TÉCNICAS PARA LA MEDICIÓN DE BIOMASA

Agamez Carlos, Cavadia Over, Durango Manuel, Montiel Carmen, Palma

Francisco, Ortiz Sair

UNIVERSIDAD DE CORDOBA

INTRODUCCIÓN

1.1 Medición de biomasa microbiana por conteo directo en cámara de

Neubauer. (Número de células).

Tabla 1. Número de células por cada dilución.

TUBO 1Z TUBO 2Z TUBO 3Z
8 2 12 9
0 0
3 10
0
9 3 4 9
0 0
Total: 25 células Total: 44 células
Total: 0 células
TUBO 4Z TUBO 5Z TUBO 6Z

8 11 28 14 29 23

3 10 10

11 12 12 19 12 48

Total: 45 células Total: 73 células Total: 122 células

  Factor de dilución para cada tubo

𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑉𝑓
𝐹𝐷 = =
𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑉𝑖
Tubo 1
0𝑚𝐿
𝐹𝐷 = =0
10 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

Tubo 2
2𝑚𝐿
𝐹𝐷 = = 0.2
10 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
Tubo 3
4𝑚𝐿
𝐹𝐷 = = 0.4
10 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
Tubo 4
6𝑚𝐿
𝐹𝐷 = = 0.6
10 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
Tubo 5
8𝑚𝐿
𝐹𝐷 = = 0.8
10 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
Tubo 6
10𝑚𝐿
𝐹𝐷 = =1
10 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

Se llevo a espectrofotometría a 3700 rpm durante 15 minutos.

 Volumen de la cámara
El cuadro tiene un área de 1mm2 y una profundidad de 0,1 mm.

Para el cálculo del número de células por mililitro de solución determinamos el

volumen del cuadro central de la siguiente manera:

𝑽𝒄𝒄 = 𝐴 ∗ 𝜀

Donde

Vcc: Volumen del cuadro central (mm3)

A: área (mm2)

𝜀: Profundidad (mm)

𝑽𝒄𝒄 = 1 𝑚𝑚2 ∗ 0.1 𝑚𝑚 = 0.1 𝑚𝑚3

En mililitros 1*10-4 /25 = 4*10-6 ml

En los 5 cuadros representativos

V= 4*10-6 ml * 5 cuadros

V= 2*10-5

 Cálculo de la concentración
Aplicamos la fórmula del cálculo de la concentración celular.

𝑁° 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑁° 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠

=
𝑚𝐿 (𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 ∗ 𝐹𝐷)

Tabla 2. Cálculo de la concentración de células para cada dilución.

Volumen total
de la cámara
Tubos N° total de FD Concentración
(mL) (5
células cuadros) (N°
Células/mL)

Tubo 1 0 2*10-5 0 0

Tubo 2 25 2*10-5 0.2 6250000

Tubo 3 44 2*10-5 0.4 5500000

Tubo 4 45 2*10-5 0.6 3750000

Tubo 5 73 2*10-5 0.8 4562500

Tubo 6 122 2*10-5 1 6100000

 140

120

100
N° de celulas

80

60

40

20

0
0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000
Concentración

Grafica 1: N° total de células vs Concentración

1.2 Medición de la biomasa microbiana por densidad óptica.

Tabla 3. Resultados de absorbancia para cada dilución.

Tubos Absorbancia Concentración

(N° Células/mL)
540 NM

Tubo 1 0 0

Tubo 2 0,385 6250000

Tubo 3 0,697 5500000

Tubo 4 1,006 3750000

Tubo 5 1,249 4562500

Tubo 6 1,627 6100000

 1.8
1.6
1.4
1.2 y = 1E-07x + 0.1905
Absorbancia

1 R² = 0.3337

0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 6000000 7000000
N° de celulas / ml

Grafica 2: Absorbancia vs N° Células/mL

1.3 Medición de la biomasa microbiana por peso seco celular.

 Determinación de contenido de células por volumen de disolución

Para la determinación del contenido de células presentes expresadas en gramos

por litro, se realizó la diferencia entre los pesos obtenidos, y luego esta cantidad de
células se divide entre el volumen en el que se trabajó para esta experiencia en
específico, que fue 7 ml (0.007 L), como se muestra a continuación:

seco (PS) = Peso tubo seco con levadura – peso tubo seco vacío

Peso seco (PS) = 12.1846 g – 12.1836 g = 0.001 g

Así se encontraron todos los pesos por diferencia, ahora hallamos los g de cel/ v
solución:

