas de las sustancias colorantes disueltas penetran en los espacios intra e
intercelulares en los que se mantienen adheridas en razón de la cohesión molecular.
Por ejemplo, la coloración de las grasas o lípidos es una tinción por adsorción; los
Sudanes III o IV tiñen las grasas por la facilidad que tienen para disolverse en ellas. Fig.
Tec. de Tinción: Tejido adiposo teñido con Sudán

b) Teoría química. El colorante se une a la sustancia coloreable combinándose con ella

íntimamente debido a la presencia de agrupaciones moleculares ácidas o básicas en
los componentes celulares o tisulares que se unen respectivamente a los cromógenos
básicos y ácidos de los colorantes, formando sales insolubles. Una prueba de ello es el
hecho de la casi imposibilidad de separar completamente el colorante de los
componentes en donde ejerció su acción de tinción aun empleando sus líquidos
solventes. De acuerdo a esta teoría los colorantes se unen (ligan) a los tejidos por
enlaces iónicos, covalentes o de hidrógeno. El enlace iónico o electrostático ocurre
cuando el colorante y la sustancia que se va a teñir, desarrollan diferentes cargas
eléctricas y entonces se atraen una a la otra, por ejemplo, el citoplasma se colorea
porque las proteínas citoplasmáticas poseen carga eléctrica (+) y las partículas del
colorante tienen carga eléctrica (-)

Clasificación de los colorantes.

Existen varios criterios para clasificar a los colorantes:

a) Por su origen. pueden ser naturales y artificiales (sintéticos).

Colorantes naturales, se extraen de:

1) Animales. Como el carmín, que se extrae de la cochinilla, artrópodo parásito

de los tallos del nopal (tuna). El carmín (de color rojo intenso) es uno de los
colorantes naturales más empleado en la industria alimentaria y cosmética.
En técnica histológica se utiliza el carmín de Best para demostrar glucógeno,
el carmín de Mayer para demostrar mucina; las células fagocíticas se
evidencian con el carmín de litio (colorante vital).
2) Vegetales. Como la hematoxilina, obtenida de la corteza de un árbol, el “palo
de campeche” (Haematoxilum campechanum), la safranina que se extrae de
una liliacea (pistilos de la flor de azafran) o la orceína que se obtiene de un
liquen. Colorantes artificiales o sintéticos. Son productos derivados de la
destilación de la hulla o carbón. Genéricamente se les conoce como
colorantes derivados de la anilina. Los colorantes artificiales son sales. Son
compuestos orgánicos formados por las modificaciones que experimenta el
anillo bencénico cuando se reemplazan dos átomos de hidrógeno por un
átomo de oxígeno o con otro átomo o por un grupo químico que tenga
enlaces de doble valencia en vez de uno, dando como resultado un
compuesto coloreado. La anilina es incolora, pero las modificaciones
químicas producidas en el anillo bencénico le confieren, a los compuestos
nuevos, un color determinado. Los colorantes artificiales y sintéticos se
clasifican en:

a) Acidos: son sales cuya parte básica es incolora y el componente ácido

posee color. Así, en la colorante eosina, la propiedad colorante se debe
al ácido eosínico y no a la base, el sodio. Los colorantes ácidos tienen
carga eléctrica negativa, por lo tanto la designación correcta es la de
colorantes aniónicos. También se les conoce como colorantes
citoplasmáticos, pues tiñen al grupo químico, cargado eléctricamente,
localizado en un extremo de la cadena de aminoácidos que integran las
proteínas citoplasmáticas. Las sustancias que atraen eléctricamente a
los colorantes ácidos se denominan “acidófilas” y químicamente están
constituidas por componentes básicos o alcalinos. Ejemplos: la eosina,
el amarillo de metanilo, la fucsina ácida, el ácido pícrico, el verde rápido,
el naranja G, la safranina, el azul de anilina, etc.

b) Básicos. Son sales que poseen la base coloreada e incolora la porción

ácida; por ejemplo, el azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno, debe
su propiedad colorante a la base azul de metileno y no al ácido clorhídrico
que es incoloro. Poseen una carga eléctrica positiva, por lo tanto son
colorantes catiónicos. Se les denomina también colorantes nucleares, pues
tienen afinidad por los ácidos nucleicos (ADN y ARN). Las sustancias teñidas
por los colorantes básicos se denominan “basófilas” y están constituidas por
componentes ácidos. Ejemplos: la hematoxilina, el rojo nuclear, el azul de
metileno, la tionina, el azul de toluidina, la fucsina básica.
c) Neutros. Son sales en las que tanto la parte básica como la parte ácida
proporcionan color. Por ejemplo el eosinato de azul de metileno o el eosinato
 de azur de metileno. Estos colorantes tienen la propiedad de teñir de manera
simultánea, a los componentes nucleares y a los citoplasmáticos, inclusive
pueden proporcionar colores distintos (metacromasia) a determinados
componentes citoplasmáticos como las granulaciones específicas de los
granulocitos (cierto tipo de leucocitos). Forman parte de las fórmulas
colorantes para frotis de sangre como los colorantes de Wright, May
Grünwald, Giemsa, Leischman, etc.
d) Indiferentes.- No forman sales. Son compuestos no iónicos incapaces de
la disociación electrolítica. Son insolubles en agua pero solubles en solventes
orgánicos como el alcohol y también en las grasas o lípidos y, aunque ellos
poseen color, en realidad estrictamente hablando no son colorantes.
Basándose en que son solubles en las grasas, estas sustancias se utilizan
para demostrar la presencia de ellas en células y tejidos, pues tiñen
selectivamente a los lípidos. Los ejemplos son: El sudan negro, el sudán III
y el sudán IV, El rojo oleoso.

D) MONTAJE. Concluido el proceso de la tinción de los cortes, éstos se deben

colocar en condiciones de protección y de poderlos utilizar infinidad de veces sin
que se deterioren. Para alcanzar tales propósitos se recurre al último
procedimiento que es el montaje.
Este procedimiento consiste en colocar encima del corte coloreado y diafanizado
una gota de una sustancia adherente, diluida, generalmente en xilol (resina
natural como el bálsamo de Canadá o resinas sintéticas, cuyos índices de
refracción son similares a los del vidrio) y encima de ellos, una laminilla
cubreobjetos, cuidando que no queden burbujas de aire entre la resina.

A continuación se deja que el xilol se evapore, y la resina adquiera solidez

suficiente; para ello las láminas se colocan en una platina caliente (45° a 50° C)
durante 24 a 48 horas y estarán listas para ser observadas.

Existen otros procedimientos en la técnica histológica que permiten la

observación de células y tejidos en los cuales no se utilizan colorantes naturales
y/o artificiales.
 CONCLUSIÓN

Los métodos para la obtención de preparaciones histológicas

ocupadas en los estudios de microscopia óptica, se engloban en la
Técnica Histológica. La Técnica Histológica abarca
varios procedimientos a los que se somete un tejido para
proporcionar los cortes como se conocen, montados bajo un cubre
objeto con imágenes de estructuras contrastadas, para su estudio
bajo microscopia óptica o electrónica.