𝐠 𝐜𝐞𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 Gramos de celulas

=
𝐕 𝐬𝐨𝐥𝐮𝐜𝐢ó𝐧 Volumen de disolucion en el que se trabajo

En el caso de cada tubo estudiado, por la anterior ecuación nos queda que:
Tubo 1

𝐠 𝐜𝐞𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 0.001 𝑔 𝑔 𝑐𝑒𝑙 𝑔 𝑐𝑒𝑙

= = 𝟎. 𝟎𝟎𝟎𝟏. 𝟒𝟐 = 𝟎. 𝟏𝟒𝟐
𝐕 𝐬𝐨𝐥𝐮𝐜𝐢ó𝐧 7 mL 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙 𝐿 𝑠𝑜𝑙
Tubo 2

𝐠 𝐜𝐞𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 0.0357 𝑔 𝑔 𝑐𝑒𝑙 𝑔 𝑐𝑒𝑙

= = 𝟎. 𝟎𝟎𝟓. 𝟏 = 𝟓. 𝟏
𝐕 𝐬𝐨𝐥𝐮𝐜𝐢ó𝐧 7 mL 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙 𝐿 𝑠𝑜𝑙

Tubo 3

𝐠 𝐜𝐞𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 0.065 𝑔 𝑔 𝑐𝑒𝑙 𝑔 𝑐𝑒𝑙

= = 𝟎. 𝟎𝟎𝟗. 𝟐 = 𝟗. 𝟐
𝐕 𝐬𝐨𝐥𝐮𝐜𝐢ó𝐧 7 mL 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙 𝐿 𝑠𝑜𝑙
Tubo 4

𝐠 𝐜𝐞𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 0.1018 𝑔 𝑔 𝑐𝑒𝑙 𝑔 𝑐𝑒𝑙

= = 𝟎. 𝟎𝟏𝟒 = 𝟏𝟒
𝐕 𝐬𝐨𝐥𝐮𝐜𝐢ó𝐧 7 mL 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙 𝐿 𝑠𝑜𝑙
Tubo 5

𝐠 𝐜𝐞𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 0.1228 𝑔 𝑔 𝑐𝑒𝑙 𝑔 𝑐𝑒𝑙

= = 𝟎. 𝟎𝟏𝟕 = 𝟏𝟕
𝐕 𝐬𝐨𝐥𝐮𝐜𝐢ó𝐧 7 mL 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙 𝐿 𝑠𝑜𝑙
Tubo 6

𝐠 𝐜𝐞𝐥𝐮𝐥𝐚𝐬 0.1334 𝑔 𝑔 𝑐𝑒𝑙 𝑔 𝑐𝑒𝑙

= = 𝟎. 𝟎𝟏𝟗 = 𝟏𝟗
𝐕 𝐬𝐨𝐥𝐮𝐜𝐢ó𝐧 7 mL 𝑚𝐿 𝑠𝑜𝑙 𝐿 𝑠𝑜𝑙

Tabla 4. Cálculo de los g células / volumen de solución para cada dilución

Numer V de la Peso Peso G cel g g Absorban

o de solució (tubo (tubo + por cel/mL cel/L cia
tubos n en L inicial levadur diferenc sol sol
)g a) (g) ia de
peso
1 0,007 12.183 12.1846 0.001 g 0.0001, 0.142 0
6g g 42
 2 0,007 12.148 12.1986 0.0357 g 0.005,1 5.1 0,385
9g g
3 0,007 12.119 12.2594 0.065 g 0.009,2 9.2 0,697
6g g
4 0,007 12.082 12.2886 0.1018 g 0.014 14 1,006
8g g
5 0,007 12.061 12.3057 0.1228 g 0.017 17 1,249
8g g
6 0,007 12.133 12.3269 0.1334 g 0.018 19 1,627
4g g

25

20 y = 4.5714x - 7.6667
R² = 0.8518

15
g de cel / L sln

10

0
0 1 2 3 4 5 6 7
-5
Absorbancia

g cel/L sol Absorbancia Linear (g cel/L sol)

Grafica 3: Absorbancia vs g Células/mL

 CUESTIONARIO

1. Consulte y explique otros métodos utilizados para la medición de la

biomasa microbiana.

A. Cuantificación de ATP por bioluminiscencia.

El adenosín trifosfato (ATP) es una sustancia que está contenida típicamente en la

biomasa de origen animal, vegetal y microbiano. Determina directamente la
presencia de material biológico en superficies, en líquidos u otras muestras. Por lo
tanto, puede ser usado como indicativo directo de la cantidad de microorganismo
especifico en estudio de crecimiento bacteriano. Est tcnic consiste en la reacción
del ATP con la LUCIFERINA en presencia de la enzima luciferasa, presente en las
luciérnagas (Roman, 2006). La cantidad de ATP puede ser usada como control
microbiológico en la industria de alimentos, como indicador de la cantidad de
material biológico sobre las superficies en contacto con los alimentos y como
controles de higiene en otros campos donde sea primordial proporcionar una
medida del estado de limpieza y eficiencia.
B. MÉTODOS DE SIEMBRA:

El recuento de microorganismos viables se fundamenta en la capacidad de dichas

células viables de desarrollar una colonia visible en un medio de cultivo apropiado.
En los recuentos en placa por vertido, un volumen de 0,1- 1 ml de la suspensión
microbiológica se mezcla con el medio de cultivo fundido y parcialmente enfriado en
una placa de Petri. En los recuentos en placa por siembra en superficie, se extiende
un volumen de aproximadamente 0,1 ml de la suspensión sobre la superficie del
medio de cultivo. Los resultados de los recuentos en placa se expresan como
unidades formadoras de colonia (UFC) por unidad de volumen de la suspensión
microbiológica (Arnaiz C. et all, 2000).
 C. MÉTODOS CINÉTICOS:

La base de estos métodos es la medida del consumo de sustrato o de la formación

de producto en ensayos en discontinuo. El ejemplo más típico en microorganismos
aerobios es la determinación de la DBO, que indica la biodegradabilidad de un
sustrato en disolución a través del consumo de oxígeno del medio.

 Adaptaciones del Respirómetro de Warburg

 Tasa de respiración
 Tasa de desaparición de sustrato
 Potencial bioquímico de producción de metano

D. MÉTODOS EN CONTINUO:

Durante los años 90 se han desarrollado métodos cuantitativos para la

determinación online de la biomasa de un proceso biológico. Las técnicas más
importantes se basan en propiedades eléctricas, microcalorimétricas o
espectrofotométricas de los cultivos biológicos. Sin embargo, a pesar del desarrollo
tecnológico, no existe un sensor ideal para la monitorización en continuo de la
biomasa (Arnaiz C. et all, 2000).

E. MÉTODOS BIOQUÍMICOS:

Las medidas de alguna actividad enzimática pueden considerarse como una

alternativa a los métodos tradicionales. Los ensayos enzimáticos son simples de
realizar y sus resultados se obtienen rápidamente. Además. El equipamiento
necesario no es ni costoso ni complejo. La mayoría de las medidas de actividad
enzimática se realiza mediante la conversión de sustratos específicos a productos
coloreados que son cuantificados fotométricamente.

La principal desventaja de los métodos bioquímicos es la variación de las

actividades enzimáticas celulares con los cambios fisiológicos y que, una vez que
los microorganisrnos mueren, las enzimas liberadas pueden seguir activas. Entre
las distintas medidas de actividad enzimática cabe destacar:
  Actividad esterasa
 Actividad deshidrogenasa

F. PESO HÚMEDO:

Es simplemente la centrifugación o filtración de muestras del cultivo seguida de

pesado directo. Aunque es un método extremadamente rápido, es importante
estandarizar correctamente el procedimiento, ya que se mide el agua tanto intra
como extra celular. Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada
luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Esta es una
técnica ampliamente utilizada para grandes volúmenes de muestra, posee una gran
desventaja que es la capacidad de medir el agua intra y extra celular, es decir
diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la
masa.

G. COMPONENTES CELULARES:

Cualquier componente celular seleccionado para la estimación de la biomasa viva

de una muestra debe responder a tres criterios fundamentales: Estar presente
únicamente en células vivas, ser rápidamente degradado en células vivas, ser
relativamente constante en concentración respecto a cambios en el estado
fisiológico celular y entre distintas especies (Arnaiz C. et all, 2000).

Hasta el momento no existe ningún componente celular que cumpla estos tres
requerimientos. Sin embargo, los más adecuados para estimar biomasa viva, son:

 Ácidos nucleicos, El ADN y el ARN

 Proteínas
 Polisacáridos
 Lípidos

H. DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS:

Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población
bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado ácido nucleico
(generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la población.

I. DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO.

Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población

bacteriana. Existen distintas para determinar la cantidad de nitrógeno que contiene
una muestra con relación con el compuesto que se requiera determinar. Puede
analizarse el nitrógeno no proteico mediante el NO3 - , NO3 - , NH4 + , el nitrógeno
proteico mediante absorción de UV, Reacción de Biuret, Reaccion de Lowry, o el
nitrogeno total mediante la digestión Kjeldahl.

J. METODO TURBIDIMETRICO.

Son muy usados en la práctica cotidiana de laboratorio. L a base común de estos

métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersa o transmitida a
través de un cultivo microbiano. Las suspensiones dispersan la luz al igual que
cualquier partícula pequeña suspendida en agua (efecto tindall) la dispersión de la
luz es dentro de ciertos límites, proporcional a la masa del cultivo.

Cuantificación de células bacterianas mediante la medida indirecta de

turbidez.

La turbidez se presenta en una muestra porque las células presentes allí dispersan
la luz que atraviesa la solución. A mayor número de células presentes habrá mayor
dispersión de luz y por lo tanto habrá un aumento de la turbidez. Esta puede medirse
con un fotómetro ( nefelómetro ) siendo sus unidades fotométricas.

2. Consulte las ventajas y desventajas de cada uno de las técnicas utilizadas

en el experimento.

MEDICIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA POR CONTEO DIRECTO EN

CÁMARA DE NEUBAUER
 Ventajas Desventajas
 Exacto cuando se trabaja con • Sólo sirve para suspensiones
muestras que contienen relativamente concentradas (>10x106
poblaciones abundantes. cel/ml). Por debajo de este valor el Nº
 Puede ser utilizada con objetivos de células es poco significativo
de inmersión, aunque la mayoría estadísticamente.
de los recuentos se realizan con • Puede conducir a errores a la hora del
objetivos secos. conteo por la cantidad y el tamaño de
 Observación de célula viable y las células.
no viable. • No se pueden distinguir células vivas
 Brindar información adicional
y muertas.
sobre el tamaño y la morfología
• Dificultad en el llenado en la cámara
de los objetos contados.
con líquido.
 Es un método muy rápido.

MEDICIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA POR DENSIDAD ÓPTICA

Ventajas Desventajas
 Es un método rápido.  No se puede determinar la
 Es un método sencillo. morfología de las células.
 La cuantificación de  No es posible diferenciar a las
microorganismos permite células vivas de las muertas.
establecer la población total de  Los dispositivos para la medición
microorganismos existentes. son muy costosos.
 MEDICIÓN DE LA BIOMASA MICROBIANA POR PESO SECO CELULAR

Ventajas Desventajas
 Es útil para grandes volúmenes  Es un método tedioso debió a
de muestra, debido a que que implica emplear mucho
diferencias del orden de los tiempo.
miligramos representan el peso  Componentes volátiles de la
de un gran número de bacterias. célula pueden perderse por el
 La incertidumbre que se maneja secado y puede existir alguna
es poca. degradación.
 La muestra seca puede recobrar
humedad durante el pesado,
principalmente si el ambiente
tiene una humedad relativa alta.

3. ¿Qué son los colorantes supravitales y para qué se usan?

Al investigar las estructuras celulares podemos utilizar dos formas diferentes de

tinción: aquellas que se hacen con el tejido muerto y las que utilizan tejido o células
vivas para su observación. Entre las segundas podemos diferenciar las tinciones
vitales, que consisten en la introducción de un colorante en la circulación de un
organismo vivo y las tinciones supravitales, que emplean el colorante sobre células
o tejidos vivos aislados del organismo.
En ambos casos lo que se pretende es destacar los elementos de la célula viva y
seguir los procesos vitales en el interior de la misma (Faustina C. et all, 2004).

Los colorantes supravitales son sustancias que colorean el tejido de la célula sin
necesidad de ser destruidas, por lo general estos son compuestos de color intenso
que permiten un realce facilitando así el conteo. Estos colorantes son utilizados
como colorantes vitales o en vivo, este tipo de colorante tiene la capacidad de
comunicar su color a otros compuestos, originando una absorción selectiva de la
luz, lo que da como resultado cuerpos coloreados con un color que ha sido
absorbido. Los tipos de colorantes supravitales más empleados, son:
 Azul de metileno
 Azul de cresilo brillante
 Cristal violeta
 Violeta de metilo
 Nilo Azul